Pemanfaatan Fenomena Luminisensi dari Bakteri Photobacterium phosphoreum yang Diisolasi dariCumi Eaut Indonesia Sebagai Sensor Polutan. - Universitas Negeri Padang Repository

LAPORAN PENELlTlAN HlBAH BERSAING

PEMANFAATAN FENOMENA
Photobacterium phosphoreum YANG DllSOLASl DARl CUM1
LAUT INDONESIA SEBAGAI SENSOR POLUTAN

Dr.

.

eel

I__--

Dr. ldam Arif
Dr. Ing. Lazuardi

--.
I

I

Dibiayai oleh
Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional
Sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Penelitian
Nomor: 006/SP2H/PP/DP2M/II1/2008
Tanggal 6 Maret 2008

UNlVERSlTAS NEGERI PADANG
NOVEMBER 2008

I

b

R
t

I:
I !

I

LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN
LAPORAN TAHUN I HASIL PENELITIAN HIBAH BERSAING
: Pemanfaatan Fenomena Luminisensi dari Bakteri
Photobacterium phosphoreum yang Diisolasi dari
Cumi Eaut Indonesia Sebagai Sensor Polutan.

A. Judul Penelitian

.I

E
I

i
I

I

I

B. Ketua Peneliti
a. Nama Lengkap dan Gelar
b. Jenis Kelamin
c. Pangkat./Golongan/NlP
d. Bidang Keahlian
e. FakultasIJurusan
f. Perguruan Tinggi
C. Tim Peneliti
NAMA

I

: Dr. Ratnawulan, M.Si
: Perempuan
: Lektorllllcll32 056 199
: Biofisika
: FMIPA/Fisika
: Universitas Negeri Padang

BIDANG
KEAHLIAN

1. Dr. Ratnawulan, M.Si Biofisika
Biofisika
2. Dr, ldam Arif
3. Dr.lng. Lazuardi Umar Sensor

FAKULTASIJUR

.

PERGURUAN
TlNGGl

FMIPNFisika
FMIPNFisika
FMIPAIFisika

UNP
ITB
UNRl

D. Pendanaan dan jangka waktu penelitian :
Jangka waktu penelitian yang diusulkan : 2 tahun
: Rp. 100.000.000,Biaya total yang diusulkan
: Rp. 45.000.000,Biaya yang disetujui tahun I
Padang, 20 November, 2008

Dr. Ratnawulan. M.Si
NlP.132056199

~

Menyetujui
mbaga Penelitian

'07221986021002

Di laut Indonesia terdapat cumi-cumi yang dapat memancarkan cahaya akibat
hubungan simbiosa dengan bakteri Photobacterium phosphoreum yang hidup didalam
organ cahaya cumi jenis Loligo duvaucelli.'!~rosespemancaran cahaya pada bakteri
lurninsensi melibatkan enzim yang disebut luciferase yang mengkatalis tiga substrat
yaitu flavin mononukleotida tereduksi (FMNH2), molekul oksigen (02) dan aldehid rantai
panjang (RCOH). Reaksi tersebut membebaskan flavin (FMN), asarn lemak rantai
panjang (RCOOH), molekul air (H20) sambil memancarkan cahaya tarnpak (hv).
Sistem bioluminisensi dari bakteri Iumininisensi telah banyak digunakan untuk
monitoring sistem biologi. Prinsip dari bioassay ini adalah didasari pada perubahan dari
0.

intensitas bioluminisensi akibat pengaruh kehadiran toxin. Dengan alasan itu penting
untuk mengetahui bagaimana mekanisme dari senyawa kimia tersebut mempengaruhi
sistem bioluminisensi agar dapat menginterpretasikan hasil tes dari biolumi?isensi
dengan benar. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki pola dari pengaruh
sejurnlah logam berat dengan berat molekul yang berbeda-beda

pada sistem

bioluminisensi.

Nilai intensitas bioluminisensi maksimum dari kurva intensitas terhadap waktu
akibat kehadiran berbagai konsentrasi logam berat dibandingkan dengan nilai yang
diperoleh tanpa kehadiran logarn berat. Pengaruh dari logarn berat dianalisa dengan
perbandingan maksimum dari nilai yang diterangkan diatas terhadap intensitas
bioluminisensi maksimum. Koefisien inhibisi bioluminisensi dibandingkan dengan enegi
bebas pengarnbilan elektron dari kation.
Hasil dari penelitian ini memperlihatkan bahwa kemampuan inhibisi dari logam
berat bertambah dengan bertambahnya berat atom dari kation dan inhibisi dan aktivasi
dari intensitas bioluminisensi dihasilkan dari pengaruh kation pada transfer elektron pada
sistem bioluminisensi.

SUMMARY
#

In sea region of Indonesia people can find a kind of squid that could emit light as

a result of symbiosis correlation with certain bacteria of Pho tobacterium phosphoreum
that lived in inner light-organ of Loligo duvaucelli
squid-type. The process of light
.emission at luminescence bacteria is involving certain enzyme, which called as

luciferase, and it catalyzed three substrates, i.e. reduced flavin mononucleotide (FMNH2),
oxygen molecule (02), and long chains aldehyde (RCOH). Those reactions would release
flavin (FMN), long chains fatty acid (RCOOH), water molecule (HzO), while at the same
time emitting visible light (hv).
Bioluminescent system of luminous bacteria are used as bioassay for biological
monitoring. The principle of bioluminescent bioassay is based on the change of
bioluminescence intensity under the influence of toxic substance. It is necessary to know
the mechanism of chemical compounds action on the bioluminescent test-system to
interpret the results of the bioluminescent enzymatic assay. The goal of this research is to
study the patterns of influence of the series of heavy metal with different molecular
weights on the bioluminescent system.
The value of maximum bioluminescence intensity of the intensity versus time
curve in the presence of a certain heavy metal concentration was compared with the
corresponding value of curve obtained in absence of heavy metal. The effect of heavy
metal on bioluminescence was analysed by the maximum ratio of the above-mentioned
values of maximum bioluminescence intensities. Bioluminescence inhibition coefficient
were compared to the free energies of electron withdrawing of cation.
The results show that the inhibiting ability of the heavy metal increases with the
increase of atomic weight of the cation and inhibition and activation of luminescence
intensity result from the effect of cations on electron transfer in the bioluminescence

system.

-

PENGANTAR
"r

t
b

!

1
\

-

Kegiatan penelitian mendukung pengembangan ilmu serta terapannya. Dalam ha1 ini,
Lembaga Penelitian Universitas Negeri Padang berusaha mendorong dosen untuk melakukan
penelitian sebagai bagian integral dari kegiatan mengajarnya, baik yang secara langsung dibiayai

oleh dana Universitas Negeri Padang maupun dana dari sulnber lain yang relevan atau bekerja
sama dengan instansi terkait.
Sehubungan dengan itu, Lembaga Penelitian Universitas Negeri Padang bekerjasama
dengan Direktorat Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Ditjen Dikti Depdiknas
dengan surat perjanjian kerja Nomor : 006/SP2H/PP/DP2M/II1/2008 Tanggal 6 Maret 2008,
dengan judul Pemat.lfaatan Fenonzerza Luminisetisi clari Bakteri Pl~otobacterium
phosphoreum y crtzg di Isolasi dari Cunri Lncrt Indonesia sebagni Sensor Polutan.
Kami menyambut gembira usaha yang dilakukan peneliti untuk menjawab berbagai
permasalahan pembangunan, khususnya yang berkaitan dengan permasalahan penelitian tersebut
di atas. Dengan selesainya penelitian ini, Lembaga Penelitian Universitas Negeri Padang telah
dapat memberikan informasi yang dapat dipakai sebagai bagian upaya penting dalam
peningkatan mutu pendidikan pada umumnya. Di samping itu, hasil penelitian ini juga
diharapkan memberikan rnasukan bagi instansi terkait dalam rangka penyusunan kebijakan
pembangunan.
Hasil penelitian ini telah ditelaah oleh tim pembahas usul dan laporan penelitian,
kemudian untuk tujuan diseminasi, hasil penelitian ini telah diseminarkan ditingkat nasional.
Mudah-mudahan penelitian ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu pada umumnya, dan
peningkatan mutu staf akademik Universitas Negeri Padang.
Pada kesempatan ini, kami ingin mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang
membantu pelaksanaan penelitian ini. Secara khusus, kami menyampaikan terima kasih kepada

