Ekstrak metanolik daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) sebagai agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks (HeLa) melalui regulasi Bcl 2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis L.)
SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS
(HeLa) MELALUI REGULASI Bcl-2

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi

Oleh :
Lela Francisca Adi Liana
NIM : 138114154

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HALAMAN JUDUL
EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis L.)
SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS
(HeLa) MELALUI REGULASI Bcl-2

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi

Oleh :
Lela Francisca Adi Liana
NIM : 138114154

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2017
i

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

v

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HALAMAN PERSEMBAHAN

Saya persembahkan skripsi ini untuk:
Tuhan Yesus Kristus
Kedua orang tuaku
Sahabat dan teman-teman
Angkatan farmasi 2013
Dan Almamaterku, Universitas Sanatha Dharma

vi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas segala berkat, serta
penyertaan yang dilimpahkan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang
berjudul “EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis
L.) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS
(HeLa) MELALUI REGULASI Bcl-2” sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan
gelar sarjana Farmasi (S.Farm.) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
Penyeleseaian skripsi ini tentunya tidak lepas dari bantuan berbagai pihak,
baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu penulis hendak
mengucapkan terimakasih kepada:
1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Sanata
Dharma.
2. Ibu Dr. Riris I. Jenie, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing utama atas segala
bimbingan, waktu dan kesabaran yang telah diberikan untuk memberi
masukan, dukungan, saran, dan motivasi kepada penulis dalam penelitian dan
penyusunan skripsi ini.
3. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., dan Bapak Maywan Hariono, Ph.D.,
Apt. selaku dosen penguji skripsi yang telah memberikan masukan dan saran
yang sangat berharga dalam penyusunan skripsi ini.
4. Ibu Agustina Setiawati M.Sc., Apt. dan Bapak Florentinus Dika Octa
Riswanto, M.Sc., selaku dosen pembimbing akademik

penulis atas

pendampingan, bimbingan, arahan serta dukungan kepada penulis selama ini.
5. Dr. Dewi Setyaningsih S.Si., Apt., M.Sc. yang telah memberikan ijin dalam
penggunaan laboratorium dan fasilitas guna menunjang penelitian.
6. Bapak Wagiran selaku laboran Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas
segala bantuan dan dukungan yang diberikan serta dinamika di laboratorium
selama melakukan penelitian.
7. Prof. dr. Supargiyono, Ibu Atin selaku supervisor dan teknisi Laboratorium
Parasitologi Fakultas Kedokteran Umum Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
yang telah membantu dan membimbing selama melakukan penelitian.
vii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

8. Seluruh Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta atas ilmu serta bimbingan yang dibagikan.
9. Keluarga terkasih, Bapak, Ibu, adek yang selalu mendoakan, mendukung, dan
memberi semangat dalam setiap proses perjalanan penulis sehingga penulis
dapat menyelesaikan studi dengan tepat waktu.
10. Saudara dan saudari saya yang terkasih Mbak Viona dan Mbak Antik yang
selalu mendukung dan menyemangati penulis.
11. Sahabat seperjuangan dalam penelitian Bcl-2: Fira Elsa Septiana dan Maria
Nareswari atas segala dinamika, kebersamaan, dukungan serta semangat agar
dapat mengenakan toga bersama tepat waktu.
12. Sahabat-sahabat penulis Abraham, Upik, Lala, Kak Tika, Futuristic (Reny,
Ivan, Rosa, Galih), Geng metropolitan, atas kebersamaan, dukungan, dan selalu
menjadi tempat berbagi suka dan duka bagi penulis.
13. Teman – teman FSM D 2013 dan FKK C 2013, serta angkatan 2013 atas
kebersamaan yang indah.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan, maka
penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak yang membangun sehingga
membuat karya yang lebih baik. Penulis mohon maaf atas segala kesalahan dan
kekurangan yang terdapat dalam skripsi ini. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat
bagi semua pihak.

Yogyakarta, 28 Januari 2017

Penulis

viii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL...................................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .........................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .....................................................

iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .....................................................

iv

LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI..................................................

v

HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................

vi

PRAKATA ..................................................................................................

vii

DAFTAR ISI ...............................................................................................

ix

DAFTAR TABEL .......................................................................................

x

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................

xi

DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................

xii

ABSTRAK ..................................................................................................

xiii

ABSTRACT ..................................................................................................

xiv

PENDAHULUAN ......................................................................................

1

METODE PENELITIAN ............................................................................

2

HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................

7

KESIMPULAN ...........................................................................................

14

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................

15

LAMPIRAN ................................................................................................

18

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................

29

ix

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR TABEL

Tabel I.

Hasil Uji Apoptosis dengan Metode flowcytometry ..................... 12

Tabel II.

Perhitungan Ekspresi Bcl-2 ........................................................... 14

Tabel III. Viabilitas Sel Kanker Seviks HeLa dengan Perlakuan Cisplatin .. 23
Tabel IV. Viabilitas Sel Kanker Seviks HeLa dengan Perlakuan Ekstrak
Metanol Daun Rosemary............................................................... 23

x

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi sel secara mikroskopis ...............

9

Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin
pada sel kanker serviks HeLa .....................................................

9

Gambar 3. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam
menginduksi apoptosis pada sel kanker serviks HeLa................

11

Gambar 4. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam
menekan ekspresi Bcl-2 pada sel kanker serviks HeLa ..............

13

Gambar 5. Tanamanan rosemary dan serbuk daun rosemary .......................

21

Gambar 6. Ekstraksi dengan refluks dan pemekanatan dengan vaccum
rotary evaporator ........................................................................

21

Gambar 7. Ekstrak metanol daun rosemary ..................................................

21

xi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi sampel daun rosemary .

19

Lampiran 2. Surat ethical clearance ........................................................

20

Lampiran 3. Ekstrak metanol daun rosemary dan alat yang digunakan ..

21

Lampiran 4. Seri konsentrasi cisplatin dan ekstrak .................................

22

Lampiran 5. Tabel viabiltas sel kanker serviks HeLa ..............................

23

Lampiran 6. Hasil analisis flowcytometry ................................................

24

Lampiran 7. Pengamatan tiga lapang pandang sel kanker serviks HeLa .

