T1__Full text Institutional Repository | Satya Wacana Christian University: Aktivitas Bakteriosin Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Air Penggumpal Tahu Alami = Bacteriocin of Lactic Acid Bacteria that Were Isolated from Tofu Coagulant T1 Full text
Aktivitas Bakteriosin Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Air Penggumpal
Tahu Alami
(Bacteriocin of Lactic Acid Bacteria that were Isolated from Tofu Coagulant)
Oleh
Dona Bella
NIM: 412013014
SKRIPSI
Diajukan untuk memenuhi sebagian dari persyaratan untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains (Biologi) dari Program Studi Biologi, Fakultas Biologi
Fakultas Biologi
Universitas Kristen Satya Wacana
Salatiga
2016
Pendahuluan
Tahu merupakan salah satu produk olahan kedelai yang sering digunakan
masyarakat sebagai lauk sehari-hari. Tahu merupakan makanan yang diolah dari
sari kedelai yang digumpalkan. Proses penggumpalan tahu merupakan proses
penting dalam pembuatan tahu. Proses diawali dengan pembuatan sari kedelai
dan proses penggumpalan sari kedelai. Untuk penggumpalan sari kedelai,
biasanya para produsen menggunakan asam asetat, batu tahu dan air
penggumpal tahu alami (Bella dkk, 2016).
Cara yang paling alami dan memberikan rasa tahu lebih enak yang dapat
digunakan sebagai koagulan tahu yaitu dengan menggunakan bakteri asam laktat
(BAL) yang diisolasi dari air penggumpal tahu (Bella dkk., 2016). BAL adalah
mikroba yang memproduksi asam laktat sebagai produk akhir. BAL memiliki ciri
gram positif, tidak membentuk spora, bersifat anaerob fakultatif dan biasanya
berbentuk basil atau batang. BAL memiliki banyak manfaat dan keunggulan bagi
kesehatan manusia terutama baik untuk saluran pencernaan. Hal itu dikarenakan
BAL dapat merangsang sekresi cairan lambung, serta sebagai sumber energi
dalam proses respirasi (Ramadzanti, 2006).
Kelebihan penggunaan bakteri asam laktat dalam industri pangan adalah
karena tingkat efisiensinya yang tinggi dalam beradaptasi terhadap lingkungan
serta memungkinkan dimanfaatkan oleh masyarakat karena harga yang relatif
murah (Misgiyarta, 2003). Salah satu peran bakteri asam laktat dalam proses
penggumpalan tahu adalah sebagai pengawet alami. BAL dapat berfungsi sebagai
pengawet karena memproduksi asam organik, dapat menurunkan pH
lingkungannya dan dapat mengekskresikan beberapa senyawa penghambat
mikroorganisme patogen seperti bakteriosin. Bakteriosin merupakan substansi
protein yang disintesis oleh ribosom yang memiliki aktivitas antimikrobia.
Bakteriosin dari BAL ini dapat memberikan pengawetan sekaligus nutrisi bagi
makanan (Kusmarwati dkk, 2014).
Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri gram negatif, berbentuk
batang berukuran 0,6 x 2 µm dan merupakan patogen utama bagi manusia.
Bakteri ini bersifat aerob, katalase positif, oksidase positif, tidak mampu
berfermentasi tetapi dapat mengoksidasi glukosa/karbohidrat lain, tidak
berspora, tidak mempunyai selubung dan mempunyai flagel. Suhu optimum untuk
pertumbuhan P. aeruginosa adalah 42oC (Mayasari, 2005). Bacillus subtilis
merupakan bakteri gram positif, berbentuk batang, bersifat anaerobik fakultatif,
mesofilik dan memiliki endospora. B. subtilis juga dapat menjadi agen pengendali
hayati dan PGR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria). Bacillus merupakan flora
normal yang tidak berbahaya bagi manusia (Kosim & Putra, 2010)
Penelitian mengenai aktivitas bakteriosin yang diisolasi dari air
penggumpal tahu belum pernah dilakukan, sehingga dilakukan penelitian ini
dengan tujuan untuk mengetahui aktivitas bakteriosin dari bakteri asam laktat
pada air penggumpal tahu sebagai penghambat pertumbuhan bakteri Bacillus
subtilis dan Pseudomonas aeruginosa. Bacillus subtilis dan Pseudomonas
aeruginosa digunakan sebagai bakteri indikator karena kedua bakteri ini umum
ditemukan sebagai penyebab pembusukkan (Kosim & Putra, 2010).
Metode Penelitian
Pengambilan Sampel
Sampel berupa air penggumpal tahu,diambil dari produsen tahu di
Kalitaman, kota Salatiga, Jawa Tengah. Pengambilan sampel dilakukan pagi hari.
Air penggumpal tahu dibawa menggunakan jerigen, dan langsung dibawa ke
laboratorium untuk diisolasi bakteri asam laktatnya
Isolasi Bakteri Asam Laktat
Sebanyak 1 ml sampel air penggumpal tahu diencerkan hingga
pengenceran 10-4. Dari tiap-tiap pengenceran tersebut diambil 0,2 ml untuk
ditabur pada media MRS agar dan diinkubasi selama 3 hari dalam inkubator 37oC.
Pemurnian Isolat Bakteri
Koloni bakteri yang tumbuh terpisah, langsung diuji kemurniannya
dengan pengecatan sederhana dan diamati di bawah mikroskop. Isolat yang telah
murni, kemudian dipelihara pada medium agar miring MRS. Jika dalam
pengamatan masih belum murni, maka perlu dimurnikan lebih lanjut dengan cara
menggores pada medium lempeng agar MRS (Nuryadi dkk, 2013).
