VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)- DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU (Nicotiana tabacum L.) SKRIPSI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-
DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU ( L.) SKRIPSIDiajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi Oleh :
Citra Dewi Ariani NIM : 088114115
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2012
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Persetujuan Pembimbing
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)- DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU ( L.)
Skripsi yang diajukan oleh : Citra Dewi Ariani NIM : 088114115 telah disetujui oleh
Pembimbing Jeffry Julianus, M.Si. tanggal 19 Desember 2011
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Halaman Persembahan ! ! ! ! PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya dari orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Apabila dikemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang- undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 19 Desember 2011 Penulis,
Citra Dewi Ariani PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Citra Dewi Ariani Nomor mahasiswa : 088114115
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-
DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM
EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU ( L.)beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 19 Desember 2011 Yang Menyatakan (Citra Dewi Ariani)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan atas berkat, penyertaan, lindungan, dan perkenananNya sehingga proses penulisan skripsi ini dapat berjalan dengan lancar dari awal hingga akhir dan pada akhirnya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul Validasi Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-Densitometri pada Penetapan Kadar Nikotin dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau ( L.). Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.).
Dalam kegiatan perkuliahan, penelitian, serta proses penyusunan skripsi ini, penulis telah mendapatkan banyak bantuan berupa bimbingan, perhatian, semangat, dan juga kritik maupun saran yang membangun dari berbagai pihak, sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Ipang Djunarko, M.Si, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Sanata Dharma.
2. Jeffry Julianus, M.Si., selaku dosen pembimbing skripsi sekaligus dosen pembimbing akademik, atas bimbingan, masukan, perhatian, dan semangat yang diberikan baik selama perkuliahan maupun penyusunan skripsi ini.
3. Yohanes Dwiatmaka,M.Si. selaku dosen penguji sekaligus dosen pembimbing akademik atas segala arahan, perhatian, masukan, kritik maupun saran yang telah diberikan kepada penulis.
4. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen penguji sekaligus dosen pembimbing akademik atas segala arahan, perhatian, masukan, kritik maupun saran yang telah diberikan kepada penulis.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing akademik, atas segala arahan, perhatian, kritik dan saran yang diberikan selama perkuliahan dan selama penelitian skripsi ini berlangsung.
6. Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Otok, Mas Kunto, dan Pak Timbul atas bantuan yang telah diberikan selama penulis bekerja di laboratorium.
7. Segenap dosen dan karyawan atas segala ilmu dan pengalaman yang telah diberikan sehingga sangat membantu dalam penyusunan skripsi ini.
8. Novi dan Cure, sebagai rekan kerja penulis atas segala bantuan, semangat, kebersamaan, selama melakukan penelitian maupun selama perkuliahan.
9. Ayesa, Amel, Dina, sebagai teman satu tim penelitian nikotin atas semangat, bantuan, dukungan, dan kebersamaan selama melakukan penelitian maupun selama perkuliahan.
10. Felis, Sasa, Lele, Susi, Susan, Nona, Sari, Tere, dan Wiwi sebagai teman seperjuangan di Laboratorium Kimia Analisis Instrumental atas semangat, keceriaan dan kebersamaannya.
11. Ko Tony, atas dukungan, perhatian, saran, dan semangat yang telah diberikan selama penyusunan skripsi ini.
12. Cik Yunita, Ko Beny, Mbak Tiwi, atas ilmu, pengalaman, dan semangat yang telah diberikan sehingga sangat membantu penulis dalam penyusunan skripsi ini.
13. Teman-teman kelompok praktikum B, atas keceriaan, pengalaman, dan kebersamaan yang tak akan terlupakan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14. Teman-teman FST B 2008 atas kebersamaan, pengalaman, suka duka, dan kekompakan yang akan penulis kenang selalu.
15. Teman-teman Kos Amakusa atas kebersamaan, keceriaan, semangat dan pengalaman yang telah dibagikan kepada penulis.
16. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu oleh penulis, atas segala bantuan yang diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki banyak kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Akhir kata, semoga skripsi ini dapat berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan selanjutnya.
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ..................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................. iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...................................................... v HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .............................................. vi PRAKATA .................................................................................................. vii DAFTAR ISI ............................................................................................... x DAFTAR TABEL ....................................................................................... xiv DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xvi
INTISARI .................................................................................................... xvii xviii BAB I PENGANTAR ................................................................................