Direktur Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Ditjen Dikti Depdiknas yang telah
memberikan dana untuk pelaksanaan penelitian ini. Kami yakin tanpa dedikasi dan kerjasama
yang terjalin selama ini, penelitian ini tidak akan dapat diselesaikan sebagaimana yang
diharapkan dan semoga kerjasama yang baik ini akan menjadi lebih baik lagi di masa yang akan
datang.
Terima kasih.
Padang, Nopember 2008
u-+ua Lembaga Penelitian
versitas Negeri Padang,

I ;I

NIP. 130365634

.I

I

PENGANTAR
Kegiatan penelitian mendukung pengembangan ilmu serta terapannya. Dalam ha1 ini,
bags Penelitian Universitas Negeri Padang berusaha mendorong dosen untuk melakukan
v~elitiansebagai bagian integral dari kegiatan mengajamya, baik yang secara langsung dibiayai
lich dana Universitas Negeri Padang maupun dana dari sumber lain yang relevan atau bekerja
sma dengan instansi terkait.
..

Sehubungan dengan itu, Lembaga Penelitian Universitas Negeri Padang bekerjasama
gan Direktorat Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Ditjen Dikti Depdiknas
.iigan surat perjanjian kerja Nomor : 006/SP2H/PP/DP2M/III/2008 Tanggal 6 Maret 2008,
-ngan judul Pemanfaatan Fenomena Luminisensi dari Bakteri Photobacterium
rlltosphoreumyang di Isolasi dari Cunti Lnut Indonesia sebagai Sensor Polutan
Kami menyam bu t gem bira usaha yang dil.akukan peneliti untuk menjawab berbagai
oermasalahan pembangunan, khususnya yang berkaitan dengan permasalahan penelitian tersebut
atas. Dengan selesainya penelitian ini, Lembaga Penelitian Universitas Negeri Padang telah
,)at memberikan informasi yang dapat dipakai sebagai bagian upaya penting dalam
ningkatan mutu pendidikan pada urnumnya. Di samping itu, hasil penelitian jni juga
;?arapkan memberikan masukan bagi instansi terkait dalam rangka penyusunan kebijakan
:mbangunan.
Hasil penelitian ini telah ditelaah oleh tim pembahas usul dan laporan penelitian,
:remudian untuk tujuan diseminasi, hasil penelitian ini telah diseminarkan ditingkat nasional.
Mudah-mudahan pe~elitian ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu pada umumnya, dan
peningkatan mutu staf akademik Universitas Negeri Padang.
Pada kesempatan ini, kami ingin mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang
3embantu pelaksanaan penelitian ini. Secara khusus, kami menyampaikan terima kasih kepada
'lirektur Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, .Ditjen Dikti Depdiknas yang telah
..~emberikandana untuk pelaksanaan penelitian ini. Kami yakin tanpa dedikasi dan kerjasama
,,ang terjalin selama ini, penelitian ini tidak akan dapat diselesaikan sebagaimana yang
liharapkan dan semoga kejasama yang baik ini akan menjadi lebih baik lagi di masa yang akan
\tang.
:rima kasih.

Padang, Nopember 2008
Ketua Lembaga Penelitian
Universitas Negeri Padang,

Prof..Dr.H. Anas Yasin, M.A.
NIP. 130365634

'

DAFTARISI

Halaman
LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN'!;.. .....................................

..II

RlNGKASAN DAN SUMMARY .............................................................

iii

PRAKATA ...............................................................................................

v

DAFTAR IS1.............................................................................................

vi

DAFTAR TABEL .................................................................................

vii

DAFTAR GAMBAR............................................................................

viii

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................

ix

I. PENDAHULUAN ............................................................................

1

11. TUJUAN DAN MANFAAT PENELlTlAN .............................................

3

Ill. TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................

6

IV. METODE PENELITIAN ...................................................................

15

V. HASIL DAN PEMBAHASAN................................................................

21

VI. KESIMPUIAN DAN SARAN ...........................................................

36

VII. RENCANAJPENELITIAN TAHAP SELANJUTNYA............................

37

DAFTAR PUSTAKA.................................................................................

41

LAMPIRAN.............................................................................................

44

DRAF ARTIKEL ILMIAH..........................................................................

48

DAFTAR TABEL
I

.. -

Halaman

Tabel V. 1.

Hasil Difraksi Sinar-X Kristal LBPP

29

Tabel V.2.

Hasil Aktivitas LBPP setelah diberi logam berat

31

1

Tabel V.3.

Hasil Quantum Yield LBPP setelah diberi Logarn berat

31

i

Tabel V.4

Parameter inhibisi, aktivasi dan energi bebas Gibbs akibat 33

I

I

diberi logam berat

vii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 111.1

Garnbar 111.2

1

Halaman
Bakteri lurninisensi yang bkisimbiosa pada cumi-cumi (a) 10
bakteri menempati sepasang organ cahaya dari cumi, (b) posisi
organ cahaya pada kantung tinta cumi-cumi, (c) bakteri dalam
kantung organ cahaya cumi-cumi dan (d) struktur sel bakteri
yang terdiri dari materi DNA dan polihidroksiburat (phb)
(Pringgenis, dkk, 2001).
Hasil elektroforesis SDS-~~~elektroforesis.
(I), Standar, (2) 11
ekstrak kasar enzim, (3) Fraksionasi amoniourn sulfat (255 85 %), (4) Kromatografi penukar ion DEAE- selulosa dan ( 5 )
Gel filtrasi. Enzim luciferase terdiri dari dua sub unit a dan P
yang masing-masing mempunyai berat molekul 41 kD dan 38

kD..
Gambar 111.3

Diagram energi reaksi bioluminisensi LBPP (Ratnawulan, dkk,
2006a).

13

Gambar 111.4

Pemancaran cahaya dari reaksi LBPP setelah diinjeksi dengan
logam berat. Intensitas maksimum tejadi pada h = 516 nrn
untuk setiap jenis logam berat.

14

Gambar IV.1

Skema spektrofotometer fluorinsensi model F-2000

16

Garnbar V. 1

Peralatan Hanging drop vapour diffusion,

25

Gambar V.2

Hasil elektroferoresis ekstrak kasar LBPP (a) Protein standar 26
Bovine Serum Albumin (BSA) , (b) luciferase dari bakteri
fisheri yang diperoleh secara komersial dari Sigma company,
(c) ekstrak kasar LBPP dan (d) hasil fraksionasi ammonium
sulfat 25-80 % LBPP.