27

xii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRAK
Kanker serviks memiliki karakter ekspresi protein Bcl-2 berlebih sehingga
dapat menghambat proses apoptosis. Salah satu pengobatan standar pada kanker
serviks dengan menggunakan cisplatin, namun dewasa ini, meningkatnya resistensi
cisplatin sering menyebabkan kegagalan pada kemoterapi. Salah satu tanaman yang
sudah banyak diteliti di berbagai sel kanker dan memiliki aktivitas antikanker adalah
daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) yang diekstraksi menggunakan metanol.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek pemberian ekstrak
metanol daun rosemary terhadap sel kanker serviks HeLa. Penelitian awal dilakukan
untuk mengetahui penghambatan viabilitas sel dengan menggunakan metode MTT,
dilanjutkan dengan uji flowcytometry untuk mengetahui potensi ekstrak metanol daun
rosemary dalam menginduksi apoptosis. Ekspresi protein Bcl-2 dianalisis
menggunakan metode imunositokimia. Hasil uji viabilitas sel menunjukkan ekstrak
metanol daun rosemary memiliki efek sitotoksik lemah dengan nilai IC50 sebesar 320
µg/mL, dan jalur kematian sel pada konsentrasi ½ IC50 menunjukkan bahwa ekstrak
metanol daun rosemary mampu menginduksi apoptosis sebesar 27% pada uji
flowcytometry dengan waktu inkubasi 24 jam. Hasil uji imunositokimia
menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary mampu menekan kuat ekspresi
protein Bcl-2 pada konsentrasi ½ IC50, sehingga kemungkinan induksi apoptosis
diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2 pada sel kanker serviks. Berdasarkan
hasil tersebut, perlu penelitian lebih lanjut mengenai potensi kemoprevensi ekstrak
metanol daun rosemary dalam meregulasi protein lainnya pada induksi apoptosis.
Kata kunci: Kanker serviks, Bcl-2, Rosmarinus officinalis L., Sel HeLa.

xiii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRACT
Cervical cancer has a character of Bcl-2 protein over expression that can be
inhibit apoptosis. The standard treatment for cervical cancer using cisplatin, yet
nowaday, the increase of cisplatin resistence often lead to the failure of
chemotherapy. One of plants that has been widely studied in various cancer cells and
having anticancer activity is the leaves of rosemary (Rosmarinus officinalis L.)
which is extracted using methanol. The aim of this study was to determine the effect
of rosemary leaves methanol extract against HeLa cervical cancer cells. The initial
research was conducted to determine cell viability using MTT, followed by a test
using a flowcytometry to detect cells undergo apoptosis. The expression of the Bcl-2
protein was analyzed using immunocytochemistry. The cell viability assay results
shows that methanol extract of rosemary leaves have a lower cytotoxic effect on 50%
inhibitory concentration (IC50) of 320 µg/mL, the cell death pathway on ½ IC50
shows the amount of apoptotic cells are 27% using a flowcytometry with 24 hours
incubation period. Immunocytochemistry showed that the methanol extract of
rosemary leaves potentially suppress the expression of the Bcl-2, so the possibility
induction of apoptosis mediated by suppress the expression of the Bcl-2 protein in
cervical cancer cells. Based on this result, further research is needed on the
chemoprevention potential of rosemary leaves methanol extract on the regulation of
other proteins in inducing apoptosis.
Keywords: Cervical cancer, Bcl-2, Rosmarinus officinalis L., HeLa cells.

xiv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PENDAHULUAN
Kanker menjadi salah satu penyebab kematian yang utama di seluruh dunia.
Jumlah kasus baru terkait kanker diperkirakan akan meningkat menjadi 70% selama dua
dekade ini. Kanker serviks merupakan jenis kanker paling umum kedua yang terjadi pada
wanita di Indonesia (IARC, 2015).
Kanker serviks sebagian besar disebabkan oleh human papillomavirus (HPV),
penyebaran infeksi oleh virus tersebut sebagian besar melalui hubungan seksual. Ibeanaum
(2011) mengatakan bahwa DNA onkogenik ditemukan dalam 95% HPV penyebab kanker
serviks. Infeksi HPV pada sel kanker serviks HeLa berikatan dengan tumor suppressor
protein p53, dimana p53 ekspresinya tertekan (Goodwin dan DiMaio, 2000). Penekanan
p53 akan menginduksi protein anti-apoptosis B cell lymphoma-2 (Bcl-2) sehingga jumlah
protein anti-apoptosis berlebih dan menyebabkan kemampuan sel untuk apoptosis menurun
sehingga memicu terjadinya kanker. Dengan demikian, Bcl-2 dapat menjadi salah satu
target molekuler dalam penemuan pengobatan kanker serviks.
Usaha pengobatan kanker sudah banyak dilakukan, namun sampai saat ini belum
ditemukan obat yang mengatasi kanker secara memuaskan. Kemoterapi menggunakan
cisplatin dan 5-flurourasil (5-FU) adalah salah satu strategi untuk pengobatan kanker
serviks (American Cancer Society, 2015). Pengobatan tersebut memiliki keterbatasan yaitu
dewasa ini penggunaan cisplatin sudah resisten. Resistensi cisplatin menyebabkan
kegagalan pada kemoterapi, dan peningkatan dosis cisplatin tidak terbukti efektif karena
pasien akan mengalami dose-dependent toxicity (Leisching, dkk., 2015). Menurut
Hemaiswarya dan Doble (2013), pengobatan mengunakan 5-FU belum cukup efektif
dalam melawan kanker serviks. Oleh karena itu, dibutuhkan agen kemoprevensi yang
selektif terhadap kanker serviks.
Kemoprevensi merupakan suatu langkah untuk mencegah, menunda, ataupun
melawan perkembangan sel kanker dengan menggunakan bahan alam, sintetik, atau
kombinasi dari keduanya. Mekanisme utama dalam menghambat karsinogenesis yaitu
dengan menghambat aktivasi karsinogen dan induksi sitokrom. Dari studi yang telah
dilakukan selama empat dekade terahir ini, banyak target molekul yang terbukti dihambat
oleh agen kemopreventif. Salah satu target molekul yang dihambat yaitu protein antiapoptosis seperti Bcl-2 (Sharma, 2012).
Daun rosemary yang diekstraksi menggunakan metanol mengandung berbagai
senyawa kimia antara lain asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat, yang
1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

mempunyai khasiat sebagai antikanker (Abe, dkk., 2002). Ekstrak metanol daun rosemary
telah ditemukan untuk menghambat proliferasi sel kanker seperti kanker paru-paru dengan
nilai IC50 sebesar 24,08 μg/mL, kanker payudara dengan nilai IC50 sebesar 20,42 μg/mL,
dan kanker hati dengan nilai IC50 sebesar 22,88 μg/mL (Yesil-Celiktas, dkk., 2010).
Menurut Anggraeni (2015) ekstrak metanol daun rosemary menunjukkan efek sitotoksik
pada sel kanker payudara T47D dengan nilai IC50 13,95 μg/mL dan mampu menginduksi
apoptosis 19,68%. Asam betulinat pada sel kanker serviks HeLa juga memiliki aktivitas
antipoliferatif sel dengan nilai IC50 sebesar 30,42 μM dan mampu menginduksi apoptosis
(Xu, dkk., 2014). Menurut Yim dkk. (2006) asam ursolat sebesar 15 μM mampu
menghambat proliferasi pada sel kanker serviks HeLa, serta menginduksi apoptosis.
Berdasarkan data diatas, maka menarik untuk diteliti lebih lanjut mengenai pengembangan
daun rosemary sebagai agen kemopreventif pada kanker serviks HeLa.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi ekstrak metanol daun rosemary
terhadap sel kanker serviks HeLa terkait aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis dan
pengaruh terhadap regulasi protein Bcl-2 yang merupakan agen anti-apoptosis. Sel kanker
serviks HeLa dipilih karena bersifat immortal dan produktif sehingga banyak digunakan
dalam berbagai penelitian ilmiah (Capes, dkk., 2010). Karakteristik sel kanker serviks
HeLa memiliki ekspresi p53 dalam jumlah yang kecil, dan overekspresi Bcl-2. Uji aktivitas
sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel kanker serviks HeLa dengan metode
3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT). Uji flowcytometry