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Uji morfologi koloni dan sel
Morfologi koloni dilakukan dengan pengamatan koloni tiap bakteri yang
telah tumbuh pada medium MRS agar. Pengamatan dilakukan terhadap bentuk,
elevasi, tepian dan warna koloni. Untuk morfologi sel dilakukan pengecatan sel
menggunakan cat gram. Sedikit bakteri dari kultur yang telah murni, diletakan
pada setetes akuades steril pada object glass, lalu di fiksasi dengan melalukan
pada api bunsen hingga kering. Pengecatan diawali dengan meneteskan pewarna
kristal violet (gram A) sampai menutupi hasil fiksasi bakteri pada object glass
selama 2 menit dan dicuci dengan akuades. Kemudian preparat ditetesi iodine
(gram B) selama 1 menit dan dicuci dengan akuades. Selanjutnya preparat dicuci
ulang dengan etanol 95% (gram C) dan dibilas dengan akuades. Langkah terakhir
dengan memberikan pewarna safranin (gram D) selama 30 detik dan dicuci
dengan akuades. Preparat tersebut diamati dibawah mikroskop (Sari dkk., 2012).
KOH string test
Satu ose kultur murni bakteri dari media miring usia 48 jam dicampur
dengan setetes KOH 3% pada object glass dan diaduk menggunakan ose,
kemudian ose diangkat secara cepat. Uji positif ditandai dengan terbentuknya
lendir seperti benang jika ose diangkat sedikit dari koloni (Arthi dkk., 2003),
Uji Biokimiawi (uji katalase)
Uji katalase dilakukan dengan menggunakan larutan H2O2 yang diteteskan
pada object glass. Koloni BAL yang telah murni diambil sedikit dengan ose
kemudian diletakkan pada object glass yang berisi larutan H2O2. Uji positif
ditandai dengan terbentuknya gelembung gas (Hadioetomo, 1990).
Uji Pembentukan Dekstran
Uji diilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri pada media SYP
(sucrose yeast extract peptone). Bakteri diinokulasikan pada media padat SYP
kemudian diinkubasi selama 48 jam. Amati pembentukan dekstran (Nuryadi dkk,
2013).
Tipe Fermentasi
Pengujian dilakukan dengan menginokulasi isolat bakteri dalam MRS cair
yang terdapat tabung durham kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu
37oC. Amati pembentukan gelembung pada tabung durham (Romadhon &
Margino, 2012).
Uji Aktivitas Bakteriosin dari BAL terhadap Bakteri Indikator
Uji aktivitas bakteriosin dilakukan menggunakan metode cakram kertas
atau paperdisc dengan dua perlakuan bakteri indikator. Masing-masing perlakuan
diulang sebanyak 5 kali dan satu kontrol. Bakteri indikator yang digunakan
(Bacillus subtilis dan Pseudomonas aeruginosa) merupakan koleksi Laboratorium
Mikrobiologi, Fakultas Biologi, Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga.
Sebanyak satu ose biakan bakteri indikator murni disuspensikan dalam 10 ml
garam fisiologis, kemudian sebanyak 1 ml suspensi biakan diinokulasikan pada 10
ml media NA yang masih cair pada tabung reaksi. Media tersebut dicampur
dengan baik dan dituangke dalam cawan petri steril, kemudian dibiarkan hingga
memadat.
Isolat bakteri asam laktat yang telah didapat ditumbuhkan dalam media
MRS cair hingga berumur 2x24 jam. Pengkulturan dilakukan untuk masing-masing
isolat murni atau campuran. Setelah inkubasi 2x24 jam, sebanyak 20 µl masingmasing kultur murni atau campuran diteteskan pada cakram kosong dan
diletakkan diatas media NA yang telah mengandung bakteri indikator. Sebagai
kontrol digunakan akuades steril sebagai pengganti kultur BAL. Cawan uji tersebut
kemudian diinkubasi selama 48 jam. Aktivitas bakteriosin diukur berdasarkan zona
hambat yang terbentuk disekitar cakram (Kelana dkk., 2010).
Analisis Data
Aktivitas bakteriosin diukur dari diameter zona bening yang terbentuk
disekitar paperdisc. Data dianalisis statistik nonparametrik dengan uji KruskalWallis H dan uji posterior Mann Whitney pada SPSS16.
Hasil dan Pembahasan
Karakterisasi Isolat Bakteri
Dari proses isolasi bakteri asam laktat asal sampel air penggumpal tahu
yang diambil dari produsen tahu di daerah Kalitaman, kota Salatiga, didapatkan 4
isolat yang berbeda yang tumbuh pada media MRS agar.Karakter morfologi koloni
dan sel ke empat isolat bakteri tersebut dapat dilihat pada tabel 1. Sedangkan
untuk hasil karakter fisiologis ke empat isolat yang didapat, dapat dilihat pada
tabel 2.
Tabel 1. Karakteristik Morfologi Koloni dan Sel
Bentuk
Tepian
Elevasi
Warna
Sel
Kokus
Batang
Koloni A
Bundar
Licin
Tombol
Koloni B
Berombak
Tombol
Koloni C
Tak
Beraturan
Bundar
Cembung
Tombol
Putih
kekuningan
Putih
kekuningan
Putih tulang
Koloni D
Berkerut
Berombak
Cembung
Putih susu
Kokus
Kokus
Tabel 2. Karakter Fisiologi Isolat Bakteri
A
B
C
D
KOH
-
-
-
-
Katalase
+
+
-
-
Pembentukan
-
-
+
-
+
-
+
-
Dekstran
Tipe Fermentasi
Berdasarkan karakter fisiologi pada tabel 2, dapat diketahui bahwa isolat
A dan B tidak sepenuhnya mempunyai ciri bakteri asam laktat sedangkan isolat C
dan D merupakan bakteri asam laktat. Ciri bakteri asam laktat adalah bersifat
gram positif, katalase negatif, serta tidak membentuk spora (Romadhon &
Margino, 2012). Semua isolat tidak membentuk benang pada KOH string test yang
berarti semua isolat bersifat gram positif. Pada pengujian katalase, isolat A dan B
menghasilkan gelembung pada saat ditetesi H2O2. Salah satu ciri bakteri asam
laktat adalah tidak mampu memecah H2O2 atau bersifat katalase negatif seperti
isolat C dan D yang menunjukan reaksi katalase negatif (Romadhon & Margino,
2012).
