Ekstrak etanolik bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) sebagai agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks (HeLa) melalui regulasi BCL 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
EKSTRAK ETANOLIK BUNGA KRISAN (Chrysanthemum indicum L.) SEBAGAI
AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)
MELALUI REGULASI BCL-2
SKRIPSI
Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
!
Diajukan oleh:
Maria Nareswari
NIM: 138114002
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
EKSTRAK ETANOLIK BUNGA KRISAN (Chrysanthemum inicum L.) SEBAGAI
AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)
MELALUI REGULASI BCL-2
SKRIPSI
Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
!
Diajukan oleh:
Maria Nareswari
NIM: 138114002
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017
!
i!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
And$when$you$want$something,$all$the$universe$conspires$in$helping$
you$to$achive$it$–$Paulo$Coelho$“The$Alchemist”$
$
Saat>saat$yang$luar$biasa$sulit$dalam$perjuangan$adalah$pertanda$
bahwa$kesuksesan$sudah$mendekat$–$Merry$Riana$
$
!
$
iv!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Kuasa penulis panjatkan atas segala berkat, rahmat,
dan limpahan kasih-Nya yang luar biasa sehingga penulis dapat menyelesaikan naskah
skripsi yang berjudul “Ekstrak etanolik bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) sebagai
agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks HeLa melalui regulasi Bcl-2” sebagai syarat
memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Penulisan skripsi ini mendapat dukungan dan bantuan dari berbagai pihak, sehingga penulis
mengucapkan terima kasih kepada :
1.! Ibu Dr. Riris Istighfari Jenie, M.Si., Apt, selaku dosen pembimbing skripsi yang telah
banyak membantu dalam berbagai ilmu, pengetahuan, dan wawasan, serta bersedia
meluangkan waktu, tenaga dan pikiran untuk berdiskusi dan mengarahkan serta
memberi semangat dan meyakinkan penulis dalam penyusunan skripsi ini.
2.! Ibu Dr. Erna Tri Wulandari., Apt., dan Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku
dosen penguji atas semua saran, dan dukungan yang membangun.
3.! Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt, selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma yang telah memberikan izin kepada peneliti.
4.! Komisi Etik Universitas Gadjah Mada, yang telah memberikan ijin untuk melakukan
penelitian.
5.! Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan
ilmu pengetahuan dan bimbingan kepada penulis selama proses perkuliahan.
6.! Bapak Wagiran selaku laboran di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia di Universitas
Sanata Dharma dan Ibu Atin selaku laboran di Laboratorium Parasitologi Universitas
Gadjah Mada yang telah membantu peneliti selama melakukan penelitian di
laboratorium.
7.! Bapak Angelo Karmayogi, Ibu Maudy Maria, Adikku Maria Sekartaji, dan seluruh
keluargaku sumber semangat, yang selalu berdoa, memberikan kasih sayang dan cinta,
dukungan, perhatian, kesabaran dalam membimbing penulis dari awal hingga
berakhirnya penulisan ini.
8.! Teman-teman seperjuangan skripsi Fira Elsa Septiana dan Lela Fransisca Adi Liana
yang selalu berjuang bersama dan saling memberikan semangat.
9.! Sahabat-sahabat yang selalu menemani dalam organisasi maupun proses perkuliahan
Enggar, Kenny, Liana, Atika, Axl, Santi, Agnes dan seluruh teman-teman FSMA dan
FKKA atas semua hiburan dan selalu mengingatkan penulis selama ini.
!
vii!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10.! Sahabat dan teman bermain Nonik, Feli, Raviano yang selalu membantu dan selalu ada
bagi penulis serta memberikan semangat untuk menyelesaikan skripsi ini.
11.! Teman-teman FSM A 2013, FKK A 2013 dan semua angkatan 2013 yang telah
bersama-sama berproses dan berbagi suka duka di Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma.
12.! Semua pihak yang telah membantu penulis, yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan serta masih
jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran
yang membangun dari semua pihak. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat
bermanfaat bagi semua pihak terutama di bidang ilmu farmasi.
Yogyakarta, 31 Januari 2017
Penulis
!
viii!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
EKSTRAK ETANOLIK BUNGA KRISAN (Chrysanthemum indicum L.) SEBAGAI
AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)
MELALUI REGULASI BCL-2
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma, Kampus III Paingan, Maguwoharjo, Depok, Sleman,
Yogyakarta, Indonesia 55282
Telp. (0274) 883037, Fax. (0274) 886529
naresca_1704@yahoo.com
ABSTRAK
Kanker serviks memiliki karakter ekspresi berlebih pada protein Bcl-2 sehingga
dapat menghambat proses apoptosis. Cisplatin merupakan obat lini pertama pada kemoterapi
kanker serviks, namun dewasa ini terjadi meningkatnya resistensi cisplatin yang dapat
menyebabkan kegagalan pada kemoterapi. Bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.)
merupakan salah satu tanaman yang memiliki kandungan myricetin, salah satu flavonoid
yang memiliki aktivitas kemoprevensi. Penelitian ini bertujuan untuk untuk melihat
penghambatan ekstrak etanol bunga krisan terhadap viabilitas sel HeLa melalui uji sitotoksik
menggunakan metode MTT, uji flowcytometry Annexin V Flous untuk melihat potensi
ekstrak etanol bunga krisan dalam menginduksi apoptosis pada sel HeLa dan penghambatan
terhadap protein Bcl-2 dianalisis secara semi kuantitatif menggunakan metode
imunositokimia. Hasil uji sitotoksik terhadap sel HeLa dengan metode MTT pada ekstrak
etanol bunga krisan menunjukkan efek sitotoksik lemah pada nilai IC50 700 µg/mL, dan
mampu menginduksi apoptosis sebesar 59% pada konsentrasi ½ IC50 (350 µg/mL) pada uji
flowcytometry. Hasil uji imunositokimia menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga krisan
mampu menekan ekspresi protein Bcl-2 dengan kuat pada konsentrasi 125 µg/mL. Hasil ini
menunjukkan ekstrak etanol bunga krisan memiliki efek sitotoksik lemah dan menyebabkan
kematian secara apoptosis salah satunya dengan menekan ekspresi protein Bcl-2.
Kata kunci: Kanker serviks, Bcl-2, Chrysanthemum indicum L, sel HeLa
!
ix!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Chrysanthemum indicum L. ETANOLIC EXTRACT AS CHEMOPREVENTION
AGENT TOWARDS HeLa CANCER CELLS THROUGH BCL-2 REGULATION
Faculty of Pharmacy
Sanata Dharma University, Campus III Paingan, Maguwoharjo, Depok, Sleman,
Yogyakarta, Indonesia 55282
Telp. (0274) 883037, Fax. (0274) 886529
naresca_1704@yahoo.com
ABSTRACT
Cervical caner has a character of over expression of Bcl-2 protein that could be
inhibit apoptosis. Cisplatin is the first line medication for cervical cancer chemotherapy,
eventually nowadays cisplatin resistance leads to the failure of chemotherapy.
Chrysanthemum indicum L. flowers is one of many plants that contain myricetin one of
flavonoids that has chemoprevention activity. The aim of this study is to determine the
chemoprevention activity of Chrysanthemum indicum L etanolic extract towards HeLa
cervical cancer cells with MTT to see HeLa viability, followed by flowcytometry with
Annexin V Flous to analyze the activity of Chrysanthemum indicum L etanolic extract that
undergo apoptotic cell and the expression of Bcl-2 is being analyzed using
immunocytochemistry. Chrysanthemum indicum L etanolic extract shows weak cytotoxic
activity on HeLa with IC50 of 700 µg/mL and induced 59% apoptosis at 350 µg/mL, as
determined by flowcytometry. Imunocytochemistry shows that Chrysanthemum indicum L
etanolic extract at 125 µg/mL reduce the expression of Bcl-2 firmly. Result shows that
Chrysanthemum indicum L etanolic extract shows weak cytotoxic activity and cause death
with an apoptotic pathway by reduce the expression of Bcl-2.
Keywords: Cervical cancer, Bcl-2, Chrysanthemum indicum L, HeLa cells.
!
x!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
!
HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. ii
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................ . iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................. v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. vi
PRAKATA.......................................................................................................... vii
ABSTRAK .......................................................................................................... ix
ABSTRACT.......................................................................................................... x
DAFTAR ISI....................................................................................................... xi
DAFTAR TABEL............................................................................................... xiii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xv
PENDAHULUAN .............................................................................................. 1
METODOLOGI PENELITIAN.......................................................................... 2
Bahan penelitian ............................................................................................. . 2
Alat penelitian ................................................................................................ . 2
Determinasi dan ekstraksi .............................................................................. . 3
Pembuatan Larutan Uji .................................................................................. . 3
Panen Sel ........................................................................................................ . 3
Uji Sitotoksik dengan MTT ........................................................................... . 4
Uji Apoptosis dengan Flowcytometry ........................................................... . 4
Uji Imunositokimia ........................................................................................ . 4
Analisis Hasil ................................................................................................. . 5
Analisis Nilai IC50 ..................................................................................... . 5
Analisis Uji Apoptosis............................................................................... . 5
Analisis Uji Imunositokimia ..................................................................... . 6
HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 6
Determinasi dan Ekstraksi Bunga Krisan ...................................................... . 6
Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa dengan MTT ......... . 7
Uji apoptosis dengan Flowcytometry ............................................................. . 9
!
xi!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Uji Imunositokimia ........................................................................................ . 11
KESIMPULAN ................................................................................................... 13
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 14
LAMPIRAN........................................................................................................ 17
BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 26
!!
!
!
xii!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR TABEL
Tabel I.
Hasil Uji Apoptosis Menggunakan Flowcytometry dengan
Pewarnaan Annexin V Flous ...........................................................
Tabel II.
Distribusi Ekpresi Bcl-2 pada Sel HeLa dengan Berbagai
perlakuan ..........................................................................................
!
9
xiii!
11
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Morfologi sel HeLa .........................................................................
7
Gambar 2. Efek sitotoksik cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap
sel HeLa ...........................................................................................
7
Gambar 3. Hasil induksi apoptosis cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan
terhadap sel HeLa.............................................................................
9
Gambar 4. Efek perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap
ekspresi Bcl-2 terhadap sel HeLa.....................................................
!
xiv!
10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Gambar bunga krisan yang digunakan dan proses ekstraksi ..........
18
Lampiran 2. Pengolahan data uji MTT assay......................................................
19
Lampiran 3. Dokumentasi Uji Apoptosis ...........................................................
20
Lampiran 4. Dokumentasi Uji Imunositokimia ..................................................
23
Lampiran 5. Surat keterangan hasil determinasi tanaman krisan ........................
24
Lampiran 6. Surat Ethical Clearance..................................................................
25
!
xv!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PENDAHULUAN
Kanker serviks berkembang menjadi masalah kesehatan bagi wanita di Indonesia
yaitu dengan prevalensi kedua tertinggi setelah kanker payudara. (Nuranna et al., 2015).
WHO (2015) juga menyebutkan bahwa kanker serviks menduduki urutan keempat pada
kanker yang sering terjadi pada wanita di belahan benua Australia, Eropa, Asia dan Afrika.
Kanker serviks disebabkan oleh infeksi HPV (Human Papiloma Virus) 18 dan 16 sehingga
terjadi gangguan pada regulasi sel. HPV 16 dan 18 mengekspresikan protein E6 dan E7 yang
memiliki kemampuan untuk menekan aktivitas p53 sebagai tumor suppressor gen. Hal itu
menyebabkan protein pro-apoptosis (Bax dan Bad) yang di aktivasi oleh sinyal dari p53
menjadi tidak aktif, sehingga muncul ekspresi berlebih dari protein anti-apoptosis (Bcl-xL
dan Bcl-2) yang menyebabkan terjadinya kanker (Kho et al., 2013)
Pengobatan kanker serviks yang dilakukan selama ini adalah dengan terapi radiasi,
kemoterapi, dan terapi dengan antibodi monoklonal. (National Cancer Institute, 2015).
Cisplatin merupakan salah satu agen kemoterapi untuk kanker serviks, namun dewasa ini
dengan meningkatnya resistensi cisplatin sering menyebabkan kegagalan pada kemoterapi.
Peningkatan dosis cisplatin untuk mengatasi resistensi terbukti tidak efektif karena pasien
akan mengalami dose-dependent toxicity dan kerusakan jangka panjang pada ginjal serta
menyebabkan terjadinya ototoksisitas yang akan menyebabkan penurunan kualitas hidup
pada pasien (Leisching et al., 2015). Maka dibutuhkan agen kemopreventif untuk mencegah
berkembangnya kanker serviks sedini mungkin.