dengan menggunakan staining Annexin V Flous untuk mengetahui sel yang mengalami
apoptosis, dan metode imunositokimia terhadap ekspresi protein Bcl-2. Dengan demikian
diharapkan hasil penelitian ini dapat memberikan tambahan informasi mengenai agen
kemopreventif pada kanker serviks.

METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Sel yang digunakan dalam pengujian ini adalah sel kanker serviks HeLa yang
didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, dan
tanaman rosemary dibeli dari Dipokusumo Farm yang ditanam di kebun Malang. Bahan
kimia yang digunakan adalah metanol absolut, metanol 60%, media kultur medium
DMEM, Tripsin EDTA 0,025%, PBS (Phosphat Buffer Saline), SDS (Sodium Dodecyl
Sulfate) 10% dalam HCl 0.01 N, DMSO (Merck) dengan konsentrasi tertinggi 0,16%,

2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

akuades, reagen Annexin V Fluos staining kit (Roche) mengandung 100 mL buffer (2 mL
of 2 mL Annexin V and Propidium Iodide), reagen MTT (Sigma) 5 mg/mL, primary
monoclonal antibody mouse anti-human Bcl-2 Oncoprotein (Dako), biotinylated universal
secondary antibody (Biocare), substrat DAB, cisplatin 10 mg/10 mL yang didapatkan dari

Kalbe Farma.
Alat Penelitian
Alat–alat gelas steril (Pyrex), waterbath (Memmert), rotary evaporator (Buchi
Labortechnik AG CH-99230), oven, 96 well-plate (Iwaki), 6 well-plate (Iwaki), sentrifuge
tube, inkubator CO2 (Thermo Heraeus HeraCell 150), Laminar air flow cabinet

(Labconco), mikropipet, hemositometer (Neubauer), ELISA reader (Bio-Rad), kamera
digital (Canon 550D), mikroskop cahaya (Olympus), mikroskop inverter (Olympus),
flowcytometer (FACS Calibur).

Pembuatan serbuk daun rosemary kering
Tanaman rosemary dibeli dari Dipokusumo Farm yang ditanam di kebun Malang,
dan dideterminasi di laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah
Mada (Lampiran 1). Bagian tanaman yang digunakan adalah daun. Daun yang akan dipilih
yaitu daun tua yang segar yang terletak bagian tengah pada tanaman antara cabang daun ke
lima dari bagian atas tanaman dan daun ke lima dari bawah tanaman, bentuk masih utuh,
dan berwarna hijau pekat. Daun rosemary dipisahkan dari batang dan akarnya, serta
pengotor lainnya seperti tanah yang menempel pada daun. Pencucian daun rosemary
dilakukan dengan menggunakan air mengalir sebanyak tiga kali. Kemudian dilakukan
pengeringan menggunakan oven suhu 40-50oC. Daun rosemary yang telah kering tersebut,
kemudian diblender hingga hancur dan diperoleh serbuk halus simplisia daun rosemary.
Pembuatan ekstrak metanol daun rosemary
Serbuk simplisia daun rosemary sebanyak 7,3 g dimasukkan dalam labu alas bulat
500 mL, dan ditambahkan 30 mL metanol absolut, direfluks pada suhu 60oC selama 30
menit. Proses refluks diulang sampai pelarut tidak berwarna dengan menggunakan pelarut
yang baru, dan terhadap hasil refluks dilakukan penyaringan, digabungkan, dan dipekatkan
menggunakan rotary evaporator sampai metanol menguap, kemudian dilanjutkan dengan
menggunakan waterbath pada suhu 80oC sampai mencapai bobot tetap. Residu serbuk
diambil sebanyak 0,5 g dan ditambahkan metanol 60% sebanyak 10 mL, kemudian
divortex selama 1 menit. Setelah divortex, larutan disentrifugasi selama 15 menit dengan
kecepatan 3000 rpm, disaring dan diambil endapan yang terbentuk. Endapan ditambahkan
3

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

10 mL metanol absolut, disaring, dan cairan dipekatkan menggunakan waterbath pada
suhu 80oC sampai mencapai bobot tetap (Abe, dkk., 2002; Anggraeni, 2015).
Pembuatan larutan uji
Sampel (Ekstrak metanol daun rosemary)
Ekstrak kering daun rosemary ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan
kedalam 100 μl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000
μg/mL. Selanjutnya dibuat seri konsentrasi sebesar 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL,
62,5 μg/mL, 31,25 μg/mL, 15,625 μg/mL.
Kontrol positif (Cisplatin)
Cisplatin dengan konsentrasi 10 mg/10 mL, kemudian dibuat larutan stok dengan
konsentrasi 1.000 μg/mL. Selanjutnya dibuat seri konsentrasi sebesar 78 μg/mL, 39 μg/mL,
20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 2,5 μg/mL.
Panen Sel
Sel HeLa ditanam dan diinkubasi dalam cawan petri hingga konfluen 80% yang
terlihat monolayer di bawah mikroskop, kemudian media kultur DMEM dibuang terlebih
dahulu menggunakan mikropipet. PBS ditambahkan ke dalam cawan petri untuk mencuci,
kemudian dibuang dan ditambahkan tripsin 0,025% secara merata dalam cawan petri.
Cawan petri ditutup dan didiamkan di dalam inkubator selama 3 menit hingga sel terlepas.
Pindahkan ke dalam ke conical tube, tambahkan PBS 10 mL, dan disentrifuge selama 10
menit. PBS dibuang, endapan diberi media kultur DMEM 2 mL, disuspensi dan dicuplik
sedikit diamati di bawah mikroskop dengan haemocytometer untuk menghitung jumlah sel
yang diperlukan selama pengujian. Perhitungan jumlah sel :
1 2 3 4 x 104/mL x faktor pengenceran
4
(Nobakht, dkk., 2014; CCRCd, 2009).
Uji Sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary pada sel HeLa
Sel sebanyak 1x106 sel/mL yang telah diinkubasi selama 24 jam dan didapati
sudah konfluen dapat segera diberi perlakuan. Media kultur dibuang terlebih dahulu. Pada
sumuran 96 well-plate diberi 100 μL seri konsentrasi sampel dan seri konsentrasi cisplatin.
Kolom kontrol sel hanya diberi media kultur, dan kolom kontrol media hanya dikosongkan
tanpa diberi media kultur, kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2.
Setelah diinkubasi selama 24 jam, media kultur dibuang, kemudian tambahkan 100 μL
larutan MTT 5 mg/mL yang telah disiapkan dan diinkubasi selama empat jam di dalam
4

