Uji Aktivitas Antioksidan dan Toksisitas Serta Antimikroba Dari Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq) Pohon Glodokan (Polyalthia longifolia) Chapter III V
BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1.
Peralatan
-
Peralatan Gelas Pyrex
-
Botol vial
-
Blender
-
Kertas Saring Whatman
-
Plat tetes
-
Hot Plate
-
Pisau
-
Penangas Air
-
Spektrofotometer UV Visibel Simadzu 1800
-
Lampu
-
Rotary Evaporator
-
Wadah Air Laut Buatan
-
Rak Tabung Reaksi
-
Statif dan Klem
-
Karet Penghisap
-
Bunsen
-
Mikro pipet
-
Aluminium Foil
-
Jangka Sorong
-
Autoklaf
-
Inkubator
-
Jarum Ose
-
Neraca Analitik
-
Spatula
-
Thermometer
Universitas Sumatera Utara
3.2
Bahan
-
Daun benalu pohon glodokan
-
Metanol p.a Merck
-
DPPH Sigma Aldrich
-
Vitamin C p.a Merck
-
Metanol Teknis Brataco
-
N Hexana Teknis
-
Etil Asetat Teknis
-
Pereaksi Mayer
-
Pereaksi Dragondorf
-
Pereaksi Wagner/Bouchardat
-
Aquadest
-
FeCl3 p.a Merck
-
DMSO p.a Merck
-
Kista Artemia salina
-
Aquadest
-
Garam Laut Kemasan
-
Mueller Hinton Agar
-
Nutrien Agar
-
Nutrien Broth
-
Kultur E. coli
-
Kultur S. mutans
-
Kultur C.albicans
3.3
Prosedur Penelitian
3.3.1
Preparasi Sampel
Dikumpulkan daun benalu berasal dari pohon glodokan yang tumbuh di sekitar
Perpustakaan USU secara purposif (tidak membandingkan dengan daerah lain)
sebagai sampel. Daun benalu dibersihkan dan ditimbang serta di kering-
Universitas Sumatera Utara
anginkan.Sampel yang sudah kering dihaluskan menggunakan blender.Kemudian
sebanyak 200 g serbuk daun benalu dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer
ditambahkan dengan 1 L metanol. Dimaserasi selama 1x24 jam pada suhu kamar.
Selanjutnya diambil maserat kemudian ditambahkan metanol kembali pada ekstrak
daun benalu sampai pelarut berwarna bening kemudian dikumpulkan maserat yang
telah disaring, diuapkan dengan Rotary Evaporator pada keadaan vakum sampai
diperoleh ekstrak kental.Ekstrak kental diuapkan sampai pelarut menguap sempurna
dan diperoleh ekstrak pekat metanol daun benalu. (Depkes RI, 2000). Selanjutnya
ekstrak pekat daun benalu dilarutkan dengan etil asetat disaring kemudian filtrat
diuapkan kembali sampai pelarut menguap sempurna sehingga diperoleh ekstrak etil
asetat daun benalu yang kemudian dilarutkan kembali dengan metanol sampai larut
sempurna dan di partisi dengan n-heksana terbentuk dua lapisan, diambil lapisan
bawah dan diuapkan sampai diperoleh flavonoid total.
3.3.2
Preparasi Larutan
3.3.2.1 Preparasi FeCl3 1%
Sebanyak 1 gram FeCl3 dimasukkan kedalam labu takar 100 mL kemudian
diencerkan dengan aquadest sampai garis tanda dan di homogenkan.
3.3.2.2 Preparasi DPPH 0,5mM
3.3.2.2.1Preparasi DPPH 0,5mM 200 ppm
Sebanyak 9,858 mg DPPHdimasukkan kedalam labu takar 50 mL kemudian
diencerkan dengan metanol sampai garis tanda dan di homogenkan diperoleh larutan
DPPH 200 ppm.(Mariani S, 2015)
3.3.2.2.2 Preparasi DPPH 0,5mM 40 ppm
Dipipet 10 mL larutan DPPH 0,5 mM 200 ppm diencerkan dengan metanol pada labu
takar 50 mL sampai garis tanda kemudian dihomogenkan diperoleh larutan DPPH 40
ppm. (Mariani S, 2015)
Universitas Sumatera Utara
3.3.3
Uji Fitokimia
3.3.3.1 Preparasi Sampel Daun Benalu Segar
Diambil ± 100 gram daun benalu segar, dibersihkan, di potong kecil dan dimasukkan
ke dalam gelas Erlenmeyer kemudian di tambahkan metanol ± 100 mL dipanaskan
dengan penangas air sampai diperoleh ekstrak metanol kemudian didinginkan dan
diambil filtratnya.
3.3.3.2 Uji Alkaloid
Sebanyak ± 5 tetes filtrat ekstrak metanol daun benalu masing-masing diteteskan
pada tiga tabung reaksi. Tabung reaksi pertama ditetesi 2 tetes pereaksi Mayer (positif
jika membentuk endapan putih atau keruh), Tabung reaksi kedua ditetesi 2 tetes
pereaksi Dragendorf (positif jika membentuk endapan jingga) dan tabung reaksi
ketiga ditetesi 2 tetes pereaksi Wagner/Bouchardat (positif jika membentuk endapan
merah kecoklatan) . Diamati perubahan yang terjadi. (Harborne, 1987)
3.3.3.3 Uji Fenolik
Sebanyak ± 5 tetes filtrat ekstrak metanol daun benalu diteteskan pada sebuah tabung
reaksi kemudian ditambah masing-masing dengan 3 tetes larutan FeCl3 1% (positif
jika membentuk coklat kehitaman).Diamati perubahan yang terjadi. (Harborne, 1987)
3.3.3.4 Uji Flavonoid
Sebanyak ± 5 tetes filtrat ekstrak metanol daun benalu diteteskan pada sebuah tabung
reaksi dengan ± 3 tetes etil asetat ditambah 2 tetes FeCl3 1% sehingga terbentuk
warna hijau sampai coklat kehitaman (positif membentuk warna hijau sampai coklat
kehitaman). Diamati perubahan warna yang terjadi. (Harborne, 1987)
3.3.3.4
Uji Terpenoid dan Steroid
Universitas Sumatera Utara
3.3.3.4.1 Uji Lieberman Bouchard
Sebanyak ± 20 mL ekstrak metanol daun benalu dimasukkan ke dalam gelas beaker
kemudian diuapkan sampai pelarut habis kemudian didinginkan kemudian ditetesi ± 5
tetes asetat anhidrat dan ± 5 tetes asam sulfat pekat (positif terpenoid jika terbentuk
warna merah kecoklatan sampai violet dan positif steroid jika terbentuk warna hijau
sampai biru). Diamati perubahan yang terjadi. (Harborne, 1987)
3.3.3.4.2 Uji Plat Tipis
Sebanyak ± 3 mL ekstrak metanol daun benalu ditetesi pada plat tipis dipanaskan
pada hotplate di tetesi ± 2 tetes Carik sulfat pekat (positif terpenoid jika terbentuk
warna kemerahan). (Harborne, 1987)
3.3.3.5.
Uji Saponin
Sebanyak ± 5 tetes ekstrak metanol daun benalu dimasukkan pada sebuah tabung
reaksi kemudian dengan 20 mL aquadest.Filtrat didinginkan kemudian diguncang
kuat selama 10 detik dan didiamkan selama 10 menit (positif jika terbentuk
busa).Diamati perubahan yang terjadi. (Harborne, 1987)
3.3.4
Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH
3.3.4.1
Penentuan Panjang Gelombang Maksimum dengan Spektrofotometer
UV Visibel
0,5 mM DPPH 40 ppm di masukkan ke dalam kuvet kemudian diukur panjang
gelombang maksimum menggunakan Spektrofotometer UV Visibel. Disimpan hasil
yang diperoleh. (Mariani S, 2015)
3.3.4.2
Pembuatan Larutan Uji dan Blanko dengan Spektrofotometer UV
Visibel
Ditimbang 10 mg ekstrak flavonoid total daun benalu pohon glodokan dilarutkan ke
dalam 10 mL metanol untuk memperoleh 1000 mg/L ekstrak. Dari 1000 mg/L larutan
ekstrak dibuat variasi konsentrasi 20, 40, 60, 80 dan 100 mg/L. Untuk Blanko Negatif
Universitas Sumatera Utara
adalah 0,5 mM DPPH 200 ppm dan untuk blanko positif adalah vitamin C dengan
konsentrasi 10,20,30 dan 40 mg/L. (Mariani S, 2015)
3.3.4.3 Uji Aktivitas Antioksidan Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan dengan Spektrofotometer UV
Visibel
Masing-masing larutan blanko dan sampel ditambahkan dengan 2 mL larutan
0.5
mM DPPH 200 ppm, di goyang perlahan sampai homogen kemudian diinkubasi
selama 30 menit. Diukur absorbansinya pada λ maksimum 516 nm menggunakan
Spektrofotometer UV Visibel.Disimpan hasil yang diperoleh.Dilakukan dua kali
pengulangan. (Mariani S, 2015)
3.3.5
Uji ToksisitasFlavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda
(L.) Miq) Pohon Glodokandengan Metode Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT)
3.3.5.1 Persiapan Larva Udang
Larutan induk wadah disekat dua bagian, diisi dengan 38 g garam laut dilarutkan
dalam 1 L aquadest diperoleh air laut buatan. Sebanyak 20 mg telur Artemia salina
dimasukkan pada bagian sekat yang tertutup dan sekat yang satu dibiarkan terbuka,
kemudian diberi lampu diatas bagian yang terbuka untuk menarik udang Artemia
salina menuju bagian yangterkena cahaya lampu sehingga terpisah dari cangkangnya.