1 A. Latar Belakang ........................................................................................
1 1. Permasalahan ......................................................................................
3 2. Keaslian penelitian .............................................................................
3 3. Manfaat penelitian ..............................................................................
4 B. Tujuan Penelitian ....................................................................................
4 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .........................................................
5 A. Nikotin …………………........................................................................
5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI B. Tembakau ................................................................................................
6 C. Ekstrak Tembakau ..................................................................................
7 D. Kromatografi Lapis Tipis ........................................................................
9 1. Tinjauan umum ..................................................................................
9 2. Sistem KLT ........................................................................................
10 E. Densitometri ............................................................................................
12 F. Validasi Metode ......................................................................................
16 1. Tinjauan umum ..................................................................................
16 2. Parameter validasi ..............................................................................
17 G. Landasan teori ........................................................................................
20 H. Hipotesis .................................................................................................
21 BAB III METODE PENELITIAN ............................................................
22 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ..............................................................
22 B. Variabel Penelitian ..................................................................................
22 C. Definisi Operasional ...............................................................................
23 D. Bahan Penelitian .....................................................................................
23 E. Alat Penelitian ........................................................................................
24 F. Tata Cara Penelitian ................................................................................
24 1. Pembuatan fase gerak .......................................................................
24 2. Pembuatan larutan baku ....................................................................
24 3. Penetapan panjang gelombang pengamatan .....................................
25 4. Pembuatan kurva baku nikotin dan pengamatan nilai R ..................
25
f 5. Penentuan dan (CV) baku .........
26
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6. Penentuan dan (CV) baku dalam matriks sampel ..................................................................................
26 G. Analisis Hasil ..........................................................................................
27 1. Selektivitas ........................................................................................
27 2. Linearitas ..........................................................................................
27 3. Akurasi .............................................................................................
27 4. Presisi ...............................................................................................
28 5. Akurasi pengukuran baku dalam matriks sampel .............................
28 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................
29 A. Pembuatan Fase Gerak ............................................................................
29 B. Preparasi Sampel ....................................................................................
29 C. Pembuatan Larutan Baku ........................................................................
31 D. Penetapan Panjang Gelombang Pengamatan Nikotin .............................
32 E. Pengamatan Nilai (R f ) dan Pembuatan Baku Nikotin ....................................................................................................
34 F. Validasi Metode Analisis ........................................................................
37 1. Selektivitas ........................................................................................
38 2. Linearitas ..........................................................................................
39 3. Akurasi .............................................................................................
40 4. Presisi ...............................................................................................
41 G. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Nikotin dalam Sampel .................
41 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .....................................................
44 A. Kesimpulan .............................................................................................
44
B. Saran ....................................................................................................... DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. LAMPIRAN ................................................................................................ BIOGRAFI PENULIS ................................................................................
44
45
48
76 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR TABEL
Tabel I.Tabel II. Tabel III. Tabel IV. Tabel V. Tabel VI. Tabel VII. Tabel VIII.
Parameter analisis validasi metode .......................................... Kriteria rentang yang dapat diterima ........................ Kriteria CV yang dapat diterima ............................................. Data replikasi kurva baku nikotin............................................. Perbandingan nilai R f baku dan sampel, serta nilai resolusi .... Data % ...................................................................... Data (CV) ......................................... dan CV baku nikotin dalam matriks sampel ............
17
18
19
36
38
40
41
43 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1.15
42
39
39
37
35
35
34
33
32
31
30
14
Gambar 2. Gambar 3. Gambar 4. Gambar 5. Gambar 6. Gambar 7. Gambar 8. Gambar 9.
7
6
5
Kromatogram sampel replikasi I (R f = 0,55) ........................... Kromatogram sampel tanpa penambahan baku nikotin .......... Kromatogram sampel dengan penambahan baku nikotin ........
f = 0,53) .....
Hubungan antara konsentrasi nikotin dengan AUC ................ Kromatogram baku nikotin konsentrasi 5 ppm (R
Interaksi hidrogen nikotin dengan fase diam silika gel 60 F 254 Interaksi nikotin dengan fase gerak (n-heksan : toluen : dietilamin) ................................................................................
f = 0,52) .....