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

inkubator CO2. Setelah empat jam, tambahkan 100 μL reagen stopper SDS 10% dalam
0,1N HCl. Plate dibungkus menggunakan alumunium foil dan diinkubasi pada tempat yang
gelap (suhu ruangan) selama 24 jam. Setelah 24 jam, dilakukan pembacaan absorbansi
dengan menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm yaitu pada daerah
cahaya tampak (Xu, dkk., 2014; CCRCc, 2009).
Uji apoptosis dengan metode flowcytometry
Sel dengan populasi 1 x 106/mL ditanam pada 6 well-plate, dan diinkubasi selama
24 jam. Setelah diinkubasi, tiap lubang diberi sampel ekstrak konsentrasi ½ IC50 dan
cisplatin konsentrasi ½ IC50 sebanyak dua mL, dan diinkubasi selama 24 jam dalam
inkubator CO2. Setelah inkubasi selama 24 jam, media dipindahkan dalam conical tube
dengan menggunakan mikropipet. Well-plate dicuci dengan menggunakan PBS sebanyak
satu mL, kemudian diambil dan dipindahkan ke dalam conical tube. Pada well-plate diberi
tripsin 0,025% sebanyak satu mL, diinkubasi selama 3 menit, dan ditampung lagi ke
dalam conical tube. PBS ditambahkan hingga 10 mL dan conical tube disentrifuge selama
10 menit. Supernatan dibuang, sisa endapan ditambahkan PBS dingin sebanyak satu mL.
Resuspensi dilakukan dan 1 mL cairan di dalam conical tube dipindahkan ke dalam micro
tube 1 mL, disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan dibuang

dan disisakan endapan yang terbentuk, ditambahkan 100 μL reagen Annexin V Fluos ke
dalam endapan sampel. Inkubasi selama 10 menit dalam ruang gelap. Buffer 300 μL
ditambahkan di dalam micro tube kemudian hasil dibaca menggunakan flowcytometer
FACS Calibur (Huang, dkk., 2015; CCRCb, 2009).
Uji Imunositokimia
Sel HeLa dengan populasi 2 x 105 ditanam dalam 6 well-plate yang telah diberi
cover slip. Setelah inkubasi 24 jam dan sel telah konfluen, media kultur dibuang. Sel diberi

perlakuan dengan menambahkan 1 mL sampel konsentrasi ½ IC50 dan cisplatin konsentrasi
IC50, diinkubasi selama 24 jam pada inkubator CO2. PBS ditambahkan ke cover slip, lalu
dibuang. Penambahan PBS dilakukan sebanyak dua kali dan difiksasi menggunakan
metanol 300 μL dengan tujuan untuk mempertahankan morfologi sel, diinkubasi selama 10
menit, lalu dibuang. Cover slip diambil dan dipindahkan ke kaca preparat, kemudian cover
slip ditambahkan larutan hidrogen peroksida (H2O2) sebanyak 1 mL untuk menghambat

peroksidase endogen, diinkubasi selama 10 menit, lalu dibuang. Cuci cover slip dengan
akuades sebanyak 1 mL. PBS 1 mL ditambahkan pada cover slip, dan didiamkan selama 5
menit, lalu dibuang. Cover slip diberi larutan blocking 20 μL selama 10 menit untuk
5

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

mencegah ikatan tidak spesifik antibodi sekunder, lalu dibuang, diberi antibodi primer 50
μL didiamkan selama 1 jam, setelah itu dibuang dan diberi PBS diulang sebanyak dua kali.
Kemudian cover slip diberi antibodi sekunder 30 μL diinkubasi selama 20 menit, lalu
dibuang dan diberi PBS didiamkan selama 2 menit dan diulang 2 kali. Reagen yang berisi
kompleks streptavidin sebanyak 30 μL untuk memperjelas pewarnaan dan diinkubasi
selama 10 menit, lalu ditambahkan PBS inkubasi 2 menit, lalu dibuang, dan diulang 2 kali.
Cover slip diberi larutan diaminobenzidin (DAB) sebagai pewarna coklat sebanyak 50 μL

diinkubasi selama 7 menit, dan ditambahkan akuades lalu dibuang. Larutan
MayerHaematoxylin ditambahkan dan diinkubasi selama 3 menit yang berguna untuk

memberikan kontras warna atau membedakan warna sel, lalu ditambahkan akuades dan
dibuang. Cover slip diangkat dengan pinset dan digenangi etanol, lalu cover slip
dikeringkan. Cover slip diletakkan di atas object glass, dan ditetesi dengan lem (mounting
media), kemudian ditutup dengan cover slip kotak. Pengamatan dilakukan dengan
mikroskop cahaya (Guimaraes, dkk., 2005; CCRCa, 2009).

Analisis Hasil
Analisis nilai IC50
Data absorbansi pada setiap sumuran dari uji MTT diperlukan untuk dikonversi
menjadi presentase sel yang hidup. Presentase sel yang hidup (% viabilitas) dihitung
menggunkan rumus:

Data yang diperoleh diolah untuk mendapatkan nilai IC50 dengan membuat regresi
linear konsentrasi versus persen viabilitas sel menggunakan program Microsoft Excel
(Setiawati, Handika, & Utami, 2016; CCRCc, 2009).
Analisis Apoptosis Sel
Pengamatan kuantitatif dilakukan menggunakan alat FACS Calibur yang
terhubung dengan software untuk membaca hasil analisis. Hasil yang didapatkan,
kemudian dikonversikan dalam diagram menjadi warna sel. Warna hijau menunjukkan sel
hidup (Annexin-/PI-), warna kuning menunjukkan sel mengalami early apoptosis
(Annexin+/PI-), merah muda menunjukkan sel mengalami late apoptosis (Annexin+/PI+)
(Hingorani, dkk., 2011), dan warna merah menunjukkan sel mengalami nekrosis (Annexin/PI+) (Nurzijah, dkk., 2012).
6

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Analisis Uji Imunositokimia
Pengamatan kualitatif digunakan untuk mengetahui ekspresi protein Bcl-2. Warna
coklat menunjukkan ekspresi protein Bcl-2, dan warna ungu menunjukkan tidak terdapat
ekspresi protein Bcl-2.
Pengamatan secara semikuantitatif dilakukan dengan level scoring. Pembacaan
data dilakukan dengan bantuan tiga orang responden (blind reader ) untuk menghitung
jumlah sel yang mengekspresikan Bcl-2 pada preparat yang terdiri dari tiga bagian tiap
preparatnya.
% Ekspresi Bcl-2 :

x 100%

Level scoring ekspresi Bcl-2 ditentukan dengan :
a.