Isolat C dapat menghasilkan dekstran, hal ini menunjukkan bahwa isolat C
merupakan bakteri asam laktat dari genus Leuconostoc yang dapat memproduksi
enzim dekstransukrase sehingga mampu mengubah sukrosa menjadi dekstran
(Landon dkk, 1993). Bakteri asam laktat memiliki dua tipe fermentasi yaitu
homofermentatif dan heterofermentatif. Isolat A dan C memiliki tipe fermentasi
heterofermentatif dimana hasil fermentasi berupa asam laktat serta asam organik
lainnya seperti asam asetat dan etanol serta menghasilkan karbondioksida. Isolat
B dan D memiliki tipe fermentasi homofermentatif dimana isolat tersebut hanya
menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir (Rachmawati dkk., 2006).
Aktivitas Bakteriosin Bakteri Asam Laktat pada Bakteri Indikator
Uji aktivitas bakteriosin oleh bakteri asam laktat dilakukan hanya dengan
isolat C dan D. Isolat A dan B tidak digunakan dalam uji aktivitas bakteriosin
karena memiliki sifat katalase positif sehingga tidak memenuhi kriteria bakteri
asam laktat. Adanya aktivitas bakteriosin (terbentuknya zona bening disekitar
paperdisc) pada isolat C dan D dapat dilihat pada gambar 1 dan 2.
C
CD
D
Kontrol
Gambar 1. Zona Hambat BAL dengan Bakteri Indikator P. aeruginosa
C
D
CD
Kontrol
Gambar 2. Zona Hambat BAL dengan Bakteri Indikator B.subtilis
Semua isolat menunjukkan adanya zona hambat di sekitar paperdisc.
Dengan begitu isolat C dan D mampu menghambat pertumbuhan bakteri
indikator sehingga dapat dijadikan pengawet alami makanan. Diameter zona
hambat yang dihasilkan oleh tiap isolat dapat dilihat pada grafik 1. Hasil tersebut
sudah termasuk diameter dari paperdisc sebesar 6 mm. Menurut Rai (2009),
aktivitas bakteriosin ditandai dengan adanya zona hambat yang jernih, luas dan
bulat. Jika tidak maka aktivitas tersebut diperkirakan merupakan aktivitas dari
asam, hidrogen peroksida atau diasetil. Beberapa penelitian mengenai aktivitas
bakteriosin dari bakteri asam laktat telah dilaporkan. Isolat BAL genus
Leuconostoc yang diisolasi dari asinan sawi mampu menghambat pertumbuhan
bakteri gram negatif E.coli dengan diameter zona hambat sebesar 4,67 mm
(Rachmawati dkk, 2006). Sedangkan isolat bakteri asam laktat genus Leuconostoc
yang diisolasi dari pekasam ale-ale mampu menghambat pertumbuhan
Pseudomonas aeruginosa dengan zona hambat sebesar 5,82 mm (Sari dkk, 2012).
Aktivitas penghambat oleh isolat C yang tergolong sangat kecil diperkirakan
merupakan aktivitas dari diasetil. Diasetil merupakan hasil produksi metabolisme
sitrat oleh beberapa genus BAL. Diasetil bereaksi dengan arginine-binding protein
pada bakteri gram negatif dan mempengaruhi penggunaan arginin (Rachmawati
dkk, 2006).
.
Aktivitas bakteriosin isolat C, D dan gabungan isolat C dan D tidak
memiliki perbedaan yang signifikan dalam menghambat pertumbuhan Bacillus
subtilis. Semua isolat memiliki aktivitas bakteriosin yang sama, terlihat pada
kemampuan menghambat bakteri gram positif Bacillus subtilis. Menurut Daeschel
(1993), bakteri asam laktat memproduksi bakteriosin hanya sedikit dibanding
asam organik. Meskipun begitu, adanya aktivitas bakteriosin yang dihasilkan
semua isolat pada bakteri indikator Bacillus subtilis sesuai dengan penelitian
Ogunbanwo dkk (2003) yang menyatakan bahwa bakteriosin yang dihasilkan BAL
mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti B. cereus, B. subtilis,
E. coli dan V.cholera. Bakteriosin yang dihasilkan oleh BAL dapat membentuk
lubang pada membran sel bakteri sehingga rusak dan mengalami kebocoran.
Dengan begitu, akan terjadi ketidakstabilan membran sel sehingga pertumbuhan
Diameter Zona Hambat
(mm)
terhambat dan mati (Rachmawati dkk, 2006).
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
P. aeruginosa
B. subtilis
C
D
CD
K
Isolat Bakteri Asam Laktat
Grafik 1. Diameter Zona Hambat Isolat terhadap Bakteri Indikator
Bakteriosin yang dihasilkan oleh isolat mampu menghambat
pertumbuhan paling baik terdapat pada penghambatan bakteri gram negatif
Pseudomonas aeruginosa dibanding bakteri gram positif Bacillus subtilis. Bakteri
gram positif memiliki dinding sel yang lebih tebal berkisar 15-23 nm dibandingkan
dengan bakteri gram positif yang hanya 10-15 nm. Oleh sebab itu bakteri gram
positif lebih resisten terhadap lisis. Selain itu, bakteri gram negatif juga tidak
tahan asam sedangkan bakteri gram positif ada yang tahan asam. Bakteri gram
negative juga tidak mengandung asam teikoik namun mengandung polisakarida
yang lebih rentan terhadap kerusakan kimia dan mekanik. Hal ini dapat menjadi
penyebab penghambatan yang lebih bagus terhadap bakteri gram positif (Jawetz
dkk, 2001).
Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa
adanya aktivitas bakteriosin dari isolat C dan D yang dapat digunakan sebagai
pengawet alami pangan. Isolat C memiliki aktivitas bakteriosin yang rendah dalam
menghambat bakteri indikator gram negatif Pseudomonas aeruginosa dibanding
dengan isolat D memiliki aktivitas bakteriosin yang lebih besar. Sedangkan dalam
menghambat bakteri indikator gram positif Bacillus subtilis, tiap isolat memiliki
kemampuan yang sama.
Saran
Terlihat adanya aktivitas bakteriosin atau penghambat oleh bakteri asam
laktat terhadap bakteri lain. Oleh karena itu diperlukan penelitian lebih lanjut
untuk menentukan kadar bakteri asam laktat yang tepat agar dapat digunakan
sebagai pengawet alami dalam waktu tertentu.
Ucapan terima kasih
Terima kasih kepada Laboratorium Mikrobiologi Universitas Kristen Satya
Wacana yang telah berkenan memfasilitasi seluruh kegiatan penelitian serta
kepada pembimbing Dr. V. Irene Meitiniarti, M.P. yang telah membimbing serta
mendukung kegiatan penelitian hingga selesai.
Daftar Pustaka
A thi, K., Appala aju, B., Pa athi, “.
. Va o
i “e siti it a d KOH “t i g
Test as an Alte ati e of g a stai i g of Ba te ia I dia Jou al of
Medical Microbiology. Vol. 21 (2): 121-123.
Bella, D., Kha , KN., Meiti ia ti, VI.
. Isolasi Bakte i Asa Laktat Pe ghasil
Asa Te aik pada ke uta se agai Pe ggu pal P otei Tahu Ala i.
Prosiding Seminar Nasional Mikrobiologi II. Kerjasama Fakuktas Biologi,
UKSW dengan PERMI cabang Solo.Salatiga.
Daes hel, MA.
. Appli atio a d i te a tio s of a te io i s f o la ti a id
a te ia i foods a d e e ages . I Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria.
Academic Press Inc. New York 63-91.
Hadioetomo, RS. 1990. Mikrobiologi dasar dalampraktek teknik dan prosedur
Dasar laboratorium. Jakarta: PT Gramedia.
Jawetz, Melnick, and Adelberg,s. 2001 ; Mikrobiologi Kedokteran ; Edisi I ;
Salemba Medika, Jakarta ; 196 -198.
Kela a, TB., “u a to, D., Wah u i, “.
. Uji A ti ik o a F aksi Ekst ak
Meta ol, Etil Asetat da α-Heksana Daun Tabar-Tabar (Costus speciosus)
da Toksisitas a te hadap La a Uda g Jurnal Biota Vol 15. No. 1: 118125.
Ku a ati, A., A ief, F‘., Ha ati, “.
. Eksplo asi Bakte iosi da i Bakte i
Asa Laktat Asal ‘usip Ba gka da Kali a ta JPB Perikanan Vol 9 No.
1: 29-40.
Kus i ati., Agusti i, NW‘.
. Uji Akti itas “e a a A ti akte i da i Mik oalga
Porphyridium cruentum Jurnal Biodiversitas Vol. 8 No. 1: 48-53.
Kosi , M & Put a, “. ‘.
. Pe ga uh “uhu pada P otease da i Ba illus su tilis.
Skripsi. Jurusan Kimia FMIPA ITS Surabaya.
La do , ‘“., Hudso , FW., K a e a d, C.
. A Model De t a sucrase
synthesis by Leuconostoc mesenteroides T a s I he E Pa t C.
215.
Mayasari, Evita. 2005. Pseudomonas aeruginosa; Karakteristik, Infeksi dan
Penanganannya. USU repository 2006.
Misgitarta & Widowati, S.
. Efektifitas Bakte i Asa Laktat BAL dala
Pe uata P oduk Fe e tasi Be asis P otei /“usu Na ati. P osidi g
Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman.
Ogu a o, “.T., “a i, A.L., a d O ilude, A.A.
. Cha a te izatio of
Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus
e is OGI Depa t e t of Bota a d i o iolog U i e sit of I ada ,
Nigeria
African
Journal
of
Available
online
at
http://
www.academicjournals. org/AJBnI, Academic Journals, ISSN 1684-5315
‘a h a ati, A., “u a to., “et a i gsih, ‘.
. Uji A ti akte i Bakte i Asa
Laktat asal Asi a “a i te hadap Bakte i Patoge Ju al Biotek ologi
Vol. 2 (2):43-48.
Rai, A K., Bhaskar, N., Amami, P M., Indirani, K., Suresh, P V., Mahendrakar, M S.
. Cha a te izatio a d appli atio of ati e la tid a id a te iu
isolated from tannery fleshing for fermentative bioconversion of tannery
fleshi g Apli atio Mi o iolog Biote h olog Vol. .
-766.
‘a adza ti, A.
. Akti itas P otease dan Kandungan Asam Laktat pada
Yoghurt yang dimodifikasi Bifidobacterium bifidum Skripsi. Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.
‘o adho , “., Ma gi o, “.
. Isolasi da Ka akte istik Bakte i Asa Laktat
dari Usus Udang Penghasil Bakteriosin sebagai Agen Antibakteria pada
Produk-p oduk Hasil Pe ika a Ju al “ai tek Pe ika a Vol. No. .
“a i, ‘A., Nofia i, ‘., A di i gsih, P.
