BAHAN DAN METODE Koleksi Sampel dan Ekstraksi Genomik DNA

  Jurnal Riset Akuakult ur, 13 (1), 2018, 57-65

Tersedia online di: ht t p://ej ournal-balit bang.kkp.go.id/index.php/j ra

  

GEN PENYANDI VIRAL PROTEIN 15 (VP-15) (W SSV) DAN

W HITE SPOT SYNDROM E VIRUS

APLIKASINYA SEBAGAI VAKSIN REKOM BINAN PADA UDANG W INDU

_#

  

Andi Parenrengi , Sri Redjeki Hesti M ulyaningrum , Andi Tenriulo, dan Agus Nawang

Balai Riset Perikanan Bu didaya Air Payau dan Penyu luhan Pe rikanan

  

(Naskah dit erima: 7 November 2017; Revisi final: 4 Desember 2017; Diset ujui publikasi: 4 Desember 2017)

ABSTRAK

Infeksi whit e spot syndrome virus (WSSV) dapat menyebabkan kematian massal pada budidaya udang windu

di Indonesia. Infeksi yang terjadi secara sistematis tersebut disebabkan oleh peran gen Penaeus monodon

nucleocapsid viral prote in (VP-15). Upaya pengembangan gen VP-15 WSSV u ntuk menginduksi respons

imun dan menetralisasi terhadap infeksi WSSV pada udang windu perlu dilakukan. Penelitian ini bertujuan

untuk mengisolasi dan merekombinasikan gen penyandi VP-15 WSSV sebagai vaksin dsRNA, serta menganalisis

aplikasinya pada udang windu. Gen VP-15 diisolasi dari udang windu yang terinfeksi WSSV, dikloning ke

dalam suatu vektor dan ditransformasikan ke sel kompeten (bakteri DH5 ). Plasmid diisolasi

  Escheria coli 

untuk mengonfirmasi insert region gen VP-15 melalui sekuensing nukleotida. Pembuatan vaksin rekombinan

dilakukan secara in-vit ro menggunakan kit MEGAscript RNAi dan diaplikasikan ke udang windu melalui

  metode injeksi dengan dosis tunggal 0,2 µg dan kontrol (tanpa injeksi vaksin). Hewan uji yang digunakan

  

b erukuran p an jan g 14,75± 3,17 g dan bo bo t 11,64± 0,76 cm ; se rt a d ip elih ara pada wadah bak fibe r

volume 250 L dengan kepadatan 10 ekor/bak. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen penyandi VP-15

telah diisolasi dari udang windu dan vaksin rekombinan telah dihasilkan secara in-vit ro . Analisis sekuens

nukleotida memperlihatkan bahwa sisipan gen DNA VP-15 sebesar 253 bp dan menunjukkan kemiripan

  yang tinggi (99%) pada GenBank. Penggunaan vaksin rekombinan dsRNA dengan dosis 0,2 µg

  

memperlihatkan sintasan udang windu yang dapat mencapai 40,0% dibandingkan dengan kontrol hanya

3,3% (p en in gkatan 36,7%). Gam baran h isto pat ologi pad a jaringan he pato pankreas ud an g win du p ad a

perlakuan kontrol menunjukkan adanya kerusakan inti sel, akibat infeksi WSSV. Gene VP-15 berpotensi

sebagai bahan vaksin rekombinan dsRNA dalam mencegah infeksi WSSV.

  KATA KUNCI: kloning; gen VP-15 WSSV; vaksin rekombinan; dsRNA; udang windu

ABSTRACT: Gene encoding viral protein 15 (VP-15) of white spot syndrome virus and its application as a

recombinant vaccine to tiger shrimp

  Penaeus monodon. By: Andi Parenrengi, Sri Redjeki Hesti M ulyaningrum, Andi Tenriulo, and Agus Nawang

  

Infect ion of whit e spot syndrome virus (WSSV) causes bulk mort alit ies of t iger shrimp Penaeus monodon cult ured in

Indonesia. The nucleocapsid viral prot ein-15 (VP-15) is st rongly suspect ed t o be responsible for t he syst emic infect ion

of WSSV. The development of VP-15 WSSV gene for inducing t he immune response t o and neut ralize WSSV infect ion

of t iger shrimp is vit ally needed. The aim of t his st udy was t o isolat e and clone t he gene encoding VP-15 WSSV as

dsRNA vaccine and assess t he vaccine applicat ion t o t iger shrimp. VP-15 gene was isolat ed from t he genomic DNA of

infect ed t iger shrimps, cloned into t he vect or, and transformed int o compet ent cells (Escheria coli DH5a). The plasmid

was isolat ed t o confirm t he insert region gene of VP-15 by t he nucleot ide sequence. Product ion of dsRNA vaccine was

performed by in-vit ro using M EGAscript RNAi kit and applied t o t iger shrimp t hrough muscular inject ion at a single

dosage of 0.2 µ g and wit hout dsRNA as a cont rol t reat ment. The average size of t iger shrimps used was 14.75± 3.17

g in weight and 11.64± 0.76 cm in lengt h and st ocked in 250 L fiber t ank at 10 ind./t ank. The result s of t he st udy

showed t he VP-15 gene was successfully isolated from t he t iger shrimps and t he recombinant vaccine was produced by

_#

in-vit ro. The analysis of nucleot ide sequence showed t hat t he insert ed DNA was 253 bp and showed a high similarit y

  Ko r esp o n d e n si: Balai Rise t Per ikan an Bu d id aya Air Payau d an Pe nyu lu h an Pe rikan an. Jl. Makm u r Dg . Sitakka No .1 2 9 , Mar o s 9 0 5 1 2 , Su lawe si Se lat an , In d o n e sia. Te l. + 6 2 4 1 1 3 7 1 5 4 4 andi _ par enr engi @ hot mai l .com

  E-m ail: Co p yright @ 201 8, Jurn al Rise t Akuakult ur, p -ISSN 19 07-6754 ; e-ISSN 25 02-6534