Telur-telur dari Artemia salina akan menetas menjadi larva dalam waktu 24-48 jam
dan digunakan uji toksisitas dari flavonoid total daun benalu. Dibuat larutan induk
dengan 100 mg flavonoid total daun benalu ditambah 3 tetes Dimetil sulfoksida
(DMSO), dilarutkan sampai 10 mL dengan air laut buatan diperoleh konsentrasi
larutan induk yaitu 10.000 mg/L kemudian diencerkan menjadi 3 konsentrasi yaitu
10,100 dan 1000 ppm. Konsentrasi 0 ppm sebagai kontrol negatif dan positif dengan
penambahan DMSO. (Mc. Laughlin, 1998)
3.3.5.2 Uji Toksisitas Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda
(L.) Miq) Pohon Glodokan dengan BSLT Selama 24 Jam
Universitas Sumatera Utara
Sebanyak 10 ekor larva dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi yang
telah diisi 5 mL larutan ekstrak pekat daun benalu dengan konsentrasi masing-masing
1000,100 dan 10 ppm. Setelah 24 jam, diamati jumlah larva yang mati untuk tiap-tiap
konsentrasi.
3.3.6
Uji Antimikroba Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan
3.3.6.1
Pembuatan Media
3.3.6.1.1 Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)
Ditimbang sebanyak 23 g Nutrien agar kemudian dimasukkan ke dalam gelas
Erlenmeyer kemudian disuspensi dengan aquadest hingga 1000 mL kemudian
dipanaskan hingga mendidih sambil diaduk kemudian disterilkan dengan autoklaf
pada suhu 121 0 C selama 15 menit. (Difco, 1997)
3.3.6.1.2 Pembuatan Media Nutrient Broth (NB)
Ditimbang sebanyak 4 g Nutrien Broth dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer
kemudian disuspensi dengan aquadest hingga 1000 mL kemudian dipanaskan hingga
mendidih sambil diaduk kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121
0
C
selama 15 menit. (Difco,1997)
3.3.6.1.3 Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Ditimbang sebanyak 38 g serbuk MHA kemudian dimasukkan ke dalam gelas
Erlenmeyer kemudian disuspensi dengan aquadest hingga 1000 mL kemudian
dipanaskan hingga mendidih sambil diaduk sampai bahan larut sempurna. Ditutup
gelas Erlenmeyer dengan kapas dan di seal kemudian disterilkan di autoklaf pada 121
0
C selama 15 menit. (Difco, 1997)
3.3.6.2
Pembuatan Stok Kultur
Universitas Sumatera Utara
Biakan mikroba Streptococcus mutans dari strain utama diambil dengan jarum ose
steril kemudian diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring dengan
cara menggores kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 350 C selama 1824 jam (Ditjen POM, 1995). Dilakukan hal sama dengan E. coli dan C. albicans.
3.3.6.3 Penyiapan Inokulum Bakteri
Koloni mikroba Streptococcus mutans diambil dari stok kultur menggunakan jarum
ose steril kemudian disuspensi ke dalam 10 mL media nutrient broth steril lalu
diinkubasi pada suhu 35 ± 2
0
C sampai diperoleh kekeruhan dengan transmitan
dengan alat spektrofotometer UV panjang gelombang 580 nm (Ditjen POM, 1995).
Dilakukan hal yang sama pada Escherichia coli dan Candida albicans
3.3.6.4 Pembuatan Larutan Uji
Disiapkan tiga tabung reaksi untuk persiapan konsentrasi larutan uji 3%, 6% dan 9%
dengan penambahan 60 µL ekstrak pekat ke dalam 2000 µL , 120 µL ekstrak pekat
ke dalam 2000 µL dan 180 µL ekstrak pekat ke dalam 2000 µL larutan DMSO.
3.3.6.5 Pengujian Aktivitas Antimikroba Flavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan dengan Metode
Difusi Agar
Disiapkan
10 mL larutan Mc. Farland (10
8
CFU/mL) kemudian diambil
Streptococcus mutans dengan jarum ose steril kemudian dimasukkan ke dalam 10
mL aquadest pada tabung reaksi kemudian di suspensi, di vortex sampai homogen
dan ditutup tabung dengan kapas dan seal wrap. Dioleskan S. mutans pada cawan
petri yang berisi MHA dengan steril kemudian dilubangi MHA pada petri yang telah
dioleskan tersebut dengan lubang yang seragam menggunakan corp borer (pelubang
agar) kemudian dimasukkan 50 µL sampel uji dengan konsentrasi 3%, 6%, 9% dan
DMSO sebagai blanko kemudian ditutup rapat dan diinkubasi pada suhu 35±2
selama
24
jam.
Selanjutnya
diukur
diameter
daerah
hambat
0
C
disekitar
lubang.Dilakukan hal yang sama pada E. coli dan C. albicans. (Ditjen POM, 1995)
Universitas Sumatera Utara
3.4 Diagram
Alir Prosedur Ekstraksi Flavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq Pohon Glodokan (Polyalthia longifolia)
(Harborne ,1987)
Diambil 100 g
untuk
skrining
fitokimia
1,1Kg Daun benalu pohon glodokan segar
-Uji Alkaloid
Dikeringanginkan
-Uji fenolik
Dihaluskan
-Uji flavonoid
Ditimbang
-Uji Terpenoid
200 g Serbuk Daun Benalu
-Uji Saponin
Direndam 1 L Metanol
Disaring filtrat
Filtrat Metanol
Material ampas
Dipekatkan dengan rotary evaporator
Ekstrak Kental Metanol
Diuapkan dengan penangas air sampai kering
Ditimbang
24,5 g Ekstrak Pekat Metanol
Dilarutkan dengan etil asetat
Fraksi Etil Asetat
Tannin
Diuapkan sampai kering
E Ekstrak pekat Etil asetat
Dilarutkan dengan Metanol
Dipartisi dengan N-heksana
Filtrat
Material ampas
Diuapkan sampai kering
Ditimbang
Flavonoid total
Uji aktivitas antioksidan
Uji aktivitas toksisitas
Uji aktivitas antimikroba
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Hasil Penelitian
4.1.1 Preparasi Sampel Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda (L.) Miq)
Pohon Glodokan
Berat awal daun benalu segar yaitu 1000 g, dibiarkan mengering sampai daun dapat
diremas pada ruangan (±1 minggu) dan ditimbang seberat 230 g atau 23 % .
Kemudian ditimbang 200 g serbuk daun benalu untuk diekstraksi dengan metanol
diperoleh ekstrak kental metanol daun benalu sebanyak 24,5 g atau sebesar 12,25 %
kemudian diekstraksi dengan etil asetat dan dipartisi dengan n-heksana dimana
lapisan bawah diuapkan dan dinyatakan sebagai flavonoid total seberat 4,98 g atau
sebesar 2,49 %.
