Daun keladi tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) sebagai agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks (HeLa) melalui regulasi Bcl-2.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRAK
Kemopreventif merupakan suatu upaya untuk mencegah, menunda, ataupun melawan
perkembangan sel kanker dengan menggunakan bahan alam, sintesis, atau kombinasi dari
keduanya. Salah satu bahan alam yang memiliki potensi antikanker adalah tanaman keladi
tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) yang dimanfaatkan sebagai terapi alternatif
pada kanker. Pada penelitian sebelumnya, daun keladi tikus memiliki efek sitotoksik terhadap
sel kanker serviks HeLa dan kanker kolon WiDr. Tujuan. Mengetahui potensi ekstrak etil
asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker serviks HeLa terkait aktivitas sitotoksik, induksi
apoptosis dan pengaruh terhadap protein Bcl-2 yang berperan sebagai antiapoptosis. Metode.
Uji sitotoksik dengan metode MTT, uji induksi apoptosis menggunakan metode flocytometry
dan uji imunositokimia untuk observasi aktivitas ekstrak etil asetat daun keladi tikus dalam
meregulasi protein Bcl-2. Hasil. Hasil yang diperoleh, ekstrak etil asetat daun keladi tikus
memiliki aktivitas sitotoksik lemah dengan nilai IC50 640 µg/mL. Hasil uji apoptosis pada
konsentrasi ½ IC50 dengan waktu inkubasi 24 jam menunjukkan bahwa sampel menginduksi
kematian (apoptosis 12% dan nekrosis sekunder yang merupakan lanjutan dari apoptosis 86%)
sehingga perlu observasi lebih lanjut pada waktu inkubasi kurang dari 24 jam. Hasil uji
imunositokimia menunjukkan sampel menekan kuat ekspresi protein Bcl-2, sehingga
kemungkinan induksi apoptosis diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2. Bedasarkan
hasil tersebut, potensi esktrak etil asetat daun keladi tikus sebagai agen kemopreventif masih

perlu ditelusuri lebih lanjut terutama induksi kematian sel.
Kata kunci: kanker serviks, Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume, sel HeLa, protein Bcl-2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRACT
Chemopreventive an attempt to prevent, delay, or against the development of cancer
cells using natural product, synthetic, or combination of both. Natural product that has the
potential anticancer is rodent tuber (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) which is used as
an alternative therapy in cancer. Previous research represent that rodent tuber leaves have a
cytotoxic effect on HeLa cervical cancer cells and WiDr colon cancer cells. Objective. To
determine the potential of ethyl acetate extract of rodent tuber leaves against HeLa cervical
cancer cell related cytotoxic activity, induction of apoptosis and effect on protein Bcl-2 as
regulator antiapoptosis. Method. Cytotoxic test was conducted using MTT assay, induction of
apoptosis test using flocytometry, immunocytochemistry test to observe the activity extracts in
regulating protein Bcl-2. Results. The results, ethyl acetate extract of rodent tuber leaves have
a weak cytotoxic activity with IC50 values of 640 µg/mL. The result of apoptosis assay in
concentration ½ IC50 with 24 hours incubation period showing that samples induce death (12%
apoptosis and secondary necrosis which is the continuation of apoptosis 86%), need further
observation on incubation period of less than 24 hours. The result of immunocytochemistry

assay showed sampel suppresses powerfully expression of Bcl-2 protein, the possibility
induction of apoptosis mediated by suppresses the expression of Bcl-2 protein. Therefore,
potential of the ethyl acetate extract of rodent tuber leaves as kemopreventif agent need further
exploration, especially the induction of cell death.
Keywords: cervical cancer, Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume, HeLa cells, Bcl-2 protein

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAUN KELADI TIKUS (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) SEBAGAI
AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)
MELALUI REGULASI Bcl-2

SKRIPSI
Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi

Disusun Oleh :
Fira Elsa Septiana
138114001


FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HALAMAN JUDUL
DAUN KELADI TIKUS (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) SEBAGAI
AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)
MELALUI REGULASI Bcl-2

SKRIPSI
Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi

Disusun Oleh :
Fira Elsa Septiana

138114001

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017

i

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PERSETUJUAN PEMBIMBING
Persetujuan Pembimbing

ii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HALAMAN PENGESAHAN


iii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

iv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

v

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HALAMAN PERSEMBAHAN

Karya ini ku persembahkan kepada :
Kemuliaan Tuhan Yesus Kristus

Kedua orang tuaku
Sahabat dan teman-teman
Farmasi angkatan 2013
Dan Almamaterku, Universitas Sanatha Dharma

vi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala
berkat, rahmat, dan kurnia-Nya yang telah dilimpahkan, sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi dengan judul “Daun Keladi Tikus (Typhonium flagelliforme
(Lodd.) Blume) sebagai Agen Kemopreventif terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa)
Melalui Regulasi Bcl-2”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat dalam
memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta. Penyusunan skripsi telah banyak melibatkan berbagai pihak
baik langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, pada kesempatan ini, penulis
ingin menyampaikan terimakasih kepada :

1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu Dr. Riris I. Jenie, M.Si., Apt., selaku pembimbing atas segala motivasi dan
kesabaran dalam membimbing, mendukung, dan membantu penulisan dari awal
hingga skripsi ini dapat terselesaikan.
3. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah
memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun.
4. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah
memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun.
5. Staf laboratorium Fakultas Farmasi USD, Bapak Yohanes Wagiran, Mas Bimo
Widura, Staf laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM, Ibu Suprihatin,
serta laboran lainnya yang telah membimbing dan membantu penulis dalam
penelitian di laboratorium.
6. Orang tua saya, Ibu Ester Dyah Retnowati, Bapak Mariyoto, dan Bapak Hadi
Prayitno. Nenek saya Inhartatiningsih dan saudara-saudara saya Deny Julian
Adela, Octa Wisnu Wardana, Allysa Sukma Maharani yang selalu memberi doa,
dukungan, motivasi, dan kasih sayang. Hal tersebut memicu saya menjadi
semangat dan kuat sehingga penulis bisa menyelesaikan skripsi ini.
vii


PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

7. Orang tua rohani saya, Shari dan Beni Nugroho. Saudara saya Nathania Devina,
Vanessa Lyora, Angelo Adi Gempar Persada, Srikah, Ezra Septian yang senantiasa
memberikan doa, bimbingan, motivasi, kasih sayang dan semangat kepada penulis
untuk menyelesaikan skripsi ini.
8. Saudara saya, Melantina Maria dan Agnes Marhilo serta semua saudara-saudara
komsel USD yang telah memberikan doa, motivasi, kasih sayang dan semangat
kepada penulis.
9. Teman-teman seperjuangan dan sahabat dalam penelitian Maria Nareswari dan
Lela Francisca Adi Liana atas kerja sama, kebersamaan, bantuan, dan perjuangan
selama penelitian ini berlangsung.
10. Sahabat saya, Liana Yudhomulyono, Amanda Anggraini, Maria Atika Sukmana,
dan semua teman-teman FSM A dan FKK A angkatan 2013 atas kebersamaan
selama ini.
11. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu-persatu yang turut membantu
penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan dan jauh dari
sempurna, maka penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua
pihak yang dapat membuat karya ini menjadi lebih baik. Mohon maaf atas segala

kesalahan dan kekurangan penulis yang terdapat dalam laporan akhir skripsi ini.
Akhir kata, penulis berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak dan
bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang kefarmasian.