Kemopreventif merupakan senyawa alami atau sintesis yang dapat menghambat dan
mencegah perkembangan kanker. Tujuan utama dari penggunaan agen ini adalah
menurunkan angka kejadian kanker dan mencegah terjadinya kanker. Agen kemopreventif
juga memliki target molekuler, yaitu protein anti apoptosis, jalur aktivasi angiogenesis, dan
protein inflamasi seperti COX-2. (Sharma et al., 2012). Bunga krisan (Chrysanthemum
indicum L.) berpotensi untuk dikembangkan menjadi agen kemopreventif pada kanker
serviks karena mengandung myricetin, salah satu flavonoid yang dapat menurunkan regulasi
dari protein anti-apoptosis yaitu Bcl-2, dan meningkatkan regulasi dari protein pro-apoptosis
yaitu Bax (Kim et al., 2014). Bcl-2 merupakan protein membran intraseluler yang mencegah
terjadinya apoptosis sehingga dapat memperpanjang masa hidup sel dan mengakibatkan
terjadinya kanker (Chipuk et al, 2008). Li et al (2009) berhasil mengekstrak bunga krisan
dengan etanol 95% dan ekstrak tersebut mampu menghambat proliferasi pada sel kanker
hepar manusia (MHCC97H) dengan selektif, yaitu tidak bersifat toksik terhadap sel
!
1!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
hepatosit tikus dan sel endothelial manusia (ECV304).
Penelitian ini dirancang untuk mengetahui potensi kemoprevensi bunga krisan yang
diekstrak dengan etanol 95% pada sel kanker serviks HeLa, yaitu sel serviks yang memiliki
gen p53 dengan tipe wild type. Infeksi HPV 18 pada sel HeLa meyebabkan penurunan pada
fungsi p53 pada HeLa sehingga aktivitas induksi apoptosis pada sel HeLa menjadi terganggu
(Kho et al., 2013). Mekanisme aksi ekstrak bunga krisan diamati melalui uji sitotoksik,
induksi apoptosis dan imunositokimia pada protein regulator apoptosis Bcl-2. Hasil dari
penelitian ini diharapkan peneliti mendapatkan bukti ilmiah untuk mengembangkan ekstrak
etanol bunga krisan sebagai agen kemopreventif terhadap kanker serviks.
METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Senyawa uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah bunga krisan yang diperoleh
dari Asta Bunda, Kaliurang, Yogyakarta, ekstrak etanol bunga krisan, sel kanker serviks
HeLa yang didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah
Mada. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 95% (teknis), Media Kultur Medium
DMEM 10% (Gibco), Tripsin EDTA 0,25%, PBS (Phosphat Buffer Saline), SDS (Sodium
Dodecyl Sulfate) 10% dalam HCl 0,01 N, DMSO (Merck) 0,5%, akuades, Cisplatin
(10mg/10mL) sebagai kontrol positif yang didapat dari Kalbe Farma, metanol 70%, reagen
Annexin V Fluos staining kit (Roche) (100 mL, binding buffer 2 mL Annexin V : 2 mL
propium iodide (PI)), reagen MTT (Sigma) 5 mg/mL, primary monoclonal antibody mouse
anti human Bcl-2 Oncoproteini (Dako), biotinylated universal secondary antibody
(Biocare), Mayer Hematoxylin (Dako), xylol, substrat DAB.
Alat Penelitian
Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas steril
(Pyrex), blender, neraca digital, rotary evaporator (buchi Labortechnik AG CH-99230),
waterbath (Memmert), alumunium foil, conical tube, autoklaf (Hirayama), 96 well-plate
(Iwaki), 24 well-plate (Iwaki), cover slip, object-glass, inkubator CO2 (Thermo Heraeus
HeraCell 150), Laminar air flow cabinet (Labconco), pinset (Gilson), mikropipet,
hemositometer (Neubauer), ELISA reader (Bio-Rad), kamera digital (Canon 550D),
mikroskop cahaya (Olympus), mikroskop inverter (Olympus), flowcytometry (FACS
Calibur)
!
2!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Determinasi dan Ekstraksi
Determinasi dilakukan di laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi
Universitas Gadjah Mada. Bagian yang di determinasi adalah tanaman utuh mulai dari akar
hingga bunga. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah
bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) (Lampiran 1). Bunga krisan yang dipilih
berwarna kuning dengan usia 13 minggu kemudian dipisahkan dari tangkainya dicuci
dengan air mengalir, lalu dikeringkan dengan oven dalam suhu 400C selama 2 minggu.
Bunga yang sudah kering dihancurkan dengan blender hingga berbentuk serbuk. Serbuk
bunga krisan sebanyak 80 gram diekstraksi dengan metode refluks menggunakan 150 mL
etanol 95% selama 3 jam. Proses ini diulang dua kali, ektrak etanol bunga krisan krisan
dipekatkan menggunakan rotary evaporator, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan
waterbath pada suhu 80OC sampai etanol menguap dan mencapai bobot tetap (Li et al.,
2009).
Pembuatan larutan uji
Ekstrak etanol kental ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan kedalam 100
µl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000 µg/ mL.
Selanjutnya dibuat lima seri kadar yaitu 1000, 500, 250, 125, 62 µg/ mL.
Cisplatin dengan konsentrasi 10 mg/10mL diambil sebanyak 1 mL sehingga
diperoleh Cisplatin dengan konsentrasi 1000 µg/mL. Kemudian diencerkan dengan media
kultur DMEM dan dibuat seri kadar pengenceran 5, 10, 20, 39, 78 µg/mL (CCRCa, 2009 ;
Li et al., 2009).
Panen sel
Sel HeLa ditanam dan diinkubasi dalam tissue culture dish hingga konfluen,
kemudian media kultur dibuang terlebih dahulu menggunakan mikropipet. PBS
ditambahkan ke dalam cawan petri untuk mencuci, kemudian dibuang dan ditambahkan
tripsin 0,5 mL secara merata dalam cawan petri. Cawan petri ditutup dan didiamkan di dalam
inkubator selama 3 menit hingga sel terlepas. Sel ditampung pada conical tube, disentrifugasi
10 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan dibuang diberi media DMEM 2 mL,
dicuplik sedikit diamati di bawah mikroskop dengan haemocytometer untuk menghitung
jumlah sel yang diperlukan selama pengujian.
Perhitungan+jumlah+sel =
!
Jumlah+sel+kuadran+1 + 2 + 3 + 4
+9+10;+ /=>
4
3!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Setelah diketahui jumlah sel, sel diambil sesuai dengan jumlah sel yang diperlukan untuk
masing-masing uji (CCRCb, 2009 ; Ham et al., 2014).
Uji Sitotoksik ekstrak bunga krisan pada sel HeLa
Sel dengan populasi 1.104 sel/well ditanam pada sumuran 96 well plate (Iwaki),
masing-masing 100 µL. Sisakan 3 sumuran kosong untuk kontrol sel, kontrol pelarut dan
kontrol media. Kemudian inkubasi sel pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C selama 24
jam. Setelah 24 jam, media dibuang dan sel diberi ekstrak etanol bunga krisan 100 µL
(konsentrasi 1000, 500, 250, 125, 62 µg/mL) dan cisplatin 100 µL (konsentrasi 78, 39, 20,
10, 5, 2,5 µg/mL) lalu diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, media kultur dibuang lalu
diberi MTT 100 µL dengan konsentrasi 5 mg/mL dan diinkubasi selama 4 jam pada
inkubator CO2 5% dengan suhu 370C, setelah itu diberi reagen stopper SDS 10% dalam 0,1
N HCl kemudian plate dibungkus dengan alumunium foil dan diinkubasi pada suhu ruangan
selama 24 jam setelah itu dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm
(CCRCc, 2009 ; Huang et al., 2015).
Uji Apoptosis
Sel dengan populasi 1.106 sel/well ditanam pada sumuran 6 well plate (Iwaki),
masing-masing 2 mL, diinkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Sel
diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan 2 mL dengan konsentrasi 125 µg/mL, lalu
diinkubasi 24 jam. Well-plate dicuci dengan 10% PBS 1 mL dan ditampung pada conical
tube, lalu diberi 200 µL tripsin, inkubasi selama 3 menit dan amati dibawah mikroskop
apakah sel sudah terlepas. Apabila sudah terlepas, tambahkan media kultur 1 mL pada well
plate lalu ditampung kembali ke dalam conical tube kemudian disentrifugasi selama 10
menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan dibuang, sisa endapan diberi PBS dingin 1
mL kemudian resuspensi campuran dan dipindahkan ke dalam microtube 1 mL kemudian
diberi reagen Annexin V Fluos staining kit (Roche) (100 mL binding buffer, 2 mL Annexin
V : 2 mL propium iodide (PI)), kemudian sampel dianalisis mengunakan flowcytometry
(FACS Calibur) (CCRCd, 2009 ; Huang et al., 2015).
Imunositokimia
Sel dengan populasi 2.105sel/well dengan volume 200 µL ditanam pada sumuran 24
well plate (Iwaki) yang telah diberi cover slip lalu diinkubasi selama 30 menit, setelah itu
tambahkan 800 µL media kultur kedalam sumuran secara perlahan dan diinkubasi 24 jam
pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Sel diberi perlakukan dengan menambahkan 1
mL sampel konsentrasi 125 µg/mL dan diinkubasi selama 24 jam pada inkubator CO2 5%
!
4!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dengan suhu 370C. Cover slip diberi PBS lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian
difiksasi menggunakan metanol 300 µL selama 10 menit lalu dibuang dan diberi PBS 1 mL,
diamkan 5 menit kemudian dibuang. Cover slip, diberi hidrogen peroksida 1 mL selama 10
menit lalu dibuang dan cuci dengan aquadest kemudian diberi PBS. Cover slip diberi larutan
blocking 20 µL selama 10 menit lalu dibuang, diberi antibodi primer 50 µL selama 1 jam
setelah itu dibuang dan diberi PBS, diulang dua kali. Kemudian cover slip diberi antibodi
sekunder 30 µL selama 20 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Setelah itu diberi streptavidin
30 µL selama 10 menit lalu tambahkan PBS lalu inkubasi 2 menit dan diulang dua kali.
Cover slip diberi larutan DAB (diaminobenzidin) 50 µL diinkubasi 7 menit dan diberi
aquadest lalu dibuang setelah itu ditambahkan dengan MayeHematoxylin selama 3 menit dan
diberi aquadest lalu dibuang. Cover slip diangkat dengan pinset, dicelupkan kedalam xylol
dan alkohol kemudian dikeringkan dan diletakkan di atas object glass lalu di tetesi dengan
lem dan ditutup dengan cover slip kotak dan diamati dengan mikroskop cahaya (CCRCe,
2009 ; Guimarães et al., 2005)
Analisis hasil
Analisis IC50
Data absorbansi pada tiap sumuran dari hasil uji MTT diperlukan untuk dikonversi
menjadi presentase sel yang hidup. Presentase sel yang hidup (% viabilitas) dihitung
menggunakan rumus:
%+Viabilitas =
Absorbansi+perlakuan − Absorbansi+kontrol+media
+x+100%
Absorbansi+kontrol+sel − Absorbansi+kontrol+media
Data yang diperoleh diolah untuk mendapatkan nilai IC50 dengan membuat regresi
linear konsentrasi versus persen viabilitas sel dengan menggunakan program Microsoft
Excel (CCRCc, 2009, Nobakht et al., 2014).
Analisis Apoptosis Sel
Pengamatan kuantitatif dilakukan menggunakan alat FACS Calibur yang terhubung
dengan software untuk membaca hasil analisis. Hasil yang didapatkan, kemudian
dikonversikan dalam diagram menjadi warna sel. Sel yang hidup ditunjukkan dengan warna
hijau (Annexin-/PI-), warna kuning menunjukkan sel mengalami early apoptosis
(Annexin+/PI-), dan merah muda menunjukkan sel mengalami late apoptosis (Annexin+/PI+),
dan warna merah menunjukkan sel mengalami nekrosis (Annexin-/PI+) (Hingorani et al.,
2011).
!
5!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Analisis Imunositokimia
Pengamatan kualitatif digunakan untuk mengetahui ekspresi protein Bcl-2. Warna
coklat menunjukkan ekspresi protein Bcl-2 dan warna biru menunjukkan tidak terdapat
ekspresi protein Bcl-2.
Pengamatan seacara semikuantitatif dilakukan dengan level scoring. Pembacaan data
dilakukan dengan bantuan tiga responden blind reader untuk menghitung jumlah sel yang
mengekspresikan Bcl-2 pada preparat yang terdiri dari tiga bagian tiap preparatnya.
%+Ekspresi+Bcl2 =
jumlah+sel+berwarna+coklat
x100%
jumlah+total+sel+satu+lapang+pandang
Level scoring ekspresi Bcl-2 ditentukan dengan : 0 : kurang dari 5% (Sangat Kuat),
1+ : 6% - 25% (Kuat), 2+: 26% - 50% (Sedang), 3+ : 51% - 75% (Lemah), 4+ : 76% - 100%
(Sangat Lemah) (Jing et al., 2015).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Determinasi dan Ekstraksi Bunga Krisan
Determinasi tanaman dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan kebenaran dari
tanaman yang digunakan sebagai sampel. Determinasi dilakukan untuk memastikan bahwa
bunga yang digunakan dalam penelitian ini benar berasal dari tanaman krisan
(Chrysanthemum indicum L.). Bunga dipetik dan dipisahkan dari tangkainya lalu dicuci dan
dikeringkan pada oven dengan suhu 40-500C. Pengeringan bertujuan untuk menghilangkan
kadar air dalam bunga karena air dapat menimbulkan tumbuhnya jamur pada bunga.