Gambar V.3

(a) Profil absorbansi dan aktivitas hasil pemurnian LBPP 27
memakai kolom kromatografi gel filtrasi Sephadex G 100 dan
(b) hasil
elektroforesis dari protein standar dan beberapa
nomor fi-aksi

i

Gambar V.4

Hasil kristalisasi LBPP dengan Hanging drop vapour difhsi

28

I

Garnbar V.5

Hasil pengujian kristal LBPP dengan mikroskop polarisator

28

I

~
I

I

Gambar V.6

Hasil pengukuran difraksi sinar-X untuk kristal LBPP

29

#

Gambar V.7

Hasil

pengindeksan

intensitas

puncak

kristal

LBPP 30

menggunakan program X' Pert.
Gambar V.8

Plot Intensitas Bioluminisensi (1110)
logarn berat.

.

terhadap konsentrasi 32

-

Gambar V.9

Plot kuantum yield terhadap konsentrasi logam berat

Gambar V. 10

Korelasi koefisien inhibisi dengan energi bebas Gibbs dan 34
berat atom logarn Berat

32

DAFTAR LAMPIMN

.L

-

Lampiran I

Tenaga Peneliti dan Lokasi Penelitian

Lampiran I1

Tenaga Peneliti dan Lokasi Penelitian

Lampiran 111

Komunikasi Ilmiah

Lampiran IV

Draf Artikel

BAB I. PENDbHULUAN

1.1. Latar Belakang
..

-

Indonesia sebagai negara tropis memiliki keanekaragarnan hasil laut yang belum
dimanfaatkan secara optimal. Sebagai contoh, cumi-cumi diperairan Indonesia diketahui
dapat memancarkan cahaya (bioluminisensi) yang membantu cumi-cumi itu mencari
makanan di kegelapan air dan sekaligus menjadi alat pertahanan melalui penyamaran dari
hewan pemangsa. Pringgenies, dkk, (2001) telah melakukan penyelidikan tentang curni
ini dan menyimpulkan bahwa c h a y a yang dipancarkannya disebabkal hubungan

1

simbiosa antara curni-cumi jenis Laligo duvaucelli dengan bakteri Photo bacterium
phosphoreum yang hidup didalamnya.

Penyebab

dan

mekanisme

bioluminisensi

dari

bakteri

Pho~obacterium

phosphoreum ini telah diteliti dan dilaporkan oleh Ratnawulan, dkk, (2005 & 2006a).

Hasil penelitian yang berupa model mekanisrne nanofabrikasi fotonik alamiah ini
selanjutnya akan menjadi dasar untuk penelitian aplikasi

fenomena bioluminisensi

sebagai biosensor monitoring kadar racun logam berat di air. Dari penelitian pendahuluan

I

menunjukkan adanya penurunan intensitas bioluminisensi bakteri ketika ditarnbahkan
beberapa jenis

logarn berat

(Ratnawulan, dkk, 2006b).

Penurunan

intensitas

bioluminisensi setelah mengikat logam berat mengarahkan kesimpulan tentang
kemarnpuan bakteri Photobacterium phosphoreum lokal ini sebagai sensor monitoring
logam berat. Meskipun demikian bagaimana senyawa logan berat mempengaruhi sistem
bioluminisensi bakteri belum bisa dijelaskan karena belum didukung landasan teori yang
mendasari proses tersebut. Oleh karena itu kajian tentang mekanisme penurunan

1
I

I

intensitas bioluminisensi setelah diberi logam berat

dan metode pengukuran adalah

penting untuk dilakukan.
Penelitian ini sangat menarik dilakukan mengingat bakteri Photobacterium
phosphoreum berlimpah di laut Indonesia, di dalam kerja laboratorium bakteri ini sangat

mudah diisolasi, ditumbuhkan dan tidak menyebabkan penyakit sehingga dapat bekerja
dengan aman dan tidak membutuhkan ruangan dan peralatan khusus. (Ratnawulan, dkk.,

I

2005). Tidak kalah penting adalah bakteri Photobacterium Phosphoreum merupakan
jenis bakteri yang memancarkan cahaya paling terang dari semua bakteri luminesen yang

1

ada dan cahaya yang dipancarkan berada pada daerah sinar tarnpak yang memungkinkan
dapat terlihat dengan kasat mata (Madden ahd Lidesten, 2001).

BAB 11. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
e

11.1. Tujuan Khusus
Dalam penelitian ini masalah utarna yang akan diselesaikan adalah bagaimana
mengaplikasikan fenomena bioluminisensi bakteri Photobacterium phosphoreum
-

-.

ini

sebagai sensor monitoring logarn berat.. Ada tiga masalah pokok yang akan diselesaikan
yaitu: masalah pertama adalah bagaimana menginterpretasikan hasil test bioluminisensi
bakteri dengan benar. Masalah kedua adalah bagaimana metode pengukuran kadar logam
berat dengan memakai data pengurangan intensitas cahaya. Masalah ketiga adalah
bagaimana kelayakan biosensor ini dibandingkan dengan biosensor komersial.
Masalah pertama akan diselesaikan dengan melakukan kajian perilaku perubahan
intensitas dan quantum yield dari sistem bioluminisensi bakteri Photobacterium

phosphoreum setelah diberi senyawa logam berat. Selanjutnya menentukan koefisien
inhibisi dan aktivasi dari sistern bioluminisensi bakteri Photobacterium phosphoreum dan
menganalisa hubungan kation logam berat dengan distribusi kerapatan elektron dalam
sistem bioluminisensi bakteri. Hasil korelasi ini selanjutnya digunakan sebagai landasan
teori dalam mengidentifikasi kadar logam berat di air.
Masalah kedua akan diselesaikan melalui pengukuran berbagai konsentrasi logam
berat terhadap intensitas bioluminisensi. Dari persamaan garis regresi, kemiringan garis
dan koefisien regresinya dapat ditentukan. Selanjutnya dapat dihitung konsentrasi inhibisi

50 % (IC 50%) , nilai rata-rata dan standar deviasi untuk setiap jenis logam berat.
Hasilnya dinyatakan dengan ppm (part per million, mg/L).
Masalah ketiga akan diselesaikan dengan mal~ikukanstudi perbandingan sensor
bioluminisensi dengan sensor polutan komersial (Microtox) dengan studi kasus uji
logam berat pada air sungai di kota Padang.
Berdasarkan rumusan masalah yang telah dijelaskan, maka dapat dirumuskan
tujuan khusus penelitian sebagai berikut:

I . Menemukan landasan ilmiah pengaruh kation logam berat pada distribusi rapat
elektron dalam sistem bioluminisensi bakteri Photobacteriumphosphoreum.
2. Mendapatkan metode pengukuran kadar logam berat melalui data pengurangan
intensitas bioluminisensi bakteri

3. Mengetahui kelayakan sensor bioluminisensi dengan melakukan uji kadar
logam berat pada air sungai kota Padangdengan pembanding sensor polutan lain.
Tujuan khusus no. 1 merupakan fokus penelitian pada tahun I dan tujuan khusus no. 2
dan 3 merupakan fokus penelitian pada tahun 11.
.. -