Yogyakarta, 31 Januari 2017

Penulis

viii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL...................................................................................................... i
PERSETUJUAN PEMBIMBING................................................................................. ii
HALAMAN PENGESAHAN...................................................................................... iii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...................................................................... iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................................... v
HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................................. vi

DAFTAR ISI ................................................................................................................ ix
DAFTAR TABEL ........................................................................................................ xi
DAFTAR GAMBAR .................................................................................................. xii
DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................................. xiii
ABSTRAK ................................................................................................................. xiv
ABSTRACT .................................................................................................................. xv
PENDAHULUAN ........................................................................................................ 1
METODOLOGI PENELITIAN .................................................................................... 2
Bahan Penelitian ........................................................................................................ 2
Alat Penelitian ........................................................................................................... 3
Determinasi dan Ekstraksi ......................................................................................... 3
Pembuatan Larutan Uji .............................................................................................. 3
Panen Sel ................................................................................................................... 4
Uji Sitotoksik dengan MTT ....................................................................................... 4
Uji Apoptosis dengan Flowcytometry ....................................................................... 4
Uji Imunositokimia .................................................................................................... 5
Analisis Hasil ............................................................................................................ 6
Analisis Nilai IC50.................................................................................................. 6
Analisis Uji Apoptosis ........................................................................................... 6
Analisis Uji Imunositokimia .................................................................................. 6

HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................................... 7
ix

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Determinasi dan Ekstraksi Daun Keladi Tikus ......................................................... 7
Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa........................................... 8
Uji Apoptosis menggunakan Flowcytometry dengan Anexin V ............................. 10
Uji Imunositokimia .................................................................................................. 13
KESIMPULAN ........................................................................................................... 15
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 16
LAMPIRAN ................................................................................................................ 20
BIOGRAFI PENULIS ................................................................................................ 31

x

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Hasil uji apoptosis menggunakan flowcytometry ...................................... 11
Tabel 2. Distribusi ekspresi Bcl-2 pada sel Hela..................................................... 13

xi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi secara mikroskopis ............................... 8
Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin ....... 9
Gambar 3. Induksi apoptosis ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin ... 11
Gambar 4. Ekspresi Bcl-2 ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin ....... 13

xii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambar tanaman keladi tikus dan proses ekstraksi .......................... 21
Lampiran 2. Pengolahan data uji MTT assay ........................................................ 22
Lampiran 3. Dokumentasi Uji Apoptosis ............................................................... 23
Lampiran 4. Dokumentasi Uji Imunositokimia...................................................... 27
Lampiran 5. Surat Keterangan hasil determinasi tanaman keladi tikus ................ 29
Lampiran 6. Surat Ethical Clearance .................................................................... 30

xiii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRAK
Kemopreventif merupakan suatu upaya untuk mencegah, menunda, ataupun
melawan perkembangan sel kanker dengan menggunakan bahan alam, sintesis, atau
kombinasi dari keduanya. Salah satu bahan alam yang memiliki potensi antikanker
adalah tanaman keladi tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) yang
dimanfaatkan sebagai terapi alternatif pada kanker. Pada penelitian sebelumnya, daun
keladi tikus memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker serviks HeLa dan kanker
kolon WiDr. Tujuan. Mengetahui potensi ekstrak etil asetat daun keladi tikus
terhadap sel kanker serviks HeLa terkait aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis dan
pengaruh terhadap protein Bcl-2 yang berperan sebagai antiapoptosis. Metode. Uji
sitotoksik dengan metode MTT, uji induksi apoptosis menggunakan metode
flocytometry dan uji imunositokimia untuk observasi aktivitas ekstrak etil asetat daun
keladi tikus dalam meregulasi protein Bcl-2. Hasil. Hasil yang diperoleh, ekstrak etil
asetat daun keladi tikus memiliki aktivitas sitotoksik lemah dengan nilai IC50 640
µg/mL. Hasil uji apoptosis pada konsentrasi ½ IC50 dengan waktu inkubasi 24 jam
menunjukkan bahwa sampel menginduksi kematian (apoptosis 12% dan nekrosis
sekunder yang merupakan lanjutan dari apoptosis 86%) sehingga perlu observasi
lebih lanjut pada waktu inkubasi kurang dari 24 jam. Hasil uji imunositokimia
menunjukkan sampel menekan kuat ekspresi protein Bcl-2, sehingga kemungkinan
induksi apoptosis diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2. Bedasarkan hasil
tersebut, potensi esktrak etil asetat daun keladi tikus sebagai agen kemopreventif
masih perlu ditelusuri lebih lanjut terutama induksi kematian sel.
Kata kunci: kanker serviks, Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume, sel HeLa,
protein Bcl-2

xiv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRACT
Chemopreventive an attempt to prevent, delay, or against the development of
cancer cells using natural product, synthetic, or combination of both. Natural product
that has the potential anticancer is rodent tuber (Typhonium flagelliforme (Lodd.)
Blume) which is used as an alternative therapy in cancer. Previous research represent
that rodent tuber leaves have a cytotoxic effect on HeLa cervical cancer cells and
WiDr colon cancer cells. Objective. To determine the potential of ethyl acetate
extract of rodent tuber leaves against HeLa cervical cancer cell related cytotoxic
activity, induction of apoptosis and effect on protein Bcl-2 as regulator antiapoptosis.
Method. Cytotoxic test was conducted using MTT assay, induction of apoptosis test
using flocytometry, immunocytochemistry test to observe the activity extracts in
regulating protein Bcl-2. Results. The results, ethyl acetate extract of rodent tuber
leaves have a weak cytotoxic activity with IC50 values of 640 µg/mL. The result of
apoptosis assay in concentration ½ IC50 with 24 hours incubation period showing that
samples induce death (12% apoptosis and secondary necrosis which is the
continuation of apoptosis 86%), need further observation on incubation period of less
than 24 hours. The result of immunocytochemistry assay showed sampel suppresses
powerfully expression of Bcl-2 protein, the possibility induction of apoptosis
mediated by suppresses the expression of Bcl-2 protein. Therefore, potential of the
ethyl acetate extract of rodent tuber leaves as kemopreventif agent need further
exploration, especially the induction of cell death.
Keywords: cervical cancer, Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume, HeLa cells, Bcl2 protein