4.1.2
Uji Skrining Fitokimia Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda (L.) Miq)
Pohon Glodokan
Diambil 100 g daun benalu segar untuk skrining fitokimia. Dibawah ini disajikan
tabel hasil skrining fitokimia dari daun segar benalu pohon glodokan sebagai berikut:
Tabel
4.1
Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Daun
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan
No Golongan
1
Alkaloid
2
Fenolik
Pereaksi
Hasil
Meyer
Buchardat
Dragendorf/Wagner
Flavonoid (Ekstrak Et.asetat FeCl3 1%)
++++
Fenolik (Ekstrak Metanol FeCl3 1%)
Aquadest
3 Saponin
Lieberman Bouchard
CeSO4 1% dalam H2SO4 dengan Plat
4 Terpenoid/Steroida
TLC
NB: - (Negatif) dan + (Positif)
Benalu
++++
+++
+++
Universitas Sumatera Utara
4.1.3
Uji Aktivitas Antioksidan Flavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan dengan
Spektrofotometer UV Visibel
Dibawah ini disajikan tabel uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH blanko
(vitamin C ;asam askorbat) dan flavonoid total daun benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq ) pohon glodokan menggunakan spektrofotometer UV Visibel.
Tabel 4.2 Uji Aktivitas Antioksidan Blanko (Vitamin C) Dengan DPPH 0.5 mM
200 ppm pada Panjang Gelombang Maksimum 516 nm
Konsentrasi
(ppm)
10
20
30
40
No
1
2
3
4
Absorbansi
(A)
0,04319
0,02814
0,02589
0,02509
%
Pemerangkapan
98,92 %
99,30 %
99,35 %
99,37 %
Dari tabel 4.2 dapat dilihat bahwa persentasi pemerangkapan oleh DPPH pada
panjang gelombang 516 nm terhadap vitamin C dengan konsentrasi 40 ppm amat kuat
sebesar 99,37 % hal ini menggambarkan bahwa vitamin C memiliki aktivitas
penghambatan radikal bebas yang kuat dan sesuai digunakan sebagai blanko positif.
Tabel 4.3 Uji Aktivitas Antioksidan Flavonoid TotalDaun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq )Pohon Glodokan dengan DPPH
0.5 mM 200 ppm pada Panjang Gelombang Maksimum 516 nm
No
Konsentrasi (ppm)
Absorbansi (A)
% Pemerangkapan
1
20
0,22299
94,42 %
2
40
0,07162
98,21 %
3
60
0,05987
98,50 %
4
5
80
100
0,06098
0,05573
98,48%
98,61 %
Dari tabel 4.3 dapat dilihat bahwa persentasi pemerangkapan oleh DPPH pada
panjang gelombang 516 nm terhadap flavonoid total daun benalu (Dendrophthoe
Universitas Sumatera Utara
pentranda (L.) Miq ) pohon glodokan dengan konsentrasi 100 ppm amat kuat sebesar
98,61 % hal ini menggambarkan bahwa flavonoid total daun benalu tersebut memiliki
aktivitas penghambatan radikal bebas yang kuat. Dari data diatas disajikan grafik uji
aktivitas antioksidan sebagai berikut:
KONSENTRASI VS PERSEN PEREDAMAN
99,40%
99,30%
99,20%
99,10%
99,00%
98,90%
98,80%
0
Gambar 4.1.
1
2
3
4
5
Grafik X sebagai Konsentrasi Vitamin C Versus Y sebagai
Persen Peredaman oleh DPPH
KONSENTRASI VS PERSEN PEREDAMAN
99,00%
98,50%
98,00%
97,50%
97,00%
96,50%
96,00%
95,50%
95,00%
94,50%
94,00%
0
Gambar 4.2.
20
40
60
80
100
120
Grafik X sebagai Konsentrasi Flavonoid Total Daun Benalu
Versus Y sebagai Persen Peredaman oleh DPPH
Universitas Sumatera Utara
4.1.4 Uji Aktivitas Toksisitas Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan dengan BSLT
Dibawah ini disajikan tabel 4.4 dan 4.5 mengenai pengamatan aktivitas toksisitas
flavonoid total daun benalu pohon glodokan dengan BSLT sebagai berikut:
Tabel 4.4 Pengamatan Toksisitas Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq )Pohon Glodokan dengan BSLT
No
Konsentrasi (ppm)
1
1000
2
100
3
10
4
Blanko +
Blanko -
Jumlah Larva
hidup
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
Jumlah
Larva Mati
24 jam
10
10
10
2
1
1
0
1
1
0
0
0
0
Dari Tabel 4.4 pengamatan dengan BSLT pada konsentrasi 1000 ppm terlihat
kematian larva udang total sementara konsentrasi 100 dan 10 ppm tingkat kematian
rendah saat pemberian flavonoid total daun benalu pohon glodokan . Pengamatan uji
aktivitas toksisitas flavonoid total daun benalu pohon glodokan disajikan pada tabel
berikut ini. Dimana A: Rerata Larva Mati, B: Akumulasi Larva Mati, C: Akumulasi
Larva Hidup, D: Total Mortalitas, E: Persen Mortalitas.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.5
Pengamatan Uji Aktivitas Toksisitas Flavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq )Pohon Glodokan dengan BSLT
Selama 24 jam
No
Konsentrasi
(ppm)
1
1000
2
100
3
10
Jumlah Jumlah
Larva
Larva A
B
C B+C=D B/D
Hidup
Mati
10
10
10
10
10 10
0
10
1
10
10
10
2
10
1
1,3 11,3 8,7
20
0,57
10
1
10
0
10
1
0,6 12 18,1
30,1
0.40
10
1
E
100
57
40
Dari tabel 4.5 pengamatan uji aktivitas toksisitas dengan BSLT selama 24 jam
diperoleh % kematian pada konsentrasi flavonoid total daun benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq ) pohon glodokan pada 10 ppm adalah 40%, 100 ppm adalah 57
% dan 1000 ppm adalah 100 %. Jika Persen Mortalitas adalah sumbu Y dan antilog
sebagai sumbu X maka diperoleh grafiksebagai berikut:
KONSENTRASI VS PERSEN MORTALITAS
120
100
80
60
40
20
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Gambar 4.3. Grafik Aktivitas Toksisitas BSLT (X sebagai Antilog dari
Konsentrasi Flavonoid Total Daun Benalu dan Y sebagai %
Mortalitas)
Universitas Sumatera Utara
4.1.5 Uji Aktivitas Antimikroba Flavonoid Total Daun benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq )Pohon Glodokan
Dibawah ini disajikan gambar uji aktivitas antimikroba terhadap flavonoid total daun
benalu pohon glodokansebagai berikut:
Gambar 4.4 Uji Aktivitas Antimikroba E. coliFlavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq)Pohon Glodokan
Dari gambar 4.4 terlihat zona hambat Bakteri Negatif E. coli terhadap konsentrasi
3%, 6% dan 9 % flavonoid total daun benalu (Dendrophthoe pentranda (L.)Miq )
pohon glodokan adalah sebesar 3.55, 4.25 dan 9.15 mm dan DMSO adalah 0.
Gambar 4.5 Uji Aktivitas Antimikroba S. mutans terhadap Flavonoid Total
Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda (L) Miq) Pohon Glodokan
Dari gambar 4.5 terlihat zona hambat Bakteri Positif S.mutans terhadap konsentrasi
3%, 6% dan 9% flavonoid total daun benalu (Dendrophthoe pentranda (L.)Miq )
pohon glodokan adalah sebesar 6,9 dan 17.25 mm dan DMSO adalah 0.
Gambar 4.6 Uji Aktivitas Antimikroba C.albicans Flavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan
Universitas Sumatera Utara
Dari gambar 4.6 terlihat zona hambat Bakteri Positif C. albicans terhadap konsentrasi
3%, 6% dan 9% flavonoid total daun benalu (Dendrophthoe pentranda (L.) Miq)
pohon glodokan adalah sebesar 8.30, 4 dan 5.30 mm danDMSO adalah 0. Dari hasil
pengujian zona hambat aktivitas antimikroba diatas di sajikan pada tabel berikut:
Tabel 4.6 Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat Uji Aktivitas Antimikroba
Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda (L.) Miq)
Pohon Glodokan
No
Konsentrasi (%)
1
2
3
4
3
6
9
Blanko DMSO
Diameter Zona Hambat (mm)
S. mutans
E. coli C. Albicans
6
3.55
8.30
9
4.25
4
17.25
9.15
5.30
0
0
0
Dari tabel diatas dapat kita lihat grafik dibawah ini:
Konsentrasi Flav. Total VS Diameter Hambat
20
15
Y3
10
Y2
5
Y1
0
0
Grafik 4.7.