Serbuk bunga krisan sebanyak 80 gram diekstraksi dengan metode refluks
menggunakan 150 mL etanol 95% selama 3 jam, proses ini dilakukan selama dua kali. Hasil
refluks yang sudah ditampung dan disaring kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator
kemudian diuapkan diatas waterbath pada suhu 80OC sampai etanol menguap dan mencapai
bobot tetap dengan berat 12,4 gram, setelah itu ekstrak disimpan pada suhu 40C (Li et al.,
2009).
Pada penelitian ini tidak dilakukan uji kandungan kimia pada bunga krisan, namun
diharapkan ekstrak bunga krisan dapat menghambat proliferasi pada sel HeLa karena
menurut penelitian Li et al (2009), bunga krisan yang diekstrak dengan etanol 95% dapat
menghambat proliferasi pada sel kanker hati dengan nilai IC50 1200 µg/mL, dengan hasil
selektif yaitu tanpa menunjukkan toksisitas pada sel normal. Selain itu Wu et al (2008)
menunjukkan bahwa bunga krisan yang diekstraksi dengan etanol 70% mengandung dua
!
6!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
flavonoid utama yaitu quercitrin dan myericetin, dimana myericetin mampu menginduksi
apoptosis pada sel kanker ovarium A2780/CP70 dan OVCAR-3 dengan nilai IC50 yaitu 30
µM dan 20 µM , namun tidak memiliki aktivitas terhadap sel ovarium normal IOSE-364
(Huang et al., 2015). Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk
mengidentifikasi kandungan kimia pada bunga krisan yang diekstraksi dengan etanol 95%
karena perbedaan usia tanaman, tempat tumbuh, waktu panen dan kondisi lingkungan serta
perbedaan metode dan pelarut ekstraksi menyebabkan kandungan yang tersari dari bunga
krisan menjadi berbeda-beda.
Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa dengan MTT
MTT merupakan uji reduksi warna kuning dari 3-(4,5-dimethythiazol- 2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide dengan enzim suksinat dehydrogenase pada mitokondria.
MTT akan masuk kedalam sel dan melewati mitokondria dan direduksi oleh enzim suksinat
dehydrogenase menjadi senyawa yang tidak larut dan membentuk formazan berwarna ungu.
Reduksi pada MTT hanya terjadi pada sel yang masih hidup (mengalami metabolisme secara
aktif) sehingga metode ini dapat digunakan untuk mengukur viabilitas sel. Formazan yang
terbentuk sebanding dengan jumlah sel yang hidup kemudian diukur dengan menggunakan
ELISA reader dengan panjang gelombang 595nm (Riss, et al., 2013).
A
B
C
D
Gambar 1. Morfologi sel HeLa secara mikroskopis dengan perbesaran 100x setelah diberi perlakuan
ekstrak etanol bunga krisan dan cisplatin dengan waktu inkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan
suhu 370C. (A) Morfologi kontrol sel HeLa. (B) Morfologi sel pada perlakuan cisplatin dengan konsentrasi
39 µg/mL. (C) Morfologi sel pada perlakuan ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi 250 µg/mL.
(D) Morfologi sel pada perlakuan ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi 500 µg/mL. Panah warna
biru menunjukkan morfologi sel yang masih utuh, menunjukkan sel yang sudah tidak utuh.
Hasil menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga krisan mampu memberikan efek
sitotoksik terhadap sel HeLa secara dose-dependent, dimana seiring dengan meningkatnya
!
7!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
konsentrasi ekstrak etanol bunga krisan, maka jumlah sel HeLa yang hidup juga semakin
berkurang (Gambar 1), begitu juga dengan cisplatin. Pada uji ini terlihat perbedaan
morfologi sel yang diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan, dimana bentuk sel menjadi
tidak utuh, terlihat bahwa ada beberapa sel yang hanya berbentuk bulat dan setelah diberi
perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan (gambar 2B, 2C dan 2D).
Uji sitotoksik dilakukan sebanyak tiga kali secara independent eksperimen, dimana
pada masing-masing eksperimen terdapat tiga replikasi. Nilai IC50 ekstrak etanol bunga
krisan adalah 700 µg/mL (Gambar 2A), sehingga potensi ekstrak etanol bunga krisan
digolongkan sebagai agen sitotoksik lemah dimana nilai IC50 > 50 µg/mL (Ellithey et al.,
2014). Nilai IC50 dari cisplatin sebagai kontrol positif adalah 36 µg/mL. (Gambar 2B).
Berdasarkan grafik yang diperoleh dari regresi linier menunjukkan bahwa baik perlakuan
cisplatin (Gambar 2A) dan ekstrak etanol bunga krisan (Gambar 2B) mampu menurunkan
viabilitas sel. Sebagai agen sitotoksik lemah, ekstrak etanol bunga krisan dapat ditingkatkan
efikasinya dengan dikombinasikan dengan cisplatin. Diharapkan dengan diturunkannya
dosis cisplatin yang dikombinasikan dengan ekstrak etanol bunga krisan, mampu
menghasilkan efek yang sama dengan dosis awal cisplatin. Namun sebelum melakukan
kombinasi ini diperlukan preformulasi untuk melihat kompatibilitas antara cisplatin dengan
ekstrak etanol bunga krisan
Viabilitas(sel((%)
Viablitas sel (%)
120
100
80
60
40
20
0
A
0
20
40
60
Cisplatin (µg/mL)
140
120
100
80
60
40
20
0
80
100
B
0
200
400
600
800 1000 1200
Ekstrak(etanol(bunga(krisan((µg/mL)((
Gambar 2. Efek sitotoksik cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel HeLa. Sel HeLa
(1.104 sel/well) yang ditanam pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam pada inkubator CO2 5%
dengan suhu 370C, kemudian diberi seri konsentrasi ekstrak etanol bunga krisan dan seri konsentrasi
cisplatin. Viabilitas sel ditentukan dengan metode MTT. (A) Viabilitas sel setelah diberi seri
konsentrasi cisplatin. (B) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi ekstrak etanol bunga krisan.
!
8!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Uji apoptosis dengan Flowcytometry
Annexin V merupakan protein yang dapat berikatan secara spesifik dengan fosfolipid
seperti fosfatidilserine yang biasanya tidak ada di luar permukaan membrane. Pada tahap
early apoptosis, fosfatidilserin akan berpindah ke permukaan membran sehingga Annexin
dapat berikatan dengan fosfatidilserin dan mendeteksi jumlah sel yang mengalami early
apoptosis. Pada tahap late apoptosis, terjadi disintegrasi pada membran sel, sehingga reagen
PI dapat masuk kedalam sel dan berikatan dengan DNA sel, sehingga pada keadaan late
apoptosis, baik Annexin maupun PI akan berikatan dengan membrane dan DNA sel. Pada
tahap nekrosis akan terjadi kebocoran plasma pada sel, kondisi ini menyebabkan reagen PI
yang akan berikatan langsung dengan DNA sel (Hingorani et al., 2011). Flowcytometry
digunakan untuk mendeteksi sel yang sudah diberi label dengan annexin maupun PI. Pada
flowcytomery sel akan ditembakkan dengan sumber cahaya dan menghasilkan fluoresensi
yang berbeda-beda berdasarkan label yang ada pada sel tersebut, sehingga sel dapat
dikelompokkan dan dihitung sesuai populasinya lalu dikonversikan menjadi sebuah grafik
dengan suatu program yang ada pada flowcytometry (Macey, 2007).
Hasil flowcytometry dengan Annexin menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga
krisan mampu meningkatkan peristiwa apoptosis dibandingkan dengan kontrol sel HeLa.
Ekstrak etanol bunga krisan dengan nilai ½ IC50 (350 µg/mL) mampu menginduksi apoptosis
sebesar 58,62%, dimana 14,64% mengalami nekrosis dan jumlah sel yang hidup sebesar
27,01% (Gambar 3C ; Tabel 1) Sel yang mengalami nekrosis diasumsikan mengalami
nekrosis sekunder karena ketika percobaan tidak dilakukan secara in vitro, tidak ada
peristiwa fagositosis dari badan golgi yang merupakan tahap kelanjutan dari peristiwa
apoptosis, sehingga sel yang apoptosis menjadi terdeteksi sebagai nekrosis sekunder
(Demoy et al., 2000).
Hal ini dapat diteliti lebih lanjut dengan menguji apoptosis menggunakan
flowcytometry dengan pewarnaan FLICA, dimana FLICA akan berikatan dengan caspase
sehingga jika terjadi lisisnya dinding sel tanpa adanya aktivitas caspase, maka dipastikan
bahwa jalur induksi pada sel yang diuji adalah melalui jalur nekrosis (Immunochemistry
Technologist, 2015). Selain itu menurut penelitian Li et al (2009) ekstrak etanol bunga krisan
memiliki mekanisme penghambatan secara time dependent, dimana pada dosis yang sama
kematian sel akan meningkat seiring dengan lamanya waktu inkubasi, sehingga pada
penelitian selanjutnya diapat dilakukan optimasi terhadap waktu inkubasi sel HeLa yang
!
9!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan, yaitu beberapa titik waktu sebelum 24 jam
untuk memastikan apakah sel mengalami kematian melalui jalur apoptosis.
Pada cisplatin, sel yang mengalami early apoptosis adalah 25,44%, late apoptosis
10,62%, nekrosis 2,68% dan sel yang masih hidup adalah 2,69% (tabel 1 ; gambar 3B). Hal
ini menunjukkan bahwa cisplatin menginduksi kematian sel melalui jalur apoptosis, dimana
cisplatin meningkatkan aktivitas dari caspase-3 dan-7 (Leisching et al., 2015) Caspase-3
menyebabkan fragmentasi pada sitoskeleton sehingga terjadi kematian sel secara apoptosis
(Elmore, 2008).
R3
R4
R4
A
B
R2
R2
R1
R1
R4
C
R2
R1
Gambar 3. Hasil induksi apoptosis cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan. Sel HeLa (1.106 sel/well)
yang ditanam pada 6 well-plate dan diberi perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan dengan
inkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Sel diwarnai dengan reagen annexin V dan
PI. Sel yang hidup ditunjukkan dengan warna hijau, early apoptosis ditunjukkan dengan warna kuning,
late apoptosis dengan warna merah muda dan nekrosis ditunjukkan dengan warna merah. Hasil dibaca
dengan flowcytometer. (A) Kontrol sel. (B) Sel HeLa dengan perlakuan cisplatin konsentrasi ½ IC50
(18 µg/mL). Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etanol bunga krisan ½ IC50 (350 µg/mL)
Tabel I. Hasil Uji Apoptosis Menggunakan Flowcytometry dengan Pewarnaan Annexin V Flous
Total Sel (%)
Radian 1
Radian 2
Radian 3
Radian 4
Hidup
Awal Apoptosis
Akhir Apoptosis
Nekrosis
Kontrol Sel
88,28
3,55
2,58
5,67
Cisplatin
61,80
25,55
10,62
2,69
Ekstrak Etanol Bunga
27,01
17,82
41,34
14,64
Krisan
!
!
10!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Uji imunositokimia
Imunositokimia merupakan teknik untuk memvisualisasikan keberadaan protein di
dalam sel dengan menggunakan biomolekul berupa antibodi yaitu berdasarkan pada
kemampuan antibodi tersebut untuk mengikat protein dalam sel yang dikenali sebagai
antigen. Ada dua jenis imunostitokimia yaitu imunositokimia langsung dan imunositokimia
tidak langsung. Imunositokimia langsung hanya menggunakan satu antibodi, metode ini
cepat namun tidak cukup sensitif untuk mendetiksi protein karena jumlah protein yang
dideteksi biasanya terlalu kecil untuk menghasilkan sinyal yang kuat. Sensitivitas akan
meningkat dengan menggunakan metode tidak langsung yaitu dengan adanya ikatan pada
antibodi sekunder terhadap komples antibodi primer dan antigen. Peristiwa ini akan
memperkuat sinyal yang ada (Uhlen et al., 2016)
Gambar 4. Efek perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap ekspresi Bcl-2 terhadap sel HeLa
dengan perbesaran 400x. Sel HeLa (2.105 sel/well) ditanam pada 6 well plate yang diberi cover slip, kemudian
diberi perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan dengan inkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5%
dengan suhu 370C. Antibodi primer yang digunakan adalah mouse anti human Bcl-2 Oncoproteini (Dako),
ekspresi Bcl-2 diamati dibawah mikroskop cahaya. (A) Kontrol sel tanpa antibodi Bcl-2. (B) Kontrol sel dengan
antibodoi Bcl-2. (C) Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etanol bunga krisan ¼ IC50 (175 µg/mL). (D) Sel HeLa
dengan perlakuan cisplatin ½ IC50 (18 µg/mL). Panah warna hitam menunjukkan adanya ekspresi Bcl-2,
sedangkan panah warna biru menunjukkan tidak adanya ekspesi Bcl-2 pada sel HeLa.