  . Amplifikasi DNA dilakukan dengan m e n ggu n a kan m e sin PCR (Ge n e Am p PCR Sys t e m 2 7 0 0 ). Kit RTG (Pu re Taq Re a d y-To -Go PCR Be ad s) d igun akan d alam reaksi PCR d en gan p e namb ahan primer ( forward dan reverse ) masing-masing sebanyak

  annealing

  Det eksi Penyakit Bintik Putih

  Det e ksi pe nyakit bint ik put ih dilakukan melalui t e k n ik PCR d e n g a n m e n g ik u t i m e t o d e d a r i k it ko mersial IQ-2000 dan menggunakan genomik sebagai cet akan (

  t emplat e

  ) DNA. Met o d e

  nest ed

  digun akan d ala m d e t e ks i in fe k si p e n ya kit WSSV. Pa d a PCR pert ama dilakukan dengan t ahapan: lima siklus unt uk denat urasi pada suhu 94°C selama 30 det ik,

  annealing

  pada 62°C selama 30 det ik; ekst ensi pada 72°C selama 30 det ik dan diikut i dengan 15 siklus denat urasi pada 94°C selama 15 det ik;

  annealing

  pada 62°C selama 15 det ik; dan ekst ensi pada 72°C selama 20 det ik. PCR kedua mengikut i t ahapan: 25 siklus denat urasi pada 94°C selama 20 det ik;

  pada 62°C selama 30 det ik; ekst ensi pada 72°C selama 30 det ik; dan diikut i dengan denat urasi pada 72°C selama 30 det ik; dan ak h irn ya p ad a su h u 2 0 °C s e lam a 3 0 d e t ik. Has il amp lifikasi PCR d ie le kt ro fo re sis pad a ge l agaro sa (2,0% dalam 1x

  Udang windu yang t erserang WSSV diko leksi dari t ambak air payau di Takalar dengan ukuran bo bo t 7- 15 g. Se ban yak 30 mg sam pel dagin g d iprese r vasi d e n ga n e t an o l 9 0 % se b e lu m d ilak u ka n e kst rak si ge n o m ik DNA. Ekst raksi ge no m ik DNA d ilaku kan dengan met o de CTAB yang t elah dikembangkan pada udang windu (Parenrengi

  TBE buffer

  ) unt uk menget ahui t ingkat infeksi dan dido kument asikan.

  Isolasi Gen VP-15 W SSV

  Gen penyandi VP-15 diiso lasi dari geno mik DNA ud an g win du yan g po sit if t e rin fe ksi WSSV de ngan t ingkat akut . Iso lasi gen mengacu pada met o de yang d ike m b an gkan o le h Sarat h i

  et al

  . (2 0 1 0 ), d e n gan m e n g g u n a k a n p r im e r fo r w a r d VP-1 5 F: 5 '- cgcggatccgat gacaaaataccccgagaac-3 dan primer reverse

  VP-15 R: 5 - ccggaat t ct t aacgcct t gact t gcggg-3 ' yan g dilengkapi dengan sit us rest riksi masing-masing adalah

  Bam-HI

  dan

  Eco-R1

  et al ., 2017).

  BAHAN DAN M ETODE Koleksi Sampel dan Ekstraksi Genomik DNA

  Gen penyandi viral prot ein 15 (VP-15) Whit e Spot Syndrome Virus ..... (Andi Parenrengi)

(99%) wit h VP-15 gene deposit ed in t he GenBank. The applicat ion of dsRNA vaccine showed t hat t he dosage of 0.2 ¼ g

result ed in the survival rate of 40.0% compared with wit hout dsRNA (control) of 3.3% (36.7% increment). Hepatopancreas

hist ology indicat ed obvious damages to cell nucleus in t he un-vaccinat ed t iger shrimp caused by t he virus infect ion. We

suggest t hat t he VP-15 gene is a very promising dsRNA recombinant vaccine against WSSV infect ion.

  et al

  KEYW ORDS: cloning; VP-15 W SSV; recombinant vaccine; dsRNA; tiger shrimp PENDAHULUAN

  Ud an g wind u

  Penaeus monodon

  dike n al se bagai ko m o d it as u t am a b u d id aya t am b ak d i In d o n e sia. Namun, sejak 1995 budidaya udang windu dihadapkan pada salah sat u masalah penyakit yang disebabkan oleh

  whit e spot syndrom virus

  (WSSV). Infeksi WSSV dit andai dengan adanya bint ik put ih at au bercak put ih pada

  exoskeleton dan epidermis t erutama pada bagian karapas udang sehingga dikenal sebagai penyakit bint ik put ih.

  Hingga saat ini belum ada cara yang dinilai efektif dalam menanggulangi penyakit t ersebut . Upaya peningkat an r e s is t e n s i u d a n g t e r h a d a p s e r a n g a n p a t o g e n merupakan salah sat u alt ernat if pemecahan masalah penyakit pada akuakult ur. Mekanisme yang po t ensial dalam peningkat an resistensi penyakit adalah produksi hewan akuat ik melalui pe nerapan int erferensi RNA (RNAi) at au ju ga d iken al seb agai t ekno lo gi d sRNA ( d ou bl e st r a nd ed RNA). RNAi m e r u p a k a n s u a t u t e kn o lo gi yan g d ap at m e n gh am b a t e k sp re si g e n t ert ent u, t ermasuk ekspresi gen virulensi pada WSSV, se h in gga viru s t e rse b u t t id ak d a p at m e n gin fe ksi udang. Pendekat an rekombinan DNA khususnya vaksin dsRNA t elah mulai diaplikasikan pada budidaya udang. Induksi imun udang melalui vaksinasi t elah dilapo rkan dengan penggunaan reko mbinan pro t ein WSSV pada u d a n g

  P. chi nensi s

  (Kim

  . , 2 0 0 4 ), a n t ivir a l menggunakan unt ai ganda RNA pada udang

  . Meskipun demikian, aplikasi t ekno logi RNAi unt uk pe nanggulangan pe nyakit pada udang masih t erb at as. Se bagai langkah awal menu ju pembu at an ko n st ru ksi ge n u n t u k RNAi m aka p e rlu d ilaku kan iso lasi gen pengko de VP-15 dari udang windu yang t e r s e r a n g p e n ya k it b in t ik p u t ih . Pe n e lit ia n in i bert ujuan unt uk mengiso lasi dan mereko mbinasikan gen penyandi VP-15 dari WSSV sebagai vaksin dsRNA, sert a menganalisis aplikasinya pada udang windu.