. Ka akte isasi Bakte i Asa Laktat
Genus Leuconostoc dari Pekasam Ale-ale Hasil Formulasi Skala
La o ato iu JKK Vol.
: -20.
Tahu Alami
(Bacteriocin of Lactic Acid Bacteria that were Isolated from Tofu Coagulant)
Oleh
Dona Bella
NIM: 412013014
SKRIPSI
Diajukan untuk memenuhi sebagian dari persyaratan untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains (Biologi) dari Program Studi Biologi, Fakultas Biologi
Fakultas Biologi
Universitas Kristen Satya Wacana
Salatiga
2016
Pendahuluan
Tahu merupakan salah satu produk olahan kedelai yang sering digunakan
masyarakat sebagai lauk sehari-hari. Tahu merupakan makanan yang diolah dari
sari kedelai yang digumpalkan. Proses penggumpalan tahu merupakan proses
penting dalam pembuatan tahu. Proses diawali dengan pembuatan sari kedelai
dan proses penggumpalan sari kedelai. Untuk penggumpalan sari kedelai,
biasanya para produsen menggunakan asam asetat, batu tahu dan air
penggumpal tahu alami (Bella dkk, 2016).
Cara yang paling alami dan memberikan rasa tahu lebih enak yang dapat
digunakan sebagai koagulan tahu yaitu dengan menggunakan bakteri asam laktat
(BAL) yang diisolasi dari air penggumpal tahu (Bella dkk., 2016). BAL adalah
mikroba yang memproduksi asam laktat sebagai produk akhir. BAL memiliki ciri
gram positif, tidak membentuk spora, bersifat anaerob fakultatif dan biasanya
berbentuk basil atau batang. BAL memiliki banyak manfaat dan keunggulan bagi
kesehatan manusia terutama baik untuk saluran pencernaan. Hal itu dikarenakan
BAL dapat merangsang sekresi cairan lambung, serta sebagai sumber energi
dalam proses respirasi (Ramadzanti, 2006).
Kelebihan penggunaan bakteri asam laktat dalam industri pangan adalah
karena tingkat efisiensinya yang tinggi dalam beradaptasi terhadap lingkungan
serta memungkinkan dimanfaatkan oleh masyarakat karena harga yang relatif
murah (Misgiyarta, 2003). Salah satu peran bakteri asam laktat dalam proses
penggumpalan tahu adalah sebagai pengawet alami. BAL dapat berfungsi sebagai
pengawet karena memproduksi asam organik, dapat menurunkan pH
lingkungannya dan dapat mengekskresikan beberapa senyawa penghambat
mikroorganisme patogen seperti bakteriosin. Bakteriosin merupakan substansi
protein yang disintesis oleh ribosom yang memiliki aktivitas antimikrobia.
Bakteriosin dari BAL ini dapat memberikan pengawetan sekaligus nutrisi bagi
makanan (Kusmarwati dkk, 2014).
Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri gram negatif, berbentuk
batang berukuran 0,6 x 2 µm dan merupakan patogen utama bagi manusia.
Bakteri ini bersifat aerob, katalase positif, oksidase positif, tidak mampu
berfermentasi tetapi dapat mengoksidasi glukosa/karbohidrat lain, tidak
berspora, tidak mempunyai selubung dan mempunyai flagel. Suhu optimum untuk
pertumbuhan P. aeruginosa adalah 42oC (Mayasari, 2005). Bacillus subtilis
merupakan bakteri gram positif, berbentuk batang, bersifat anaerobik fakultatif,
mesofilik dan memiliki endospora. B. subtilis juga dapat menjadi agen pengendali
hayati dan PGR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria). Bacillus merupakan flora
normal yang tidak berbahaya bagi manusia (Kosim & Putra, 2010)
Penelitian mengenai aktivitas bakteriosin yang diisolasi dari air
penggumpal tahu belum pernah dilakukan, sehingga dilakukan penelitian ini
dengan tujuan untuk mengetahui aktivitas bakteriosin dari bakteri asam laktat
pada air penggumpal tahu sebagai penghambat pertumbuhan bakteri Bacillus
subtilis dan Pseudomonas aeruginosa. Bacillus subtilis dan Pseudomonas
aeruginosa digunakan sebagai bakteri indikator karena kedua bakteri ini umum
ditemukan sebagai penyebab pembusukkan (Kosim & Putra, 2010).
Metode Penelitian
Pengambilan Sampel
Sampel berupa air penggumpal tahu,diambil dari produsen tahu di
Kalitaman, kota Salatiga, Jawa Tengah. Pengambilan sampel dilakukan pagi hari.
Air penggumpal tahu dibawa menggunakan jerigen, dan langsung dibawa ke
laboratorium untuk diisolasi bakteri asam laktatnya
Isolasi Bakteri Asam Laktat
Sebanyak 1 ml sampel air penggumpal tahu diencerkan hingga
pengenceran 10-4. Dari tiap-tiap pengenceran tersebut diambil 0,2 ml untuk
ditabur pada media MRS agar dan diinkubasi selama 3 hari dalam inkubator 37oC.
Pemurnian Isolat Bakteri
Koloni bakteri yang tumbuh terpisah, langsung diuji kemurniannya
dengan pengecatan sederhana dan diamati di bawah mikroskop. Isolat yang telah
murni, kemudian dipelihara pada medium agar miring MRS. Jika dalam
pengamatan masih belum murni, maka perlu dimurnikan lebih lanjut dengan cara
menggores pada medium lempeng agar MRS (Nuryadi dkk, 2013).