Uji imunositokimia bertujuan untuk melihat ekspresi dari protein anti-apoptosis Bcl2, yaitu salah satu mekanisme sitotoksik dari ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel HeLa.
Warna coklat pada sitoplasma menunjukan adanya ekspresi protein Bcl-2 pada sel,
sedangkan warna biru menunjukkan tidak adanya ekspresi Bcl-2 pada sel. Intensitas warna
coklat digunakan sebagai parameter semi-kuantitatif untuk menilai ekspresi Bcl-2 dan
menghitung jumlah sel yang mengekspresikan protein Bcl-2. Ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa
dapat dilihat pada gambar 4. Ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi ¼ IC50 (125
!
11!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
µg/mL) mampu menekan ekspresi Bcl-2 dengan kuat (level ekspresi 1+) dan cisplatin
dengan konsentrasi ½ IC50 (18 µg/mL) mampu menekan ekspresi Bcl-2 dengan sangat kuat
(level ekspresi 0).
Tabel II. Distribusi Ekspresi Bcl-2 pada Sel HeLa dengan Berbagai Perlakuan
Lapang
Pandang
Ekspresi Bcl-2 pada
Kontrol Sel tanpa
Lapang
Level
Pandang
Antibodi
Ekspresi Bcl-2 pada
Kontrol Sel dengan
Level
Antibodi
1 (n = 128)
1 (0,78%)
0
1 (n = 105)
105 (100%)
4+
2 (n = 125)
3 (2,4%)
0
2 (n = 97)
97 (100%)
4+
3 (n = 107)
0 (0%)
0
3 (n = 106)
106 (100%)
4+
!
!
Lapang
Ekspresi Bcl-2 pada
Pandang
Perlakuan Cisplatin
Level
Ekspresi Bcl-2 pada
Lapang
Perlakuan Ekstrak
Pandang
Etanol Bunga
Level
Krisan
!
1 (n = 128)
1 (0,78%)
0
1 (n = 350)
21 (6%)
1+
2 (n = 125)
3 (2,4%)
0
2 (n = 345)
23 (6.6%)
1+
3 (n = 107)
0 (0%)
0
3 (n = 300)
20 (6.6%)
1+
!
Menurunnya fungsi p53 pada sel HeLa menyebabkan sel tersebut kehilangan fungsi
supresifnya, akibatnya terjadi ekspresi berlebih pada protein anti-apoptosis, yaitu Bcl-2.
Strategi untuk mengatasi hal ini adalah meningkatkan protein-protein yang bersifat proapoptosis yaitu p21, Hdm2, PUMA, NOXA dan Bax. Bax adalah salah satu protein proapoptosis, dimana meningkatnya Bax akan menurunkan ekspresi dari Bcl-2 sebagai protein
anti-apoptosis (Kroemer et al., 2007). Ekstrak etanol bunga krisan yang pada penelitian
sebelumnya dilaporakan memiliki efek sitotoksik diharapkan mampu menurunkan ekspresi
Bcl-2 sehingga dapat meningkatkan peristiwa apoptosis dan menyebabkan terjadinya
penurunan viabilitas sel akibat dari pemberian ekstrak etanol bunga krisan pada sel HeLa.
Ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi ¼ IC50 (125 µg/mL) mampu
menekan ekspresi Bcl-2 dengan kuat. Hal ini disebabkan karena kemungkinan dari
mekanisme induksi apoptosis bunga krisan adalah melalui jalur caspase-3, dimana aktivasi
dari caspase-3 melalui jalur ekstriksik apoptosis akan menyebabkan terjadinya aktivasi
protein yang menyebabkan transduksi sinyal cascade, sehingga menyebabkan aktivasi
apoptosis secara intrinsik yaitu induksi keluarnya sitorom-c dari mitokondria. Keluarnya
sitokrom-c dari sitoplasma diperantarai dengan aktivitas Bax/Bax sebagai protein proapoptosis. Meningkatnya Bax akan menekan ekspresi Bcl-2 sebagai protein anti-apoptosis.
!
12!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Sitokrom-c akan berikatan dengan Apaf-1, hal ini akan mengaktivasi caspase-9. Caspase-9
menjadi pemicu terjadinya aktivasi caspase-3 dan-7 sehingga akan terjadi fragmentasi dan
menyebabkan kematian sel secara apoptosis (Weyhenmeyer et al., 2012). Namun perlu diuji
lebih lanjut untuk mengetahui hal tersebut, yaitu untuk menghitung jumlah ekspresi Bcl-2
secara kuantitatif pada sel HeLa yang diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan terhadap
sel HeLa.
Pada gambar 4A yaitu kontrol sel tanpa antibodi, morfologi sel terlihat berbeda-beda.
Hal ini disebabkan karena tanpa adanya ikatan antibodi dengan sel menyebabkan pewarna
streptavidin tidak optimal dalam mewarnai sel tersebut. Pewarnaan streptavidin yang tidak
optimal menyebabkan DAB tidak dapat memunculkan reaksi warna coklat dengan jelas,
sehingga bentuk morfologi sel menjadi terlihat berbeda-beda antara satu dengan yang lain
(Colby, 2014).
Kesimpulan
Ekstrak etanol bunga krisan mempunyai efek sitotoksik lemah pada sel kanker
serviks HeLa dengan nilai IC50 sebesar 700 µg/mL serta mampu menginduksi apoptosis
dengan konsentrasi 350 µg/mL dan menekan ekspresi protein Bcl-2 secara kuat pada
konsentrasi 175 µg/mL.
Saran untuk penelitian berikutnya adalah dilakukan uji kandungan senyawa dalam
ekstrak etanol bunga krisan, melihat efek sitotoksik ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel
normal serta efek sinergis dari kandungan ekstrak etanol bunga krisan dan agen kemoterapi.
Selain itu mekanisme induksi apoptosis perlu dikonfirmasi dengan melakukan time course
assay dengan waktu inkubasi kurang dari 24 jam dan perlu dilakukan uji untuk mendeteksi
adanya ekspresi Bcl-2 secara kuantitatif serta penelitian lebih lanjut untuk mengetahui
regulasi mediator lainnya setelah terjadi penekanan ekspresi Bcl-2.
!
13!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Daftar Pustaka
ATCC, 2014, HeLa (ATCC® CCL-2™), American Type Culture Collection, USA,
https://www.atcc.org/products/all/CCL-2.1.aspx, diakses tanggal 20 April 2016
Bo, L., Gao, Y., Rankin, G. O., Rojanasakul, Y., Cutler, S. J., Tu, Y., Chen, Y. C., 2015.
Chaetoglobosin K Induces Apoptosis and G2 Cell Cycle Arrest through p53Dependent Pathway in Cisplatin-Resistant Ovarian Cancer Cells. HHS Public Access,
33(4), 395–401.
Cancer Chemoprevention Research Centera, 2009. Prosedur Tetap: Preparasi Sampel,
Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wpcontent/uploads/03.009.-Preparasi-sampel.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.
Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur TetapPanen Sel, Unversitas
Gajah
Mada,
Yogyakarta,
http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wpcontent/uploads/03.005.-Panen-Sel.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.
Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Uji sitotoksik MTT,
Unversitas
Gajah
Mada,
Yogyakarta,
http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wpcontent/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf, diakses pada tanggal 1 April
2016.
Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Flowcytometry,
Unversitas
Gajah
Mada,
Yogyakarta,
http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wpcontent/uploads/03.014.02-flowcytometry.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.
Cancer Chemoprevention Reasearch Centere, 2009. Prosedur tetap pengamatan ekspresi
protein dengan metode imunositokimia, Universitas Gajah Mada, Yogyakarta,
http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.012.-Imunositokimia.pdf,
diakses tanggal 14 April 2016.
Colby, D., 2014. A Guide to Successful Immunohistochemistry, Cell Signalling Technology,
http://kromat.hu/UserFiles/files/patologia/Dako_IHC_metodikai_kézikönyv_I.pdf,
diakses tanggal 22 Februari 2017
Chipuk, J. E., Green, D. R., 2008. How do BCL-2 proteins induce mitochondrial outer
membrane permeabilization. Trends Cell Biology, 18(4), 157–164.
Comalada, M., Camuesco, D., Sierra, S., Ballester, I., Xaus, J., Gálvez, J., & Zarzuelo, A.,
2005. In vivo quercitrin anti-inflammatory effect involves release of quercetin, which
inhibits inflammation through down-regulation of the NF-κB pathway. European
Journal of Immunology, 35(2), 584–592.
Demoy, M., Minko, T., Kopenckova, P., Kopecek, J., 2000. Time and concentration
dependent apoptosis and necrosis induced by free and HPMA copolymerbound
doxorubicin in human ovarian carcinoma cells. J Control Release, 69(1): 185-96
!
14!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Ellithey, M. S., Lall, N., Hussein, A. A., Meyer, D. 2014. Cytotoxic and HIV-1 enzyme
inhibitory activities of Red Sea marine organisms. BMC Complementary and
Alternative Medicine, 14 (77).
Elmore, S., 2008. Apoptosis%: A Review of Programmed Cell Death. NIH Public Access,
381(1) 143–154.
Guimarães, M. C. M., Gonçalves, M. A. G., Soares, C. P., Bettini, J. S. R., Duarte, R. A.,
Soares, E. G., 2005. Immunohistochemical Expression of p16INK4A and bcl-2
According to HPV Type and to the Progression of Cervical Squamous Intraepithelial
Lesions. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 53(4): 509–516.
Hingorani, R., Deng, J., Elia, J., McIntyre, C., Mittar, D., 2011. Detection of Apotosis using
the BD Annexin V FITC Assay on the BD FACSVerseTM System, BD Biosciences, 112.
Huang, H., Chen, A. Y., Ye, X., Li, B., Rojanasakul, Y., Rankin, G. O., & Chen, Y. C., 2015.
Myricetin inhibits proliferation of cisplatin-resistant cancer cells through a p53dependent apoptotic pathway. International Journal of Oncology, 47(4), 1494–1502.
Immunochemistry Technologist, 2015. FAM-FLICA® Caspase Assay Kits,
Immunochemistry
Technologist
LCC,
USA,
https://www.bio-radantibodies.com/caspases-flica.html, diakses tanggal 22 Februari 2017.
Jing, Z., Heng, W., Xia, L., Ning, W., Yafei, Q., Yao, Z., Shulan, Z., 2015. Downregulation
of phosphoglycerate dehydrogenase inhibits proliferation and enhances cisplatin
sensitivity in cervical adenocarcinoma cells by regulating Bcl-2 and caspase-3. Cancer
Biology and Therapy, 16(4)
Kho, E. Y., Wang, H. K., Banerjee, N. S., Broker, T. R., Chow, L. T., 2013. HPV-18 E6
mutants reveal p53 modulation of viral DNA amplification in organotypic cultures.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
110(19), 7542–9.
Kim, M. E., Ha, T. K., Yoon, J. H., & Lee, J. S., 2014. Myricetin induces cell death of human
colon cancer cells. Anticancer Research, 34(2), 701 – 706.
Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C., 2007. Mitochondrial Membrane Permeabilization
in Cell Death. Physiology Reveiw, 99–163
Leisching, G., Loos, B., Botha, M., Engelbrecht, A.-M., Benedetti-Panici, P., Bermudez, A.,
Albertyn, G., 2015. Bcl-2 confers survival in cisplatin treated cervical cancer cells:
circumventing cisplatin dose-dependent toxicity and resistance. Journal of
Translational Medicine 2015 13:1, 13(1), 2470–2486.
Li, Z. F., Wang, Z. D., Ji, Y. Y., Zhang, S., Huang, C., Li, J., & Xia, X. M., 2009. Induction
of apoptosis and cell cycle arrest in human HCC MHCC97H cells with Chrysanthemum
indicum extract. World Journal of Gastroenterology, 15(36), 4538–4546.
!
15!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Macey, M., 2007. Flow cytometry: Principles and Applications, Springer Science & Business
Media, Totowa, pp. 1-2
National Cancer Institute, 2015. Cervical Cancer Treatment-Patient Version (PDQ) General
Information About Cervical Cancer, U.S Departement of Health and Human Services,
USA, https://www.cancer.gov/types/cervical/patient/cervical-treatment-pdq, diakses
tanggal 4 April 2016
Nuranna, L., Aziz, M.F., Cornain, S., Purwoto, G., Purbadi, S., Budiningsih, S., Budiningsih,
S., Peters, A. A. W., 2012. Cervical Cancer Prevention Program in Jakarta, Indonesia:
See and Treat Model in developing country, J Gynecol Oncol, 23 (3): 147-152.
Nobakht, G. M., Kadir, M., Stanslas, J., Charng, C. W. 2014. Cytotoxic effect of Typhonium
flagelliforme extract. Journal of Medicinal Plants Research, 8(31), 1021–1024.
Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L., 2015.
Cell viability assays, 1–31.
Sharma, R., 2012. Cancer Chemoprevention: Prevention is Better than Cure. Journal of
Cancer Science & Therapy, 01(S3), 5956
Uhlen, M., Ponten, F., Tegel, H., Nilson, P., Feilitzen, K., Lundberg, E., 2016,
Immunocytochemistry,
Uppsala
University,
Sweden,
www.proteinatlas.org/learn/method/immunocytochemistry, diakses
EKSTRAK ETANOLIK BUNGA KRISAN (Chrysanthemum indicum L.) SEBAGAI
AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)
MELALUI REGULASI BCL-2
SKRIPSI
Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
!