  L. vannamei (Ro balino et al ., 2004).

  Be r b a g a i p e n e lit ia n d a la m u p a ya u n t u k m e nin gkat kan im u n it as u d an g t e rhad ap se rangan pato gen telah dilakukan, misalnya penggunaan vaksin po lisakarid a bersulfat yang diiso lasi dari Sargassum

  polycyst um

  (Cho t igeat

  et al

  ., 2004), bakt eri

  Vibrio sp.

  inakt if, sert a WSSV yang dilemahkan dengan fo rmalin (Nam iko shi et al ., 20 04 ). Wit t e ve ld t et al . (20 0 4a) berhasil membuat vaksin reko mbinan

  viral prot ein

• 19 (VP1 9 ) ya n g m a m p u m e n in g ka t k a n s in t a s a n P.

  monodon

  Co p yright @ 201 8, Jurn al Rise t Akuakult ur, p -ISSN 19 07-6754 ; e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 13 (1), 2018, 57-65

   TBE buffer

  dan

  r ever se dan dH ₂ O hingga mencapai volume 25 µL.

  Me t o d e d e t e k si in se rs i ge n p ad a ve kt o r klo n in g dilakukan de ngan m et o de iso lasi ge n VP-15 WSSV se p e rt i d ije las kan s e b e lu m n ya. Un t u k ke p e r lu an pengurut an DNA, maka plasmid bakt eri reko mbinan diisolasi dan selanjut nya disekuensing di laborato rium The First Base, Singapura.

  Isolasi dan Konstruksi Gen VP-15 dengan Promoter T7

  VP-15 diiso lasi dari plasmid bakt eri reko mbinan m e n g g u n a k a n

  p r i m er f or w a r d

  T7 -VP-1 5 F: 5 '- gaattaatacgactcactatagggagacgcggatccgatgacaaaataccccgagaac- 3 d a n

  p r i m er r ever se

  T7 -VP-1 5 R: 5 - gaattaatacgactcactatagggagaccggaattcttaacgccttgacttgcggg- 3'. Konstruksi gen dilakukan dengan cara menambahkan sekuens pro mot er pada set iap primer. Amplifikasi DNA dilakukan pada mesin PCR, dengan menggunakan kit

  RTG sebagai reaksi PCR dan 1 µL (50 ρ

  mol/mL) masing- masing primer dan dH ₂ O unt uk mencapai vo lume akhir

  25 µL. Siklus suhu ( t hermal cycle

  ) PCR yang digunakan mengikut i pro gram iso lasi gen penyandi VP-15 sepert i ya n g d ije la s k a n s e b e lu m n ya . Am p lik o n PCR dielekro fo resis pada gel agaro sa (2,0% dalam 1X

  ) unt uk menget ahui keberhasilan ko nst ruksi gen dengan indikat o r t erbent uknya fo rmasi fragmen DNA t unggal.

  mo l/ µ L) primer

  Produksi Vaksin Rekom binan dsRNA VP-15

  Vaksin reko mbinan dsRNAVP-15 dihasilkan secara

  in-vit ro

  , dilakukan menggunakan kit MEGAscript RNAi berdasarkan met o de Lo y et al . (2012). Ko nst ruksi gen

  VP-1 5 d e n gan p ro m o t e r T7 d ari p la sm id b akt e ri reko mbinan dijadikan sebagai bahan dasar (

  t emplat e DNA) unt uk perbanyakan vaksin reko mbinan dsRNA.

  Pro se s p ro d uksi dsRNA melalu i b ebe rapa t ah apan, yakni (a) perbanyakan dsRNA; (b) digest i dsRNA; dan (c) p e m u r n ia n d sRNA. Ve rifikasi p ro d u ksi d sRNA dilakukan dengan met o de elekt ro fo resis.

  Aplikasi Vaksin Rekombinan dsRNA pada Udang W indu

  St u d i p e n d a h u lu a n in i d ila k u k a n d e n g a n

  mengaplikasikan dosis tunggal dsRNA (0,2 µg) dan

  t an p a d sRNA se b agai p e rlaku kan ko n t ro l (in je ksi larut an fisio lo gis). Vaksin dsRNA diinjeksi ke udang windu berukuran panjang 14,75± 3,17 g dan bo bo t 11,64± 0,76 cm melalui met o de injeksi

  int er-muscu- lar

  . Udang windu yang digunakan telah dinyatakan bebas dari penyakit bint ik put ih o leh infeksi WSSV. Hewan uji yang telah divaksin dipelihara pada bak fiber ukuran 250 L dengan kepadat an 10 eko r/bak menggunakan me dia air laut 3 2 ppt . Set elah lima h ari vaksin asi, udang diuji t ant ang dengan WSSV dengan ko nsent rasi

  50 µL/ shrimp

  forward

  menambahkan 1 µL (50 ρ

  1 µL (50 ρ

  ) d e n g a n

  mo l/mL) dan dH ₂ O unt uk mencapai vo lume akhir 25 mL. Pro ses PCR dilakukan dengan t ahapan pre-denat u rasi 9 4°C se lama t iga me nit ; d ilanju t kan dengan denat urasi 94°C (sat u menit ),

  annealing

  57°C (45 d et ik), dan e kst e n si 7 2°C (sat u me n it ). Siklu s t ersebut diulang sebanyak 35 kali. Tahapan berikut nya adalah ekst ensi akhir 72°C selama lima menit . Hasil amplifikasi PCR selanjut nya dielekt ro fo resis pada gel agaro sa (2,0% dalam 1x

  TBE buffer

  ) unt uk ve rifikasi kebe rhasilan iso lasi dan dido ku ment asikan de ngan kamera Geldo c.

  Pengklonan Gen Penyandi VP-15

  Pe n gklo n an ge n p e n yan d i VP-1 5 d ilaku kan d i Labo rat o rium Inst alasi Penelit ian dan Pengembangan Pengendalian Penyakit Ikan di Depo k. Fragmen DNA dari ampliko n PCR yang t elah dielekt ro fo resis dalam agaro sa gel dipo t o ng, diiso lasi kembali DNA-nya dan dimurnikan dengan kit

  GF-1 Gel Recovery

  berdasarkan pro sedur yang disarankan. Selanjut nya fragmen DNA diklo n dengan meligasikan ke vekt o r melalui met o de yang ada pada TOPO TA

  Cloning Kit

  berdasarkan manual ve n d o r d an d it r an s fo r m as i k e b akt e ri ko m p e t e n

  Escheria coli

  DH5  . Tran sfo rm asi b akt eri dilakukan m e lalu i t e kn ik k e ju t p a n as (

  heat shock

  mencampurkan 5 µL hasil ligasi dengan 100 µL sel

  Re a k s i PCR m e n g g u n a k a n k it RTG, d e n g a n

  ko mpet en bakt eri dalam t abung mikro pada ko ndisi dingin. Hasil pencampuran t ersebut diinkubasi pada suhu 42°C selama 30 det ik sebagai perlakuan kejut panas dan dipindahkan ke dalam es selama 10 menit . Campuran gen VP-15 yang sudah dit ransfo rmasi ke d a la m s e l k o m p e t e n d ip in d a h k a n k e t a b u n g po lipro pilena vo lume 15 mL dan dit ambahkan media LB 1 mL. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C dengan

  rot ary shaker

  120 rpm (sat u jam) dan disen t rifugasi dengan kecepat an 6.000 rpm selama lima menit .