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Uji morfologi koloni dan sel
Morfologi koloni dilakukan dengan pengamatan koloni tiap bakteri yang
telah tumbuh pada medium MRS agar. Pengamatan dilakukan terhadap bentuk,
elevasi, tepian dan warna koloni. Untuk morfologi sel dilakukan pengecatan sel
menggunakan cat gram. Sedikit bakteri dari kultur yang telah murni, diletakan
pada setetes akuades steril pada object glass, lalu di fiksasi dengan melalukan
pada api bunsen hingga kering. Pengecatan diawali dengan meneteskan pewarna
kristal violet (gram A) sampai menutupi hasil fiksasi bakteri pada object glass
selama 2 menit dan dicuci dengan akuades. Kemudian preparat ditetesi iodine
(gram B) selama 1 menit dan dicuci dengan akuades. Selanjutnya preparat dicuci
ulang dengan etanol 95% (gram C) dan dibilas dengan akuades. Langkah terakhir
dengan memberikan pewarna safranin (gram D) selama 30 detik dan dicuci
dengan akuades. Preparat tersebut diamati dibawah mikroskop (Sari dkk., 2012).
KOH string test
Satu ose kultur murni bakteri dari media miring usia 48 jam dicampur
dengan setetes KOH 3% pada object glass dan diaduk menggunakan ose,
kemudian ose diangkat secara cepat. Uji positif ditandai dengan terbentuknya
lendir seperti benang jika ose diangkat sedikit dari koloni (Arthi dkk., 2003),
Uji Biokimiawi (uji katalase)
Uji katalase dilakukan dengan menggunakan larutan H2O2 yang diteteskan
pada object glass. Koloni BAL yang telah murni diambil sedikit dengan ose
kemudian diletakkan pada object glass yang berisi larutan H2O2. Uji positif
ditandai dengan terbentuknya gelembung gas (Hadioetomo, 1990).
Uji Pembentukan Dekstran
Uji diilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri pada media SYP
(sucrose yeast extract peptone). Bakteri diinokulasikan pada media padat SYP
kemudian diinkubasi selama 48 jam. Amati pembentukan dekstran (Nuryadi dkk,
2013).
Tipe Fermentasi
Pengujian dilakukan dengan menginokulasi isolat bakteri dalam MRS cair
yang terdapat tabung durham kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu
37oC. Amati pembentukan gelembung pada tabung durham (Romadhon &
Margino, 2012).
Uji Aktivitas Bakteriosin dari BAL terhadap Bakteri Indikator
Uji aktivitas bakteriosin dilakukan menggunakan metode cakram kertas
atau paperdisc dengan dua perlakuan bakteri indikator. Masing-masing perlakuan
diulang sebanyak 5 kali dan satu kontrol. Bakteri indikator yang digunakan
(Bacillus subtilis dan Pseudomonas aeruginosa) merupakan koleksi Laboratorium
Mikrobiologi, Fakultas Biologi, Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga.
Sebanyak satu ose biakan bakteri indikator murni disuspensikan dalam 10 ml
garam fisiologis, kemudian sebanyak 1 ml suspensi biakan diinokulasikan pada 10
ml media NA yang masih cair pada tabung reaksi. Media tersebut dicampur
dengan baik dan dituangke dalam cawan petri steril, kemudian dibiarkan hingga
memadat.
Isolat bakteri asam laktat yang telah didapat ditumbuhkan dalam media
MRS cair hingga berumur 2x24 jam. Pengkulturan dilakukan untuk masing-masing
isolat murni atau campuran. Setelah inkubasi 2x24 jam, sebanyak 20 µl masingmasing kultur murni atau campuran diteteskan pada cakram kosong dan
diletakkan diatas media NA yang telah mengandung bakteri indikator. Sebagai
kontrol digunakan akuades steril sebagai pengganti kultur BAL. Cawan uji tersebut
kemudian diinkubasi selama 48 jam. Aktivitas bakteriosin diukur berdasarkan zona
hambat yang terbentuk disekitar cakram (Kelana dkk., 2010).
Analisis Data
Aktivitas bakteriosin diukur dari diameter zona bening yang terbentuk
disekitar paperdisc. Data dianalisis statistik nonparametrik dengan uji KruskalWallis H dan uji posterior Mann Whitney pada SPSS16.
Hasil dan Pembahasan
Karakterisasi Isolat Bakteri
Dari proses isolasi bakteri asam laktat asal sampel air penggumpal tahu
yang diambil dari produsen tahu di daerah Kalitaman, kota Salatiga, didapatkan 4
isolat yang berbeda yang tumbuh pada media MRS agar.Karakter morfologi koloni
dan sel ke empat isolat bakteri tersebut dapat dilihat pada tabel 1. Sedangkan
untuk hasil karakter fisiologis ke empat isolat yang didapat, dapat dilihat pada
tabel 2.
Tabel 1. Karakteristik Morfologi Koloni dan Sel
Bentuk
Tepian
Elevasi
Warna
Sel
Kokus
Batang
Koloni A
Bundar
Licin
Tombol
Koloni B
Berombak
Tombol
Koloni C
Tak
Beraturan
Bundar
Cembung
Tombol
Putih
kekuningan
Putih
kekuningan
Putih tulang
Koloni D
Berkerut
Berombak
Cembung
Putih susu
Kokus
Kokus
Tabel 2. Karakter Fisiologi Isolat Bakteri
A
B
C
D
KOH
-
-
-
-
Katalase
+
+
-
-
Pembentukan
-
-
+
-
+
-
+
-
Dekstran
Tipe Fermentasi
Berdasarkan karakter fisiologi pada tabel 2, dapat diketahui bahwa isolat
A dan B tidak sepenuhnya mempunyai ciri bakteri asam laktat sedangkan isolat C
dan D merupakan bakteri asam laktat. Ciri bakteri asam laktat adalah bersifat
gram positif, katalase negatif, serta tidak membentuk spora (Romadhon &
Margino, 2012). Semua isolat tidak membentuk benang pada KOH string test yang
berarti semua isolat bersifat gram positif. Pada pengujian katalase, isolat A dan B
menghasilkan gelembung pada saat ditetesi H2O2. Salah satu ciri bakteri asam
laktat adalah tidak mampu memecah H2O2 atau bersifat katalase negatif seperti
isolat C dan D yang menunjukan reaksi katalase negatif (Romadhon & Margino,
2012).