xv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PENDAHULUAN
Kanker merupakan keadaan sel-sel dalam tubuh mulai tumbuh tidak kendali dan
dapat menyebar ke seluruh tubuh. Kanker serviks merupakan kanker yang berkembang dari
sel di daerah serviks atau mulut rahim sampai bagian bawah uterus (American Cancer Society,
2016). Menurut data dari IARC 2015, prevalensi kanker serviks memiliki tingkat mortalitas
dan morbiditas yang tinggi dan menduduki peringkat keempat di belahan benua Australia,
Eropa, Afrika dan Asia setelah kanker payudara dan kanker kolon. Di Indonesia, prevalensi
kanker serviks menduduki peringkat ketiga setelah kanker payudara (Ferlay, dkk., 2015).
Sebagian besar penderita kanker serviks berobat dengan keadaan stadium lanjut
sehingga mengakibatkan rendahnya angka survival (DeSantis, dkk., 2014). Penemuan obatobat kemopreventif dan alternatif banyak dilakukan untuk penelitian kanker. Kemopreventif
merupakan suatu upaya untuk mencegah, menunda, ataupun melawan perkembangan sel
kanker dengan menggunakan bahan alam, sintesis, atau kombinasi dari keduanya (Sharma,
2012). Beberapa obat herbal dilaporkan efektif untuk menghambat pertumbuhan sel kanker
serviks dan berpotensi untuk digunakan pada terapi kanker serviks (Galluzzi, dkk., 2014).
Oleh sebab itu, upaya penemuan agen kemopreventif dengan target yang spesifik perlu
ditingkatkan.
Kanker serviks sebagian besar disebabkan karena adanya infeksi Human Papiloma
Virus (HPV). Sel kanker leher rahim yang diinfeksi HPV diketahui mengekspresikan dua
onkogen, yaitu E6 dan E7. Protein E6 berikatan dengan tumor suppressor protein p53 dan
mempercepat degradasi p53, serta menekan aktivitas p53. Pada keadaan ini mediator
antiapoptosis (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w) terinduksi, sehingga jumlahnya berlebih. Jumlah
mediator antiapoptosis yang berlebih mengakibatkan proses apoptosis atau kematian sel
terhambat (You, dkk., 2010). Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) berperan dalam proses apoptosis pada
sel karena Bcl-2 dapat menghambat pelepasan sitokrom C sehingga proses apoptosis
terhambat (de Bruin & Medema, 2008). Dengan demikian, salah satu target molekuler dari
perkembangan terapi kanker serviks adalah yang potensial adalah Bcl-2.
Daun keladi tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) diketahui memiliki
aktivitas antikanker, detoksifikasi, antiinflamasi, antivirus dan antibakteri. Dari beberapa
penelitian disebutkan bahwa daun keladi tikus dimanfaatkan sebagai terapi alternatif pada
kanker payudara, kolon, paru-paru, serviks dan leukemia (Masood, dkk., 2011). Ada beberapa
1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

kandungan kimia dalam daun keladi tikus antara lain alkaloid, flavonoid, terpenoid dan
steroid. Alkaloid dan flavonoid merupakan kandungan kimia terbesar dalam daun keladi tikus
(Mankaran, dkk. 2013). Dari penelitian Da’i, dkk. (2007) dilakukan uji sitotoksik dari ekstrak
diklorometan, etil asetat dan etanol 98% daun keladi tikus terhadap sel HeLa. Ekstrak etil
asetat daun keladi tikus memiliki nilai IC50 147,77 µg/mL. Ekstrak etil asetat daun keladi tikus
memiliki efek sitotoksik paling baik dibandingkan dengan ekstrak diklorometan dan etanol
98%. Secara in vitro ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki nilai IC50 yang baik
dibandingkan n-hexan dan etanol pada sel leukemia yaitu 11,81 µg/mL (Katrin, dkk., 2012).
Sedangkan ekstrak etanol 80% keladi tikus memiliki nilai IC50 30,19 µg/mL terhadap sel
HeLa (Purwaningsih, dkk., 2014). Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui
mekanisme molekuler yang spesifik pada kanker serviks.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi ekstrak etil asetat daun keladi tikus
terhadap sel kanker serviks HeLa terkait aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis dan pengaruh
terhadap regulasi protein Bcl-2 yang merupakan regulator antiapoptosis. Sel kanker serviks
yang digunakan untuk penelitian ini adalah sel kanker serviks HeLa yang merupakan sel epitel
kanker serviks. Sel kanker serviks HeLa digunakan karena sel bersifat imortal dan dapat
membelah secara tidak terbatas selama memenuhi kondisi dasar bagi sel untuk tetap hidup,
selain itu sel kanker serviks HeLa dipilih karena cukup aman dan umum digunakan (Landry,
dkk., 2013). Uji MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida) dilakukan
untuk mengetahui aktivitas sitotoksik, uji apoptosis menggunakan metode flowcytometry
untuk mengetahui induksi apoptosis dan uji imunositokimia untuk mengetahui regulasi protein
Bcl-2.

METODOLOGI PENELITIAN
Bahan Penelitian
Ekstrak etil asetat daun keladi tikus, cisplatin 10mg/10mL dari Kalbe Farma, sel
kanker serviks HeLa didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas
Gadjah Mada. Bahan kimia yang digunakan adalah etil asetat teknis, media kultur DMEM
(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 10% (Gibco), Tripsin 0,025%, PBS (Phosphat Buffer
Saline), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 10% dalam HCl 0,01 N, DMSO (dimethylsulfoxide)
(Merck) dengan konsentrasi tertinggi 0,35%, akuades, reagen Annexin V Fluos staining kit
2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(Roche) mengandung 100 mL binding buffer 2 mL Anexin V : 2mL propidium iodida (PI) ,
reagen MTT (sigma) 5 mg/mL, etanol, primary monoclonal antibody mouse anti-human Bcl-2
Oncoprotein