  Skrining

  koloni

  E. coli

  DH5  yang mengandung plas- m id re ko m b in an (TOPO -VP-1 5 ) d ilaku kan d e n gan met o de seleksi ko loni ber warna put ih dan biru. Empat ko lo ni put ih yang diduga mengandung

  insert

  gen VP- 1 5 d ig u n a k a n s e b a g a i

  t em p l at e

  . Ko lo n i p u t ih dit umbuhkan pada media LB cair dalam t est t ube 15 m L, k e m u d ia n d iin k u b a s i s e la m a s a t u m a la m menggunakan

  shaker

  suhu 37°C dengan kecepatan 120 r p m . Pa n e n b a k t e r i d ila k u k a n d e n g a n c a r a disent rifugasi dengan ke cepat an 5.000 rp m selama lima menit dan pelet yang terbentuk digunakan sebagai

  t emplat e unt uk PCR.

  melalui injeksi (berdasarkan dat a LC-50 pada penelitian sebelumnya), dan selanjutnya dipelihara dengan kepadat an dan wadah yang sama dengan saat vaksinasi. Sint asan d iamat i se t iap hari selama lima

• galakt o pirano sa). IPTG merupakan bahan unt uk menginduksi ekspresi gen penyandi enzim
• galakt o sidase yang akan memecah X-gal, se h ingga ko lo ni be r warn a b iru . Seb alikn ya, bakt eri pembawa plasmid reko mbinan t idak mampu meme cah X-gal yan g diind ikasikan o leh muncu lnya k o lo n i b e r w a r n a p u t ih (Ho w e , 2 0 0 7 ). Ha s il e le k t r o fo r e s is e m p a t k o lo n i p u t ih b a k t e r i menunjukkan bahwa gen VP-15 t elah t erbukt i t ersisip d i ve k t o r k lo n in g , ya n g d ib u k t ik a n d e n g a n t e r b e n t u k n ya fr a gm e n t u n gg al DNA p a d a p o s is i t arget gen 253 bp (Gambar 2).

  (ORF) sekitar 243 bp yang dimulai dengan adanya ko do n awal ”ATG” ( st art codon ) dan diakhiri dengan k o d o n a k h ir “ TAA” (

  et al

  ., 2001; Xing & Shi, 2011), pada vekt o r ekspresi pGEX-4T-2 (Mukhlis, 2010) dan vekt o r pUCm-T (Jha & Xu, 2005).

  Analisis Sekuens Nukleoit ida Gen Sisipan

  VP-15

  Analisis sekuens nukleo t ida gen VP-15 dari ko lo ni bakt eri reko mbinan pembawa plasmid TOPO-VP-15 t elah dilakukan. Hasil pengurut an sekuens nukleot ida dengan menggunakan t arget pembacaan

  open reading frame

  st op cod on ) (Ga m b a r 3 ).

  et al ., 20 04).

  Karakt erisasi gen VP-15 iso lat dari Takalar, Indo nesia yang mewabah pada t ahun 2012, 2013, dan 2014 telah d ila k u k a n o le h Pa r e n r e n g i

  et a l

  . (2 0 1 7 ), ya n g

  300 bp 200 bp 100 bp M 1 2 3 4 M

  Gambar 1. Amplifikasi PCR dengan menghasilkan fragmen t unggal gen VP-15 yang diiso lasi dari geno mik udang windu (M= marker DNA 100 bp; 1-4= sampel udang).

  

Figure 1. PCR amplificat ion by generat ing a single fragment of VP-15 gene isolat ed from

genomic DNA of t iger shrimp (M = DNA marker 100 bp; 1-4= shrimp sample)

  Pengklonan gen VP-WSSV telah berhasil dilakukan pada vekt o r pGEM-T Easy (Liu

  VP-15, VP-19, VP-28 , dan VP-35 (Seo k

  Gen penyandi viral prot ein 15 (VP-15) Whit e Spot Syndrome Virus ..... (Andi Parenrengi)

  unt uk menget ahui perbedaan ant ara perlakuan vaksin dengan ko nt ro l. Dat a hasil iso lasi, pro d uksi vaksin reko mbinan dsRNA, dan pensejajaran sekuens

  h a r i d a n a n a lis is h is t o p a t o lo g i ja r in g a n hepat o pankreas dilakukan pada akhir penelit ian.

  Analisis Dat a

  Analisis sekuens menggunakan pro gram GENETYX versi 7 unt uk mendapat kan ko nsensus. Pensejajaran (

  alignment

  ) nu kleo t ida h asil p en gklo nan dilaku kan den gan se kuens VP-15 yang t ersimpan d i GenBank d e n gan m e n ggu n akan p ro gram BLAST-N d i NCBI. Sint asan udang set elah uji t ant ang dianalisis dengan

  t -t est

  VP-1 5 , se rt a h ist o p at o lo gi h e pat o p an kre as u dan g windu disajikan secara deskript if.

  Ha s il p e n e lit ia n in i m e n u n ju k k a n b a h w a pengklonan gen VP-15 dapat dilakukan di vekt or TOPO TA Clo ning Kit. Keberhasilan pengklo nan gen VP-WSSV pada vekt o r yang sama juga t elah dilapo rkan unt uk

  HASIL DAN BAHASAN Isolasi dan Pengklonan Gen Pengkode VP-15 W SSV

  Hasil ekst raksi geno mik DNA dari daging udang win d u yang p o sit if t e rin feksi WSSV m en u nju kkan t ingkat kemurnian sebesar 1,87 yang dianggap cukup sesuai unt uk amplifikasi DNA (Linacero et al ., 1998). Hasil iso lasi ge n p e n yan d i VP-1 5 dit and ai d e n gan fragm en t unggal DNA pada po sisi berat mo le kuler se besar 2 53 bp (Gam bar 1). Be rdasarkan ind ikat o r kemurnian DNA, dan ket epat an amplifikasi fragmen tunggal yang terbentuk, maka satu sampel dipilih untuk s e la n ju t n ya d ig u n a k a n u n t u k k e p e r lu a n pengklo ningan.