11.2. Manfaat Penelitian
Penelitian ini penting dilakukan, mengingat sudah banyak infonnasi ilmiah yang
tersedia untuk bakteri luminisensi lokal ini, seperti: penyebab, karakteristik dan
mekanisme bioluminisensi bakteri (Ratnawulan, dkk, 2005, 2006a, 2006b). Masalahnya
sekarang adalah bagaimana memanfaatkan . fenomena bioluminisensi

ini untuk

kepentingan aplikasi, khususnya sebagai biosensor monitoring kadar logam berat di air.
Wdaupun pada studi pendahuluan tersebut telah diperoleh garnbaran tentang perubahan
intensitas bioluminisensi setelah mengikat logam berat, namurn belum bisa menjelaskan
kemarnpuannya dan tes logam berat. Kemarnpuan bakteri sebagai sensor toksin logarn
b k a t ditentukan dari beberapa syarat diantaranya adalah respon yang linier dari bakteri
dan waktu respon yang baik. Pengujian dari sensitifitas cahaya dari bakteri untuk
beberapa logam berat diharapkan memberikan informasi dari aplikasi bakteri untuk uji
logam berat (sensor logam berat).
Biosensor bioluminisensi ini diharapkan dapat mengganti keberadaan indikator
organisme seperti tikus, kelinci maupun ikan untuk mendeteksi keberadaan toksinllogam
berat di lingkungan kita (air, udara dan makanan). Tes toksin menggunakan indikator ini
biasanya

kompleks,

rnahal

dan

memerlukan

keahlian

perorangan

untuk

melaksanakannya. Seperti contoh, diperlukan analisa tarnbahan untuk menentukan
apakah binatang tersebut mati akibat toksin atau akibat lainnya. Kemudian tes toksin
pada binatang memerlukan waktu berhari-hari untuk memantau kondisinya. Oleh karena
itu dalam penelitian ini akan diusulkan altematif lain untuk mendeteksi keberadaan
toksin di lingkungan dengan cara cepat, sederhana dan dengan biaya yang rendah antara
lain menggunakan organisme bakteri. Bakteri dan senyawa aktifnya memainkan peranan
yang besar dari sejumlah tes yang memakai organisme disebabkan respon yang sangat
cepat, populasi yang besar dan biaya yang rendah (Kudryasheva, dkk, dkk, 1994).

Dari hasil penelusuran pustaka, sarnpai saat ini belum ada literatur yang
menerbitkan hasil-hasil peneliti& tentang landasan teori bioluminisensi untuk mengkaji
perubahan

perilaku

parameter-parameter

fisika

biolurninisensi

dari

bakteri

Photobacterium Phosphoreum setelah diberi senyawa logam berat. Hasil penelitian ini
akan memberikan konstribusi terhadap khazanah ilmu pengetahuan dasar berupa
.. -

landasan ilmiah orisinilitas tinggi dalam menginterpretasikan hasil biotest bioluminisensi
sebagai alat monitoring kadar logam berat di alam. Kajian teori ini penting untuk menjadi
landasan dalam mendesaian dan menginterpretasikan hasil biotest biolurninisensi sebagai
alat monitoring kadar logarn berat di air. Selain itu penelitian ini merupakan terobosan
baru dalam studi bioluminisensi bakteri Photobacterium Phosphoreum khususnya sifatsifat dasar fisika bioluminisensi. Jika penelitian ini berhasil maka terbuka kemungkinan
kerjasama aRtar peneliti dalarn berbagai bidang ilmu seperti biofisika, biokimia,
bakteriologi dan kelautan.

BAB 111. STUDJ PUSTAKA
111.1 Perkembangan Penelitian Bioluminisensi Bakteri

Fenomena bioluminisensi pada organisme hidup telah menjadi objek perhatian

I

!

-

semenjak zaman dahulu kala. Ketika Cristopher Columbus menyeberangi laut Atlantik, ia
sering melihat cahaya luminisensi misterius di sekitar kapalnya. Saat itu, dijelaskan
bahwa luminisensi yang ditemukan di laut dihubungkan dengm monster atau misteri lain

,

.

I

1

I

yang belurn diketahui (Harvey, 1920 dikutip dari Floyd, 1997).
Usaha serius pertama ilmuwan untuk menyelidiki asal muasal luminisensi pada
organisme dimulai pada pertengahan tahun 1600 Masehi. Saat itu Boyle menguji
C

pengaruh oksigen pada luminisensi yang teramati pada daging yang sudah mati. (Harvey,
1952 dikutip dari Kruse dan Boyle, 2000). Pada tahun 1830, ilmuwan Jerman, G.A.
Michaelis, menemukan.bahwa luminisensi dari daging yang sudah mati disebabkan oleh
sesuatu yang hidup (Harvey, 1920 dikutip dari Biron, 2003). Penemuan G.A. Michaelis
ini merupakan titik awal para peneliti untuk mengobservasi luminisensi pada makluk
hidup. Saat ini, bioluminisensi telah diobservasi pada ribuan spesies meliputi kunangkunang, jamur, binatang laut d m bakteri.
Salah satu spesies yang menarik perhatian adalah bakteri luminisensi. Bakteri
luminisensi mayoritas ditemukan di alam dalam bentuk simbiosis dengan makluk hidup
yang lain seperti ikan, cumi dan ada juga yang mampu hidup bebas di alam (MeyerRochow, 2001). Holt dkk. (1994) mengungkapkan bahwa bakteri luminisensi dapat
dikelompokkan atas tiga genus: pertama Photobacterium, kedua Vibrio, dan ketiga
Photorhabdus.

Genus yang ada pada lingkungan laut dikelompokkan

sebagai

Photobacterium dan Vibrio. Genus Photobacterium kebanyakan bersimbiosa pada organ
cahaya dari binatang laut sedangkan genus Vibrio selain ada dalam keadaaan bersimbiosa
juga ditemukan dalam keadaan hidup bebas di dalam laut. Sedangkan genus
Photorhabdus hidup bebas di lingkungan darat.

111.1.1 Kajian Pola Aktivitas Bioluminisensi Bakteri

Hasting (1971) telah merumuskan reaksi bioluminisensi untuk bakteri yaitu
melibatkan enzim yang disebut luciferase. Luciferase ini mengkatalis tiga substrat yaitu
flavin

mononukleotida

tereduksi

(FMNH2),

molekul

oksigen

(02)

-

!

dan aldehid rantai panjang (RCOH). Reaksi tersebut membebaskan flavin (FMN), asarn
lemak rantai panjang (RCOOH), molekul air (H20) sambil memancarkan cahaya tarnpak
(hv) sebagai berikut.
FMNH2 + 0 2 + RCOH + FMN + RCOQH + H 2 0 + hv

(1111)

Untuk menjelaskan proses biolu~blinisensipada bakteri, Hasting dkk. (1,973) membagi
reaksi bioluminisensi atas empat intermediat kunci sesuai dengan urutan reaksi yaitu
intermediat

I

(substrat

FMNH2

.

terikat

pada

luciferase),

intermediat

11

(penarnbahan substrat O2 pada qeaksi intermediat I), intermediat 111 ( penambahan
substrat RCOH pada reaksi intermediat 11) dan intermediat IV* (keadaan eksitasi dari
reaksi yang akan meluruh kekeadaan dasar sambil memancarkan cahaya) sesuai
persarnaan beri kut.
Luciferase
FMNH2

0 2

I -1

--

RCHO

I11

IV*

Selanjutnya Hasting telah mengisolasi dan mengkarakterisasi intermediat I1 reaksi
bioluminisensi pada bakteri Photobacterium jisheri dengan memakai metode absorbsi
spektroskopi. Intermediat I1 bakteri ini mempunyai absorbsi energi dengan sebuah
puncak pita tunggal pada panjang gelombang 372 nm. Balny dan Hasting (1975), Tu
(1979) dan Lee dkk. (1988) telah mengkarakterisasi intermediat I1 pada bakteri yang
sama memakai metode fluoresensi spektroskopi. Hasilnya menemukan bahwa emisi
fluoresensi maksimum dari intermediat I1 terjadi pada panjang gelombang 485 nm.
Vervoort dkk. (1986a dan 1986b)

juga menyelidiki intermediat I1 dari bakteri

PhotobacteriumJsheri untuk mengetahui dudukan pengikatan FMNH2 dengan mcmakai
metoda NMR. Hasilnya menemukan bahwa dudukan
dudukan pengikatan

C4a

pada FMNH2 merupakan

02.