(Dako),

secondary

antibody

(Biocare),

streptavidin,

larutan

DAB

(diaminobenzidin), Mayerhematoxilin.
Alat Penelitian
Alat–alat gelas steril (Pyrex), timbangan analitik, blender, waterbath (Memmert),
rotary evaporator (buchi Labortechnik AG CH-99230), oven, 96 well-plate (Iwaki), 6 wellplate (Iwaki), sentrifuge tube, inkubator CO2 (Thermo Heraeus HeraCell 150), Laminar air
flow cabinet (Labconco), mikropipet, hemositometer (Neubauer), ELISA reader (Bio-Rad),
kamera digital (Canon 550D), mikroskop cahaya (Olympus), mikroskop inverter (Olympus),
flowcytometry (FACS Calibur).
Determinasi dan Ekstraksi
Tanaman keladi tikus didapatkan dari Malang, Jawa Timur dengan usia 2-6 bulan.
Sebelumnya tanaman dideterminasi menggunakan buku acuan menurut Backer, 1963
dilakukan di Fakultas Biologi Universitas Gajah Mada (lampiran 5). Daun yang dipilih adalah
daun tua yang berwarna hijau pekat (Nobakht, dkk., 2014) kemudian daun dipetik dan
dikeringkan dalam oven dengan suhu 40-500C. Daun yang telah kering dihaluskan
menggunakan blender untuk menjadi simplisia serbuk daun keladi tikus. Serbuk daun keladi
tikus ditimbang sebanyak 10 gram kemudian direndam dalam 100 ml etil asetat dalam
erlenmeyer bertutup dan digojok menggunakan shaker selama 24 jam. Dilakukan remaserasi
dengan etil asetat seperti proses sebelumnya hingga pelarut tidak berwarna. Kemudian
hasilnya ditampung dan dipekatkan menggunakan rotary vaccum evaporator (Setiawati, dkk.,
2016).
Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak etil asetat daun keladi tikus ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan
kedalam 100 μl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000 μg/
mL, selanjutnya dibuat seri kadar pengenceran untuk melakukan optimasi dengan konsentrasi
1.500 μg/ mL, 750 μg/ mL, 375 μg/ mL, 187,5 μg/ mL, 94 μg/ mL, 47 μg/ mL, dan 23 μg/ mL.
Cisplatin konsentrasi 10 mg/10 mL, kemudian diambil 1 ml sehingga diperoleh konsentrasi
1mg/mL atau setara dengan 1000 μg/mL. Kemudian dibuat seri kadar pengenceran untuk

3

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

melakukan optimasi dengan konsentrasi 160 μg/ mL, 80 μg/ mL, 40 μg/ mL, 20 μg/ mL, 10
μg/ mL, 5 μg/ mL dan 2,5 μg/ mL.
Panen Sel
Panen sel dilakukan setelah sel 80% konfluen yang terlihat monolayer dibawah
mikroskop, sel yang telah diinkubasi diambil dari inkubator CO2 dan diamati kondisi sel.
Media kultur DMEM 10% dibuang, kemudian sel dicuci tiga kali menggunakan PBS.
Selanjutnya tambahkan 2 ml tripsin 0,025% secara merata dan diinkubasi dalam inkubator
selama 3 menit. Sel dipindahkan ke dalam conical tube sampai semua sel terlepas dari plate,
kemudian PBS ditambahkan sampai 10 ml untuk deaktivasi tripsin. Selanjutnya disentrifuge
selama 10 menit, kemudian PBS dibuang dan ditambahkan media DMEM 10% sebanyak 1-2
ml. Sel diresuspensi menggunakan pipet, kemudian diambil sebanyak 10 μl dan dipindahkan
ke hemacytometer untuk dihitung di bawah mikroskop (Nobakht, dkk., 2014; CCRCa, 2009).
Uji Sitotoksik dengan MTT
Uji sitotoksik dilakukan dengan cara memberi perlakuan pada sel (dengan populasi
1x106/mL) yang telah ditanam dalam 96 well-plate. Pertama, media kultur dibuang terlebih
dahulu kemudian ke dalam tiap lubang diberi 100 μl seri konsentrasi sampel (1.500 μg/ mL,
750 μg/ mL, 375 μg/ mL, 187,5 μg/ mL, 94 μg/ mL, 47 μg/ mL, dan 23 μg/ mL yang telah
diencerkan dalam media dan 100 μl seri konsentrasi cisplatin (160 μg/ mL, 80 μg/ mL, 40 μg/
mL, 20 μg/ mL, 10 μg/ mL, 5 μg/ mL dan 2,5 μg/ mL), pada kolom kontrol sel diberi media
kultur sedangkan pada kolom kontrol media dikosongkan, lalu diinkubasi selama 24 jam
dalam inkubator CO2. Setelah inkubasi 24 jam, media kultur dalam well-plate dibuang lalu ke
dalam tiap lubang diberi 100 μl larutan MTT dalam media kultur dan diinkubasi selama 4 jam.
Setelah 4 jam ke dalam tiap lubang diberi 100 μl reagen stopper SDS kemudian plate
dibungkus dengan alumunium foil dan diinkubasi di ruang selama 24 jam. Setelah inkubasi,
dilakukan pembacaan absorbansi menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 595
nm (Xu, dkk., 2014; CCRCd, 2009).
Uji Apoptosis dengan Flowcytometry
Sel ditanam (dengan populasi 1x106/mL) dalam 2 mL media DMEM 10% di dalam 6
well-plate, kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam, sampel dengan konsentrasi ½
IC50 yang telah diencerkan dengan media 2 mL dimasukkan ke dalam tiap sumuran dan
diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, sel dalam tiap lubang diambil dengan mikropipet
4

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

dipindahkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 1 mL PBS, kemudian diambil lagi dan
dimasukkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 1 mL tripsin 0,025% dan ditampung lagi
ke dalam conical tube sampai semua sel terlepas dari plate. Setelah semua sel dipanen
ditambahkan PBS sampai 10 ml dan conical tube disentrifugasi selama 10 menit. Supernatan
dibuang, sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL kemudian resuspensi campuran dan
dipindahkan ke dalam micro tube sebanyak 1 mL. Campuran dalam micro tube disentrifugasi
(5 menit, 5000 rpm). Micro tube yang berisi sampel dibuang supernatannya kemudian diberi
reagen 100 μl Annexin V lalu diinkubasi 10 menit. Setelah inkubasi 10 menit diberi 300 μl
buffer, dan sampel dianalisis mengunakan flowcytometer FACS Calibur (Huang, dkk., 2015;
CCRCc, 2009).
Uji Imunositokimia
Sel ditanam dalam 6 well-plate diberi cover slip sebanyak 2x105 sel/mL. Setelah
inkubasi 24 jam media kultur dibuang. Sel diberi perlakuan dengan memberikan 1 mL sampel
dengan konsentrasi ½ IC50 yang dilarutkan dalam media dan diinkubasi 24 jam, setelah
inkubasi media dibuang dan diberi PBS lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian difiksasi
menggunakan metanol yang bertujuan untuk mempertahankan morfologi sel. Methanol
dibuang dan diberi PBS 1 ml selama 5 menit. Cover slip diberi hidrogen peroksida 100 μl
selama 10 menit untuk menghambat peroxidase endogen, lalu dibuang dan dicuci dengan
akuades 1 ml. Selanjutnya cover slip diangkat dan dipindahkan ke kaca preparat. Cover slip
diberi larutan blocking 20 μl selama 10 menit lalu dibuang untuk mencegah ikatan tidak
spesifik dari antibody sekuder, diberi antibodi primer 50 μl selama 1 jam setelah itu dicuci
dengan PBS tergenang selama 2 menit diulang 2 kali. Cover slip diberi antibodi sekunder 30
μl selama 20 menit dan dicuci PBS tergenang selama 2 menit diulang 2 kali. Cover slip diberi
streptavidin sebanyak 30 μl selama 10 menit untuk memperjelas pewarnaan kemudian dicuci
dengan PBS selama 2 menit diulang 2 kali. Lalu diberi larutan DAB 50 μl selama 7 menit
sebagai pewarna coklat pada sel yang mengekspresikan protein dan dicuci menggunakan
aquadest lalu dibuang. Cover slip diberi 1 tetes Mayerhematoxilin selama 3 menit untuk
memberikan kontras warna atau membedakan warna sel, kemudian dicuci dengan akuades lalu
dibuang. Cover slip digenangi etanol absolut dan segera dibuang, preparat dikeringkan terlebih
dahulu lalu diawetkan. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali
(Guimaraes, dkk., 2005; CCRCb, 2009).
5