  Se t elah m elalu i p ro se s p e n gklo n in gan , se le ksi kolo ni bakt eri ko mpeten ber warna put ih yang tumbuh d ila k u k a n d e n g a n a s u m s i b a h w a k o lo n i p u t ih membawa DNA sisipan dari gen t arget . Hal t ersebut t e r ja d i k a r e n a b a k t e r i h a s il t r a n s fo r m a s i t e la h dit umbuhkan pada media LB padat yang mengandung ant ibio t ik, IPTG (

  isopropil t iogalakt osidase

  ), dan X-gal (5-bro mo -4-klo ro -3-indo lil-

  β

  β

  . Co p yright @ 201 8, Jurn al Rise t Akuakult ur, p -ISSN 19 07-6754 ; e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 13 (1), 2018, 57-65

  mengungkapkan bahwa gen VP-15 t ersusun dari 80 asam amino , t erdapat dua ko do n awal, sat u ko do n akhir, sat u

  KT957056.1, KU216744.1, AJ937742.1, KT957059.1, KT957058.1, dan AY713371.1), India (DQ681072.1), Ko re a (JX5 1 5 7 8 8 .1 d an AY3 7 4 1 2 0 .1 ), d an Me s ir (KR083866.1). Hasil ini mengindikasikan bahwa iso lat WSSV ya n g m e n g in fe k s i u d a n g win d u m e m ilik i kekerabat an (filo genet ik) yang relat if dekat dengan iso lat dari beberapa negara sepert i Asia dan Amerika Lat in. Hidayani

  

Figure 3. ORF sequences of a gene encoding VP-15 isolat ed from t iger shrimp (Start codon=

underlined let t ers, st op codon= it alic let t ers, A= adenine, C= cyt osine, G= gua- nine, T= t hymine) .

  Gambar 3. Sekuens ORF gen pengko de VP-15 WSSV yang diso lasi dari udang windu (Ko do n awal= garis bawah, ko ndo n akhir= huruf miring, A= adenina, C= sit o sina, G= guanina, T= t imina).

  500 bp 300 bp 200 bp M 1 2 3 4 NC

  

Figure 2. DNA fragment of a gene encoding VP-15 insert ed in plas-

mid of recombinant bact eria (M = DNA marker and 1-4= samples of colonies bact eria) .

  VP-19 WSSV iso lat Sit ubo ndo dengan iso lat Indo ne- sia lainnya maupun dari negara-negara lain mencapai 98% (Alim et al ., 2011). Gambar 2. Fragm en DNA d e n gan sisip an ge n p e n gko d e VP-1 5 dalam plasmid bakt eri reko mbinan (M= marker DNA dan 1-4= sampel ko lo ni bakt eri).

  . (2016) juga melapo rkan bahwa iso lat WSSV (VP-19) yang menginfeksi udang vaname di Indo nesia memiliki kerabat an yang dekat dengan iso lat WSSV dari Meksiko . Kemirip an sekuen s gen

  et al

  ) menunjukkan bahwa OFR gen VP-15 pada penelit ian ini memiliki t ingkat kemiripan sampai dengan 99% dengan iso lat WSSV dari Cin a (KY8 27 81 3.1, KT9 95 47 2.1, KT9 95 47 1.1, KT9 9 5 4 7 0 . 1 , AF3 3 2 0 9 3 . 3 , AF2 2 7 9 1 0 . 1 , d a n AY2 49 44 9.1), Me ksiko (KT95 70 60 .1 , KT95 70 57 .1 .

  Kozak cont ext

  ht t ps://blast .ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi?PAGE_TYPE= Blast Search

  di websit e

  online

  Hasil analisis dengan menggunakan Blast -N (diakses secara

  et al . (2002).

  , sert a kaya dengan asam amino lisina (21,3%), a rg in in a (2 2 ,9 %), d a n s e r in a (2 4 ,6 %). Se lain it u , karakt erisasi gen VP-15 juga t elah dilapo rkan o leh Van- Hult en

  N-t erminal sequence

  (AAAATGG) dan

  

ATG ACA AAA TAC CCC GAG AAC AAA AGA TTG TTG TCT AGG AAC AAA

GAA ACA TTA AAA ATG GTT GCC CGA AGC TCC AAG ACC AAA TCC CGC

CGT GGA AGC AAG AAG AGG TCC ACC ACT GCT GGA CGC ATC TCC AAG

CGG AGG AGC CCA TCA ATG AAG AAG CGT GCA GGA AAG AAG AGC TCC

ACT GTC CGT CGC CGC TCC TCA AAG AGC GGA AAG AAG TCT GGA GCC

CGC AAG TCA AGG CGT TAA

  Gen penyandi viral prot ein 15 (VP-15) Whit e Spot Syndrome Virus ..... (Andi Parenrengi) Aplikasi Vaksin Rekombinan dsRNA VP-15

  60

  ., 2012). Udang

  L. vannamei

  yang diinjeksi dengan plasmid yang mengandung VP-28, VP-39, dan wsv-477 mem perlihat kan sint asan masing-masing 50 %, 6 0%,

  Gambar 4. Sint asan kumulat if udang windu

  Penaeus monodon

  yang diuji t ant ang dengan WSSV.

  

Figure 4. Cum ul at i ve sur vival r at e of t ig er shr i m p Pena eus monodon

challenged wit h WSSV.