Diajukan oleh:
Maria Nareswari
NIM: 138114002
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
EKSTRAK ETANOLIK BUNGA KRISAN (Chrysanthemum inicum L.) SEBAGAI
AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)
MELALUI REGULASI BCL-2
SKRIPSI
Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
!
Diajukan oleh:
Maria Nareswari
NIM: 138114002
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017
!
i!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
And$when$you$want$something,$all$the$universe$conspires$in$helping$
you$to$achive$it$–$Paulo$Coelho$“The$Alchemist”$
$
Saat>saat$yang$luar$biasa$sulit$dalam$perjuangan$adalah$pertanda$
bahwa$kesuksesan$sudah$mendekat$–$Merry$Riana$
$
!
$
iv!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Kuasa penulis panjatkan atas segala berkat, rahmat,
dan limpahan kasih-Nya yang luar biasa sehingga penulis dapat menyelesaikan naskah
skripsi yang berjudul “Ekstrak etanolik bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) sebagai
agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks HeLa melalui regulasi Bcl-2” sebagai syarat
memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Penulisan skripsi ini mendapat dukungan dan bantuan dari berbagai pihak, sehingga penulis
mengucapkan terima kasih kepada :
1.! Ibu Dr. Riris Istighfari Jenie, M.Si., Apt, selaku dosen pembimbing skripsi yang telah
banyak membantu dalam berbagai ilmu, pengetahuan, dan wawasan, serta bersedia
meluangkan waktu, tenaga dan pikiran untuk berdiskusi dan mengarahkan serta
memberi semangat dan meyakinkan penulis dalam penyusunan skripsi ini.
2.! Ibu Dr. Erna Tri Wulandari., Apt., dan Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku
dosen penguji atas semua saran, dan dukungan yang membangun.
3.! Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt, selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma yang telah memberikan izin kepada peneliti.
4.! Komisi Etik Universitas Gadjah Mada, yang telah memberikan ijin untuk melakukan
penelitian.
5.! Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan
ilmu pengetahuan dan bimbingan kepada penulis selama proses perkuliahan.
6.! Bapak Wagiran selaku laboran di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia di Universitas
Sanata Dharma dan Ibu Atin selaku laboran di Laboratorium Parasitologi Universitas
Gadjah Mada yang telah membantu peneliti selama melakukan penelitian di
laboratorium.
7.! Bapak Angelo Karmayogi, Ibu Maudy Maria, Adikku Maria Sekartaji, dan seluruh
keluargaku sumber semangat, yang selalu berdoa, memberikan kasih sayang dan cinta,
dukungan, perhatian, kesabaran dalam membimbing penulis dari awal hingga
berakhirnya penulisan ini.
8.! Teman-teman seperjuangan skripsi Fira Elsa Septiana dan Lela Fransisca Adi Liana
yang selalu berjuang bersama dan saling memberikan semangat.
9.! Sahabat-sahabat yang selalu menemani dalam organisasi maupun proses perkuliahan
Enggar, Kenny, Liana, Atika, Axl, Santi, Agnes dan seluruh teman-teman FSMA dan
FKKA atas semua hiburan dan selalu mengingatkan penulis selama ini.
!
vii!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10.! Sahabat dan teman bermain Nonik, Feli, Raviano yang selalu membantu dan selalu ada
bagi penulis serta memberikan semangat untuk menyelesaikan skripsi ini.
11.! Teman-teman FSM A 2013, FKK A 2013 dan semua angkatan 2013 yang telah
bersama-sama berproses dan berbagi suka duka di Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma.
12.! Semua pihak yang telah membantu penulis, yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan serta masih
jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran
yang membangun dari semua pihak. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat
bermanfaat bagi semua pihak terutama di bidang ilmu farmasi.
Yogyakarta, 31 Januari 2017
Penulis
!
viii!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
EKSTRAK ETANOLIK BUNGA KRISAN (Chrysanthemum indicum L.) SEBAGAI
AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)
MELALUI REGULASI BCL-2
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma, Kampus III Paingan, Maguwoharjo, Depok, Sleman,
Yogyakarta, Indonesia 55282
Telp. (0274) 883037, Fax. (0274) 886529
naresca_1704@yahoo.com
ABSTRAK
Kanker serviks memiliki karakter ekspresi berlebih pada protein Bcl-2 sehingga
dapat menghambat proses apoptosis. Cisplatin merupakan obat lini pertama pada kemoterapi
kanker serviks, namun dewasa ini terjadi meningkatnya resistensi cisplatin yang dapat
menyebabkan kegagalan pada kemoterapi. Bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.)
merupakan salah satu tanaman yang memiliki kandungan myricetin, salah satu flavonoid
yang memiliki aktivitas kemoprevensi. Penelitian ini bertujuan untuk untuk melihat
penghambatan ekstrak etanol bunga krisan terhadap viabilitas sel HeLa melalui uji sitotoksik
menggunakan metode MTT, uji flowcytometry Annexin V Flous untuk melihat potensi
ekstrak etanol bunga krisan dalam menginduksi apoptosis pada sel HeLa dan penghambatan
terhadap protein Bcl-2 dianalisis secara semi kuantitatif menggunakan metode
imunositokimia. Hasil uji sitotoksik terhadap sel HeLa dengan metode MTT pada ekstrak
etanol bunga krisan menunjukkan efek sitotoksik lemah pada nilai IC50 700 µg/mL, dan
mampu menginduksi apoptosis sebesar 59% pada konsentrasi ½ IC50 (350 µg/mL) pada uji
flowcytometry. Hasil uji imunositokimia menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga krisan
mampu menekan ekspresi protein Bcl-2 dengan kuat pada konsentrasi 125 µg/mL. Hasil ini
menunjukkan ekstrak etanol bunga krisan memiliki efek sitotoksik lemah dan menyebabkan
kematian secara apoptosis salah satunya dengan menekan ekspresi protein Bcl-2.
Kata kunci: Kanker serviks, Bcl-2, Chrysanthemum indicum L, sel HeLa
!
ix!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Chrysanthemum indicum L. ETANOLIC EXTRACT AS CHEMOPREVENTION
AGENT TOWARDS HeLa CANCER CELLS THROUGH BCL-2 REGULATION
Faculty of Pharmacy
Sanata Dharma University, Campus III Paingan, Maguwoharjo, Depok, Sleman,
Yogyakarta, Indonesia 55282
Telp. (0274) 883037, Fax. (0274) 886529
naresca_1704@yahoo.com
ABSTRACT
Cervical caner has a character of over expression of Bcl-2 protein that could be
inhibit apoptosis. Cisplatin is the first line medication for cervical cancer chemotherapy,
eventually nowadays cisplatin resistance leads to the failure of chemotherapy.
Chrysanthemum indicum L. flowers is one of many plants that contain myricetin one of
flavonoids that has chemoprevention activity. The aim of this study is to determine the
chemoprevention activity of Chrysanthemum indicum L etanolic extract towards HeLa
cervical cancer cells with MTT to see HeLa viability, followed by flowcytometry with
Annexin V Flous to analyze the activity of Chrysanthemum indicum L etanolic extract that
undergo apoptotic cell and the expression of Bcl-2 is being analyzed using
immunocytochemistry. Chrysanthemum indicum L etanolic extract shows weak cytotoxic
activity on HeLa with IC50 of 700 µg/mL and induced 59% apoptosis at 350 µg/mL, as
determined by flowcytometry. Imunocytochemistry shows that Chrysanthemum indicum L
etanolic extract at 125 µg/mL reduce the expression of Bcl-2 firmly. Result shows that
Chrysanthemum indicum L etanolic extract shows weak cytotoxic activity and cause death
with an apoptotic pathway by reduce the expression of Bcl-2.
Keywords: Cervical cancer, Bcl-2, Chrysanthemum indicum L, HeLa cells.
!
x!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
!
HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. ii
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................ . iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................. v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. vi
PRAKATA.......................................................................................................... vii
ABSTRAK .......................................................................................................... ix
ABSTRACT.......................................................................................................... x
DAFTAR ISI....................................................................................................... xi
DAFTAR TABEL............................................................................................... xiii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xv
PENDAHULUAN .............................................................................................. 1
METODOLOGI PENELITIAN.......................................................................... 2
Bahan penelitian ............................................................................................. . 2
Alat penelitian ................................................................................................ . 2
Determinasi dan ekstraksi .............................................................................. . 3
Pembuatan Larutan Uji .................................................................................. . 3
Panen Sel ........................................................................................................ . 3
Uji Sitotoksik dengan MTT ........................................................................... . 4
Uji Apoptosis dengan Flowcytometry ........................................................... . 4
Uji Imunositokimia ........................................................................................ . 4
Analisis Hasil ................................................................................................. . 5
Analisis Nilai IC50 ..................................................................................... . 5
Analisis Uji Apoptosis............................................................................... . 5
Analisis Uji Imunositokimia ..................................................................... . 6
HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 6
Determinasi dan Ekstraksi Bunga Krisan ...................................................... . 6
Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa dengan MTT ......... . 7
Uji apoptosis dengan Flowcytometry ............................................................. . 9
!
xi!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Uji Imunositokimia ........................................................................................ . 11
KESIMPULAN ................................................................................................... 13
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 14
LAMPIRAN........................................................................................................ 17
BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 26
!!
!
!
xii!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR TABEL
Tabel I.
Hasil Uji Apoptosis Menggunakan Flowcytometry dengan
Pewarnaan Annexin V Flous ...........................................................
Tabel II.
Distribusi Ekpresi Bcl-2 pada Sel HeLa dengan Berbagai
perlakuan ..........................................................................................
!
9
xiii!
11
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Morfologi sel HeLa .........................................................................
7
Gambar 2. Efek sitotoksik cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap
sel HeLa ...........................................................................................
7
Gambar 3. Hasil induksi apoptosis cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan
terhadap sel HeLa.............................................................................
9
Gambar 4. Efek perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap
ekspresi Bcl-2 terhadap sel HeLa.....................................................
!
xiv!
10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Gambar bunga krisan yang digunakan dan proses ekstraksi ..........
18
Lampiran 2. Pengolahan data uji MTT assay......................................................
19
Lampiran 3. Dokumentasi Uji Apoptosis ...........................................................
20
Lampiran 4. Dokumentasi Uji Imunositokimia ..................................................
23
Lampiran 5. Surat keterangan hasil determinasi tanaman krisan ........................
24
Lampiran 6. Surat Ethical Clearance..................................................................
25
!
xv!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PENDAHULUAN
Kanker serviks berkembang menjadi masalah kesehatan bagi wanita di Indonesia
yaitu dengan prevalensi kedua tertinggi setelah kanker payudara. (Nuranna et al., 2015).
WHO (2015) juga menyebutkan bahwa kanker serviks menduduki urutan keempat pada
kanker yang sering terjadi pada wanita di belahan benua Australia, Eropa, Asia dan Afrika.
Kanker serviks disebabkan oleh infeksi HPV (Human Papiloma Virus) 18 dan 16 sehingga
terjadi gangguan pada regulasi sel. HPV 16 dan 18 mengekspresikan protein E6 dan E7 yang
memiliki kemampuan untuk menekan aktivitas p53 sebagai tumor suppressor gen. Hal itu
menyebabkan protein pro-apoptosis (Bax dan Bad) yang di aktivasi oleh sinyal dari p53
menjadi tidak aktif, sehingga muncul ekspresi berlebih dari protein anti-apoptosis (Bcl-xL
dan Bcl-2) yang menyebabkan terjadinya kanker (Kho et al., 2013)
Pengobatan kanker serviks yang dilakukan selama ini adalah dengan terapi radiasi,
kemoterapi, dan terapi dengan antibodi monoklonal. (National Cancer Institute, 2015).
Cisplatin merupakan salah satu agen kemoterapi untuk kanker serviks, namun dewasa ini
dengan meningkatnya resistensi cisplatin sering menyebabkan kegagalan pada kemoterapi.
Peningkatan dosis cisplatin untuk mengatasi resistensi terbukti tidak efektif karena pasien
akan mengalami dose-dependent toxicity dan kerusakan jangka panjang pada ginjal serta
menyebabkan terjadinya ototoksisitas yang akan menyebabkan penurunan kualitas hidup
pada pasien (Leisching et al., 2015). Maka dibutuhkan agen kemopreventif untuk mencegah
berkembangnya kanker serviks sedini mungkin.