Marcheroux dkk. (1 993) rnengkarakterisasi sifat spektral dan kinetik dari
intermediat 111 pada bakteri yang sarna. Hasilnya rnenunjukkan

bahwa

spektrum

absorbsi maksimum dari intermediat 111 terjadi pada panjang gelombang 365 nrn dan
spektrum emisi terjadi pada panjang gelombang 460 nrn.
Selanjutnya karakteristik fluoresensi dari intermediat IV telah dilaporkan oleh
Matheson dkk. (1 98 1 ) menggunakan berbagai jenis substrat flavin bentuk tereduksi.
Matheson dkk. menyimpulkan bahwa spektrum bioluminisensi memakai lurniflavin
tereduksi mempunyai pola yang sama dengan spektrum bioluminisensi memakai substrat

FMNH2 dimana intensitas maksimum terjadi pada panjang gelombang 492 nrn dan
C

quantum yield adalah 0,3. Kurhst dkk. (1984) juga melakukan pengukuran spektrum
absorbsi dari intermediat IV dan menemukan bahwa spektrum absorbsi maksimurn dari
intermediat IV terjadi pada panjang gelombang 360 nrn.
111.1.2 Kajian Lokasi Dudukan Aktif Bioluminisensi Bakteri

Pusat aktivitas bioluminisensi pada setiap intermediat terjadi pada lokasi dudukan
aktif bioluminisensi bakteri. Dudukan aktif didefenisikan sebagai permukaan enzim
dimana molekul substrat terikat pada enzim terjadi reaksi luminisensi. Meigen dan Bartlet
(1980) mengungkapkan bahwa dudukan aktif

terletak pada subunit

a sehingga

modifikasi subunit ini akan mengubah sifat katalis dari luciferase. Ketidakhadiran subunit

D menyebabkan subunit a tidak berfungsi secara optimal sehingga intensitas cahaya yang
dipancarkan adalah rendah. Untuk memprediksi dudukan aktif dari luciferase, Swanson
dkk. (1985) telah melakukan studi awal tentang struktur kristal dari luciferase bakteri
Vibrio haweyi pada resoiusi

3A. Struktur kristal dari Vibrio harveyi menunjukkan bahwa

terjadi interaksi intensif dan pola pengikatan kompleks antara beberapa rantai dudukan
dan punggung asam amino dari subunit a dan

P.

Dari hasil penelitian ini diketahui

bahwa subunit f3 b e h n g s i sebagai penunjang perubahan konformasi pada subunit a
selarna katalis dimana subunit a diprediksi sebagai lokasi dudukan aktif. Selanjutnya
Flynn dkk. (1993) menyatakan bahwa subunit a dari luciferase bakteri Vibrio harveyi

berfungsi

sebagai ternpat pengikatan substrat dari reaksi bioluminisensi. Sedangkan

Waddle dan Baldwin (1 991) menyatakan bahwa aktivitas bioluminisensi yang terarnati
adalah hasil reaksi yang dikatalis oleh subunit a tanpa kehadiran subunit

P. Sebaliknya

aktivitas bioluminisensi juga teramati pada subunit P tanpa kehadiran subunit a.
Choi dkk. (1995) menemukan bahwa dudukan
.,_
aktif tunggal boleh jadi terletak di
antarmuka subunit-subunit. Dugaan ini diperoleh berdasarkan studi hibridasi subunit dan
pelabelan fotoaktivitas pada luciferase. Ini berbeda dengan teori yang dikemukakan
Fisher dkk. (1995 dan 1996) bahwa pusat aktif dari enzim luciferase terletak pada subunit

a. Choi mengklaim bahwa maiing-masing subunit dari luciferase Vibrio harveyi terlibat
aktif dalam katalis reaksi pemancaran cahaya: Kemampuan subunit a dan

dalam

mengkatalis pemancaran cahaya adalah kunci untuk memahami bagaimana kehadiran
logam-logarn berat dapat menginhibisi intensitas biolumfnisensi.
111.2 Hasil yang Sudah Dicapai

111.2.1 Bakteri Luminisensi Plzotobacterium phosphoreum yang Diisolasi dari Cumi
Lolligo duvauceIli
Pringgenis, dkk,

(2001) menemukan kehadiran bakteri

Photobacterium

phosphoreum pada cumi-cumi jenis Loligo duvauceli di laut Indonesia. Populasi curnicumi ini dominan di laut Indonesia dan termasuk d a l A cumi-cumi ekonomis penting.
Bakteri

Photobacterium phosphoreum

terdapat pada sepasang organ cahaya yang

menempel pada bagian dorso-lateral kantung tinta seperti diperlihatkan pada Gambar
III.3(a). Posisi organ cahaya di bagian dorsal kantung tinta cumi mudah diketahui karena
benvarna kontras yaitu putih dengan panjang 2 s.d 5 mm seperti diperlihatkan pada
Gambar III.3(b). Didalam organ cahaya terdapat kantung organ cahaya yang berisi penuh
dengan koloni bakteri seperti diperlihatkan pada Gambar II1.3(c). Sel bakteri tarnpak
berbentuk batang atau silinder dan tidak mempunyai rambut getar atau flagella. Ukuran
bakteri adalah 0,9 pm x 3,2 pm. Permukaan sel bakteri mengandung suatu lapisan
kapsula dan didalam sel terdapat satu atau lebi h butiran phb (polihidroksiburat) serta

DNA seperti yang diperlihatkan pada Gambar 111.3(d). Keberadaan kapsula pada bakteri

Photobacterium phosphoreum ini merupakan karakteristik khas yang dimiliki oleh strain
tropis yang berbeda dari jenis Photobacterium phosphoreum yang pernah dilaporkan.

Gambar 1II.I.Bakteri luminisensi yang bersimbiosa- pada cumi-cumi (a) bakteri
menempati sepasang organ cahaya dari curni, (b) posisi organ cahaya pada
kantung tinta cumi-cumi, (c) bakteri dalam kantung organ cahaya curnicurni dan (d) struktur sel bakteri yang terdiri dari materi DNA dan
polihidroksiburat (phb) (Pringgenis, dkk, 2001).
Bakteri Photobaclerium phosphoreum mudah ditumbuhkan dalam laboratorium dengan
cara mengeluarkan kantong tinta dari curni kemudian organ cahaya dilepas dari kantong
tinta dan dipisahkan dari lensanya. Lensa kemudian dibelah dan digerus supaya bakteri
dapat dibiakkan pada media "agar miring".

111.2.2. Isolasi, Identifikasi dan Pemurnian Senyawa Aktif Penyebab Pemancaran
cahaya pada Ba kteri Photobacterium phosphorerrm
Senyawa aktif penyebab pemancaran cahaya pada bakteri Pholobacterium

phosphoreum

yang diisolasi dari cumi laut Indonesia telah berhasil diisolasi dan

dimurnikan sarnpai 97% oleh Ratnawulan, dkk, (2005) dengan metode DEAE Selulosa
dan kromatografi gel filtrasi Sephadex G 1OO.;Senyawa aktif tersebut dinamakan dengan
luciferase disingkat LBPP (~ucifei-aseBakteri Photobacterium phosphoreum), terdiri
dari dua subunit a dan subunit p dengan berat molekul masing-masing adalah 41 k D dm
38 kD. Aktivitas spesifik dari LBPP adalah 3,5x10'~
quanta /s.mg seperti terlihat pada
., -

Garnbar 111.2.