  20

  40

  80 100

  m e n in gkat kan sin t asan 1 0 0 % m e lawan IHNV (Lo y

  I II

  III

  IV V

  S in ta sa n ( S u rv iv a l ra te ) (% )

  Hari se t elah uji t ant ang (hari)

  Day aft er chalenge (day)

  Ko nt rol/Cont rol Vaksin VP-15/VP-15 vaccine

  Ko n t ro l (

  Cont rol

  ) Vaksin VP-1 5 (

  et al

  dengan dosis 2,0 µg pada udang L. vannamei dapat

  Vaksin reko mbinan VP-15 t elah berhasil dipro duksi secara in-vit r o me n ggu nakan kit MEGAscrip t RNAi dengan t ingkat kemurnian yang sangat t inggi yakni

  . (2 0 1 3 ) yan g menyeb ut kan bahwa gen VP-15 memiliki ho mo lo gi yang tinggi dengan prot ein-prot ein hist on; oleh karena it u, pro t e in in i d ipe rkirakan me miliki p eran dalam pengikat DNA WSSV, membent uk poro s nukleo pro t ein (

  1,87 dengan konsentrasi 23.200 µg/mL. Linacero et al

  . (1998) mereko mendasikan t ingkat kemurnian DNA unt uk kep erluan analisis mo lekuler adalah 1,8-2 ,0. Ke b e r h a s ila n p r o d u k s i t e r s e b u t d ive r ifik a s i keberadaan fragmen gen VP-15 yang telah dikonstruksi dengan pro m o t er T7 melalu i t ekn ik elekt ro fo re sis. Hal yang sama juga dilapo rkan o leh Wulandari (2010) bahwa pro duksi dsRNA dari gen

  gonad inhibit ing hor- mone (GIH) d ap at d ilakukan secara in-vit ro d en gan

  menggunakan kit MEGAscript RNAi. Hasil ko nst ruksi pro mo t er dan gen VP-15 (T7-VP-15) dijadikan sebagai bahan vaksin reko mbinan yang diinjeksikan ke udang w in d u s e b e lu m d ila k u k a n u ji t a n t a n g . Ha s il p e n g am a t a n s in t a sa n h e w a n u ji p a s ca -va k sin as i menunjukkan adanya kemat ian yang t idak berart i (1-2 e ko r), b aik p ad a p e rlaku an d en gan vaksin dsRNA m au p u n p ad a in je ksi laru t an fisio lo gis (ko n t r o l), kemat ian diduga bukan karena vaksin dsRNA t et api hanya karena pengaruh adanya t ekanan penanganan injeksi

  int ra-muscular .

  Pengamatan t erhadap sintasan udang windu setelah uji t ant ang sampai dengan hari ke-5 memperlihat kan bahwa vaksin reko mbinan VP-15 menghasilkan 40,0% at au mamp u m en in gkat kan sint asan u d an g wind u hingga 36,7% dibandingkan dengan t anpa penggunaan vaksin at au ko nt ro l hanya sebesar 3,3% (Gambar 4) at au set ara dengan nilai RPS (

  relat ive percent age sur- vival ) sebesar 37,9%. Hasil analisis t -t est menunjukkan

  b a h w a sin t as an u d a n g yan g d ib e ri vak sin VP-1 5 berbeda nyat a dengan ko nt ro l (P< 0,05).

  Tin gginya sint asan u dang win du yang divaksin dibandingkan dengan yang t idak divaksin menunjukkan b a h w a VP-1 5 d id u g a m e m b e r ika n p e rlin d u n g a n t erh adap in fe ksi WSSV. Pe nd ap at t erse bu t se jalan d e n gan p e n yat aan Un d e r wo o d

  et al

  nucleoprot ein core

  ., 2004a). Penggunaan vaksin dsRNA

  ) dan berperan dalam infeksi sistemik pada udang, dan dapat menstimulasi munculnya sist em kekebalan pada udang windu. Nilai RPS pada penelitian ini relat if sama dengan hasil penelit ian Wit t eveldt

  et al

  . (2004b) pada udang windu dengan menggunakan vaksin VP-28 dan campuran VP-28+ VP-19 dengan nilai masing-masing adalah 44% dan 33% pada pengamat an uji t ant ang pada hari ke-2 set elah vaksinasi. Namiko shi

  et al

  . (2004) melapo rkan bahwa aplikasi vaksin VP-26 dan VP-28 pada udang P. j aponicus dapat meningkat kan resistensinya dengan nilai RPS masing-masing 80% dan 9 5 %, s e d a n g k a n a p lik a s i d s RNA VP-2 8 p a d a

  M acrobrachium rosenbergii menghasilkan RPS sebesar

  4 4 ,5 % t e r h a d a p WSSV (Ja riya p o n g

  et al ., 2 0 1 5 ).

  Vaksin asi melalui pakan pada udang windu dengan m e n ggu n akan VP-1 9 d ap at m e n in gkat an sin t asan dengan nilai RPS sebesar 77% pada hari ke-7 dan 29% p ad a hari ke-21 set elah uji t ant an g de ngan WSSV (Wit t eveldt

  et al

  VP-15 vaccine )

KESIM PULAN

  unt uk menginduksi po t ensi respo ns ant ivirus secara

  B A C

  

Figure 5. Histopathology profile of tiger shrimp challenged with WSSV (bar scale= 20 µm; A=

negat ive cont rol; B= shrimp wit h vaccine; and C= shrimp wit hout vaccine, and black arrow indicat es normal cell and red arrow indicat es lysis cell) .

  vaksin; dan t anda panah hit am menunjukkan int i sel no rmal, dan t anda panah merah menunjukkan lisis int i sel).

  (skala bar= 20 µm; A= kontrol negatif; B= udang dengan vaksin; C= udang tanpa

  Gambar 5. Gambaran hist o pat o lo gi hepat opankreas udang windu yang dit ant ang dengan WSSV

  Penelit ian ini t erlaksana at as dukungan anggaran APBN-2016 dari DIPA Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau d an Pen yu luh an Perikan an . Terim a kasih disampaikan kepada Ibu Dr. Hessy No vit a dan Bapak Jo han Effendi at as pendampingannya selama pro ses p e n g k lo n a n ge n , d a n u ca p a n t e r im a k as ih ju g a disampaikan kepada penelit i dan teknisi lit kayasa dan non-litkayasa BRPBAPPP, Maros at as bantuannya dalam penelit ian ini.

  UCAPAN TERIM A KASIH

  le bih t in ggi m en cap ai 36 ,7 % dib an din gkan de ngan t idak menggunakan vaksin. Ke depan, nampaknya ada peluang dan pot ensi besar untuk menghasilkan vaksin reko mbinan dari gen VP-15 dalam upaya mencegah t erjadinya infeksi WSSV pada budidaya udang windu.