Kemopreventif merupakan senyawa alami atau sintesis yang dapat menghambat dan
mencegah perkembangan kanker. Tujuan utama dari penggunaan agen ini adalah
menurunkan angka kejadian kanker dan mencegah terjadinya kanker. Agen kemopreventif
juga memliki target molekuler, yaitu protein anti apoptosis, jalur aktivasi angiogenesis, dan
protein inflamasi seperti COX-2. (Sharma et al., 2012). Bunga krisan (Chrysanthemum
indicum L.) berpotensi untuk dikembangkan menjadi agen kemopreventif pada kanker
serviks karena mengandung myricetin, salah satu flavonoid yang dapat menurunkan regulasi
dari protein anti-apoptosis yaitu Bcl-2, dan meningkatkan regulasi dari protein pro-apoptosis
yaitu Bax (Kim et al., 2014). Bcl-2 merupakan protein membran intraseluler yang mencegah
terjadinya apoptosis sehingga dapat memperpanjang masa hidup sel dan mengakibatkan
terjadinya kanker (Chipuk et al, 2008). Li et al (2009) berhasil mengekstrak bunga krisan
dengan etanol 95% dan ekstrak tersebut mampu menghambat proliferasi pada sel kanker
hepar manusia (MHCC97H) dengan selektif, yaitu tidak bersifat toksik terhadap sel
!
1!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
hepatosit tikus dan sel endothelial manusia (ECV304).
Penelitian ini dirancang untuk mengetahui potensi kemoprevensi bunga krisan yang
diekstrak dengan etanol 95% pada sel kanker serviks HeLa, yaitu sel serviks yang memiliki
gen p53 dengan tipe wild type. Infeksi HPV 18 pada sel HeLa meyebabkan penurunan pada
fungsi p53 pada HeLa sehingga aktivitas induksi apoptosis pada sel HeLa menjadi terganggu
(Kho et al., 2013). Mekanisme aksi ekstrak bunga krisan diamati melalui uji sitotoksik,
induksi apoptosis dan imunositokimia pada protein regulator apoptosis Bcl-2. Hasil dari
penelitian ini diharapkan peneliti mendapatkan bukti ilmiah untuk mengembangkan ekstrak
etanol bunga krisan sebagai agen kemopreventif terhadap kanker serviks.
METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Senyawa uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah bunga krisan yang diperoleh
dari Asta Bunda, Kaliurang, Yogyakarta, ekstrak etanol bunga krisan, sel kanker serviks
HeLa yang didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah
Mada. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 95% (teknis), Media Kultur Medium
DMEM 10% (Gibco), Tripsin EDTA 0,25%, PBS (Phosphat Buffer Saline), SDS (Sodium
Dodecyl Sulfate) 10% dalam HCl 0,01 N, DMSO (Merck) 0,5%, akuades, Cisplatin
(10mg/10mL) sebagai kontrol positif yang didapat dari Kalbe Farma, metanol 70%, reagen
Annexin V Fluos staining kit (Roche) (100 mL, binding buffer 2 mL Annexin V : 2 mL
propium iodide (PI)), reagen MTT (Sigma) 5 mg/mL, primary monoclonal antibody mouse
anti human Bcl-2 Oncoproteini (Dako), biotinylated universal secondary antibody
(Biocare), Mayer Hematoxylin (Dako), xylol, substrat DAB.
Alat Penelitian
Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas steril
(Pyrex), blender, neraca digital, rotary evaporator (buchi Labortechnik AG CH-99230),
waterbath (Memmert), alumunium foil, conical tube, autoklaf (Hirayama), 96 well-plate
(Iwaki), 24 well-plate (Iwaki), cover slip, object-glass, inkubator CO2 (Thermo Heraeus
HeraCell 150), Laminar air flow cabinet (Labconco), pinset (Gilson), mikropipet,
hemositometer (Neubauer), ELISA reader (Bio-Rad), kamera digital (Canon 550D),
mikroskop cahaya (Olympus), mikroskop inverter (Olympus), flowcytometry (FACS
Calibur)
!
2!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Determinasi dan Ekstraksi
Determinasi dilakukan di laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi
Universitas Gadjah Mada. Bagian yang di determinasi adalah tanaman utuh mulai dari akar
hingga bunga. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah
bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) (Lampiran 1). Bunga krisan yang dipilih
berwarna kuning dengan usia 13 minggu kemudian dipisahkan dari tangkainya dicuci
dengan air mengalir, lalu dikeringkan dengan oven dalam suhu 400C selama 2 minggu.
Bunga yang sudah kering dihancurkan dengan blender hingga berbentuk serbuk. Serbuk
bunga krisan sebanyak 80 gram diekstraksi dengan metode refluks menggunakan 150 mL
etanol 95% selama 3 jam. Proses ini diulang dua kali, ektrak etanol bunga krisan krisan
dipekatkan menggunakan rotary evaporator, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan
waterbath pada suhu 80OC sampai etanol menguap dan mencapai bobot tetap (Li et al.,
2009).
Pembuatan larutan uji
Ekstrak etanol kental ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan kedalam 100
µl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000 µg/ mL.
Selanjutnya dibuat lima seri kadar yaitu 1000, 500, 250, 125, 62 µg/ mL.
Cisplatin dengan konsentrasi 10 mg/10mL diambil sebanyak 1 mL sehingga
diperoleh Cisplatin dengan konsentrasi 1000 µg/mL. Kemudian diencerkan dengan media
kultur DMEM dan dibuat seri kadar pengenceran 5, 10, 20, 39, 78 µg/mL (CCRCa, 2009 ;
Li et al., 2009).
Panen sel
Sel HeLa ditanam dan diinkubasi dalam tissue culture dish hingga konfluen,
kemudian media kultur dibuang terlebih dahulu menggunakan mikropipet. PBS
ditambahkan ke dalam cawan petri untuk mencuci, kemudian dibuang dan ditambahkan
tripsin 0,5 mL secara merata dalam cawan petri. Cawan petri ditutup dan didiamkan di dalam
inkubator selama 3 menit hingga sel terlepas. Sel ditampung pada conical tube, disentrifugasi
10 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan dibuang diberi media DMEM 2 mL,
dicuplik sedikit diamati di bawah mikroskop dengan haemocytometer untuk menghitung
jumlah sel yang diperlukan selama pengujian.
Perhitungan+jumlah+sel =
!
Jumlah+sel+kuadran+1 + 2 + 3 + 4
+9+10;+ /=>
4
3!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Setelah diketahui jumlah sel, sel diambil sesuai dengan jumlah sel yang diperlukan untuk
masing-masing uji (CCRCb, 2009 ; Ham et al., 2014).
Uji Sitotoksik ekstrak bunga krisan pada sel HeLa
Sel dengan populasi 1.104 sel/well ditanam pada sumuran 96 well plate (Iwaki),
masing-masing 100 µL. Sisakan 3 sumuran kosong untuk kontrol sel, kontrol pelarut dan
kontrol media. Kemudian inkubasi sel pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C selama 24
jam. Setelah 24 jam, media dibuang dan sel diberi ekstrak etanol bunga krisan 100 µL
(konsentrasi 1000, 500, 250, 125, 62 µg/mL) dan cisplatin 100 µL (konsentrasi 78, 39, 20,
10, 5, 2,5 µg/mL) lalu diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, media kultur dibuang lalu
diberi MTT 100 µL dengan konsentrasi 5 mg/mL dan diinkubasi selama 4 jam pada
inkubator CO2 5% dengan suhu 370C, setelah itu diberi reagen stopper SDS 10% dalam 0,1
N HCl kemudian plate dibungkus dengan alumunium foil dan diinkubasi pada suhu ruangan
selama 24 jam setelah itu dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm
(CCRCc, 2009 ; Huang et al., 2015).
Uji Apoptosis
Sel dengan populasi 1.106 sel/well ditanam pada sumuran 6 well plate (Iwaki),
masing-masing 2 mL, diinkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Sel
diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan 2 mL dengan konsentrasi 125 µg/mL, lalu
diinkubasi 24 jam. Well-plate dicuci dengan 10% PBS 1 mL dan ditampung pada conical
tube, lalu diberi 200 µL tripsin, inkubasi selama 3 menit dan amati dibawah mikroskop
apakah sel sudah terlepas. Apabila sudah terlepas, tambahkan media kultur 1 mL pada well
plate lalu ditampung kembali ke dalam conical tube kemudian disentrifugasi selama 10
menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan dibuang, sisa endapan diberi PBS dingin 1
mL kemudian resuspensi campuran dan dipindahkan ke dalam microtube 1 mL kemudian
diberi reagen Annexin V Fluos staining kit (Roche) (100 mL binding buffer, 2 mL Annexin
V : 2 mL propium iodide (PI)), kemudian sampel dianalisis mengunakan flowcytometry
(FACS Calibur) (CCRCd, 2009 ; Huang et al., 2015).
Imunositokimia
Sel dengan populasi 2.105sel/well dengan volume 200 µL ditanam pada sumuran 24
well plate (Iwaki) yang telah diberi cover slip lalu diinkubasi selama 30 menit, setelah itu
tambahkan 800 µL media kultur kedalam sumuran secara perlahan dan diinkubasi 24 jam
pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Sel diberi perlakukan dengan menambahkan 1
mL sampel konsentrasi 125 µg/mL dan diinkubasi selama 24 jam pada inkubator CO2 5%
!
4!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dengan suhu 370C. Cover slip diberi PBS lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian
difiksasi menggunakan metanol 300 µL selama 10 menit lalu dibuang dan diberi PBS 1 mL,
diamkan 5 menit kemudian dibuang. Cover slip, diberi hidrogen peroksida 1 mL selama 10
menit lalu dibuang dan cuci dengan aquadest kemudian diberi PBS. Cover slip diberi larutan
blocking 20 µL selama 10 menit lalu dibuang, diberi antibodi primer 50 µL selama 1 jam
setelah itu dibuang dan diberi PBS, diulang dua kali. Kemudian cover slip diberi antibodi
sekunder 30 µL selama 20 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Setelah itu diberi streptavidin
30 µL selama 10 menit lalu tambahkan PBS lalu inkubasi 2 menit dan diulang dua kali.
Cover slip diberi larutan DAB (diaminobenzidin) 50 µL diinkubasi 7 menit dan diberi
aquadest lalu dibuang setelah itu ditambahkan dengan MayeHematoxylin selama 3 menit dan
diberi aquadest lalu dibuang. Cover slip diangkat dengan pinset, dicelupkan kedalam xylol
dan alkohol kemudian dikeringkan dan diletakkan di atas object glass lalu di tetesi dengan
lem dan ditutup dengan cover slip kotak dan diamati dengan mikroskop cahaya (CCRCe,
2009 ; Guimarães et al., 2005)
Analisis hasil
Analisis IC50
Data absorbansi pada tiap sumuran dari hasil uji MTT diperlukan untuk dikonversi
menjadi presentase sel yang hidup. Presentase sel yang hidup (% viabilitas) dihitung
menggunakan rumus:
%+Viabilitas =
Absorbansi+perlakuan − Absorbansi+kontrol+media
+x+100%
Absorbansi+kontrol+sel − Absorbansi+kontrol+media
Data yang diperoleh diolah untuk mendapatkan nilai IC50 dengan membuat regresi
linear konsentrasi versus persen viabilitas sel dengan menggunakan program Microsoft
Excel (CCRCc, 2009, Nobakht et al., 2014).
Analisis Apoptosis Sel
Pengamatan kuantitatif dilakukan menggunakan alat FACS Calibur yang terhubung
dengan software untuk membaca hasil analisis. Hasil yang didapatkan, kemudian
dikonversikan dalam diagram menjadi warna sel. Sel yang hidup ditunjukkan dengan warna
hijau (Annexin-/PI-), warna kuning menunjukkan sel mengalami early apoptosis
(Annexin+/PI-), dan merah muda menunjukkan sel mengalami late apoptosis (Annexin+/PI+),
dan warna merah menunjukkan sel mengalami nekrosis (Annexin-/PI+) (Hingorani et al.,
2011).
!
5!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Analisis Imunositokimia
Pengamatan kualitatif digunakan untuk mengetahui ekspresi protein Bcl-2. Warna
coklat menunjukkan ekspresi protein Bcl-2 dan warna biru menunjukkan tidak terdapat
ekspresi protein Bcl-2.
Pengamatan seacara semikuantitatif dilakukan dengan level scoring. Pembacaan data
dilakukan dengan bantuan tiga responden blind reader untuk menghitung jumlah sel yang
mengekspresikan Bcl-2 pada preparat yang terdiri dari tiga bagian tiap preparatnya.
%+Ekspresi+Bcl2 =
jumlah+sel+berwarna+coklat
x100%
jumlah+total+sel+satu+lapang+pandang
Level scoring ekspresi Bcl-2 ditentukan dengan : 0 : kurang dari 5% (Sangat Kuat),
1+ : 6% - 25% (Kuat), 2+: 26% - 50% (Sedang), 3+ : 51% - 75% (Lemah), 4+ : 76% - 100%
(Sangat Lemah) (Jing et al., 2015).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Determinasi dan Ekstraksi Bunga Krisan
Determinasi tanaman dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan kebenaran dari
tanaman yang digunakan sebagai sampel. Determinasi dilakukan untuk memastikan bahwa
bunga yang digunakan dalam penelitian ini benar berasal dari tanaman krisan
(Chrysanthemum indicum L.). Bunga dipetik dan dipisahkan dari tangkainya lalu dicuci dan
dikeringkan pada oven dengan suhu 40-500C. Pengeringan bertujuan untuk menghilangkan
kadar air dalam bunga karena air dapat menimbulkan tumbuhnya jamur pada bunga.