0

: kurang dari 5% (Sangat kuat)

b.

1+

: 6% - 25% (Kuat)

c.

2+

: 26% - 50% (Sedang)

d.

3+

: 51% - 75% (Lemah)

e.

4+

: 76% - 100% (Sangat lemah)
(Zang, dkk., 2002).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembuatan ekstrak daun rosemary pada penelitian ini dilakukan dengan metode
refluks menggunakan pelarut metanol. Refluks merupakan cara ekstraksi menggunakan
pemanasan. Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus mampu melarutkan senyawa
yang diharapkan, dan memiliki titik didih lebih rendah dibandingkan dengan senyawa
target, dengan hal tersebut kerusakan senyawa target dapat dihindari. Metanol merupakan
pelarut yang mampu menyari senyawa bersifat polar maupun nonpolar, sehingga
diharapkan senyawa target dalam daun rosemary mampu tersari dengan baik. Ekstraksi
yang dilakukan pada penelitian ini dengan metode refluks menggunakan pelarut metanol
didapatkan rendemen sebesar 12%.
Berdasarkan penelitian Abe dkk. (2002), diketahui bahwa daun rosemary yang
diekstraksi dengan menggunakan pelarut metanol mampu menyari senyawa aktif seperti
asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat. Metode refluks dapat digunakan pada
metode ekstraksi daun rosemary karena senyawa target memiliki titik didih yang tinggi
7

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

yaitu asam betulinat sebesar 295-298oC, asam oleanolat sebesar 300oC, asam ursolat
sebesar 284oC, dan pelarut metanol yang digunakan memiliki titik didih 64,5oC. Pada
penelitian ini tidak dilakukan uji kandungan senyawa ekstrak metanol daun rosemary,
namun diperkirakan bahwa ekstrak metanol daun rosemary memiliki aktivitas antikanker
oleh adanya senyawa-senyawa tersebut. Penelitian lain menggunakan asam betulinat pada
sel kanker serviks HeLa memiliki aktivitas antipoliferatif sel dengan nilai IC50 sebesar
30,42 μM dan mampu menginduksi apoptosis Xu, dkk., 2014 . Menurut Yim dkk. 2006)
asam ursolat sebesar 15 μM mampu menghambat proliferasi pada sel kanker serviks HeLa.
Asam oleanolat sebesar 40 μM memiliki efek sitotoksik dan mampu menginduksi apotosis
pada sel kanker hati HepG2 (Wang, dkk., 2013).
Perbedaan usia tanaman, tempat tumbuh, cuaca, dan kondisi lingkungan
menyebabkan kandungan senyawa aktif dalam daun rosemary berbeda-beda, namun
dengan menggunakan metode ekstraksi yang sama pada penelitian sebelumnya oleh Abe
dkk. (2002) diharapkan senyawa yang tersari sama dengan penelitian tersebut. Menurut
Yesil-Celiktas dkk. (2010), menyatakan bahwa ada beberapa kandungan senyawa aktif
lainnya yang diidentifikasi dari daun rosemary antara lain asam carnosic, dan asam
rosmarinic. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi
kandungan senyawa dalam ekstrak metanol daun rosemary.
Uji 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT)
merupakan uji yang digunakan untuk mengukur viabilitas sel. MTT masuk ke dalam sel
dan direduksi oleh enzim suksinat dehydrogenase menjadi formazan berwarna ungu yang
tidak larut dan pada mitrokondria (Riss, dkk., 2013). Sel HeLa yang hidup ditandai dengan
terbentuknya kristal formazan berwarna ungu, sehingga metode ini dapat digunakan untuk
mengukur viabilitas sel. Formazan tersebut dapat larut setelah ditambahkan stopper (SDS),
sehingga dapat dibaca absorbansinya dengan menggunakan ELISA reader dan dapat
mengetahui IC50 dari ekstrak.
Aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel kanker serviks
HeLa memberikan pengaruh pada morfologi sel setelah 24 jam perlakuan. Pada kelompok
kontrol sel, sel berbentuk poligonal dan menempel pada plate (Gambar 1A). Pada
kelompok perlakuan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi 62,5 μg/mL (Gambar 1B),
morfologi sel HeLa terlihat mengkerut yang ditandai dengan sel berbentuk bulat, tidak
menempel pada plate, serta kepadatan sel berkurang, begitu juga pada kelompok perlakuan
cisplatin (Gambar 1C).
8

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

B

A

C

Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi sel secara mikroskopis dengan perbesaran 100x setelah perlakuan
dengan ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dengan waktu inkubasi 24 jam. (A) Morfologi kontrol
sel HeLa. (B) Morfologi sel pada perlakuan ekstrak metanol daun rosemary dengan konsentrasi 62,5 μg/mL.
(C) Morfologi sel pada perlakuan cisplatin dengan konsentrasi 20 μg/mL. Keterangan :
menunjukkan
sel menjadi mengkerut (berbentuk bulat),
menunjukkan sel hidup dengan bentuk sel poligonal.

Viabilitas sel (%)

120
100
80
60
40
20
0
0

100

200

300

400

500

600

Ekstrak metanol daun rosemary (µg/mL)

A

viabilitas sel (%)

120
100
80
60
40
20
0
0

B

20

40
60
Cisplatin (µg/mL)

80

100

Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin pada sel kanker serviks HeLa. Sel
HeLa (1x106 sel/mL) yang ditanam pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi seri
konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary dan seri konsentrasi cisplatin. Viabilitas sel ditentukan dengan
metode MTT. (A) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary selama 24 jam.
(B) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi cisplatin selama 24 jam.