  0,2 µg memperlihatkan sintasan udang windu yang

  Ge n p e n ya n d i VP-1 5 b e r h a s il d ik lo n in g d a n m e n gh a silk an vaksin r e ko m b in a n se cara in-vi t r o . An alisis n ukleo t ida VP-1 5 me nu njukkan kem irip an yang t inggi (99%) dengan sekuens nukleo t ida VP-15 pada GenBank. Penggunaan vaksin reko mbinan do sis

  15. Kerusakan jaringan hepat o pankreas udang windu akibat ad an ya in fe ksi WSSV t elah dilapo rkan o le h Firmansyah (2002) dan Rahmawati (2002) yang dit andai adanya badan inklusi yang sent ro nuklear, eo sino filik, dan t e rpisah dari me mbran sel, kem udian b enan g- benang kro mat in menepi.

  Dukungan hist o pat o lo gi dilakukan pada jaringan hepat o pankreas unt uk menget ahui hubungan ant ara k e r u sa k a n ja r in g a n a k ib a t in fe k si vir u s d e n g a n rendahnya sint asan udang windu yang t idak divaksin. Pen gamat an hist o p at o lo gi ud an g uji pada aplikasi va k s in VP-1 5 m e n u n ju k k a n b a h w a ja r in g a n h e p a t o p an k re a s u d a n g t an p a vak s in m e n ga lam i abno rmalitas bila dibandingkan dengan ko nt ro l negat if d a n u d an g ya n g d ib e ri vak sin (Ga m b ar 5 ). Has il penelit ian ini menunjukkan bahwa hepat o pan kreas u d a n g w in d u t a n p a va k s in m e n g a la m i t in g k a t kerusakan int i sel yang lebih akut o leh adanya infeksi WSSV dibandingkan udang yang divaksin dengan VP-

  in-vivo .

  Co p yright @ 201 8, Jurn al Rise t Akuakult ur, p -ISSN 19 07-6754 ; e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 13 (1), 2018, 57-65

  dan 90% dibandingkan dengan ko nt ro l (0%) pada hari ke-9 set elah dit ant ang dengan WSSV (Akhila

  ) t et api juga melalui mekanisme

  innat e immune

  . (2 00 5), m e ngu ngkap kan bahwa imun antivirus yang diberi dsRNA akan melawan infeksi virus t idak hanya pada jalur imun alami (

  et al

  (s iRNA) sehingga memicu t erjadinya RNAi pada sel t arget , (b) siRNA akan berikat an dengan ko mpleks pro t ein RISC ( RNA-induced silencing complex ) yan g akan me mandu m e n g e n a l m RNA ya n g b e r is i s e k u e n s h o m o lo g sehingga dapat berko mplemen, selanjutnya mRNA akan t erd e gre d asi, d an (c) e ksp re si gen se cara spe sifik me njad i in -akt if pada t ahap po st -t ranskripsi. Hasil p en elit ian Ro balin o

  sm al l i nt er f er i ng RNA

  t ranskripsi dan t ranslasi pro t ein, t et api melalui beberapa pro ses, ant ara lain: (a) pemo t o ngan unt ai ganda o leh enzim RNAs e -III m e n ja d i

  shut down

  . (2014) dan Mo cellin & Pro venzano (2004) me nyat akan bahwa mekan isme pe rlin dun gan yang t erjadi pada saat dsRNA diinjeksi ke dalam sel t arget , t idak secara langsung memicu

  et al

  Hasil penelit ian ini menunjukkan adanya induksi resit ensi udang windu set elah diinjeksi dengan vaksin re ko m b in an (d sRNA) yan g d id u g a ak ib a t ad an ya mekanisme penghambat an (int erferensi) infeksi virus. Reshi

  ., 2015). Peningkat an resist ensi udang windu t erhadap WSSV d e n ga n t e k n o lo g i t ra n sg e n e sis ju g a t e lah dilapo rkan o leh Parenrengi (2010) dengan sint asan 24,5% lebih t inggi dibandingkan dengan ko nt ro l.

  et al

  RNAi-like

  Gen penyandi viral prot ein 15 (VP-15) Whit e Spot Syndrome Virus ..... (Andi Parenrengi) DAFTAR ACUAN

  Peningkat an r esist ensi udang windu Penaeus monodon t erhadap penyakit whit e spot syndr ome virus melalui t r ansfer gen Penaeus monodon ant iviral . Disert asi. Seko lah Pascasarjana, Inst it ut Pert anian Bo go r. Bo go r, 108 hlm.

  Lo y, J.D., Mo gler, M.A., Lo y, S.S., Janke, B., Kamrud, K., Scura, E.D., Harris, D.L.H., & Bart ho lo may, L.C.

  (2012). dsRNA pro vides sequence-dependent pro - t e ct io n against infe ct io us myo necro sis virus in

  Lit openaeus vannamei .

  Journal of General Virology

  , 93, 880-888. Mo cellin, S. & Pro venzano , M. (2004). RNA int erfer- ence: learning gene kno ck-do wn fro m cell physi- o lo gy.

  Journal of Translat ional M edicine , 2(39), 6.

  Mukhlis, A. (2010).

  Pengklonan gen VP28 penyandi vi- ral prot ein-28 dari virus whit e spot syndrome sebagai langkah aw al pr oduksi vaksin r ekombinan udang penaei d

  . Te s is . Se ko lah Pas ca sa rjan a, In s t it u t Pert anian Bo go r. Bo go r, 80 hlm. Namiko shi, A., Wu, J.L., Yamashit a, T., Nishizawa, T., Nishio ka, T., Arimo t o , M., & Muro ga, K. (2004).

  Vaccinat io n t rials wit h Penaeus j aponicas t o induce resist en ce t o

  whit e spot syndrome virus .

  Aquacul- t ure

  , 229(1), 25-35. Pare nre ngi, A. (2 0 10 ).

  Parenrengi, A., Alimuddin, & Tenriulo , A. (2017). Char- act erist ic o f a viral pro t ein (VP-15) o f

  Linacero , R., Rueda, J.,&Vazquez, A.M. (1998). Quan- t ificat io n o f DNA. In Mo lecular t o o ls fo r screen- ing bio diversit y: plant s and animals (p.18-21). Lon- do n, Weinheim, New Yo rk, To kyo , Melbo urne, Ma- dras: Chapman and Hall. Liu, W.J., Yu, H.T., Peng, S.E., Chang, Y.S., Pien, H.W.,

  whit e spot syndrome virus

  iso lat ed fro m infect ed t iger shrimp

  Penaeus monodon .