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Analisis Hasil
Analisis Nilai IC50
Dari data yang diperoleh melalui uji MTT, dihitung % viabilitas sel dengan
menggunakan rumus:
sor ansi perlakuan
sor ansi kontrol sel

sor ansi kontrol media x 100%
sor ansi kontrol media

Setelah data % viabilitas didapatkan, dilanjutkan dengan membuat grafik antara % viabilitas
sel dengan konsentrasi untuk mendapatkan nilai IC50 menggunakan program Microsoft Excel
(Nobakht, dkk., 2014; CCRCc, 2009).
Analisis Uji Apoptosis
Pengamatan kuantitatif dilakukan dengan mengolah data menggunakan metode
cellquest dan dibaca menggunakan alat flowcytometry FACS Calibur yang terhubung dengan
software untuk membaca hasil analisis. Hasil yang didapatkan, kemudian dikonversikan dalam
diagram warna sel. Sel yang hidup ditunjukkan dengan warna hijau (Annexin-/PI-), warna
kuning menunjukkan sel mengalami early apoptosis (Annexin+/PI-), dan merah muda
menunjukkan sel mengalami late apoptosis (Annexin+/PI+) (Li, dkk., 2009).
Analisis Uji Imunositokimia
Pengamatan secara kualitatif digunakan untuk mengetahui ekspresi protein Bcl-2.
Adanya ekspresi protein Bcl-2 akan ditunjukkan dengan warna coklat pada sitoplasma (bukan
inti sel). Sedangkan warna biru menunjukkan tidak adanya protein Bcl-2. Pembacaan data
dilakukan dengan bantuan blind reader. Sebanyak tiga orang responden menghitung jumlah
sel yang mengekspresikan Bcl-2 pada preparat. Hasil yang didapatkan berupa % rata-rata ±
SD. % Ekspresi Bcl-2:
Sel er arna oklat

X 100%

otal sel satu lapang pandang

Level skoring ekspresi Bcl-2 ditentukan dengan: 0: kurang dari 5% (sangat kuat), 1+:
6% - 25% (kuat), 2+: 26% - 50% (sedang), 3+: 51% - 75% (lemah), 4+: 76% - 100% (sangat
lemah) (Zhang, dkk., 2002).

6

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HASIL DAN PEMBAHASAN
Determinasi dan Ekstraksi Daun Keladi Tikus
Determinasi tanaman dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan kebenaran dari
tanaman yang digunakan untuk diuji. Determinasi dilakukan untuk memastikan bahwa daun
yang digunakan dalam penelitian ini benar berasal dari tanaman keladi tikus (Typhonium
Flagelliforme (Lodd.) Blume). Daun dipetik dari tanaman, kemudian dicuci dan dikeringkan di
dalam oven dengan suhu 40-500C. Pengeringan bertujuan untuk mengurangi kadar air di
dalam daun karena air dapat menyebabkan adanya penjamuran dan mengaktifkan enzim yang
dapat merusak zat aktif dalam simplisia.
Simplisia ditimbang sebanyak 10 gram kemudian dilakukan maserasi menggunakan
pelarut etil asetat untuk mengambil zat-zat aktif dari simplisia. Prinsip dari maserasi adalah
memindahkan masa dari sel simplisia menuju cairan penyari berdasarkan derajat konsentrasi.
Setiap 24 jam pelarut diganti menggunakan pelarut baru dan pelarut sebelumnya ditampung
dengan tujuan menghindari kejenuhan senyawa dalam pelarut. Hasil maserasi yang sudah
ditampung disaring dan dilakukan pemekatan menggunakan rotary evaporator dengan suhu
600C dilanjutkan dengan diuapkan di atas water bath dengan suhu 55-600C sampai semua
pelarut menguap atau sampai bobot tetap. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa sel yang
mati disebabkan oleh ekstrak bukan pelarut yang tersisa. Hasil ekstraksi yang dilakukan
dengan metode maserasi menggunakan pelarut etil asetat didapatkan rendemen 5,6%.
Maserasi bertujuan untuk mendapatkan zat-zat aktif dari simplisia daun keladi tikus.
Zat-zat aktif atau kandungan fitokimia dalam ekstrak daun keladi tikus yang diharapkan dapat
tersari adalah alkaloid, flavonoid, terpenoid dan steroid sebagai kandungan terbesar dalam
tanaman keladi tikus (Mankaran, dkk., 2013). Senyawa lainnya yang ada dalam keladi tikus
adalah senyawa flavonoid yang diidentifikasi secara kualitatif dari ekstrak diklorometan, etil
asetat dan etanol daun keladi tikus (Da’i, dkk., 2007). Per edaan usia tanaman, tempat
tumbuh, waktu panen dan kondisi lingkungan dan perbedaan cara ekstraksi menyebabkan
kandungan atau senyawa fitokimia dalam daun keladi tikus berbeda-beda. Dalam penelitian ini
tidak dilakukan identifikasi senyawa yang ada dalam ekstrak etil asetat daun keladi tikus. Oleh
karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi kandungan kimia
dalam ekstrak etil asetat daun keladi tikus.

7

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa
Metode MTT digunakan untuk menentukan viabilitas sel yang berdasarkan pada
perubahan garam tetrazolium (MTT) menjadi formazan dalam mitokondria yang aktif pada sel
hidup (Jo, dkk., 2015). MTT diabsorbsi ke dalam sel hidup dan dipecah melalui reaksi reduksi
oleh enzim reduktase dalam rantai respirasi mitokondria menjadi formazan yang berwarna
ungu. Formazan dapat dibaca absorbansinya secara spektrofotometri dengan ELISA reader
pada panjang gelombang 595 nm yang merupakan panjang gelombang maksimal untuk
mengamati fomazan (Ho, dkk, 2012). Uji sitotoksik dengan metode MTT dilakukan untuk
mengetahui efek sitotoksik ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel HeLa.