9

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Hasil yang didapatkan menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary
memiliki aktivitas sitotoksik pada sel kanker serviks HeLa dengan nilai IC50 sebesar 320
µg/mL (Gambar 2A) dan nilai IC50 cisplatin yaitu sebesar 36 µg/mL (Gambar 2B).
Semakin tinggi konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary yang diberikan, sel HeLa yang
hidup semakin berkurang. Secara umum efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary
menunjukkan fenomena dose-dependent. Cisplatin adalah first line agen kemoterapi yang
dalam pengobatan kanker serviks. Oleh karena itu cisplatin dapat dijadikan sebagai kontrol
positif dalam pengembangan agen kemoprevensi.
Potensi suatu ekstrak dikatakan sebagai agen sitotoksik digolongkan menjadi tiga
kategori yaitu agen sitotoksik kuat apabila nilai IC50 < 20 µg/mL, sedang apabila memiliki
nilai IC50 < 50 µg/mL dan lemah apabila nilai IC50 > 50 µg/mL (Ellithey, dkk., 2014).
Menurut Machana dkk. (2011), menyatakan bahwa ekstrak dikatakan tidak aktif sebagai
antikanker apabila nilai IC50 >500 µg/mL. Berdasarkan kriteria tersebut maka dapat
dikatakan bahwa ekstrak metanol daun rosemary tidak cukup toksik atau memiliki aktivitas
antikanker yang lemah terhadap sel kanker serviks HeLa.
Ekstrak metanol daun rosemary tidak cukup toksik terhadap sel kanker serviks
HeLa, namun tetap dapat dijadikan agen kemopreventif. Efek toksik yang kuat pada obat
kemoterapi cisplatin memiliki kelemahan yaitu tidak selektif terhadap sel kanker, cisplatin
bersifat toksik pada sel kanker dan sel normal sehingga muncul efek samping (Dasari dan
Bernard, 2014). Oleh karena itu, dengan ekstrak metanol daun rosemary tidak cukup toksik
terhadap sel kanker serviks HeLa, maka diharapkan tidak bersifat toksik terhadap sel
normal, namun tetap diperlukan penelitian lebih lanjut untuk memastikan aktivitas
sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel normal.
Ekstrak metanol daun rosemary memiliki efikasi pengobatan yang rendah yang
disebabkan efek sitotoksik lemah pada sel kanker serviks, sehingga untuk meningkatkan
efikasi pengobatan ekstrak metanol daun rosemary dapat dikombinasikan dengan agen
kemoterapi yang sudah ada seperti cisplatin. Kombinasi tersebut bertujuan untuk
meningkatan efikasi dengan mengurangi efek toksik cisplatin pada sel atau jaringan normal
dan resistensi (Hemaiswarya dan Doble, 2006). Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan
untuk mengetahui efek sinergis dari kandungan ekstrak metanol daun rosemary dan obat
kemoterapi.

10

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Jenis kematian sel dibagi menjadi dua yaitu melalui apoptosis dan nekrosis.
Apoptosis adalah kematian sel yang terprogram, hal ini memicu fagositosis oleh makrofag,
tanpa menimbulkan inflamasi (Hanahan dan Weinberg, 2000). Metode flowcytometry
digunakan dalam penelitian ini untuk mengetahui jenis kematian sel dan menampilkan data
secara kuantitatif.
Sel- sel normal bersifat hidrofobik dan memiliki membran fosfolipid. Pada bagian
luar lipid bilayer terdapat fosfatidilkolin dan sfingomielin, sedangkan pada bagian dalam
terdapat fosfatidilserin. Ketika sel tersebut mengalami apoptosis, fosfatidilserin akan
menuju ke bagian luar dan Annexin V akan berikatan secara spesifik dengan
fosfatidilserine dibantu oleh ion Ca2+ (Hingorani, dkk., 2011). Sel yang mengalami
kerusakan membran reagen propidium iodida akan berikatan dengan DNA, dan dapat
memberikan data jumlah sel yang mengalami nekrosis (Vermes, dkk., 1995).
R3

R4

R4

R2

R2

R1

R1

B

A
R4

R2
R1

C

Gambar 3. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam menginduksi apoptosis pada sel kanker
serviks HeLa. Sel HeLa (1x 106/mL) yang ditanam pada 6 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian
diberi ekstrak metanol daun rosemary 160 µg/mL dan cisplatin 18 µg/mL diinkubasi selama 24 jam, dan
diwarnai dengan reagen annexin V dan propidium iodida (PI). Hasil dibaca menggunakan flowcytometer. (A)
Kontrol sel kanker serviks HeLa. (B) Sel kanker serviks HeLa yang diberi cisplatin (18 µg/mL). (C) Sel
kanker serviks HeLa yang diberi ekstrak metanol daun rosemary (160 µg/mL).

Hasil uji apoptosis menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol sel, sel yang
masih hidup sebanyak 88,28%. Pada sel HeLa yang diberi cisplatin konsentrasi ½ IC50,
menunjukkan bahwa sel yang mengalami nekrosis sebanyak 2,69%, sel yang mengalami
apoptosis total sebanyak 36,06%, dan sel yang masih hidup sebanyak 61,80%. Pada sel
HeLa yang diberi perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi ½ IC50
11

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

menunjukkan bahwa sel yang mengalami nekrosis sebanyak 19,55%, sel yang mengalami
apoptosis total sebanyak 27,02%, dan sel yang masih hidup sebanyak 54,09% (Tabel I).
Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary menginduksi kematian sel
melalui apoptosis pada sel kanker serviks HeLa. Pada kelompok sel yang mengalami
nekrosis, nekrosis tersebut yaitu nekrosis sekunder karena dalam penelitian secara in vitro
yang dilakukan tidak ada peristiwa fagositosis oleh makrofag. Tahap kelanjutan dari
peristiwa apoptosis akan terdeteksi sebagai nekrosis sekunder (Demoy, dkk., 2000). Pada
penelitian yang dilakukan yaitu dengan waktu inkubasi 24 jam, peristiwa apoptosis
sebelum terdeteksi sebagai nekrosis sekunder belum teramati. Oleh karena itu, perlu
dilakukan pengamatan time-point peristiwa apoptosis sebelum 24 jam.
Tabel I. Hasil Uji Apoptosis dengan Metode Flowcytometry
Total Sel (%)
Radian 1

Radian 2

Radian 3

Radian 4

Sel Hidup

Early Apoptosis

Late Apoptosis

Nekrosis

Kontrol Sel

88,28

3,55

2,58

5,67

Cisplatin

61,80

25,44

10,62

2,69

54,09

11,82

15,20

19,55

Ekstrak

Metanol

Daun Rosemary

Apoptosis dibagi menjadi dua jalur, yaitu jalur ekstrinsik dan jalur intrinsik. Jalur
ekstrinsik yaitu melalui aktivasi caspase-8 oleh ligan yang berikatan dengan reseptor
tumor necrosis factor (TNF) seperti Fas atau TNFR1. Jalur intrinsik disebabkan oleh

peristiwa seperti kerusakan DNA sehingga berpengaruh terhadap ekspresi dari family
protein Bcl-2 seperti Bax, Bcl-2, dan Bad (Weyhenmeyer, dkk., 2012).
Sel kanker serviks Hela memiliki karakteristik ekspresi p53 dalam jumlah yang
kecil dan overekspresi Bcl-2. Overekspresi protein Bcl-2 menghambat pelepasan
sitokrom–c dari mitokondria. Sitokrom-c tidak akan mengikat apoptotic proteaseactivating factor 1 (Apaf-1), kemudian tidak terbentuk kompleks teraktivasi dari (d)ATP,

sehingga caspase-3 tidak teraktivasi dan menyebabkan terjadiya penghambatan apoptosis
(Weyhenmeyer, dkk., 2012). Uji imunositokimia digunakan untuk mengetahui aktivitas
ekstrak metanol daun rosemary terhadap ekspresi protein Bcl-2.
Pada uji imunositokimia, perubahan warna yang terjadi akibat perubahan DAB
dapat dijadikan penanda adanya kompleks antigen dan antibodi pada sel (Uhlen, dkk.,
2016). Warna coklat pada sitoplasma menunjukkan ekspresi protein Bcl-2, dan warna ungu
12