4.2
1
2
3
4
5
X
sebagai Konsentrasi Flavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq ) Pohon Glodokan Versus Y1
oleh S. mutans Y2 oleh E. coli dan Y3 oleh C. albicans
Pembahasan
4.2.1 Preparasi Sampel Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda
(L.) Miq) Pohon Glodokan
Sampel daun benalu dari pohon glodokan segar dengan berat awal yaitu 1000 g.
Kemudian sampel dibiarkan mengering dan ditimbang kembali sebagai berat akhir
Universitas Sumatera Utara
yaitu 230 g atau sebesar 23%. Perhitungannya adalah sebagai berikut:
���ℎ������� ����� ������ ������
����� ������ ������
=
����� ������ �����
230�
=
× 100%
1000 �
= 23 %
× 100%
Ekstrak tidak mengandung sisa pelarut oleh karena itu susut pengeringan yang
identik dengan kadarair, maka ekstrak yang dihasilkan dalam penelitian ini adalah
ekstrak kental yang liat pada keadaan dingin, sukar dituang dan persentase kandungan
air sebesar 5-30%. (DEPKES RI, 2000)
Ekstrak kental metanol daun benalu sebanyak 24,5 g atau sebesar 12,25 %.
Perhitungan kadar ekstrak kental metanol daun benalu pohon glodokan adalah
sebagai berikut:
���ℎ������� ����� ������� ������ =
����� ������� ������
× 100%
����� ������ ����
24,5 �
= 200 � × 100%
=
12,25%
Flavonoid total sebanyak 4,98 g atau sebesar 2,49 % dengan perhitungan
sebagai berikut :
���ℎ������� ����� ��������� �����
=
����� ��������� �����
× 100%
����� ������ ����
4,98 �
= 200 � × 100%
=
2,49 %
4.2.2 Uji Skrining Fitokimia Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq Pohon Glodokan
Dari uji skrining fitokimia daun segar benalu pohon glodokan yang dilakukan bahwa
uji Alkaloid antara lain ekstrak metanol daun benalu dengan penambahan pereaksi
Meyer, Dragondorf dan Wagner / Bouchardat tidak memberikan perubahan warna
Universitas Sumatera Utara
(negatif alkaloid) demikian juga halnya saponin tidak menghasilkan busa yang
konstan (negatif saponin) tetapi untuk uji fenolik ekstrak metanol dengan
penambahan FeCl3 1% terjadi perubahan warna coklat kehitaman (positif fenolik) dan
dengan ekstrak etil asetat ditambah FeCl3 1% memberikan warna coklat kehitaman
(positif flavonoid) demikian pula dengan uji terpenoid dengan CeSO4 memberikan
warna merah pada plat TLC dan dengan pereaksi Lieberman Bouchard memberikan
perubahan warna merah kehitaman. Pada tabel 4.1 tanda Positif ++++ menunjukkan
perubahan warna yang sangat kuat dan kontras menunjukkan bahwa daun benalu
mengandung senyawa metabolit sekunder yaitu fenolik, flavonoid dan terpenoid.
4.2.3 Uji Aktivitas Antioksidan Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan Oleh DPPH Dengan
Spektrofotometri UV Visibel
Dari tabel 4.2 terlihat bahwa persentasi pemerangkapan oleh DPPH dengan
spektrofotometri UV Visibel pada panjang gelombang 516 nm dari flavonoid total
daun benalu (Dendrophthoe pentranda (L.) Miq) pohon glodokan dengan konsentrasi
100 ppm sangat kuat sebesar 98,61 % dibandingkan dengan konsentrasi lain.
Dengan Data pada Tabel 4.3 persamaan garis regresi aktivitas antioksidan
flavonoid total daun benalu(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq) pohon glodokan
diperoleh sebagai berikut:
Tabel 4.7 Persamaan Garis Regresi Linier
No
X
Y
XY
X2
Y2
1
0
0
0
0
0
2
20
94,42
1.888,4
400
8.915,1
3
40
98,21
3.928,4
1.600,0
9.645,2
4
98,50
5
60
80
98,48
5.910,0
7.878,4
3.600,0
6.400,0
9.702,2
9,698,3
6
100
98,61
9.861,0
10.000,0
9.723,9
ΣX=300
ΣY=488,22
ΣXY= 29.466,2ΣX2=22.000,0 ΣY2= 47.684,7
Universitas Sumatera Utara
Keterangan:
X=
Konsentrasi total flavonoid daun benalu pohon glodokan
Y=
% Pemerangkapan pada panjang gelombang516 nm
Jika a adalah intersep (titik potong kurva terhadap sumbu Y) dan b adalah kemiringan
(slope) kurva linier dimana Y adalah variabel terikat dan X adalah variabel bebas
maka: Y = aX + b (Sugiono, 2009)
Persamaan garis regresi linier adalah sebagai berikut:
a=
a=
(��� )−(��)(��)/�
(�� 2 )−(��) 2 /�
(29.4666 ,2)−(300.488,2)/6
(22.000,0)−(300) 2 /6
a= 5.056,2 / 7.000 =0.72
Untuk mendapatkan nilai b digunakan rumus sebagai berikut:
b= Y-aX
b=97.64 – (0.72). 60
b= 54.44
Untuk mengetahui daya hambat menggunakan radikal bebas DPPH
dipergunakan IC50 (Inhibit Concentration 50) dengan rumus sebagai berikut:
Y = aX + b
50 = 0.72 X + 54.44
X= 6.16 mg/L
Metode yang digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan flavonoid total daun
benalu pohon glodokan adalah metode uji menggunakan radikal bebas DPPH karena
ekuivalen memberikan 50% konsentrasi hambat sebagai aktivitas antioksidan (IC50).
DPPH merupakan radikal bebas stabil yang dapat bereaksi dengan senyawa yang
dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas
antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak karena memiliki elektron yang
tidak berpasangan, DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 515517 nm.Ketika elektronnya menjadi berpasangan absorbansinya menurun secara
Universitas Sumatera Utara
stoikiometri sesuai jumlah elektron yang diambil.Keberadaan senyawa antioksidan
dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, 2009).
Gambar 4.8 Mekanisme Peredaman Radikal Bebas DPPH (Yuhernita dan
Juniarti, 2011)
Dari data disimpulkan bahwa flavonoid total daun benalu pohon glodokan memiliki
aktivitas antioksidan yang sangat kuat sebesar 6,16 mg/L. Menurut Pokorny (2001)
nilai IC50 sangat kuat jika IC50< 50 mg/L.
4.2.4
Uji Aktivitas Toksisitas Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan Dengan Metode BSLT
Dari Tabel 4.4 Pengamatan dengan BSLT pada konsentrasi 1000 ppm terlihat
kematian total larva udang setelah 24 jam. Tabung reaksi yang berisi larva udang
dengan konsentrasi ekstrak 100 ppm mengalami kematian rerata sebesar 1,3 skala 10
larva udang dan pada 10 ppm mengalami kematian rerata sebesar 0,6 skala 10 larva
udang di setiap tabung reaksi.
Dari tabel 4.5 Pengamatan uji aktivitas Toksisitas dengan BSLT selama 24 jam
diperoleh % kematian pada konsentrasi flavonoid total daun benalu pohon glodokan
10 ppm adalah 40%, 100 ppm adalah 57 % dan 1000 ppm adalah 100%. Jika Persen
mortalitas adalah sumbu Y dan antilog konsentrasi sampel sebagai sumbu X maka
untuk perhitungan probit diperoleh tabel sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.8 X dan Y dalam persamaan garis regresi
X
Y
XY
X2
1
2
40
57
40
114
1
4
3
100
300
9
ΣX=6
X=2
Σ Y = 197
Y = 65,67
Σ X.Y = 454
X.Y = 151,33
Σ X2 = 14
Keterangan:
X=
Log konsentrasi
Y=
Persen Kematian larva udang (A. salina Leach)
Dengan persamaan garis regresi linier diperoleh bahwa nilai a dan b adalah sebagai
berikut:
a=
a=
(��� )−(��)(��)/�
(�� 2 )−(��) 2 /�
(454)−(6)(197)/3
(14)−(6) 2 /3
a= 30
b= Y-aX
b= 65,67- (30) 2
b=5,67
Y=aX+b
LC50 = 30 (X)+5,67
X
= 1,478, Antilog X= 30,06mg/L (ppm)
Jika LC50 (Lethal Concentration 50) merupakan antilog dari kematian larva udang
dalam 50% maka diperolehLC50 = 30,06 mg/L. Menurut Meyer (1982) suatu ekstrak
dianggap toksik apabila memiliki nilai LC50
METODOLOGI PENELITIAN
3.1.