Serbuk bunga krisan sebanyak 80 gram diekstraksi dengan metode refluks
menggunakan 150 mL etanol 95% selama 3 jam, proses ini dilakukan selama dua kali. Hasil
refluks yang sudah ditampung dan disaring kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator
kemudian diuapkan diatas waterbath pada suhu 80OC sampai etanol menguap dan mencapai
bobot tetap dengan berat 12,4 gram, setelah itu ekstrak disimpan pada suhu 40C (Li et al.,
2009).
Pada penelitian ini tidak dilakukan uji kandungan kimia pada bunga krisan, namun
diharapkan ekstrak bunga krisan dapat menghambat proliferasi pada sel HeLa karena
menurut penelitian Li et al (2009), bunga krisan yang diekstrak dengan etanol 95% dapat
menghambat proliferasi pada sel kanker hati dengan nilai IC50 1200 µg/mL, dengan hasil
selektif yaitu tanpa menunjukkan toksisitas pada sel normal. Selain itu Wu et al (2008)
menunjukkan bahwa bunga krisan yang diekstraksi dengan etanol 70% mengandung dua
!
6!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
flavonoid utama yaitu quercitrin dan myericetin, dimana myericetin mampu menginduksi
apoptosis pada sel kanker ovarium A2780/CP70 dan OVCAR-3 dengan nilai IC50 yaitu 30
µM dan 20 µM , namun tidak memiliki aktivitas terhadap sel ovarium normal IOSE-364
(Huang et al., 2015). Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk
mengidentifikasi kandungan kimia pada bunga krisan yang diekstraksi dengan etanol 95%
karena perbedaan usia tanaman, tempat tumbuh, waktu panen dan kondisi lingkungan serta
perbedaan metode dan pelarut ekstraksi menyebabkan kandungan yang tersari dari bunga
krisan menjadi berbeda-beda.
Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa dengan MTT
MTT merupakan uji reduksi warna kuning dari 3-(4,5-dimethythiazol- 2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide dengan enzim suksinat dehydrogenase pada mitokondria.
MTT akan masuk kedalam sel dan melewati mitokondria dan direduksi oleh enzim suksinat
dehydrogenase menjadi senyawa yang tidak larut dan membentuk formazan berwarna ungu.
Reduksi pada MTT hanya terjadi pada sel yang masih hidup (mengalami metabolisme secara
aktif) sehingga metode ini dapat digunakan untuk mengukur viabilitas sel. Formazan yang
terbentuk sebanding dengan jumlah sel yang hidup kemudian diukur dengan menggunakan
ELISA reader dengan panjang gelombang 595nm (Riss, et al., 2013).
A
B
C
D
Gambar 1. Morfologi sel HeLa secara mikroskopis dengan perbesaran 100x setelah diberi perlakuan
ekstrak etanol bunga krisan dan cisplatin dengan waktu inkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan
suhu 370C. (A) Morfologi kontrol sel HeLa. (B) Morfologi sel pada perlakuan cisplatin dengan konsentrasi
39 µg/mL. (C) Morfologi sel pada perlakuan ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi 250 µg/mL.
(D) Morfologi sel pada perlakuan ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi 500 µg/mL. Panah warna
biru menunjukkan morfologi sel yang masih utuh, menunjukkan sel yang sudah tidak utuh.
Hasil menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga krisan mampu memberikan efek
sitotoksik terhadap sel HeLa secara dose-dependent, dimana seiring dengan meningkatnya
!
7!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
konsentrasi ekstrak etanol bunga krisan, maka jumlah sel HeLa yang hidup juga semakin
berkurang (Gambar 1), begitu juga dengan cisplatin. Pada uji ini terlihat perbedaan
morfologi sel yang diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan, dimana bentuk sel menjadi
tidak utuh, terlihat bahwa ada beberapa sel yang hanya berbentuk bulat dan setelah diberi
perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan (gambar 2B, 2C dan 2D).
Uji sitotoksik dilakukan sebanyak tiga kali secara independent eksperimen, dimana
pada masing-masing eksperimen terdapat tiga replikasi. Nilai IC50 ekstrak etanol bunga
krisan adalah 700 µg/mL (Gambar 2A), sehingga potensi ekstrak etanol bunga krisan
digolongkan sebagai agen sitotoksik lemah dimana nilai IC50 > 50 µg/mL (Ellithey et al.,
2014). Nilai IC50 dari cisplatin sebagai kontrol positif adalah 36 µg/mL. (Gambar 2B).
Berdasarkan grafik yang diperoleh dari regresi linier menunjukkan bahwa baik perlakuan
cisplatin (Gambar 2A) dan ekstrak etanol bunga krisan (Gambar 2B) mampu menurunkan
viabilitas sel. Sebagai agen sitotoksik lemah, ekstrak etanol bunga krisan dapat ditingkatkan
efikasinya dengan dikombinasikan dengan cisplatin. Diharapkan dengan diturunkannya
dosis cisplatin yang dikombinasikan dengan ekstrak etanol bunga krisan, mampu
menghasilkan efek yang sama dengan dosis awal cisplatin. Namun sebelum melakukan
kombinasi ini diperlukan preformulasi untuk melihat kompatibilitas antara cisplatin dengan
ekstrak etanol bunga krisan
Viabilitas(sel((%)
Viablitas sel (%)
120
100
80
60
40
20
0
A
0
20
40
60
Cisplatin (µg/mL)
140
120
100
80
60
40
20
0
80
100
B
0
200
400
600
800 1000 1200
Ekstrak(etanol(bunga(krisan((µg/mL)((
Gambar 2. Efek sitotoksik cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel HeLa. Sel HeLa
(1.104 sel/well) yang ditanam pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam pada inkubator CO2 5%
dengan suhu 370C, kemudian diberi seri konsentrasi ekstrak etanol bunga krisan dan seri konsentrasi
cisplatin. Viabilitas sel ditentukan dengan metode MTT. (A) Viabilitas sel setelah diberi seri
konsentrasi cisplatin. (B) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi ekstrak etanol bunga krisan.
!
8!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Uji apoptosis dengan Flowcytometry
Annexin V merupakan protein yang dapat berikatan secara spesifik dengan fosfolipid
seperti fosfatidilserine yang biasanya tidak ada di luar permukaan membrane. Pada tahap
early apoptosis, fosfatidilserin akan berpindah ke permukaan membran sehingga Annexin
dapat berikatan dengan fosfatidilserin dan mendeteksi jumlah sel yang mengalami early
apoptosis. Pada tahap late apoptosis, terjadi disintegrasi pada membran sel, sehingga reagen
PI dapat masuk kedalam sel dan berikatan dengan DNA sel, sehingga pada keadaan late
apoptosis, baik Annexin maupun PI akan berikatan dengan membrane dan DNA sel. Pada
tahap nekrosis akan terjadi kebocoran plasma pada sel, kondisi ini menyebabkan reagen PI
yang akan berikatan langsung dengan DNA sel (Hingorani et al., 2011). Flowcytometry
digunakan untuk mendeteksi sel yang sudah diberi label dengan annexin maupun PI. Pada
flowcytomery sel akan ditembakkan dengan sumber cahaya dan menghasilkan fluoresensi
yang berbeda-beda berdasarkan label yang ada pada sel tersebut, sehingga sel dapat
dikelompokkan dan dihitung sesuai populasinya lalu dikonversikan menjadi sebuah grafik
dengan suatu program yang ada pada flowcytometry (Macey, 2007).
Hasil flowcytometry dengan Annexin menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga
krisan mampu meningkatkan peristiwa apoptosis dibandingkan dengan kontrol sel HeLa.
Ekstrak etanol bunga krisan dengan nilai ½ IC50 (350 µg/mL) mampu menginduksi apoptosis
sebesar 58,62%, dimana 14,64% mengalami nekrosis dan jumlah sel yang hidup sebesar
27,01% (Gambar 3C ; Tabel 1) Sel yang mengalami nekrosis diasumsikan mengalami
nekrosis sekunder karena ketika percobaan tidak dilakukan secara in vitro, tidak ada
peristiwa fagositosis dari badan golgi yang merupakan tahap kelanjutan dari peristiwa
apoptosis, sehingga sel yang apoptosis menjadi terdeteksi sebagai nekrosis sekunder
(Demoy et al., 2000).
Hal ini dapat diteliti lebih lanjut dengan menguji apoptosis menggunakan
flowcytometry dengan pewarnaan FLICA, dimana FLICA akan berikatan dengan caspase
sehingga jika terjadi lisisnya dinding sel tanpa adanya aktivitas caspase, maka dipastikan
bahwa jalur induksi pada sel yang diuji adalah melalui jalur nekrosis (Immunochemistry
Technologist, 2015). Selain itu menurut penelitian Li et al (2009) ekstrak etanol bunga krisan
memiliki mekanisme penghambatan secara time dependent, dimana pada dosis yang sama
kematian sel akan meningkat seiring dengan lamanya waktu inkubasi, sehingga pada
penelitian selanjutnya diapat dilakukan optimasi terhadap waktu inkubasi sel HeLa yang
!
9!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan, yaitu beberapa titik waktu sebelum 24 jam
untuk memastikan apakah sel mengalami kematian melalui jalur apoptosis.
Pada cisplatin, sel yang mengalami early apoptosis adalah 25,44%, late apoptosis
10,62%, nekrosis 2,68% dan sel yang masih hidup adalah 2,69% (tabel 1 ; gambar 3B). Hal
ini menunjukkan bahwa cisplatin menginduksi kematian sel melalui jalur apoptosis, dimana
cisplatin meningkatkan aktivitas dari caspase-3 dan-7 (Leisching et al., 2015) Caspase-3
menyebabkan fragmentasi pada sitoskeleton sehingga terjadi kematian sel secara apoptosis
(Elmore, 2008).
R3
R4
R4
A
B
R2
R2
R1
R1
R4
C
R2
R1
Gambar 3. Hasil induksi apoptosis cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan. Sel HeLa (1.106 sel/well)
yang ditanam pada 6 well-plate dan diberi perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan dengan
inkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Sel diwarnai dengan reagen annexin V dan
PI. Sel yang hidup ditunjukkan dengan warna hijau, early apoptosis ditunjukkan dengan warna kuning,
late apoptosis dengan warna merah muda dan nekrosis ditunjukkan dengan warna merah. Hasil dibaca
dengan flowcytometer. (A) Kontrol sel. (B) Sel HeLa dengan perlakuan cisplatin konsentrasi ½ IC50
(18 µg/mL). Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etanol bunga krisan ½ IC50 (350 µg/mL)
Tabel I. Hasil Uji Apoptosis Menggunakan Flowcytometry dengan Pewarnaan Annexin V Flous
Total Sel (%)
Radian 1
Radian 2
Radian 3
Radian 4
Hidup
Awal Apoptosis
Akhir Apoptosis
Nekrosis
Kontrol Sel
88,28
3,55
2,58
5,67
Cisplatin
61,80
25,55
10,62
2,69
Ekstrak Etanol Bunga
27,01
17,82
41,34
14,64
Krisan
!
!
10!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Uji imunositokimia
Imunositokimia merupakan teknik untuk memvisualisasikan keberadaan protein di
dalam sel dengan menggunakan biomolekul berupa antibodi yaitu berdasarkan pada
kemampuan antibodi tersebut untuk mengikat protein dalam sel yang dikenali sebagai
antigen. Ada dua jenis imunostitokimia yaitu imunositokimia langsung dan imunositokimia
tidak langsung. Imunositokimia langsung hanya menggunakan satu antibodi, metode ini
cepat namun tidak cukup sensitif untuk mendetiksi protein karena jumlah protein yang
dideteksi biasanya terlalu kecil untuk menghasilkan sinyal yang kuat. Sensitivitas akan
meningkat dengan menggunakan metode tidak langsung yaitu dengan adanya ikatan pada
antibodi sekunder terhadap komples antibodi primer dan antigen. Peristiwa ini akan
memperkuat sinyal yang ada (Uhlen et al., 2016)
Gambar 4. Efek perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap ekspresi Bcl-2 terhadap sel HeLa
dengan perbesaran 400x. Sel HeLa (2.105 sel/well) ditanam pada 6 well plate yang diberi cover slip, kemudian
diberi perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan dengan inkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5%
dengan suhu 370C. Antibodi primer yang digunakan adalah mouse anti human Bcl-2 Oncoproteini (Dako),
ekspresi Bcl-2 diamati dibawah mikroskop cahaya. (A) Kontrol sel tanpa antibodi Bcl-2. (B) Kontrol sel dengan
antibodoi Bcl-2. (C) Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etanol bunga krisan ¼ IC50 (175 µg/mL). (D) Sel HeLa
dengan perlakuan cisplatin ½ IC50 (18 µg/mL). Panah warna hitam menunjukkan adanya ekspresi Bcl-2,
sedangkan panah warna biru menunjukkan tidak adanya ekspesi Bcl-2 pada sel HeLa.
Uji imunositokimia bertujuan untuk melihat ekspresi dari protein anti-apoptosis Bcl2, yaitu salah satu mekanisme sitotoksik dari ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel HeLa.