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

menunjukkan tidak terdapat ekspresi protein Bcl-2. Uji imunositokimia merupakan uji
kualitatif, namun dapat dijadikan uji semikuantitatif, dengan pengambilan tiga lapang
pandang dari tiap preparat. Pembacaan hasil dilakukan dengan bantuan blind reader.
Hasil perhitungan ekspresi Bcl-2 menunjukkan bahwa pada kelompok perlakuan
dengan cisplatin konsentrasi IC50 dan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi ½ IC50
mampu menekan ekspresi dari Bcl-2 (Gambar 4). Hasil perhitungan ekspresi Bcl-2 pada
kelompok perlakuan dengan cisplatin adalah bernilai 0 (sangat kuat). Pada kelompok
perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary level ekspresi Bcl-2 adalah 1+ (kuat)
(Tabel II). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary dalam induksi
apoptosis pada sel kanker serviks HeLa salah satunya diperantarai oleh penekanan ekspresi
protein Bcl-2. Perhitungan ekspresi Bcl-2 dalam uji imunositokimia dalam penelitian ini
hanya bersifat semikuantitatif, oleh karena itu diperlukan penelitian lebih lanjut dengan
menggunakan metode lain untuk mendeteksi adanya suatu protein Bcl-2 secara kuantitatif.

A

B

C

D

Gambar 4. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam menekan ekspresi Bcl-2 pada sel kanker
serviks HeLa. Sel HeLa (2 x 105/mL) ditanam dalam 6 well-plate yang telah diberi cover slip diinkubasi
selama 24 jam. Sel diberi perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi ½ IC50 dan cisplatin
konsentrasi IC50, diinkubasi selama 24 jam. (A) Kontrol sel tanpa antibodi Bcl-2. (B) Kontrol sel dengan
antibodi Bcl-2. (C) Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak metanol daun rosemary (160 µg/mL).
(D) Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin (36 µg/mL). Pengamatan dilakukan di bawah
mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x. Keterangan :
sel tidak mengekspresikan Bcl-2,
sel mengekspresikan Bcl-2.

Apoptosis yang terjadi akibat aktivasi caspase-3 tidak hanya diperantarai oleh
penghambatan protein Bcl-2. Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Yim dkk. (2006)
menyatakan bahwa dengan meningkatkan ekspresi Fas, akan mengaktivasi caspase-8 dan
13

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

mengaktivasi caspase-3, kemudian memicu fragmentasi dan akhirnya terjadi apoptosis
pada sel kanker serviks HeLa. Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk
mengetahui regulasi protein lainnya dalam menginduksi apoptosis setelah penekanan
ekspresi Bcl-2.
Tabel II. Perhitungan Ekspresi Bcl-2
Lapang Pandang

Kontrol Sel Tanpa
Antibodi

Kontrol Sel
dengan Antibodi

Cisplatin

Ekstrak Metanol
Daun Rosemary

Ekspresi
Bcl-2

Level

1 (n = 90)

0 (0%)

0

2 (n = 85)

0 (0%)

0

3 (n = 107)

0 (0%)

0

1 (n = 105)

105 (100%)

4+

2 (n = 97)

97 (100%)

4+

3 (n = 106)

106 (100%)

4+

1 (n = 128)

1 (0,78%)

0

2 (n = 125)

3 (2,4%)

0

3 (n = 107)

0 (0%)

0

1 (n = 271)

23 (8,49%)

1+

2 (n = 257)

31 (12,06%)

1+

3 (n = 296)

23 (7,77%)

1+

KESIMPULAN
Hasil uji viabilitas sel menunjukkan ekstrak metanol daun rosemary memiliki efek
sitotoksik lemah terhadap sel kanker serviks HeLa dengan nilai IC50 sebesar 320 µg/mL,
namun tetap memiliki potensi sebagai agen kemopreventif. Jalur kematian sel pada
konsentrasi ½ IC50 menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary mampu
menginduksi apoptosis sebesar 27% pada uji flowcytometry dengan waktu inkubasi 24 jam.
Hasil uji imunositokimia menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary mampu
menekan kuat ekspresi protein Bcl-2 pada konsentrasi ½ IC50, sehingga kemungkinan
induksi apoptosis diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2 pada sel kanker serviks.
Saran untuk penelitian berikutnya yaitu dilakukan identifikasi senyawa aktif
dalam ekstrak metanol daun rosemary, mengetahui efek sitotoksik ekstrak metanol daun
rosemary terhadap sel normal, melakukan pengamatan time-point peristiwa apoptosis
sebelum 24 jam, mendeteksi adanya suatu ekspresi protein Bcl-2 secara kuantitatif, serta
mengetahui regulasi protein lainnya dalam menginduksi apoptosis setelah penekanan
ekspresi Bcl-2.
14

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR PUSTAKA
Abe, F., Yamauchi, T., Nagao, T., Kinjo, J., Okabe, H., Higo, H., dan Akahane, H., 2002.
Ursolic acid as a Trypanocidal Constituent in Rosemary. Biological &
Pharmaceutical Bulletin, 25 (11), 1485–1487.
American Cancer Society, 2015. Treatment Options for Cervical Cancer, by Stage,
http://www.cancer.org/cancer/cervicalcancer/detailedguidecervicalcancer-treatingtargeted-therapy diakses pada tanggal 1 April 2016.
Anggraeni, C. D., 2015. Aktivitas Sitotoksik Ekstrak metanolik Daun Rosemary
(Rosmarimus officinalis L.) terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui Regulasi
Ekspresi Reseptor Estrogen-α ERα . Skripsi, Universitas Sanata Dharma,
Yogyakarta.
Cancer Chemoprevention Research Centera, 2009. Prosedur Tetap: Pengamatan Ekspresi
Protein dengan Metode Immunositokimia , Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta,
http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.012.-Imunositokimia.pdf,
diakses pada tanggal 1 April 2016.
Cancer Chemoprevention Research Centerb, 2009. Prosedur Tetap: Preparasi Sampel
untuk
Flowcytometry,
Unversitas
Gajah
Mada,
Yogyakarta,
http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.014.02-flowcytometry.pdf,
diakses pada tanggal 1 April 2016.
Cancer Chemoprevention Research Centerc, 2009. Prosedur Tetap: Uji Sitotoksik Metode
MTT, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wpcontent/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf, diakses pada tanggal 1 April
2016.
Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Panen Sel, Unversitas
Gajah
Mada,
Yogyakarta,
http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wpcontent/uploads/03.005.-Panen-Sel.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.
Capes, D., Theodosopoulos G., & Atkin, I., 2010. Check Your Cultures! A List of CrossContaminated or Misidentified Cell Lines. Int J Cancer , 127 (1): 1–8.
Dasari,
S.,
dan
Bernard,
P.,
2014.
Cisplatin
in
Molecular mechanisms of action. European Journal
1–15.