Peralatan
-
Peralatan Gelas Pyrex
-
Botol vial
-
Blender
-
Kertas Saring Whatman
-
Plat tetes
-
Hot Plate
-
Pisau
-
Penangas Air
-
Spektrofotometer UV Visibel Simadzu 1800
-
Lampu
-
Rotary Evaporator
-
Wadah Air Laut Buatan
-
Rak Tabung Reaksi
-
Statif dan Klem
-
Karet Penghisap
-
Bunsen
-
Mikro pipet
-
Aluminium Foil
-
Jangka Sorong
-
Autoklaf
-
Inkubator
-
Jarum Ose
-
Neraca Analitik
-
Spatula
-
Thermometer
Universitas Sumatera Utara
3.2
Bahan
-
Daun benalu pohon glodokan
-
Metanol p.a Merck
-
DPPH Sigma Aldrich
-
Vitamin C p.a Merck
-
Metanol Teknis Brataco
-
N Hexana Teknis
-
Etil Asetat Teknis
-
Pereaksi Mayer
-
Pereaksi Dragondorf
-
Pereaksi Wagner/Bouchardat
-
Aquadest
-
FeCl3 p.a Merck
-
DMSO p.a Merck
-
Kista Artemia salina
-
Aquadest
-
Garam Laut Kemasan
-
Mueller Hinton Agar
-
Nutrien Agar
-
Nutrien Broth
-
Kultur E. coli
-
Kultur S. mutans
-
Kultur C.albicans
3.3
Prosedur Penelitian
3.3.1
Preparasi Sampel
Dikumpulkan daun benalu berasal dari pohon glodokan yang tumbuh di sekitar
Perpustakaan USU secara purposif (tidak membandingkan dengan daerah lain)
sebagai sampel. Daun benalu dibersihkan dan ditimbang serta di kering-
Universitas Sumatera Utara
anginkan.Sampel yang sudah kering dihaluskan menggunakan blender.Kemudian
sebanyak 200 g serbuk daun benalu dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer
ditambahkan dengan 1 L metanol. Dimaserasi selama 1x24 jam pada suhu kamar.
Selanjutnya diambil maserat kemudian ditambahkan metanol kembali pada ekstrak
daun benalu sampai pelarut berwarna bening kemudian dikumpulkan maserat yang
telah disaring, diuapkan dengan Rotary Evaporator pada keadaan vakum sampai
diperoleh ekstrak kental.Ekstrak kental diuapkan sampai pelarut menguap sempurna
dan diperoleh ekstrak pekat metanol daun benalu. (Depkes RI, 2000). Selanjutnya
ekstrak pekat daun benalu dilarutkan dengan etil asetat disaring kemudian filtrat
diuapkan kembali sampai pelarut menguap sempurna sehingga diperoleh ekstrak etil
asetat daun benalu yang kemudian dilarutkan kembali dengan metanol sampai larut
sempurna dan di partisi dengan n-heksana terbentuk dua lapisan, diambil lapisan
bawah dan diuapkan sampai diperoleh flavonoid total.
3.3.2
Preparasi Larutan
3.3.2.1 Preparasi FeCl3 1%
Sebanyak 1 gram FeCl3 dimasukkan kedalam labu takar 100 mL kemudian
diencerkan dengan aquadest sampai garis tanda dan di homogenkan.
3.3.2.2 Preparasi DPPH 0,5mM
3.3.2.2.1Preparasi DPPH 0,5mM 200 ppm
Sebanyak 9,858 mg DPPHdimasukkan kedalam labu takar 50 mL kemudian
diencerkan dengan metanol sampai garis tanda dan di homogenkan diperoleh larutan
DPPH 200 ppm.(Mariani S, 2015)
3.3.2.2.2 Preparasi DPPH 0,5mM 40 ppm
Dipipet 10 mL larutan DPPH 0,5 mM 200 ppm diencerkan dengan metanol pada labu
takar 50 mL sampai garis tanda kemudian dihomogenkan diperoleh larutan DPPH 40
ppm. (Mariani S, 2015)
Universitas Sumatera Utara
3.3.3
Uji Fitokimia
3.3.3.1 Preparasi Sampel Daun Benalu Segar
Diambil ± 100 gram daun benalu segar, dibersihkan, di potong kecil dan dimasukkan
ke dalam gelas Erlenmeyer kemudian di tambahkan metanol ± 100 mL dipanaskan
dengan penangas air sampai diperoleh ekstrak metanol kemudian didinginkan dan
diambil filtratnya.
3.3.3.2 Uji Alkaloid
Sebanyak ± 5 tetes filtrat ekstrak metanol daun benalu masing-masing diteteskan
pada tiga tabung reaksi. Tabung reaksi pertama ditetesi 2 tetes pereaksi Mayer (positif
jika membentuk endapan putih atau keruh), Tabung reaksi kedua ditetesi 2 tetes
pereaksi Dragendorf (positif jika membentuk endapan jingga) dan tabung reaksi
ketiga ditetesi 2 tetes pereaksi Wagner/Bouchardat (positif jika membentuk endapan
merah kecoklatan) . Diamati perubahan yang terjadi. (Harborne, 1987)
3.3.3.3 Uji Fenolik
Sebanyak ± 5 tetes filtrat ekstrak metanol daun benalu diteteskan pada sebuah tabung
reaksi kemudian ditambah masing-masing dengan 3 tetes larutan FeCl3 1% (positif
jika membentuk coklat kehitaman).Diamati perubahan yang terjadi. (Harborne, 1987)
3.3.3.4 Uji Flavonoid
Sebanyak ± 5 tetes filtrat ekstrak metanol daun benalu diteteskan pada sebuah tabung
reaksi dengan ± 3 tetes etil asetat ditambah 2 tetes FeCl3 1% sehingga terbentuk
warna hijau sampai coklat kehitaman (positif membentuk warna hijau sampai coklat
kehitaman). Diamati perubahan warna yang terjadi. (Harborne, 1987)
3.3.3.4
Uji Terpenoid dan Steroid
Universitas Sumatera Utara
3.3.3.4.1 Uji Lieberman Bouchard
Sebanyak ± 20 mL ekstrak metanol daun benalu dimasukkan ke dalam gelas beaker
kemudian diuapkan sampai pelarut habis kemudian didinginkan kemudian ditetesi ± 5
tetes asetat anhidrat dan ± 5 tetes asam sulfat pekat (positif terpenoid jika terbentuk
warna merah kecoklatan sampai violet dan positif steroid jika terbentuk warna hijau
sampai biru). Diamati perubahan yang terjadi. (Harborne, 1987)
3.3.3.4.2 Uji Plat Tipis
Sebanyak ± 3 mL ekstrak metanol daun benalu ditetesi pada plat tipis dipanaskan
pada hotplate di tetesi ± 2 tetes Carik sulfat pekat (positif terpenoid jika terbentuk
warna kemerahan). (Harborne, 1987)
3.3.3.5.
Uji Saponin
Sebanyak ± 5 tetes ekstrak metanol daun benalu dimasukkan pada sebuah tabung
reaksi kemudian dengan 20 mL aquadest.Filtrat didinginkan kemudian diguncang
kuat selama 10 detik dan didiamkan selama 10 menit (positif jika terbentuk
busa).Diamati perubahan yang terjadi. (Harborne, 1987)
3.3.4
Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH
3.3.4.1
Penentuan Panjang Gelombang Maksimum dengan Spektrofotometer
UV Visibel
0,5 mM DPPH 40 ppm di masukkan ke dalam kuvet kemudian diukur panjang
gelombang maksimum menggunakan Spektrofotometer UV Visibel. Disimpan hasil
yang diperoleh. (Mariani S, 2015)
3.3.4.2
Pembuatan Larutan Uji dan Blanko dengan Spektrofotometer UV
Visibel
Ditimbang 10 mg ekstrak flavonoid total daun benalu pohon glodokan dilarutkan ke
dalam 10 mL metanol untuk memperoleh 1000 mg/L ekstrak. Dari 1000 mg/L larutan
ekstrak dibuat variasi konsentrasi 20, 40, 60, 80 dan 100 mg/L. Untuk Blanko Negatif
Universitas Sumatera Utara
adalah 0,5 mM DPPH 200 ppm dan untuk blanko positif adalah vitamin C dengan
konsentrasi 10,20,30 dan 40 mg/L. (Mariani S, 2015)
3.3.4.3 Uji Aktivitas Antioksidan Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan dengan Spektrofotometer UV
Visibel
Masing-masing larutan blanko dan sampel ditambahkan dengan 2 mL larutan
0.5
mM DPPH 200 ppm, di goyang perlahan sampai homogen kemudian diinkubasi
selama 30 menit. Diukur absorbansinya pada λ maksimum 516 nm menggunakan
Spektrofotometer UV Visibel.Disimpan hasil yang diperoleh.Dilakukan dua kali
pengulangan. (Mariani S, 2015)
3.3.5
Uji ToksisitasFlavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda
(L.) Miq) Pohon Glodokandengan Metode Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT)
3.3.5.1 Persiapan Larva Udang
Larutan induk wadah disekat dua bagian, diisi dengan 38 g garam laut dilarutkan
dalam 1 L aquadest diperoleh air laut buatan. Sebanyak 20 mg telur Artemia salina
dimasukkan pada bagian sekat yang tertutup dan sekat yang satu dibiarkan terbuka,
kemudian diberi lampu diatas bagian yang terbuka untuk menarik udang Artemia
salina menuju bagian yangterkena cahaya lampu sehingga terpisah dari cangkangnya.