A

B

C

Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi sel secara mikroskopis. Sel HeLa (1x106 sel/mL) yang ditanam
pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi seri konsentrasi ekstrak etil asetat daun keladi
tikus dan seri konsentrasi cisplatin dengan waktu inkubasi 24 jam. Selanjutnya diamati dibawah mikroskop
dengan perbesaran 100 kali. (A) Kontrol sel HeLa, (B) Perlakuan cisplatin dengan konsentrasi 20 µg/mL, (C)
Perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus konsentrasi 750 µg/mL.
Keterangan gambar: sel yang ditunjuk tanda panah (
) menunjukkan sel mengkerut, sel yang ditunjuk tanda
panah putus-putus (
) menunjukkan sel hidup.

Aktivitas sitotoksik ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel HeLa juga
berpengaruh pada morfologi sel setelah diberi perlakuan selama 24 jam. Pada kelompok
kontrol sel menunjukkan kepadatan sel tinggi, sel berbentuk polygonal dan menempel pada
plate. Morfologi sel dengan perlakuan cisplatin dengan konsentrasi 20 µg/mL beberapa sel
mengkerut yang ditandai dengan bentuk bulat tidak menempel pada plate dan kepadatan sel
berkurang. Sedangkan morfologi sel dengan perlakuan etil asetat daun keladi tikus sel dengan
konsentrasi 750 µg/mL banyak sel mengkerut yang ditandai dengan bentuk bulat tidak
menempel pada plate serta kepadatan sel berkurang.
Uji sitotoksik dilakukan untuk menentukan IC50 atau konsentrasi sampel yang mampu
menghambat pertumbuhan sel sebanyak 50% yang digunakan sebagai parameter uji sitotoksik.
Hasil uji sitotoksik dapat dilihat pada Gambar 2 yang menyatakan kurva hubungan antara
8

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

konsentrasi dan persen viabilitas sel. Cisplatin digunakan sebagai kontrol positif karena
cisplatin merupakan salah satu obat yang digunakan dalam terapi kanker serviks. Hasil uji
sitotoksik menggunakan metode MTT menunjukkan cisplatin memiliki nilai IC50 36 µg/mL
sedangkan ekstrak etil asetat daun keladi tikus nilai IC50 640 µg/mL terhadap sel HeLa. Efek
sitotoksik pada umumnya menunjukkan pola dose dependent yang dapat dilihat dari
menurunnya viabilitas sel seiring dengan meningkatnya konsentrasi. Pada penelitian
sebelumnya menyebutkan bahwa ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki efek sitotoksik
terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 147,77 µg/mL (Da’i, dkk., 2007). Hal ini dapat
diakibatkan karena perbedaan cara ekstraksi dan juga perbedaan sumber tanaman yang
digunakan.

viabilitas sel (%)

120
100
80
60
40
20
0
0

A

500
1000
1500
Ekstrak Daun Keladi Tikus (µg/mL)

2000

viabilitas sel (%)

120
100
80
60
40
20
0

B

0

20

40
60
Cisplatin (µg/mL)

80

100

Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin. Sel HeLa (1x106 sel/mL)
yang ditanam pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi seri konsentrasi ekstrak etil asetat
daun keladi tikus dan seri konsentrasi cisplatin. Viabilitas sel ditentukan dengan metode MTT. (A) Viabilitas sel
setelah diberi seri konsentrasi ekstrak etil asetat daun keladi tikus selama 24 jam. (B) Viabilitas sel setelah diberi
seri konsentrasi cisplatin selama 24 jam.

Potensi ekstrak sebagai agen sitotoksik digolongkan menjadi tiga kategori yaitu kuat
(IC50 < 20 µg/mL), sedang (IC50 < 50 µg/mL) dan lemah (IC50 > 50 µg/mL) (Ellithey, dkk.,
9

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2014). Pada uji sitotoksik ekstrak daun keladi tikus menunjukkan niai IC50 yang cukup tinggi,
dapat diartikan bahwa ekstrak daun keladi tikus tidak cukup toksik namun memiliki potensi
untuk dikembangkan sebagai agen kemopreventif. Efek toksik yang kuat dari cisplatin sebagai
obat kemoterapi mengakibatkan efek toksik terhadap sel atau jaringan normal karena tidak
selektif terhadap sel kanker (Dasari & Bernard, 2014). Ekstrak etil asetat daun keladi tikus
berpotensi sebagai agen kemopreventif karena tidak cukup toksik terhadap sel kanker serviks
HeLa sehingga diharapkan ekstrak etil asetat daun keladi tikus tidak bersifat toksik terhadap
sel normal. Namun perlu adanya penelitian lebih lanjut untuk memastikan selektivitas ekstrak
etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker.
Efek toksik yang rendah terhadap sel kanker serviks HeLa mengakibatkan ekstrak etil
asetat daun keladi tikus memiliki efikasi pengobatan yang rendah. Untuk meningkatkan efikasi
penggobatan, ekstrak etil asetat daun keladi tikus dapat dikombinasikan dengan agen
kemoterapi. Penggunaan kombinasi kemoterapi dapat diberikan dengan senyawa yang bersifat
non-toksik atau senyawa yang memiliki efek toksik rendah dikombinasikan dengan agen
kemoterapi untuk meningkatkan efikasi dengan cara mengurangi efek toksik agen kemoterapi
pada sel atau jaringan normal (Hemaiswarya & Doble, 2006). Penelitian lebih lanjut perlu
dilakukan untuk mengetahui efek sinergis dari kombinasi ekstrak etil asetat daun keladi tikus
dan agen kemoterapi terhadap sel kanker dan selektivitas terhadap sel normal.