  Indonesian Aquacult ure Journal

  , 12(2), 67-75 Rahmawat i, R. (2002).

  Uj i pat ogenit as whit e spot syn- drome virus (WSSV) . pada udang windu (Penaeus monodon

   Fabr.) melalui met ode perendaman dengan konsentrasi 200 µg/mL selama 30, 60, dan 90 menit .

  Skrip si. Faku lt as Pe rikanan dan Ilm u Ke laut an , Inst it ut Pert anian Bo go r. Bo go r, 80 hlm. Reshi, M.L., Wu, J.L., Wang, H.V.,& Ho ng, J.R. (2014).

  RNA int erference t echno lo gy used fo r t he st udy o f aquat ic virus infect io ns.

   Fish & Shellfish Immu- nology

  , 40, 14-23. Ro balino , J., Bro wdy, C.L., Prio r, S., Met z, A., Parnell,

  P., Gro ss. P., & Warr, G. (2004). Induct io n o f ant i- viral immunit y by do uble-st randed RNA in a ma- rine invertebrat a.

   Journal of Virology

  , 78(19), 10442- 10448. Ro b a lin o , J., Ba r t le t t , T. , Sh e p a rd , E., Pr io r, S.,

  Lin, C.J., Huang, C.J., Tsai, M.F., Huang, C.J., Wang, C.H., Lin, J.Y., Lo , C.F., & Ko u, G.H. (2001). Clo n- ing, charact erizat io n, and phylo genet ic analysis o f a shrimp wh it e spo t syndro me viru s gene t h at enco des a pro t ein kinase. Virology , 289, 362-377.

  Aquacult ure , 237, 21-30.

  Akhila, D.S., Mani, M.K., Rai, P., Co ndo n, K., Owens, L., & Karunasagar, I. (2015). Ant isense RNA medi- at e d pro t ect io n fro m

  A. (2016). Iso lat io n and charact erizat io n o f an en- velo pe pro t ein (VP19) o f a Whit e Spot Syndrome

  w hit e spot syndrome virus

  (WSSV) in fe c t io n in Pa c ific w h it e s h r im p

  Lit openaeus vannamei .

  Aquacult ure , 435, 306-309.

  Alim , S. , Wa h yu n in g r u m , D., & Ali, M. (2 0 1 1 ).

  Pengklo nan dan pengurutan gen penyandi prot ein permukaan VP19 WSSV iso lat Sit ubo ndo .

  Jur nal Akuakult ur Indonesia

  , 10(2), 154-164. Ch o t ige a t , W., To n g s u p a , S., Su p a m a t a ya , K., &

  Ph o n gd ara, A. (2 0 0 4 ). Effe ct o f fu co sid an o n desease resist ance o f black t iger shrimp.

   Aquacul- t ure

  , 223, 23-30. Firmansyah, A. (2002).

  Uj i pat ogenit as whit e spot syn- dr ome vir us (W SSV) pada udang windu (Penaeus monodon Fabr.)

  . Skripsi. Fakult as Perikan an d an Ilmu Kelaut an, Inst it ut Pert anian Bo go r. Bo go r, 88 hlm.

  Hidayan i, A.A., Tassakka, A.C.M.A.R., & Pare nrengi,

  Vi r us

  & Kim, J.W. (2004). Shrimp pro t ect ed fro m WSSV dise ase by t reat m ent wit h egg yo lk ant ibo dies (IgY) against a t runcat ed fusio n pro t ein derivat ed fro m WSSV.

  fr o m d is e a s e d va n n a m e i (

  Li t op en aeu s vannamei

  ) in Indo nesia.

  AACL Bioflux,

  9(2), 3 89- 395. Ho we, C. (2 00 7 ). Ge ne clo n in g and man ip ulat io n .

  Second edit io n. United Kingdo m: Cambrridge Uni- versit y Press, 266 pp. Ja r iya p o n g , P. , Ch o t w iw a t t h a n a k u n ,

  C. , Dir e k b u s a r a k o m , S. , Hir o n o , I. , Wut hisut himet havee, S., & Weerachat yanukul, W.

  (2 0 1 5 ). De live r y o f d o u b le s t r a n d e d RNA b y

  M acrobrachium rosenbergii

  no davirus-like part icles t o pro t ect shrimp fro m

  whit e spot syndrome virus . Aquacult ure , 435, 86-91.

  Jha, R.K. & Xu, Z. (2005). Pro duct io n o f reco mbinant envelo ped st ru ct ural pro t eins fro m t he ch inese wssv iso lat e.

  Indian Journal of Clinical Biochemist r y

  , 20(2), 136-141. Kim, D.K., Jang, I.K., Seo , H.C., Shin, S.O., Yang, S.Y.,

  Jaramillo , G., Scura, E., Chapman, R.W., Gro ss, P.S., & Warr, G.W. (2005). Do uble-stranded RNA induces Co p yright @ 201 8, Jurn al Rise t Akuakult ur, p -ISSN 19 07-6754 ; e-ISSN 25 02-6534 Jurnal Riset Akuakult ur, 13 (1), 2018, 57-65

  seq uence-specific ant iviral silencing in addit io n t o no nspecific immunit y in a marine shrimp: co n- ve r g e n ce o f RNA in t e r fe r e n c e a n d in n a t e immunit yin t he invert ebrat e ant iviral respo nse?.

  M.C.W. (2004a). Pro t ect io ns o f

  Cana- dian Journal M icrobiology

  . Te sis. Pro g ram St u d i Magis t e r Bio t ekno lo gi, Inst it ut Tekno lo gi Bandung. Xing, Y. & Shi, Z. (2011). Nucleo capsid pro t ein VP15 o f whit e spot syndrome virus co lo calizes wit h t he nucleo lar pro t eins nucleo lin and fibrillarin.

  gonad-inhibit ing hor mone udang windu (Penaeus monodon ) secara in vit ro dan in vivo pada vekt or ekspresi L4 440

  Wulandari, A.S. (2010). Konst ruksi dan produksi dsRNA

  Fish & Shellfish Immunology , 16, 571-579.

  using a WSSV sub unit vaccine.

  whit e spot syndrome virus

  against

  Penaeus monodon