Telur-telur dari Artemia salina akan menetas menjadi larva dalam waktu 24-48 jam
dan digunakan uji toksisitas dari flavonoid total daun benalu. Dibuat larutan induk
dengan 100 mg flavonoid total daun benalu ditambah 3 tetes Dimetil sulfoksida
(DMSO), dilarutkan sampai 10 mL dengan air laut buatan diperoleh konsentrasi
larutan induk yaitu 10.000 mg/L kemudian diencerkan menjadi 3 konsentrasi yaitu
10,100 dan 1000 ppm. Konsentrasi 0 ppm sebagai kontrol negatif dan positif dengan
penambahan DMSO. (Mc. Laughlin, 1998)
3.3.5.2 Uji Toksisitas Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda
(L.) Miq) Pohon Glodokan dengan BSLT Selama 24 Jam
Universitas Sumatera Utara
Sebanyak 10 ekor larva dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi yang
telah diisi 5 mL larutan ekstrak pekat daun benalu dengan konsentrasi masing-masing
1000,100 dan 10 ppm. Setelah 24 jam, diamati jumlah larva yang mati untuk tiap-tiap
konsentrasi.
3.3.6
Uji Antimikroba Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan
3.3.6.1
Pembuatan Media
3.3.6.1.1 Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)
Ditimbang sebanyak 23 g Nutrien agar kemudian dimasukkan ke dalam gelas
Erlenmeyer kemudian disuspensi dengan aquadest hingga 1000 mL kemudian
dipanaskan hingga mendidih sambil diaduk kemudian disterilkan dengan autoklaf
pada suhu 121 0 C selama 15 menit. (Difco, 1997)
3.3.6.1.2 Pembuatan Media Nutrient Broth (NB)
Ditimbang sebanyak 4 g Nutrien Broth dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer
kemudian disuspensi dengan aquadest hingga 1000 mL kemudian dipanaskan hingga
mendidih sambil diaduk kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121
0
C
selama 15 menit. (Difco,1997)
3.3.6.1.3 Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Ditimbang sebanyak 38 g serbuk MHA kemudian dimasukkan ke dalam gelas
Erlenmeyer kemudian disuspensi dengan aquadest hingga 1000 mL kemudian
dipanaskan hingga mendidih sambil diaduk sampai bahan larut sempurna. Ditutup
gelas Erlenmeyer dengan kapas dan di seal kemudian disterilkan di autoklaf pada 121
0
C selama 15 menit. (Difco, 1997)
3.3.6.2
Pembuatan Stok Kultur
Universitas Sumatera Utara
Biakan mikroba Streptococcus mutans dari strain utama diambil dengan jarum ose
steril kemudian diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring dengan
cara menggores kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 350 C selama 1824 jam (Ditjen POM, 1995). Dilakukan hal sama dengan E. coli dan C. albicans.
3.3.6.3 Penyiapan Inokulum Bakteri
Koloni mikroba Streptococcus mutans diambil dari stok kultur menggunakan jarum
ose steril kemudian disuspensi ke dalam 10 mL media nutrient broth steril lalu
diinkubasi pada suhu 35 ± 2
0
C sampai diperoleh kekeruhan dengan transmitan
dengan alat spektrofotometer UV panjang gelombang 580 nm (Ditjen POM, 1995).
Dilakukan hal yang sama pada Escherichia coli dan Candida albicans
3.3.6.4 Pembuatan Larutan Uji
Disiapkan tiga tabung reaksi untuk persiapan konsentrasi larutan uji 3%, 6% dan 9%
dengan penambahan 60 µL ekstrak pekat ke dalam 2000 µL , 120 µL ekstrak pekat
ke dalam 2000 µL dan 180 µL ekstrak pekat ke dalam 2000 µL larutan DMSO.
3.3.6.5 Pengujian Aktivitas Antimikroba Flavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan dengan Metode
Difusi Agar
Disiapkan
10 mL larutan Mc. Farland (10
8
CFU/mL) kemudian diambil
Streptococcus mutans dengan jarum ose steril kemudian dimasukkan ke dalam 10
mL aquadest pada tabung reaksi kemudian di suspensi, di vortex sampai homogen
dan ditutup tabung dengan kapas dan seal wrap. Dioleskan S. mutans pada cawan
petri yang berisi MHA dengan steril kemudian dilubangi MHA pada petri yang telah
dioleskan tersebut dengan lubang yang seragam menggunakan corp borer (pelubang
agar) kemudian dimasukkan 50 µL sampel uji dengan konsentrasi 3%, 6%, 9% dan
DMSO sebagai blanko kemudian ditutup rapat dan diinkubasi pada suhu 35±2
selama
24
jam.
Selanjutnya
diukur
diameter
daerah
hambat
0
C
disekitar
lubang.Dilakukan hal yang sama pada E. coli dan C. albicans. (Ditjen POM, 1995)
Universitas Sumatera Utara
3.4 Diagram
Alir Prosedur Ekstraksi Flavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq Pohon Glodokan (Polyalthia longifolia)
(Harborne ,1987)
Diambil 100 g
untuk
skrining
fitokimia
1,1Kg Daun benalu pohon glodokan segar
-Uji Alkaloid
Dikeringanginkan
-Uji fenolik
Dihaluskan
-Uji flavonoid
Ditimbang
-Uji Terpenoid
200 g Serbuk Daun Benalu
-Uji Saponin
Direndam 1 L Metanol
Disaring filtrat
Filtrat Metanol
Material ampas
Dipekatkan dengan rotary evaporator
Ekstrak Kental Metanol
Diuapkan dengan penangas air sampai kering
Ditimbang
24,5 g Ekstrak Pekat Metanol
Dilarutkan dengan etil asetat
Fraksi Etil Asetat
Tannin
Diuapkan sampai kering
E Ekstrak pekat Etil asetat
Dilarutkan dengan Metanol
Dipartisi dengan N-heksana
Filtrat
Material ampas
Diuapkan sampai kering
Ditimbang
Flavonoid total
Uji aktivitas antioksidan
Uji aktivitas toksisitas
Uji aktivitas antimikroba
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Hasil Penelitian
4.1.1 Preparasi Sampel Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda (L.) Miq)
Pohon Glodokan
Berat awal daun benalu segar yaitu 1000 g, dibiarkan mengering sampai daun dapat
diremas pada ruangan (±1 minggu) dan ditimbang seberat 230 g atau 23 % .
Kemudian ditimbang 200 g serbuk daun benalu untuk diekstraksi dengan metanol
diperoleh ekstrak kental metanol daun benalu sebanyak 24,5 g atau sebesar 12,25 %
kemudian diekstraksi dengan etil asetat dan dipartisi dengan n-heksana dimana
lapisan bawah diuapkan dan dinyatakan sebagai flavonoid total seberat 4,98 g atau
sebesar 2,49 %.