Uji Apoptosis menggunakan Flowcytometry dengan Anexin V
Mekanisme kematian sel dibedakan menjadi dua yaitu apoptosis dan nekrosis.
Apoptosis atau kematian sel yang terprogram secara genetik memiliki mekanisme regulasi
pergantian sel karena adanya perkembangan dan penuaan sel (Akl, dkk., 2014). Nekrosis
didefinisikan sebagai kematian sel yang tidak terkontrol yang merupakan kematian sel yang
secara patologik dapat mengakibatkan adanya inflamasi atau peradangan (de Bruin &
Medema, 2008). Uji apoptosis dilakukan untuk mengetahui aktivitas ekstrak etil asetat daun
keladi tikus dalam menginduksi kematian sel melalui jalur apoptosis terhadap sel HeLa.
Uji apoptosis pada penelitian ini menggunakan flowcytometry dengan reagen Anexin
V yang akan berikatan secara spesifik terhadap fosfolipid seperti fosfatidilserine yang keluar
dari dalam membran sel ketika sel mengalami apoptosis (Hingorani, dkk., 2011). Secara
umum, flowcytometry merupakan suatu teknik yang digunakan untuk menganalisis jenis-jenis
10

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

kematian sel yang terdapat dalam suatu populasi sel. Sel ditandai dengan reagen fluoresen
kemudian dilewatkan celah sempit dan ditembak sinar UV atau laser. Sel yang telah ditandai
dengan fluoresen akan memancarkan fluoresensi yang akan ditangkap oleh detektor.
Fluoresensi yang ditangkap oleh detektor akan dikonversikan menjadi sebuah grafik dengan
suatu program yang ada pada flowcytometry (Hayrabedyan, dkk., 2012).
R4

R4

R2

R2

R1

R1

A

B

R2
R1

C

Gambar 3. Induksi apoptosis ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin. Sel HeLa (1x 106/mL)
yang ditanam pada 6 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi ekstrak etil asetat daun keladi tikus
320 µg/mL dan cisplatin 18 µg/mL diinkubasi selama 24 jam, dan diwarnai dengan reagen annexin V dan
propidium iodida (PI). Hasil dibaca menggunakan flowcytometer. (A) Kontrol sel. (B) Sel kanker serviks HeLa
yang diberi cisplatin (18 µg/mL). (C) Sel kanker serviks HeLa yang diberi ekstrak etil asetat daun keladi tikus
(320 µg/mL).

Tabel 1. Hasil uji apoptosis menggunakan flowcytometry
Total Sel (%)
Radian 1

Radian 2

Radian 3

Radian 4

Sel Hidup

Early Apoptosis

Late Apoptosis

Nekrosis

Kontrol Sel

88,28 %

3,55 %

2,58 %

5,67 %

Cisplatin

61,80 %

25,44 %

10,62 %

2,69 %

2,38 %

0,01 %

11,79 %

86,03 %

Ekstrak etil asetat daun
keladi tikus

Hasil uji apoptosis dapat dilihat pada Gambar 3 dan Tabel 1. Pada kontrol sel, sel
yang masih hidup sebesar 88,28%, total sel yang mengalami apoptosis 6,13% dan yang
mengalami nekrosis 5,67%. Sel dengan perlakuan cisplatin menunjukkan sel yang masih
11

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

hidup 61,80%, total sel yang mengalami apoptosis 36,06% dan yang mengalami nekrosis
sebesar 2,69%. Cisplatin dapat menyebabkan kematian sel dengan cara menghentikan siklus
sel dan menginduksi apoptosis jika ada kerusakan sel. Cisplatin dapat menginduksi apoptosis
pada sel kanker HeLa dengan cara meregulasi proses apoptosis melalui jalur dependent p53
(Kutuk, dkk., 2009). Sedangkan sel dengan perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus
menunjukkan sel yang masih hidup 2,38%, total sel yang mengalami apoptosis 11,80% dan
yang mengalami nekrosis sebesar 86,03%.
Pada penelitian ini uji apoptosis yang dilakukan terbatas karena hanya menggunakan
satu time point yaitu 24 jam untuk waktu inkubasi perlakuan sehingga kemungkinan kematian
sel sudah berlanjut menjadi nekrosis. Nekrosis yang terjadi akibat perlakuan ekstrak etil asetat
daun keladi tikus kemungkinan karena adanya nekrosis sekunder yang merupakan lajutan dari
apoptosis. Nekrosis sekunder terjadi karena karena secara in vitro tidak ada fagositosis badan
apoptosis oleh makrofag. Nekrosis sekunder juga dapat terjadi kerena perubahan morfologi sel
yang semula mengalami apoptosis menjadi nekrosis karena adanya pengaruh waktu inkubasi
(Demoy, dkk., 2000). Morfologi sel yang mengalami apoptosis ditandai dengan penyusutan
sel secara keseluruhan, blebbing atau pembengkakan membran plasma dan pembentukan
badan apoptosis (Akl, dkk., 2014). Sedangkan morfologi sel yang mengalami nekrosis tidak
terkontrol, tiba-tiba sel kehilangan integritas membran dan cairan ekstraseluler keluar dari sel
(Martin & Henry, 2013). Oleh karena itu, perlu diamati kematian sel yang terjadi akibat
perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus dengan waktu inkubasi kurang dari 24 jam.
Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengamati induksi apoptosis pada beberapa time
point sebelum 24 jam.
Kemungkinan yang lain sel menunjukkan hasil nekrosis karena adanya blebing
nekrosis yang meningkatkan permeabilitas terhadap propidium iodida. Salah satu ciri dari
apoptosis adalah blebbing apoptosis dan nekrosis (Fackler & Grosse, 2008) yang
menyebabkan sitoplasma keluar dari sel karena adanya tekanan hidrostatik dalam sel (Charras,
dkk., 2005). Blebing nekrosis menyebabkan membran sel memiliki permeabilitas yang tinggi
terhadap propidium iodida sehingga dapat memberikan data sel mengalami nekrosis karena sel
mengikat reagen propidium iodida (Barros, dkk., 2003). Namun pada penelitian ini tidak
dilakukan pengamatan morfologi sel setelah perlakuan, penelitian lebih lanjut perlu dilakukan
untuk mengamati morfologi sel setelah perlakuan.
12

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Uji Imunositokimia
Proses apoptosis diregulasi oleh faktor ekstrenal dan internal. Salah satu faktor internal
dari proses apoptosis adalah Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) (de Bruin & Medema, 2008). Sel
kanker serviks Hela memiliki karakteristik overekspresi Bcl-2 sehingga menghambat proses
apoptosis (You, dkk., 2010). Imunositokimia merupakan teknik untuk mendeteksi protein,
antigen dalam satu jaringan dengan mendeteksi adanya reaksi antigen antibodi menggunakan
bantuan penanda. Antibodi spesifik akan berikatan dengan antigen yang dideteksi dengan
antibodi sekunder (Chen, dkk., 2010). Pada penelitian ini uji imunositokimia terhadap protein
Bcl-2 dilakukan untuk mengidentifikasi apakah kematian sel diregulasi oleh protein Bcl-2
dengan tujuan mengetahui aktivitas ekstrak daun keladi tikus dalam menghambat protein Bcl2. Sel yang mengekspresikan protein Bcl-2 ditandai dengan warna coklat pada sitoplasma
sedangkan sel yang tidak mengekspresikan Bcl-2 berwarna ungu.
A

B

C

D

Gambar 4. Ekspresi Bcl-2 ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan cisplatin. Sel HeLa (2x105 sel/mL)
ditanam dalam 6 well-plate yang telah diberi cover slip diinkubasi selama 24 jam. Sel diberi perlakuan dengan
ekstrak etil asetat daun keladi tikus ½ IC50 dan cisplatin konsentrasi IC50, diinkubasi selama 24 jam. Ekspresi
protein diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali. (A) Kontrol sel tanpa antibodi Bcl-2. (B)
Kontrol sel dengan antibodi Bcl-2. (C) Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin (36 µg/mL). (D) Sel
kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus (320 µg/mL).