1
I

l

Gambar 111.2 Hasil elektroforesis SDS-PPAelektroforesis. (I), Standar, (2) ekstrak
kasar enzim, (3) Fraksionasi amoniourn sulfat (255 - 85 %), (4) Kromatografi penukar
ion DEAE- selulosa dan (5) Gel filtrasi. Enzim luciferase terdiri dari dua sub unit a dan P
yang masing-masing mempunyai berat molekul41 kD dan 38 kD..

Tujuan pemurnian

I

I

adalah untuk mendapatkan

enzim luciferase dari bakteri

Photobacterium phosporium pada kemurnian tertentu yang akan digunakan sebagai
medium dalam rnengikat senyawa-senyawa logam berat.
111.2.3. Karakteristik Fisis Pemancaran Cahaya Reaksi Bioluminisensi Bakteri
Photobacterium phosphoreum

Hasil analisis karakteristik fisis pemancaran cahaya dari reaksi bioluminisensi
bakteri Photobacterium phosphoreum, menunjukkan bahwz panjang gelombang eksitasi
dari intermediat I1 dm intermediat I11 adalah 366 nrn dan 350 nrn sedangkan panjang
gelombang cahaya emisi adalah 5 16 nrn. Reaksi berlangsung pada kondisi optimum
dimana pH adalah 7, temperatur adalah 25OC, konstanta peluruhan cahaya adalah 0,007/s,
quantum yield adalah 0,3 d m energi aktivasi reaksi adalah 19 kkallmol. Perubahan pH,

temperatur, konsentrasi oksigen dan kontaminasi logam berat tidak menyebabkan
pergeseran panjang gelombang emisi 5 16 nm tetapi hanya mengubah intensitas cahaya
(Ratnawulan, dkk, 2004).
Dengan diketahuinya karakteristik fisis pemancaran

cahaya dari reaksi

bioluminisensi bakteri Photobacterium phosphoreum, maka setiap pengukuran kadar
.

-

logam berat dilakukan pada kondisi optimum ini.
111.2.3. Karakteristik Fisis Pembentukan Keadaan Eksitasi Reaksi Bioluminisensi

Ba kteri PJtofobacteriumphosp/soreum
Hasil prediksi dudukan aktif menggunakan metoda MNDO-PM3 mendapatkan
bahwa dan asparagin (Asn) dan lysin (L~S-H+)pada LBPP adalah representasi residuresidu katalis yang terlibat dalarn proses protonasi dan deprotonasi dari subtrat FMNIT2
(Arif & Ratnawulan, 2006). Mekanisme pembentukan keadaan eksitasi pada bakteri
Photobacterium phosphoreurn diperoleh dari hasil analisis pengikatan dudukan aktif
LBPP dengan substrat-substratnya (Arif & Ratnawulan, 2006). Karakteristik

energi

aktivasi dan urutan reaksi LBPP memperlihatkan bahwa deprotonasi pada kedudukan N1
dari FMNH2 oleh residu asam amino Asn untuk membentuk intermediat I mengalami
energi aktivasi sebesar 3,9 kkallmol. Reaksi intermediat I dengan O2 membentuk
intermediat I1 dengan energi aktivasi sebesar 18,5 kkal/mol. Reaksi intermediat I1 dengan
RCOH membentuk intermediat 111 dengan energi aktivasi sebesar 20 kkal/mol. Pelepasan
molekul RCOOH dari intermediat I11 membentuk intermediat IV* yang disebut dengan
keadaan eksitasi. Hasil analisis pengukuran panjang gelombang cahaya secara
eksperimen memberikan perubahan energi bebas Gibbs sebesar -55,228 kkal/mol.
Sedangkan hasil analisis karakteristik fisis pembentukan keadaan eksitasi memberikan
perubahan energi bebas Gibbs sebesar -59,22 kkal/mol. Oleh karena kedua hasil analisis
bersesuaian maka mekanisme yang diusulkan untuk pembentukan keadaan eksitasi sudah
memenuhi

syarat

energi bagi

terjadinya

reaksi

bioluminisensi

pada

bakteri

Photobacterium phosphoreum. Diagram energi reaksi bioluminisensi LBPP dapat dilihat
pada Garnbar 111.3.

.

FMN

Gambar 111.3. Diagram energi reaksi bioluminisensi LBPP (Ratnawulan, dkk, 2006a).
Model mekanisme bioluminisensi ini selanjutnya digunakan sebagai model awal
mekanisme bioluminisensi bakteri sebelum diberi logam berat. Dari model awal ini dapat
dipelajari perilaku perubahan intensitas bioluminisensi setelah diberi senyawa logam
berat.

111.3. Studi Pendahuluan Yang sudah dilaksanakan.
Penelitian ini dilatar belakangi oleh adanya perubahan intensitas bioluminisensi
bakteri Photobacterium phosphoreum ketika ditarnbahkan beberapa jenis logarn berat,
seperti ymg telah dilaporkan oleh Papilaya, dkk., (2003) dan Ratnawulan, dkk, (2006b).
Hasil pengukuran spektrum pemancaran cahaya dari LBPP setelah diinjeksi dengan
logam berat dapat dilihat pada Gambar 111.4.

Garnbar 111.4. Spektrum pemancaran cahaya dari reaksi LBPP setelah diinjeksi dengan
logam berat. Intensitas maksimum terjadi pada h = 5 16 nrn untuk setiap
jenis logam berat.

I

1

Garnbar 111.4 memperlihatkan bahwa kehadiran logam berat tidak mempengaruhi panjang
gelombang pada intensitas pemancaran maksimum. Intensitas pemancaran maksimum
terjadi pada panjang gelombang 516 nm. Kehadiran timah menyebabkan intensitas

I

cahaya turun lebih besar dibandingkan dengan tembaga, kobalt dan mangan untuk,

1

konsentrasi 3 mgll.

I

I

Untuk mengaplikasikan fenomena ini sebagai sensor monitoring logam berat,
maka perlu diketahui

teori fisika yang mendasari proses tersebut. Kajian teori ini

berguna untuk menginterpretasikan hasil uji tes logam berat yang menggunakan
I

fenomena bioluminisensi dari bakteri ini.

BAB IV. METODE PENELITIAN
Untuk mencapai tujuan penelitian ini, pola pendekatan ilmiah yang digunakan
adalah eksperimen. Pendekatan eksperimen..- bertujuan mengukur perubahan ntensitas
biolurninisensi dan quantum yield setelah bakteri Photobacterium phosphoreum setelah
diberi logarn berat dengan berat molekul, potensial redox, dan jumlah kation yang
berbeda-beda. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan Spektrofotometer Fluoresensi
Model F 2000. Berdasarkan data-data diatas, akan diturunkan parameter-parameter
inhibisi dan aktivasi bioluminisensi bakteri . menggunakan pemodelan kedepan atau
inversi dengan bantuan paket program MATLAB versi 7.0.1.24704 (Release 14).
Selanjutnya akan dikaji korelasi koefisien inhibisi dan aktivasi bioluminisensi bakteri
terhadap energi bebas Gibbs akibat pengambilan elektron dari kation logarn berat.
Korelasi yang dihasilkan akan digunakan untuk mengidentifikasi kadar logam berat di
air.
IV.1. Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan pada tiga tempat, pertarna di Laboratorium Fisika

UNP untuk menganalisa data-data menggunakan sebuah komputer yang telah diinstal
dengan paket program MATLAB versi 7.0. I -24704 (Release 14), kedua di Laboratorium
Biofisika ITB Bandung untuk preparasi bakteri Photobacterium phosphoreum dan ketiga
Kelompok Penelitian dan Pengembangan (KPP) Bioteknologi-ITB yang menyediakan
layanan untuk karakterisasi sarnpel dengan menggunakan peralatan spektrofotometer
fluorosensi model F-2000.