4.1.2
Uji Skrining Fitokimia Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda (L.) Miq)
Pohon Glodokan
Diambil 100 g daun benalu segar untuk skrining fitokimia. Dibawah ini disajikan
tabel hasil skrining fitokimia dari daun segar benalu pohon glodokan sebagai berikut:
Tabel
4.1
Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Daun
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan
No Golongan
1
Alkaloid
2
Fenolik
Pereaksi
Hasil
Meyer
Buchardat
Dragendorf/Wagner
Flavonoid (Ekstrak Et.asetat FeCl3 1%)
++++
Fenolik (Ekstrak Metanol FeCl3 1%)
Aquadest
3 Saponin
Lieberman Bouchard
CeSO4 1% dalam H2SO4 dengan Plat
4 Terpenoid/Steroida
TLC
NB: - (Negatif) dan + (Positif)
Benalu
++++
+++
+++
Universitas Sumatera Utara
4.1.3
Uji Aktivitas Antioksidan Flavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan dengan
Spektrofotometer UV Visibel
Dibawah ini disajikan tabel uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH blanko
(vitamin C ;asam askorbat) dan flavonoid total daun benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq ) pohon glodokan menggunakan spektrofotometer UV Visibel.
Tabel 4.2 Uji Aktivitas Antioksidan Blanko (Vitamin C) Dengan DPPH 0.5 mM
200 ppm pada Panjang Gelombang Maksimum 516 nm
Konsentrasi
(ppm)
10
20
30
40
No
1
2
3
4
Absorbansi
(A)
0,04319
0,02814
0,02589
0,02509
%
Pemerangkapan
98,92 %
99,30 %
99,35 %
99,37 %
Dari tabel 4.2 dapat dilihat bahwa persentasi pemerangkapan oleh DPPH pada
panjang gelombang 516 nm terhadap vitamin C dengan konsentrasi 40 ppm amat kuat
sebesar 99,37 % hal ini menggambarkan bahwa vitamin C memiliki aktivitas
penghambatan radikal bebas yang kuat dan sesuai digunakan sebagai blanko positif.
Tabel 4.3 Uji Aktivitas Antioksidan Flavonoid TotalDaun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq )Pohon Glodokan dengan DPPH
0.5 mM 200 ppm pada Panjang Gelombang Maksimum 516 nm
No
Konsentrasi (ppm)
Absorbansi (A)
% Pemerangkapan
1
20
0,22299
94,42 %
2
40
0,07162
98,21 %
3
60
0,05987
98,50 %
4
5
80
100
0,06098
0,05573
98,48%
98,61 %
Dari tabel 4.3 dapat dilihat bahwa persentasi pemerangkapan oleh DPPH pada
panjang gelombang 516 nm terhadap flavonoid total daun benalu (Dendrophthoe
Universitas Sumatera Utara
pentranda (L.) Miq ) pohon glodokan dengan konsentrasi 100 ppm amat kuat sebesar
98,61 % hal ini menggambarkan bahwa flavonoid total daun benalu tersebut memiliki
aktivitas penghambatan radikal bebas yang kuat. Dari data diatas disajikan grafik uji
aktivitas antioksidan sebagai berikut:
KONSENTRASI VS PERSEN PEREDAMAN
99,40%
99,30%
99,20%
99,10%
99,00%
98,90%
98,80%
0
Gambar 4.1.
1
2
3
4
5
Grafik X sebagai Konsentrasi Vitamin C Versus Y sebagai
Persen Peredaman oleh DPPH
KONSENTRASI VS PERSEN PEREDAMAN
99,00%
98,50%
98,00%
97,50%
97,00%
96,50%
96,00%
95,50%
95,00%
94,50%
94,00%
0
Gambar 4.2.
20
40
60
80
100
120
Grafik X sebagai Konsentrasi Flavonoid Total Daun Benalu
Versus Y sebagai Persen Peredaman oleh DPPH
Universitas Sumatera Utara
4.1.4 Uji Aktivitas Toksisitas Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan dengan BSLT
Dibawah ini disajikan tabel 4.4 dan 4.5 mengenai pengamatan aktivitas toksisitas
flavonoid total daun benalu pohon glodokan dengan BSLT sebagai berikut:
Tabel 4.4 Pengamatan Toksisitas Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq )Pohon Glodokan dengan BSLT
No
Konsentrasi (ppm)
1
1000
2
100
3
10
4
Blanko +
Blanko -
Jumlah Larva
hidup
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
Jumlah
Larva Mati
24 jam
10
10
10
2
1
1
0
1
1
0
0
0
0
Dari Tabel 4.4 pengamatan dengan BSLT pada konsentrasi 1000 ppm terlihat
kematian larva udang total sementara konsentrasi 100 dan 10 ppm tingkat kematian
rendah saat pemberian flavonoid total daun benalu pohon glodokan . Pengamatan uji
aktivitas toksisitas flavonoid total daun benalu pohon glodokan disajikan pada tabel
berikut ini. Dimana A: Rerata Larva Mati, B: Akumulasi Larva Mati, C: Akumulasi
Larva Hidup, D: Total Mortalitas, E: Persen Mortalitas.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.5
Pengamatan Uji Aktivitas Toksisitas Flavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq )Pohon Glodokan dengan BSLT
Selama 24 jam
No
Konsentrasi
(ppm)
1
1000
2
100
3
10
Jumlah Jumlah
Larva
Larva A
B
C B+C=D B/D
Hidup
Mati
10
10
10
10
10 10
0
10
1
10
10
10
2
10
1
1,3 11,3 8,7
20
0,57
10
1
10
0
10
1
0,6 12 18,1
30,1
0.40
10
1
E
100
57
40
Dari tabel 4.5 pengamatan uji aktivitas toksisitas dengan BSLT selama 24 jam
diperoleh % kematian pada konsentrasi flavonoid total daun benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq ) pohon glodokan pada 10 ppm adalah 40%, 100 ppm adalah 57
% dan 1000 ppm adalah 100 %. Jika Persen Mortalitas adalah sumbu Y dan antilog
sebagai sumbu X maka diperoleh grafiksebagai berikut:
KONSENTRASI VS PERSEN MORTALITAS
120
100
80
60
40
20
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Gambar 4.3. Grafik Aktivitas Toksisitas BSLT (X sebagai Antilog dari
Konsentrasi Flavonoid Total Daun Benalu dan Y sebagai %
Mortalitas)
Universitas Sumatera Utara
4.1.5 Uji Aktivitas Antimikroba Flavonoid Total Daun benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq )Pohon Glodokan
Dibawah ini disajikan gambar uji aktivitas antimikroba terhadap flavonoid total daun
benalu pohon glodokansebagai berikut:
Gambar 4.4 Uji Aktivitas Antimikroba E. coliFlavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq)Pohon Glodokan
Dari gambar 4.4 terlihat zona hambat Bakteri Negatif E. coli terhadap konsentrasi
3%, 6% dan 9 % flavonoid total daun benalu (Dendrophthoe pentranda (L.)Miq )
pohon glodokan adalah sebesar 3.55, 4.25 dan 9.15 mm dan DMSO adalah 0.
Gambar 4.5 Uji Aktivitas Antimikroba S. mutans terhadap Flavonoid Total
Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda (L) Miq) Pohon Glodokan
Dari gambar 4.5 terlihat zona hambat Bakteri Positif S.mutans terhadap konsentrasi
3%, 6% dan 9% flavonoid total daun benalu (Dendrophthoe pentranda (L.)Miq )
pohon glodokan adalah sebesar 6,9 dan 17.25 mm dan DMSO adalah 0.
Gambar 4.6 Uji Aktivitas Antimikroba C.albicans Flavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan
Universitas Sumatera Utara
Dari gambar 4.6 terlihat zona hambat Bakteri Positif C. albicans terhadap konsentrasi
3%, 6% dan 9% flavonoid total daun benalu (Dendrophthoe pentranda (L.) Miq)
pohon glodokan adalah sebesar 8.30, 4 dan 5.30 mm danDMSO adalah 0. Dari hasil
pengujian zona hambat aktivitas antimikroba diatas di sajikan pada tabel berikut:
Tabel 4.6 Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat Uji Aktivitas Antimikroba
Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda (L.) Miq)
Pohon Glodokan
No
Konsentrasi (%)
1
2
3
4
3
6
9
Blanko DMSO
Diameter Zona Hambat (mm)
S. mutans
E. coli C. Albicans
6
3.55
8.30
9
4.25
4
17.25
9.15
5.30
0
0
0
Dari tabel diatas dapat kita lihat grafik dibawah ini:
Konsentrasi Flav. Total VS Diameter Hambat
20
15
Y3
10
Y2
5
Y1
0
0
Grafik 4.7.
4.2
1
2
3
4
5
X
sebagai Konsentrasi Flavonoid Total Daun Benalu
(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq ) Pohon Glodokan Versus Y1
oleh S. mutans Y2 oleh E. coli dan Y3 oleh C. albicans
Pembahasan
4.2.1 Preparasi Sampel Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe pentranda
(L.) Miq) Pohon Glodokan
Sampel daun benalu dari pohon glodokan segar dengan berat awal yaitu 1000 g.