Keterangan gambar:
(menunjukkan sel tidak mengekspresikan Bcl-2) dan
mengekspresikan Bcl-2)

13

(menunjukkan sel

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Tabel 2. Distribusi ekspresi Bcl-2 pada sel Hela

Kontrol sel tanpa antibody

Kontrol sel dengan antibody

Cisplatin

Ekstrak etil asetat daun keladi tikus

Lapang Pandang

Ekspresi Bcl-2

Level

1 (n = 90)

0 (0%)

0

2 (n = 85)

0 (0%)

0

3 (n = 107)

0 (0%)

0

1 (n = 105)

105 (100%)

4+

2 (n = 97)

97

(100%)

4+

3 (n = 106)

106 (100%)

4+

1 (n = 128)

1 (0,78%)

0

2 (n = 125)

3 (2,4%)

0

3 (n = 107)

0

0

(0%)

1 (n = 207)

16 (7,73%)

1+

2 (n = 219)

18 (8,22%)

1+

3 (n = 178)

17 (9,55%)

1+

Pada tabel 2 dapat dilihat bahwa pada kontrol sel HeLa tanpa antibodi tidak
mengekspresikan Bcl-2 (0%) level ekspresi 0, dan untuk kontrol sel HeLa dengan antibodi
100% mengekspresikan Bcl-2 level ekspresi +4. Untuk perlakuan sel HeLa dengan cisplatin
mengekspresikan Bcl-2 sebesar 0,78%; 2,4% dan 0% dengan level ekspresi 0 yang
menyatakan cisplatin sangat kuat menekan ekspresi Bcl-2. Cisplatin berinteraksi dengan Bcl-2
sebagai faktor intrinsik dalam apoptosis. Cisplatin menekan Bcl-2 sebagai mediator
antiapoptosis, sehingga cisplatin dapat menginduksi apoptosis (Leisching, dkk., 2015). Oleh
karena itu cisplatin digunakan sebagai pembanding atau kontrol positif dalam skrining
penemuan agen kemopreventif yang selektif pada regulasi ekspresi protein Bcl-2.
Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus mengekspresikan Bcl2 sebesar 7,73%; 8,22% dan 9,55% dengan level ekspresi +1 yang menyatakan ekstrak etil
asetat daun keladi tikus kuat menekan ekspresi Bcl-2. Hal tersebut juga menyatakan bahwa
proses apoptosis dari sel HeLa diperantarai melalui penekanan protein Bcl-2. Ketika aktivitas
protein Bcl-2 sebagai agen antiapoptosis dihambat maka proses apoptosis atau kematian sel
akan meningkat (Czabotar, dkk., 2014). Pada penelitian sebelumnya ekstrak etil asetat daun
keladi tikus dapat menekan ekspresi protein siklooksigenase-2 (COX-2) (Setiawati, dkk.,
2016). Protein COX-2 dapat memicu proliferasi sel dengan meningkatkan produksi PGE-2

14

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

yang dapat menghambat proses apoptosis dan meningkatkan produksi agen antiapoptosis yaitu
Bcl-2. Sehingga dengan adanya penekanan COX-2 dapat menekan produksi Bcl-2 (Shehzad,
dkk., 2015). Pada penelitian ini perhitungan ekspresi Bcl-2 bersifat semikuantitatif, diperlukan
penelitian lebih lanjut untuk mengetahui ekspresi Bcl-2 secara kuantitatif.
Protein Bcl-2 mencegah terlepasnya sitokrom-C sehingga proses apoptosis tidak
terjadi, dengan dihambatnya protein Bcl-2 maka sitokrom C akan terlepas dan proses
apoptosis dapat terjadi (Smedt & Bultynck, 2014). Sitokrom-c berikatan dengan apoptotic
protease-activating factor 1 (Apaf-1), sehingga terbentuk kompleks yang teraktivasi dari
(d)ATP, dan procaspase-9. Aktivasi caspase-9 memicu aktivasi caspase-3 dan caspase-7,
sehingga memicu terjadinya apoptosis (Weyhenmeyer, dkk., 2012). Adanya mediator lainnya
setelah terjadi penekanan ekspresi Bcl-2 juga berpengaruh pada proses apoptosis. Penelitian
lebih lanjut diperlukan untuk mengetahui regulasi mediator lainnya yang berperan dalam
proses apoptosis setelah terjadi penekanan ekspresi Bcl-2.

KESIMPULAN
Hasil yang diperoleh, ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki aktivitas sitotoksik
lemah dengan

Dokumen yang terkait

Efek Imunostimulator Ekstrak Etanol Umbi Keladi Tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd) Blume.) terhadap Respon Hipersensitivitas Tipe Lambat Dan Titer Antibodi Sel Imun Mencit Jantan

3 29 82

Invasi Sel Kanker

0 26 11

UJI SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOL DAUN KELADI TIKUS (Typhonium flagelliforme L), KEMANGI (Ocimum Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Daun Keladi Tikus (Typhonium Flagelliforme L), Kemangi (Ocimum Sanctum L) Dan Pepaya (Carica Papaya L) Terhadap Sel Hela.

0 2 13

Ekstrak metanolik daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) sebagai agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks (HeLa) melalui regulasi Bcl-2.

0 1 46

Ekstrak etanolik bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) sebagai agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks (HeLa) melalui regulasi BCL-2.

0 6 45

Aktivitas antikanker ekstrak etil asetat daun keladi tikus (Typhonium flagelliforme Lodd. Blume) terhadap sel kanker kolon WiDr melalui penekanan ekspresi protein COX-2.

0 7 101

Ekstrak metanolik daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) sebagai agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks (HeLa) melalui regulasi Bcl 2

0 0 44

Ekstrak etanolik bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) sebagai agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks (HeLa) melalui regulasi BCL 2

0 0 42

Daun keladi tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) sebagai agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks (HeLa) melalui regulasi Bcl 2

0 2 47

Potensi Ekstrak Etanol Daun Keladi Tikus (Typhonium flagelliforme Lodd.) Sebagai Induktor Apoptosis Sel Kanker Lidah Manusia (SP-C1) | Rosyid Ridlo | Insisiva Dental Journal 530 1651 1 PB

0 1 5