IV.2. Bahan Penelitian
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini ialah bakteri Photobacterium

phosphoreum yang telah diisolasi dari organ cahaya cumi dan senyawa logam berat
(kobalt, tembaga, timah, merkuri, dan mangan). Bahan dasar bakteri Photobacterium

phosphoreum diperoleh atas kebaikan Dr.1r. Delianis Pringgenis, M.Sc dari Jurusan Ilmu

Kelautan- Universitas Dipenegoro dan bahan dasar senyawa logarn berat dibeli dari

SIGMA.

j

N.3.
Instrumentasi Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer fluorisensi
model F-2000 yang berfungsi mengukur intensitas pemancaran cahaya pada bakteri

Photobactereum phosphoreum dan sebuah komputer mini yang telah diinstal dengan
paket program

MATLAB versi 7.0.1.24704

(Release

14). Skema dari alat

spektrofotometer fluorisensi model F-2000 dapat dilihat pada Gambar IV. 1.

Gambar IVI . Skema spektrofotometer fluorinsensi model F-2000
Cara kerja alat tersebut sebagai berikut : radiasi lampu Xe dikumpulkan ke celah S1 dari
monokromator eksitasi dengan bantuan lensa L1 dan L2. Kemudian dengan bantuan kisi
konkaf eksitasi sinar didispersikan ke celah S2. Berkas eksitasi dari celah keluar S2
kemudian direfleksikan oleh cermin konkaf M1 dan dipecah kedalam 2 berkas dengan
bantuan "splitter" BS. Satu dari berkas eksitasi masuk ke detektor monitor untuk
pengukuran panjang gelombang eksitasi, dan berkas lain dilewatkan ke sample melalui
lensa L3. Fluorisensi yang terjadi akibat di eksitasi oleh berkas sinar dengan panjang
gelombang h dilewatkan ke celah S2 dari monokromator emisi melalui lensa L4 dan L5

/

1

- .

9

dan kemudian didispersikan ke celah S4 dan dikumpulkan pada tabung photomultiplier
melalui cermin konkaf M2 untuk pengukuran intensitas luminesensi.
Untuk rnengukur intensitas pernancaran cahaya pada bakteri Photobac~eriurn
Phosphoreum, tidak diperlukan eksitasi dari lampu Xe. Oleh karena itu celah S1 dan S2
di-off-kan untuk memproteksi berkas lampu Xe
masuk ke sampel.
!

IV.4. Teknik Pengumpulan Data

LBPP yang telah diperoleh dari hasil penelitian sebelumnya (Ratnawulan, dkk,
2005) ,dibagi kedalarn 31 buah bejana gelas kecil ukuran 5 ml dengan perincian
tabung

diarnbil

sebagai

kontrol

dan

,diukur

intensitas

cahayanya

1

dengan

spektrofluorometer melalui injeksi cepat dari 1 ml dari 5 XIO-' M FMNH2 pada 1,2 mi
dari c ampuran reaksi mengandung luciferase, dodekanal, 0,2 % BSA dan oksigen dalam
buffer fosfat 0,02 M pada pH 7. Aldehid ditambahkan dalam jumlah optimal (sekitar 100
pL) . Satuan berkenaan aktivitas enzirn yang didapatkan dari pengukuran intensitk
cahaya ini dinyatakan dalam quanta sec-' rnl-' enzim, diukur sebagai intensitas
maksimum awal pada saat pencampuran pada suhu 2 5 ' ~ .Sedangkan 30 tabung yang lain
dibagi menjadi 5 bagian dan dilabel dengan cobalt (yang terdiri dari 6 tabung dengan
konsentrasi cobalt yang berbeda), tembaga (yang terdiri dari 6 tabung dengan konsentrasi
tembaga yang berbeda-beda), timah (yang terdiri dari 6 tabung dengan konsentrasi timah
yang berbeda-beda), merkuri (yang terdiri dari 6 tabung dengan konsentrasi merkuri yang
berbeda-beda) dan mangan (yang terdiri dari 6 tabung dengan konsentrasi mangan yang
berbeda-beda). Pembacaan intensitas dengan spektrofluoromcter untuk semua sampel di
lakukan setelah carnpuran 1,2 ml dari c ampuran reaksi mengandung luciferase,
dodekanal, 0,2 % BSA, dan oksigen dalam buffer fosfat 0,02 M pada pH 7, aldehid I00
pL dan 20 p1 larutan senyawa logam berat diinjeksi dengan 1 ml dari 5 xl0-5 M FMNH2
pada untuk 15 menit. Hasil pengumpulan data akan mendapatkan nilai intensitas
bioluminsensi dan quantum yield terhadap konsentrasi logam berat.

IV.5. Teknik Analisis Data
Nilai intensitas maksimum bioluminisensi dalam kehadiran senyawa logam berat
dengan konsentrasi molar tertentu (I,,)

akan dibandingkan dengan nilai intensitas

bioluminisensi tanpa senyawa logarn berat (Io,

Perbandingan (I,,/Io,,,)

kemudian

ditulis ulang sebagai (100). Pengaruh kehadiran senyawa logam berat pada sistem
biolurninisensi bakteri akan dianalisis dengan parameter-parameter yang didefinisikan
berikut ini: (IIIo),,

adalah perbandingan maksimum dari nilai intensitas bioluminisensi

dengan dan tanpa kehadiran senyawa logam
.. - berat. Nilai parameter inhibisi intensitas
bioluminisensi K,! dapat dihitung dengan menggunakan persamaan kurva peluruhan
berikut :

(IV. 1)
dimana C adalah konsentrasi senyawa logam berat dan A adalah konstanta normalisasi.
Sedangkan nilai parameter aktivasi intensitas bioluminisensi K,' dihitung dengan
memakai persamaan berikut

dimana a adalahpower indeks .

Quantum yield bioluminisensi Q didefinisikan sebagai daerah dibawah kurva
peluruhan (intensitas terhadap waktu). Quantum yield dalam kehadiran senyawa logam
berat dengan konsentrasi tertentu ditulis (Q) akan dibandingkan dengan nilai quantum

yield tanpa senyawa logam berat (Qo). Sehingga nilai parameter inhibisi yield cahaya

;

bioluminisensi K,? dapat dihitung dengan memakai persamaan benkut:

1

dimana C adalah konsentrasi senyawa logarn berat dan B adalah konstanta normalisasi.
Sedangkan nilai parameter aktivasi yield cahaya bioluminisensi K:

I

dihitung

menggunakan pertambahan awal dari kurva peluruhan dengan memakai persamaan

(

berikut:

i

dimana

p

adalah power indekr . Nilai K,', K ~ , K $ K
, $ , ~ , P pada pers. (IV.3) akan

dihitung menggunakan pemodelan kedepan atau inversi dengan bantuan paket program

MATLAB versi 7.0.1.24704 (Release 14).