cancer
therapy :
of Pharmacology,

Demoy, M., Minko, T., & Kopeckova, P. 2000. Time- and concentration-dependent
apoptosis and necrosis induced by free and HPMA copolymer-bound doxorubicin in
human ovarian carcinoma cells, 69, 185–196.

15

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Ellithey, M. S., Lall, N., Hussein, A. A., & Meyer, D., 2014. Cytotoxic and HIV-1 enzyme
inhibitory activities of Red Sea marine organisms. BMC Complementary and
Alternative Medicine, 14, 77.
Guimaraes, M.C.M., dkk., 2005. Immunohistochemical Expression of p16INK4a and bcl-2
According to HPV Type and to the Progression of Cervical Squamous Intraepithelial
Lesions. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 53(4), 509–16.
Goodwin, E.C., and DiMaio, D., 2000. Repression of Human Papillomavirus Oncogenes in
Hela Cervical Carcinoma Cells Causes the Orderly Reactivation of Dormant Tumor
Suppressor Pathways. Biochemistry, Vol.97, no.23.
Hanahan, D., dan Weinberg, R.A., 2000. The Hallmarks of Cancer. Cell., 100, 57-70.
Hemaiswarya, S., dan Doble, M., 2013. Combination of Phenylpropanoids with 5Fluorouracil as Anti-Cancer Agents against Human Cervical Cancer (HeLa) Cell
Line. Phytomedicine, 20(2), 151–58.
Hingorani, R., Deng, J., Elia, J., McIntyre, C., & Mittar, D, 2011. Detection of Apoptosis
Using the BD Annexin V FITC Assay on the BD FACSVerseTM System. BD
Biosciences, 1–12.
Huang, H., Chen, A. Y., Ye, X., Li, B., Rojanasakul, Y., Rankin, G. O., & Chen, Y. C.,
2015. Myricetin inhibits proliferation of cisplatin-resistant cancer cells through a
p53-dependent apoptotic pathway. International Journal of Oncology, 47(4), 1494–
1502.
Ibeanau, O.A., 2011. Molecular Pathogenesis of Cervical Cancer. Cancer Biology &
Therapy,11(3), 295- 306.
International Agency for Research on Cancer WHO (IARC), 2015. Estimated Cancer
Incidence, Mortality and Prevalence, tersedia dalam www.http://globocan.iarc.fr/,
diakses tanggal 5 April 2016.
Leisching, G., Loss, B., Botha, M., Engelbrecht, A., 2015. Bcl-2 Confers Survival in
Cisplatin Treated Cervical Cancer Cells: Circumventing Cisplatin Dose-Dependent
Toxicity and Resistance. J Transl Med, 13, 328.
Machana, S., dkk., 2011. Cytotoxic and apoptotic effects of six herbal plants against the
human hepatocarcinoma (HepG2) cell line. Chin Med, 6(1), 1-8.
Nobakht, G. M., Kadir, M. a, Stanslas, J., & Charng, C. W., 2014. Cytotoxic effect of
Typhonium flagelliforme extract. Journal of Medicinal Plants Research, 8(31),
1021–1024.
Nurzijah, I., Putri, D. D. P., Rivanti, E., & Meiyanto, E., 2012. Secang (Caesalpinia
sappan L.) Heartwood Ethanolic Extract Shows Activity as Doxorubicin Co16

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

chemotherapeutic Agent by Apoptotis Induction on T47D Breast Cancer Cells.
Indonesian Journal of Cancer Chemoprevention, 3(2), 377–384.
Riss, T.L., Richard, A.M., Andrew, L.N., Helene, A.B., Tracy, J.W., Lisa, M., 2013, Assay
Guidance
Manual:
Cell
Viability
Assays,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/, diakses pada tanggal 8 April
2016.
Setiawati, A., Immanuel, H., & Utami, M. T., 2016. The inhibition of Typhonium
flagelliforme Lodd. Blume Leaf Extract on COX-2 Expression of WiDr Colon
Cancer Cells. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 6(3), 251–255.
Sharma, R., 2012. Cancer Chemoprevention: Prevention is Better than Cure. Cancer
Science Therapy, S3:e001.
Uhlen, M., Ponten, F., Tegel, H., Nilsson, P., Feilitzen, K., Lundberg, E., dkk., 2016,
http://www.proteinatlas.org/learn/method/,
Immunocytochemistry,
immunocytochemistry, diakses pada tanggal 22 April 2016.
Vermes, I., Clemens, H., Helga, S., dan Chris, R., 1995, A Novel Assay for Apoptosis
Flow Cytrometric Detection of Phospatidylserine Expression on early Apoptic Cells
Using Flourescein Labelled Annexin V, Journal of Immunological Methods, 184: 3951.
Wang, X., dkk., 2013. Inhibitory effect of oleanolic acid on hepatocellular carcinoma via
ERK–p53-mediated cell cycle arrest and mitochondrial-dependent apoptosis.
Carcinogenesis, 34(6)1323-1330.
Weyhenmeyer, B., Murphy, A. C., Prehn, J. H. M., & Murphy, B. M., 2012. Targeting the
Anti-apoptotic Bcl-2 Family Members for the Treatment of Cancer. Experimental
Oncology, 34(3), 192–199.
Xu, T., dkk., 2014. Proteomic Investigation into Betulinic Acid-Induced Apoptosis of
Human Cervical Cancer HeLa Cells. PLoS ONE, 9(8), 1–11.
Yesil-Celiktas, O., SevimLi, C., Bedir, E., & Vardar-Sukan, F., 2010. Inhibitory Effects of
Rosemary Extracts, Carnosic acid and Rosmarinic Acid on the Growth of Various
Human Cancer Cell Lines. Plant Foods for Human Nutrition, 65(2), 158–163.
Yim, E. K., dkk., 2006. Antiproliferative and Antivi

Dokumen baru

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

76 1855 16

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

28 486 43

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

28 430 23

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

9 258 24

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

19 380 23

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

31 569 14

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

25 501 50

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

10 319 17

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

15 491 30

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

26 582 23