Kemudian sampel dibiarkan mengering dan ditimbang kembali sebagai berat akhir
Universitas Sumatera Utara
yaitu 230 g atau sebesar 23%. Perhitungannya adalah sebagai berikut:
���ℎ������� ����� ������ ������
����� ������ ������
=
����� ������ �����
230�
=
× 100%
1000 �
= 23 %
× 100%
Ekstrak tidak mengandung sisa pelarut oleh karena itu susut pengeringan yang
identik dengan kadarair, maka ekstrak yang dihasilkan dalam penelitian ini adalah
ekstrak kental yang liat pada keadaan dingin, sukar dituang dan persentase kandungan
air sebesar 5-30%. (DEPKES RI, 2000)
Ekstrak kental metanol daun benalu sebanyak 24,5 g atau sebesar 12,25 %.
Perhitungan kadar ekstrak kental metanol daun benalu pohon glodokan adalah
sebagai berikut:
���ℎ������� ����� ������� ������ =
����� ������� ������
× 100%
����� ������ ����
24,5 �
= 200 � × 100%
=
12,25%
Flavonoid total sebanyak 4,98 g atau sebesar 2,49 % dengan perhitungan
sebagai berikut :
���ℎ������� ����� ��������� �����
=
����� ��������� �����
× 100%
����� ������ ����
4,98 �
= 200 � × 100%
=
2,49 %
4.2.2 Uji Skrining Fitokimia Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq Pohon Glodokan
Dari uji skrining fitokimia daun segar benalu pohon glodokan yang dilakukan bahwa
uji Alkaloid antara lain ekstrak metanol daun benalu dengan penambahan pereaksi
Meyer, Dragondorf dan Wagner / Bouchardat tidak memberikan perubahan warna
Universitas Sumatera Utara
(negatif alkaloid) demikian juga halnya saponin tidak menghasilkan busa yang
konstan (negatif saponin) tetapi untuk uji fenolik ekstrak metanol dengan
penambahan FeCl3 1% terjadi perubahan warna coklat kehitaman (positif fenolik) dan
dengan ekstrak etil asetat ditambah FeCl3 1% memberikan warna coklat kehitaman
(positif flavonoid) demikian pula dengan uji terpenoid dengan CeSO4 memberikan
warna merah pada plat TLC dan dengan pereaksi Lieberman Bouchard memberikan
perubahan warna merah kehitaman. Pada tabel 4.1 tanda Positif ++++ menunjukkan
perubahan warna yang sangat kuat dan kontras menunjukkan bahwa daun benalu
mengandung senyawa metabolit sekunder yaitu fenolik, flavonoid dan terpenoid.
4.2.3 Uji Aktivitas Antioksidan Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan Oleh DPPH Dengan
Spektrofotometri UV Visibel
Dari tabel 4.2 terlihat bahwa persentasi pemerangkapan oleh DPPH dengan
spektrofotometri UV Visibel pada panjang gelombang 516 nm dari flavonoid total
daun benalu (Dendrophthoe pentranda (L.) Miq) pohon glodokan dengan konsentrasi
100 ppm sangat kuat sebesar 98,61 % dibandingkan dengan konsentrasi lain.
Dengan Data pada Tabel 4.3 persamaan garis regresi aktivitas antioksidan
flavonoid total daun benalu(Dendrophthoe pentranda (L.) Miq) pohon glodokan
diperoleh sebagai berikut:
Tabel 4.7 Persamaan Garis Regresi Linier
No
X
Y
XY
X2
Y2
1
0
0
0
0
0
2
20
94,42
1.888,4
400
8.915,1
3
40
98,21
3.928,4
1.600,0
9.645,2
4
98,50
5
60
80
98,48
5.910,0
7.878,4
3.600,0
6.400,0
9.702,2
9,698,3
6
100
98,61
9.861,0
10.000,0
9.723,9
ΣX=300
ΣY=488,22
ΣXY= 29.466,2ΣX2=22.000,0 ΣY2= 47.684,7
Universitas Sumatera Utara
Keterangan:
X=
Konsentrasi total flavonoid daun benalu pohon glodokan
Y=
% Pemerangkapan pada panjang gelombang516 nm
Jika a adalah intersep (titik potong kurva terhadap sumbu Y) dan b adalah kemiringan
(slope) kurva linier dimana Y adalah variabel terikat dan X adalah variabel bebas
maka: Y = aX + b (Sugiono, 2009)
Persamaan garis regresi linier adalah sebagai berikut:
a=
a=
(��� )−(��)(��)/�
(�� 2 )−(��) 2 /�
(29.4666 ,2)−(300.488,2)/6
(22.000,0)−(300) 2 /6
a= 5.056,2 / 7.000 =0.72
Untuk mendapatkan nilai b digunakan rumus sebagai berikut:
b= Y-aX
b=97.64 – (0.72). 60
b= 54.44
Untuk mengetahui daya hambat menggunakan radikal bebas DPPH
dipergunakan IC50 (Inhibit Concentration 50) dengan rumus sebagai berikut:
Y = aX + b
50 = 0.72 X + 54.44
X= 6.16 mg/L
Metode yang digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan flavonoid total daun
benalu pohon glodokan adalah metode uji menggunakan radikal bebas DPPH karena
ekuivalen memberikan 50% konsentrasi hambat sebagai aktivitas antioksidan (IC50).
DPPH merupakan radikal bebas stabil yang dapat bereaksi dengan senyawa yang
dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas
antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak karena memiliki elektron yang
tidak berpasangan, DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 515517 nm.Ketika elektronnya menjadi berpasangan absorbansinya menurun secara
Universitas Sumatera Utara
stoikiometri sesuai jumlah elektron yang diambil.Keberadaan senyawa antioksidan
dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, 2009).
Gambar 4.8 Mekanisme Peredaman Radikal Bebas DPPH (Yuhernita dan
Juniarti, 2011)
Dari data disimpulkan bahwa flavonoid total daun benalu pohon glodokan memiliki
aktivitas antioksidan yang sangat kuat sebesar 6,16 mg/L. Menurut Pokorny (2001)
nilai IC50 sangat kuat jika IC50< 50 mg/L.
4.2.4
Uji Aktivitas Toksisitas Flavonoid Total Daun Benalu (Dendrophthoe
pentranda (L.) Miq) Pohon Glodokan Dengan Metode BSLT
Dari Tabel 4.4 Pengamatan dengan BSLT pada konsentrasi 1000 ppm terlihat
kematian total larva udang setelah 24 jam. Tabung reaksi yang berisi larva udang
dengan konsentrasi ekstrak 100 ppm mengalami kematian rerata sebesar 1,3 skala 10
larva udang dan pada 10 ppm mengalami kematian rerata sebesar 0,6 skala 10 larva
udang di setiap tabung reaksi.
Dari tabel 4.5 Pengamatan uji aktivitas Toksisitas dengan BSLT selama 24 jam
diperoleh % kematian pada konsentrasi flavonoid total daun benalu pohon glodokan
10 ppm adalah 40%, 100 ppm adalah 57 % dan 1000 ppm adalah 100%. Jika Persen
mortalitas adalah sumbu Y dan antilog konsentrasi sampel sebagai sumbu X maka
untuk perhitungan probit diperoleh tabel sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.8 X dan Y dalam persamaan garis regresi
X
Y
XY
X2
1
2
40
57
40
114
1
4
3
100
300
9
ΣX=6
X=2
Σ Y = 197
Y = 65,67
Σ X.Y = 454
X.Y = 151,33
Σ X2 = 14
Keterangan:
X=
Log konsentrasi
Y=
Persen Kematian larva udang (A. salina Leach)
Dengan persamaan garis regresi linier diperoleh bahwa nilai a dan b adalah sebagai
berikut:
a=
a=
(��� )−(��)(��)/�
(�� 2 )−(��) 2 /�
(454)−(6)(197)/3
(14)−(6) 2 /3
a= 30
b= Y-aX
b= 65,67- (30) 2
b=5,67
Y=aX+b
LC50 = 30 (X)+5,67
X
= 1,478, Antilog X= 30,06mg/L (ppm)
Jika LC50 (Lethal Concentration 50) merupakan antilog dari kematian larva udang
dalam 50% maka diperolehLC50 = 30,06 mg/L. Menurut Meyer (1982) suatu ekstrak
dianggap toksik apabila memiliki nilai LC50