Secara energetika, mekanisme biolurninisensi terjadi ketika sebagian besar dari
reaksi kimia yang eksoterm (AG) diubah kgdalam energi eksitasi elektronik (*) dari
produk reaksi dan kemudian memancarkan cahaya dengan energi (hv). Untuk ringkasnya
prosesnya dapat dirumuskan sebagai berikut :
*-

AG +*+hv
Langkah AG

+*

(IV.4a)

disebut dengan langkah kemieksitasi dan langkah *+hv disebut

dengan langkah luminisensi. Persyaratan lain adalah AG menghasilkan energi yang cukup
untuk membentuk keadaan eksitasi (Garcia, dkk., 2001) dan persyaratan energi dapat
ditentukan dalarn bentuk

1

AG2 hclh,,

(IV.4b)

dimana hexadalah batas panjang gelombang untuk mengeksitasi spesies luminisensi.
Pengaruh dari kation senpawa logam berat pada distribusi kerapatan elektron

!

dalarn sistem bioluminisensi dinyatakan dengan energi bebas Gibbs pengambilan

(

elektron dari kation logam berat AGO (e)

dimana AG("-')' adalah energi bebas standar pembentukan kation yang bermuatan (n)-

I

dan dan AGn+ adalah energi bebas standar pembentukan kation yang bermuatan (n-lyang
dihitung berdasarkan energi-energi pembentukan standar kation-kation dari atom-atom
bebas dalam vakum dan energi-energi hidrasi standar dari kation-kation logam berat
(Kudryasheva, dkk., 2004).
Energi bebas Gibbs (AG) akan ditentukan berdasarkan nilai berat molekul dan
berat anionkation dari senyawa logam berat. Nilai energi elektron yang diarnbil dari

I

kation dari setiap senyawa logarn berat AG'(~)dihitung menurut pers. (1V.4~).Koefisien
inhibisi dan aktivasi dari sistem bioluminisensi K,' , K,' , K,Q, dan K:

Kemudian

dibandingkan dengan energi bebas Gibbs pengambilan elektron dari kation logam berat
AGO(e). Korelasi yang dihasilkan akan rnenjelaskan pengaruh kation-kation setiap logam
berat pada proses transfer elektron dan pembentukan keadaan eksitasi dalam sistem
I

bioluminisensi

.

Untuk interpretasi data, Kudryasheva, dkk., (2004) memberikan kriteria bahwa
kation senyawa asing dengan

AGO

(e) >1 00 , kJImo1 akan mengaktivasi bioluminisensi

yang setara dengan KO.
..-

AGO

(e) 4 0 0 kJ/mol

BAB V.,HASIL DAN PEMBAHASAN
Tahun pertama penelitian ini
ilmiah pengaruh kation logam berat

dikonsentrasikan untuk menemukan landasan
pada

distribusi rapat elektron dalarn sistem

bioluminisensi bakteri Photobacterium phosplioreum. Tiga langkah utama yang telah
dilakukan dalam penelitian tahun I ini terdiri dari (1) pemesanan dan pengadaan sejumlah
bahan pokok yang digunakan dalam eksperimen pengaruh kation logam berat
distribusi

rapat elektron

dalam

sistem bioluminisensi

bakteri

pada

Photobacterium

phosphoreum, (2) mendapatkan bahan aktif (LBPP) penyebab pemancaran cahaya bakteri
Photobacterium phosphoreum, (3) Penentuan distribusi rapat elektron LBPP sebelum
diberi logarn berat, (4) pengukuran intensitas bioliuminisensi bakteri Photobacterium

phosphoreum akibat diberi berbagai jenis logam berat dengan konsentrasi logam berat.,
( 5 ) penentuan koefisien inhibisi dan aktivasi intensitas bioluminisensi, (6) analisis
landasan ilmiah pengaruh kation logam berat pada
sistem

bioluminisensi

bakteri

distribusi rapat elektron dalarn

Photobacterium phosphoreum.

Adapun

riincian

pelaksanaannya dapat diuraikan sebagai berikut :
(1) Isolasi dan Pemurnian LBPP

Bakteri Photobacterium phosphoreum diisolasi dari curni spesifik Indonesia jenis

Loligo duvace/li. Bakteri ini dikultur pada medium padat yang terdiri dari 3g extract
Bacto, 5g peptone-bacto, 15g agar bakto, 30g NaCI, 3 ml glyserol; 1 liter air suling dan
NaOH secukupnya untuk mengatur pH 7.0. Kultur dilanjutkan pada 5 liter medium cair
yang terdiri dari

1 liter air suling; 30 g NaCI, 14g Na2HP04.7H20, 2g KH2P04, 0,5 g

(NH4)2HP04,0,2 g MgS04.7H20,3 ml glyserol, 5g triptone bacto, 5g ekstrak ragi bacto
dan NaOH secukupnya untuk mengatur pH 7.0.
Proses penumbuhan bakteri Photobacterium phosphoreum dilakukan dengan
mengukur secara langsung kultur dengan metode spektrofotometer UV-VIS. Sebanyak
satu ose bakteri Photobacteriumphosphoreum ditanam dalam media padat dan diinkubasi
pada suhu kamar selama 24 jam hingga terbentuk koloni tunggal. Koloni tunggal tersebut
dicuplik dan diingkubasi kedalam lOOml media cair selama 20 jam dengan kecepatan

1

putar 200 rpm pada suhu kamar. Sebanyak 4,5 ml kultur hasil inkubasi pada media

:

pertama dipindahkan ke dalam' 450 ml meqia cair kedua dan diingkubasi dengan
kecepatan putar 200 rprn pada suhu larnar selama 20 jam. Seiring berjalannya inkubasi

I

i

secara bersamaan dilakukan sampling pengukuran waktu untuk mengetahui kerapatan sel
setiap dua jam

1

I

selama 24 jam. Hasil sampling tersebut ditentukan dengan
'_

I

spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 660nm. Sel dipanen pada kerapatan
s e l 4 x lo-' seWml.
Stok Sel bakteri yang diproleh dari hasil sampling disentrifugasi dengan
kecepatan putar 6000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 OC, agar cairan fermentasi dan
supematannya terpisah. Supernatan dicuci dengan air suling dingin sebanyak tiga kali
untuk menghilangkan sisa-sisa media dan sel-sel yang mati. Setiap kali pencucian,
* dilakukan sentrifugasi dan penimbangan untuk mengetahui berat molekul supernatan

yang tertinggal. Kemudian supematan tersebut disuspensi dalam larutan buffer fosfat
0,05 M pH 7 (sebanyak 1 gram sel basah dalam 5 ml buffer fosfat) selama 20 jam.
Supematan yang telah disuspensi tersebut dipecah dengan alat sonikasi selama 5 menit
dalam keadaan dingin sebanyak 5 kali. Hasil sonikasi diinkubasi kembali selama 1 jam,
yang selanjutnya disentrifugasi selama 20 menit pada kecepatan putar 12.000 rpm pada
4 ' ~ .Ekstrak kasar yang diperoleh dilihat larik proteinnya dengan elektroforesis.

I
I

I

Untuk mengendapkan protein yang ada di ekstrak kasar dilakukan fiaksionasi
ammonium sulfat dengan derajat kejenuhan 25-85%. Penambahan ammonium sulfat
dilakukan sambil mengaduk-aduk larutan ekstrak kasar secara perlahan dengan pengaduk
magnet pada 4

OC.

Larutan ekstrak kasar kemudian didiamkan selarna satu malam sambil

diaduk secara perlahan agar pengendapan berlangsung sempurna. Untuk memisahkan
endapan dengan supematan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan putar 7000 rprn