Isolat C dapat menghasilkan dekstran, hal ini menunjukkan bahwa isolat C
merupakan bakteri asam laktat dari genus Leuconostoc yang dapat memproduksi
enzim dekstransukrase sehingga mampu mengubah sukrosa menjadi dekstran
(Landon dkk, 1993). Bakteri asam laktat memiliki dua tipe fermentasi yaitu
homofermentatif dan heterofermentatif. Isolat A dan C memiliki tipe fermentasi
heterofermentatif dimana hasil fermentasi berupa asam laktat serta asam organik
lainnya seperti asam asetat dan etanol serta menghasilkan karbondioksida. Isolat
B dan D memiliki tipe fermentasi homofermentatif dimana isolat tersebut hanya
menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir (Rachmawati dkk., 2006).
Aktivitas Bakteriosin Bakteri Asam Laktat pada Bakteri Indikator
Uji aktivitas bakteriosin oleh bakteri asam laktat dilakukan hanya dengan
isolat C dan D. Isolat A dan B tidak digunakan dalam uji aktivitas bakteriosin
karena memiliki sifat katalase positif sehingga tidak memenuhi kriteria bakteri
asam laktat. Adanya aktivitas bakteriosin (terbentuknya zona bening disekitar
paperdisc) pada isolat C dan D dapat dilihat pada gambar 1 dan 2.
C
CD
D
Kontrol
Gambar 1. Zona Hambat BAL dengan Bakteri Indikator P. aeruginosa
C
D
CD
Kontrol
Gambar 2. Zona Hambat BAL dengan Bakteri Indikator B.subtilis
Semua isolat menunjukkan adanya zona hambat di sekitar paperdisc.
Dengan begitu isolat C dan D mampu menghambat pertumbuhan bakteri
indikator sehingga dapat dijadikan pengawet alami makanan. Diameter zona
hambat yang dihasilkan oleh tiap isolat dapat dilihat pada grafik 1. Hasil tersebut
sudah termasuk diameter dari paperdisc sebesar 6 mm. Menurut Rai (2009),
aktivitas bakteriosin ditandai dengan adanya zona hambat yang jernih, luas dan
bulat. Jika tidak maka aktivitas tersebut diperkirakan merupakan aktivitas dari
asam, hidrogen peroksida atau diasetil. Beberapa penelitian mengenai aktivitas
bakteriosin dari bakteri asam laktat telah dilaporkan. Isolat BAL genus
Leuconostoc yang diisolasi dari asinan sawi mampu menghambat pertumbuhan
bakteri gram negatif E.coli dengan diameter zona hambat sebesar 4,67 mm
(Rachmawati dkk, 2006). Sedangkan isolat bakteri asam laktat genus Leuconostoc
yang diisolasi dari pekasam ale-ale mampu menghambat pertumbuhan
Pseudomonas aeruginosa dengan zona hambat sebesar 5,82 mm (Sari dkk, 2012).
Aktivitas penghambat oleh isolat C yang tergolong sangat kecil diperkirakan
merupakan aktivitas dari diasetil. Diasetil merupakan hasil produksi metabolisme
sitrat oleh beberapa genus BAL. Diasetil bereaksi dengan arginine-binding protein
pada bakteri gram negatif dan mempengaruhi penggunaan arginin (Rachmawati
dkk, 2006).
.
Aktivitas bakteriosin isolat C, D dan gabungan isolat C dan D tidak
memiliki perbedaan yang signifikan dalam menghambat pertumbuhan Bacillus
subtilis. Semua isolat memiliki aktivitas bakteriosin yang sama, terlihat pada
kemampuan menghambat bakteri gram positif Bacillus subtilis. Menurut Daeschel
(1993), bakteri asam laktat memproduksi bakteriosin hanya sedikit dibanding
asam organik. Meskipun begitu, adanya aktivitas bakteriosin yang dihasilkan
semua isolat pada bakteri indikator Bacillus subtilis sesuai dengan penelitian
Ogunbanwo dkk (2003) yang menyatakan bahwa bakteriosin yang dihasilkan BAL
mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti B. cereus, B. subtilis,
E. coli dan V.cholera. Bakteriosin yang dihasilkan oleh BAL dapat membentuk
lubang pada membran sel bakteri sehingga rusak dan mengalami kebocoran.
Dengan begitu, akan terjadi ketidakstabilan membran sel sehingga pertumbuhan
Diameter Zona Hambat
(mm)
terhambat dan mati (Rachmawati dkk, 2006).
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
P. aeruginosa
B. subtilis
C
D
CD
K
Isolat Bakteri Asam Laktat
Grafik 1. Diameter Zona Hambat Isolat terhadap Bakteri Indikator
Bakteriosin yang dihasilkan oleh isolat mampu menghambat
pertumbuhan paling baik terdapat pada penghambatan bakteri gram negatif
Pseudomonas aeruginosa dibanding bakteri gram positif Bacillus subtilis. Bakteri
gram positif memiliki dinding sel yang lebih tebal berkisar 15-23 nm dibandingkan
dengan bakteri gram positif yang hanya 10-15 nm. Oleh sebab itu bakteri gram
positif lebih resisten terhadap lisis. Selain itu, bakteri gram negatif juga tidak
tahan asam sedangkan bakteri gram positif ada yang tahan asam. Bakteri gram
negative juga tidak mengandung asam teikoik namun mengandung polisakarida
yang lebih rentan terhadap kerusakan kimia dan mekanik. Hal ini dapat menjadi
penyebab penghambatan yang lebih bagus terhadap bakteri gram positif (Jawetz
dkk, 2001).
Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa
adanya aktivitas bakteriosin dari isolat C dan D yang dapat digunakan sebagai
pengawet alami pangan. Isolat C memiliki aktivitas bakteriosin yang rendah dalam
menghambat bakteri indikator gram negatif Pseudomonas aeruginosa dibanding
dengan isolat D memiliki aktivitas bakteriosin yang lebih besar. Sedangkan dalam
menghambat bakteri indikator gram positif Bacillus subtilis, tiap isolat memiliki
kemampuan yang sama.
Saran
Terlihat adanya aktivitas bakteriosin atau penghambat oleh bakteri asam
laktat terhadap bakteri lain. Oleh karena itu diperlukan penelitian lebih lanjut
untuk menentukan kadar bakteri asam laktat yang tepat agar dapat digunakan
sebagai pengawet alami dalam waktu tertentu.
Ucapan terima kasih
Terima kasih kepada Laboratorium Mikrobiologi Universitas Kristen Satya
Wacana yang telah berkenan memfasilitasi seluruh kegiatan penelitian serta
kepada pembimbing Dr. V. Irene Meitiniarti, M.P. yang telah membimbing serta
mendukung kegiatan penelitian hingga selesai.
Daftar Pustaka
A thi, K., Appala aju, B., Pa athi, “.
. Va o
i “e siti it a d KOH “t i g
Test as an Alte ati e of g a stai i g of Ba te ia I dia Jou al of
Medical Microbiology. Vol. 21 (2): 121-123.
Bella, D., Kha , KN., Meiti ia ti, VI.
. Isolasi Bakte i Asa Laktat Pe ghasil
Asa Te aik pada ke uta se agai Pe ggu pal P otei Tahu Ala i.
Prosiding Seminar Nasional Mikrobiologi II. Kerjasama Fakuktas Biologi,
UKSW dengan PERMI cabang Solo.Salatiga.
Daes hel, MA.
. Appli atio a d i te a tio s of a te io i s f o la ti a id
a te ia i foods a d e e ages . I Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria.
Academic Press Inc. New York 63-91.
Hadioetomo, RS. 1990. Mikrobiologi dasar dalampraktek teknik dan prosedur
Dasar laboratorium. Jakarta: PT Gramedia.
Jawetz, Melnick, and Adelberg,s. 2001 ; Mikrobiologi Kedokteran ; Edisi I ;
Salemba Medika, Jakarta ; 196 -198.
Kela a, TB., “u a to, D., Wah u i, “.
. Uji A ti ik o a F aksi Ekst ak
Meta ol, Etil Asetat da α-Heksana Daun Tabar-Tabar (Costus speciosus)
da Toksisitas a te hadap La a Uda g Jurnal Biota Vol 15. No. 1: 118125.
Ku a ati, A., A ief, F‘., Ha ati, “.
. Eksplo asi Bakte iosi da i Bakte i
Asa Laktat Asal ‘usip Ba gka da Kali a ta JPB Perikanan Vol 9 No.
1: 29-40.
Kus i ati., Agusti i, NW‘.
. Uji Akti itas “e a a A ti akte i da i Mik oalga
Porphyridium cruentum Jurnal Biodiversitas Vol. 8 No. 1: 48-53.
Kosi , M & Put a, “. ‘.
. Pe ga uh “uhu pada P otease da i Ba illus su tilis.
Skripsi. Jurusan Kimia FMIPA ITS Surabaya.
La do , ‘“., Hudso , FW., K a e a d, C.
. A Model De t a sucrase
synthesis by Leuconostoc mesenteroides T a s I he E Pa t C.
215.
Mayasari, Evita. 2005. Pseudomonas aeruginosa; Karakteristik, Infeksi dan
Penanganannya. USU repository 2006.
Misgitarta & Widowati, S.
. Efektifitas Bakte i Asa Laktat BAL dala
Pe uata P oduk Fe e tasi Be asis P otei /“usu Na ati. P osidi g
Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman.
Ogu a o, “.T., “a i, A.L., a d O ilude, A.A.
. Cha a te izatio of
Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus
e is OGI Depa t e t of Bota a d i o iolog U i e sit of I ada ,
Nigeria
African
Journal
of
Available
online
at
http://
www.academicjournals. org/AJBnI, Academic Journals, ISSN 1684-5315
‘a h a ati, A., “u a to., “et a i gsih, ‘.
. Uji A ti akte i Bakte i Asa
Laktat asal Asi a “a i te hadap Bakte i Patoge Ju al Biotek ologi
Vol. 2 (2):43-48.
Rai, A K., Bhaskar, N., Amami, P M., Indirani, K., Suresh, P V., Mahendrakar, M S.
. Cha a te izatio a d appli atio of ati e la tid a id a te iu
isolated from tannery fleshing for fermentative bioconversion of tannery
fleshi g Apli atio Mi o iolog Biote h olog Vol. .
-766.
‘a adza ti, A.
. Akti itas P otease dan Kandungan Asam Laktat pada
Yoghurt yang dimodifikasi Bifidobacterium bifidum Skripsi. Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.
‘o adho , “., Ma gi o, “.
. Isolasi da Ka akte istik Bakte i Asa Laktat
dari Usus Udang Penghasil Bakteriosin sebagai Agen Antibakteria pada
Produk-p oduk Hasil Pe ika a Ju al “ai tek Pe ika a Vol. No. .
“a i, ‘A., Nofia i, ‘., A di i gsih, P.
. Ka akte isasi Bakte i Asa Laktat
Genus Leuconostoc dari Pekasam Ale-ale Hasil Formulasi Skala
La o ato iu JKK Vol.
: -20.