Warna coklat pada sitoplasma menunjukan adanya ekspresi protein Bcl-2 pada sel,
sedangkan warna biru menunjukkan tidak adanya ekspresi Bcl-2 pada sel. Intensitas warna
coklat digunakan sebagai parameter semi-kuantitatif untuk menilai ekspresi Bcl-2 dan
menghitung jumlah sel yang mengekspresikan protein Bcl-2. Ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa
dapat dilihat pada gambar 4. Ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi ¼ IC50 (125
!
11!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
µg/mL) mampu menekan ekspresi Bcl-2 dengan kuat (level ekspresi 1+) dan cisplatin
dengan konsentrasi ½ IC50 (18 µg/mL) mampu menekan ekspresi Bcl-2 dengan sangat kuat
(level ekspresi 0).
Tabel II. Distribusi Ekspresi Bcl-2 pada Sel HeLa dengan Berbagai Perlakuan
Lapang
Pandang
Ekspresi Bcl-2 pada
Kontrol Sel tanpa
Lapang
Level
Pandang
Antibodi
Ekspresi Bcl-2 pada
Kontrol Sel dengan
Level
Antibodi
1 (n = 128)
1 (0,78%)
0
1 (n = 105)
105 (100%)
4+
2 (n = 125)
3 (2,4%)
0
2 (n = 97)
97 (100%)
4+
3 (n = 107)
0 (0%)
0
3 (n = 106)
106 (100%)
4+
!
!
Lapang
Ekspresi Bcl-2 pada
Pandang
Perlakuan Cisplatin
Level
Ekspresi Bcl-2 pada
Lapang
Perlakuan Ekstrak
Pandang
Etanol Bunga
Level
Krisan
!
1 (n = 128)
1 (0,78%)
0
1 (n = 350)
21 (6%)
1+
2 (n = 125)
3 (2,4%)
0
2 (n = 345)
23 (6.6%)
1+
3 (n = 107)
0 (0%)
0
3 (n = 300)
20 (6.6%)
1+
!
Menurunnya fungsi p53 pada sel HeLa menyebabkan sel tersebut kehilangan fungsi
supresifnya, akibatnya terjadi ekspresi berlebih pada protein anti-apoptosis, yaitu Bcl-2.
Strategi untuk mengatasi hal ini adalah meningkatkan protein-protein yang bersifat proapoptosis yaitu p21, Hdm2, PUMA, NOXA dan Bax. Bax adalah salah satu protein proapoptosis, dimana meningkatnya Bax akan menurunkan ekspresi dari Bcl-2 sebagai protein
anti-apoptosis (Kroemer et al., 2007). Ekstrak etanol bunga krisan yang pada penelitian
sebelumnya dilaporakan memiliki efek sitotoksik diharapkan mampu menurunkan ekspresi
Bcl-2 sehingga dapat meningkatkan peristiwa apoptosis dan menyebabkan terjadinya
penurunan viabilitas sel akibat dari pemberian ekstrak etanol bunga krisan pada sel HeLa.
Ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi ¼ IC50 (125 µg/mL) mampu
menekan ekspresi Bcl-2 dengan kuat. Hal ini disebabkan karena kemungkinan dari
mekanisme induksi apoptosis bunga krisan adalah melalui jalur caspase-3, dimana aktivasi
dari caspase-3 melalui jalur ekstriksik apoptosis akan menyebabkan terjadinya aktivasi
protein yang menyebabkan transduksi sinyal cascade, sehingga menyebabkan aktivasi
apoptosis secara intrinsik yaitu induksi keluarnya sitorom-c dari mitokondria. Keluarnya
sitokrom-c dari sitoplasma diperantarai dengan aktivitas Bax/Bax sebagai protein proapoptosis. Meningkatnya Bax akan menekan ekspresi Bcl-2 sebagai protein anti-apoptosis.
!
12!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Sitokrom-c akan berikatan dengan Apaf-1, hal ini akan mengaktivasi caspase-9. Caspase-9
menjadi pemicu terjadinya aktivasi caspase-3 dan-7 sehingga akan terjadi fragmentasi dan
menyebabkan kematian sel secara apoptosis (Weyhenmeyer et al., 2012). Namun perlu diuji
lebih lanjut untuk mengetahui hal tersebut, yaitu untuk menghitung jumlah ekspresi Bcl-2
secara kuantitatif pada sel HeLa yang diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan terhadap
sel HeLa.
Pada gambar 4A yaitu kontrol sel tanpa antibodi, morfologi sel terlihat berbeda-beda.
Hal ini disebabkan karena tanpa adanya ikatan antibodi dengan sel menyebabkan pewarna
streptavidin tidak optimal dalam mewarnai sel tersebut. Pewarnaan streptavidin yang tidak
optimal menyebabkan DAB tidak dapat memunculkan reaksi warna coklat dengan jelas,
sehingga bentuk morfologi sel menjadi terlihat berbeda-beda antara satu dengan yang lain
(Colby, 2014).
Kesimpulan
Ekstrak etanol bunga krisan mempunyai efek sitotoksik lemah pada sel kanker
serviks HeLa dengan nilai IC50 sebesar 700 µg/mL serta mampu menginduksi apoptosis
dengan konsentrasi 350 µg/mL dan menekan ekspresi protein Bcl-2 secara kuat pada
konsentrasi 175 µg/mL.
Saran untuk penelitian berikutnya adalah dilakukan uji kandungan senyawa dalam
ekstrak etanol bunga krisan, melihat efek sitotoksik ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel
normal serta efek sinergis dari kandungan ekstrak etanol bunga krisan dan agen kemoterapi.
Selain itu mekanisme induksi apoptosis perlu dikonfirmasi dengan melakukan time course
assay dengan waktu inkubasi kurang dari 24 jam dan perlu dilakukan uji untuk mendeteksi
adanya ekspresi Bcl-2 secara kuantitatif serta penelitian lebih lanjut untuk mengetahui
regulasi mediator lainnya setelah terjadi penekanan ekspresi Bcl-2.
!
13!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Daftar Pustaka
ATCC, 2014, HeLa (ATCC® CCL-2™), American Type Culture Collection, USA,
https://www.atcc.org/products/all/CCL-2.1.aspx, diakses tanggal 20 April 2016
Bo, L., Gao, Y., Rankin, G. O., Rojanasakul, Y., Cutler, S. J., Tu, Y., Chen, Y. C., 2015.
Chaetoglobosin K Induces Apoptosis and G2 Cell Cycle Arrest through p53Dependent Pathway in Cisplatin-Resistant Ovarian Cancer Cells. HHS Public Access,
33(4), 395–401.
Cancer Chemoprevention Research Centera, 2009. Prosedur Tetap: Preparasi Sampel,
Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wpcontent/uploads/03.009.-Preparasi-sampel.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.
Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur TetapPanen Sel, Unversitas
Gajah
Mada,
Yogyakarta,
http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wpcontent/uploads/03.005.-Panen-Sel.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.
Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Uji sitotoksik MTT,
Unversitas
Gajah
Mada,
Yogyakarta,
http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wpcontent/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf, diakses pada tanggal 1 April
2016.
Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Flowcytometry,
Unversitas
Gajah
Mada,
Yogyakarta,
http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wpcontent/uploads/03.014.02-flowcytometry.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.
Cancer Chemoprevention Reasearch Centere, 2009. Prosedur tetap pengamatan ekspresi
protein dengan metode imunositokimia, Universitas Gajah Mada, Yogyakarta,
http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.012.-Imunositokimia.pdf,
diakses tanggal 14 April 2016.
Colby, D., 2014. A Guide to Successful Immunohistochemistry, Cell Signalling Technology,
http://kromat.hu/UserFiles/files/patologia/Dako_IHC_metodikai_kézikönyv_I.pdf,
diakses tanggal 22 Februari 2017
Chipuk, J. E., Green, D. R., 2008. How do BCL-2 proteins induce mitochondrial outer
membrane permeabilization. Trends Cell Biology, 18(4), 157–164.
Comalada, M., Camuesco, D., Sierra, S., Ballester, I., Xaus, J., Gálvez, J., & Zarzuelo, A.,
2005. In vivo quercitrin anti-inflammatory effect involves release of quercetin, which
inhibits inflammation through down-regulation of the NF-κB pathway. European
Journal of Immunology, 35(2), 584–592.
Demoy, M., Minko, T., Kopenckova, P., Kopecek, J., 2000. Time and concentration
dependent apoptosis and necrosis induced by free and HPMA copolymerbound
doxorubicin in human ovarian carcinoma cells. J Control Release, 69(1): 185-96
!
14!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Ellithey, M. S., Lall, N., Hussein, A. A., Meyer, D. 2014. Cytotoxic and HIV-1 enzyme
inhibitory activities of Red Sea marine organisms. BMC Complementary and
Alternative Medicine, 14 (77).
Elmore, S., 2008. Apoptosis%: A Review of Programmed Cell Death. NIH Public Access,
381(1) 143–154.
Guimarães, M. C. M., Gonçalves, M. A. G., Soares, C. P., Bettini, J. S. R., Duarte, R. A.,
Soares, E. G., 2005. Immunohistochemical Expression of p16INK4A and bcl-2
According to HPV Type and to the Progression of Cervical Squamous Intraepithelial
Lesions. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 53(4): 509–516.
Hingorani, R., Deng, J., Elia, J., McIntyre, C., Mittar, D., 2011. Detection of Apotosis using
the BD Annexin V FITC Assay on the BD FACSVerseTM System, BD Biosciences, 112.
Huang, H., Chen, A. Y., Ye, X., Li, B., Rojanasakul, Y., Rankin, G. O., & Chen, Y. C., 2015.
Myricetin inhibits proliferation of cisplatin-resistant cancer cells through a p53dependent apoptotic pathway. International Journal of Oncology, 47(4), 1494–1502.
Immunochemistry Technologist, 2015. FAM-FLICA® Caspase Assay Kits,
Immunochemistry
Technologist
LCC,
USA,
https://www.bio-radantibodies.com/caspases-flica.html, diakses tanggal 22 Februari 2017.
Jing, Z., Heng, W., Xia, L., Ning, W., Yafei, Q., Yao, Z., Shulan, Z., 2015. Downregulation
of phosphoglycerate dehydrogenase inhibits proliferation and enhances cisplatin
sensitivity in cervical adenocarcinoma cells by regulating Bcl-2 and caspase-3. Cancer
Biology and Therapy, 16(4)
Kho, E. Y., Wang, H. K., Banerjee, N. S., Broker, T. R., Chow, L. T., 2013. HPV-18 E6
mutants reveal p53 modulation of viral DNA amplification in organotypic cultures.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
110(19), 7542–9.
Kim, M. E., Ha, T. K., Yoon, J. H., & Lee, J. S., 2014. Myricetin induces cell death of human
colon cancer cells. Anticancer Research, 34(2), 701 – 706.
Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C., 2007. Mitochondrial Membrane Permeabilization
in Cell Death. Physiology Reveiw, 99–163
Leisching, G., Loos, B., Botha, M., Engelbrecht, A.-M., Benedetti-Panici, P., Bermudez, A.,
Albertyn, G., 2015. Bcl-2 confers survival in cisplatin treated cervical cancer cells:
circumventing cisplatin dose-dependent toxicity and resistance. Journal of
Translational Medicine 2015 13:1, 13(1), 2470–2486.
Li, Z. F., Wang, Z. D., Ji, Y. Y., Zhang, S., Huang, C., Li, J., & Xia, X. M., 2009. Induction
of apoptosis and cell cycle arrest in human HCC MHCC97H cells with Chrysanthemum
indicum extract. World Journal of Gastroenterology, 15(36), 4538–4546.
!
15!
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Macey, M., 2007. Flow cytometry: Principles and Applications, Springer Science & Business
Media, Totowa, pp. 1-2
National Cancer Institute, 2015. Cervical Cancer Treatment-Patient Version (PDQ) General
Information About Cervical Cancer, U.S Departement of Health and Human Services,
USA, https://www.cancer.gov/types/cervical/patient/cervical-treatment-pdq, diakses
tanggal 4 April 2016
Nuranna, L., Aziz, M.F., Cornain, S., Purwoto, G., Purbadi, S., Budiningsih, S., Budiningsih,
S., Peters, A. A. W., 2012. Cervical Cancer Prevention Program in Jakarta, Indonesia:
See and Treat Model in developing country, J Gynecol Oncol, 23 (3): 147-152.
Nobakht, G. M., Kadir, M., Stanslas, J., Charng, C. W. 2014. Cytotoxic effect of Typhonium
flagelliforme extract. Journal of Medicinal Plants Research, 8(31), 1021–1024.
Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L., 2015.
Cell viability assays, 1–31.
Sharma, R., 2012. Cancer Chemoprevention: Prevention is Better than Cure. Journal of
Cancer Science & Therapy, 01(S3), 5956
Uhlen, M., Ponten, F., Tegel, H., Nilson, P., Feilitzen, K., Lundberg, E., 2016,
Immunocytochemistry,
Uppsala
University,
Sweden,
www.proteinatlas.org/learn/method/immunocytochemistry, diakses