Kromatogram baku nikotin konsentrasi 3 ppm (R
Struktur nikotin ........................................................................ Alkaloid utama dalam tembakau ............................................. Tanaman tembakau .................................................................. Ilustrasi model refleksi dan transmisi ...................... CAMAG’s 3 densitometer ........................................ Reaksi penggaraman nikotin dengan larutan HCl ................... Reaksi pembentukan molekul nikotin basa ............................. Kromofor pada nikotin ............................................................ Densitogram baku nikotin dengan konsentrasi 3 ppm dalam pelarut etanol ...........................................................................
Gambar 13. Gambar 14. Gambar 15. Gambar 16. Gambar 17.
Gambar 10. Gambar 11. Gambar 12.
42 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1.54
74
73
71
69
67
66
65
64
62
58
56
55
52
Lampiran 2. Lampiran 3.
51
50
49
Kromatogram sampel dengan penambahan baku ............... Nilai AUC sampel dan sampel yang diadisi baku nikotin... Contoh perhitungan baku nikotin dalam sampel.. Tabel perhitungan CV kadar baku nikotin dalam sampel ...
Kromatogram seri baku nikotin replikasi III ...................... Kromatogram validasi metode ........................................... Data penimbangan sampel dan perhitungan kadar nikotin.. Persamaan kurva baku dan gambar kurva baku nikotin ..... Nilai AUC dan contoh perhitungan nikotin ......... Contoh perhitungan CV nikotin ......................................... Kromatogram pemisahan sampel dan perhitungan resolusi Kromatogram sampel tanpa penambahan baku ..................
maks
= 261 nm)...................................Tabel data densitogram pada panjang gelombang pengamatan nikotin (λ
Data pengamatan tembakau VBN dan NO ......................... Densitogram baku nikotin dengan konsentrasi 3 ppm dalam pelarut etanol ............................................................
Surat keterangan keaslian baku nikotin ( ) ............ Sistem KLT-densitometri yang digunakan ......................... Surat determinasi tembakau jenis dan ! .................................................................................
Lampiran 7. Lampiran 8. Lampiran 9. Lampiran 10. Lampiran 11. Lampiran 12. Lampiran 13. Lampiran 14. Lampiran 15. Lampiran 16. Lampiran 17. Lampiran 18.
Lampiran 6.
Lampiran 4. Lampiran 5.
75 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
INTISARI
Nikotin merupakan senyawa alkaloid yang banyak terdapat dalam tanaman tembakau ( L.). Dewasa ini nikotin berpotensi sebagai agen terapetik. Oleh karena itu, diperlukan analisis kuantitatif melalui penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau dengan metode KLT - densitometri. Sebelum dilakukan penetapan kadar perlu dilakukan validasi metode untuk mengetahui apakah metode yang digunakan memberikan hasil yang dapat dipercaya.
Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental deskriptif. Dalam penelitian ini, sistem yang digunakan yaitu fase diam silika gel 60 F 254 dan fase gerak n-heksan : toluen : dietilamin (15,25 : 5,75 :4). Setelah pemisahan dengan KLT kemudian dilakukan analisis kuantitatif menggunakan densitometer. Parameter validasi yang diteliti adalah selektivitas, linearitas, akurasi, dan presisi.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode ini memiliki selektivitas yang baik dengan resolusi pada 3 kali replikasi sampel berturut-turut adalah 1,58; 1,89; dan 1,88; linearitas yang baik pada konsentrasi 1-5 ppm dengan r = 0,999, nilai dan CV berturut-turut untuk konsentrasi nikotin 1 ppm, 3 ppm, dan 5 ppm yaitu 98,72-102,46% dan 1,50%; 99,90-101,80% dan 0,78%; 98,23- 100,55% dan 0,96%. Berdasarkan hasil tersebut, maka metode KLT-densitometri ini memiliki validitas yang baik untuk menetapkan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau.
Kata kunci : nikotin, KLT-densitometri, validasi metode
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
Nicotine is an alkaloid compound that is widely available in tobacco plants ( L.). Nowadays, nicotine potentialy become a therapeutic agent. Therefore, quantitative analysis is required through the determination of nicotine levels in the ethanolic extract tobacco’s leaves by the method of TLC - densitometry. Prior to the assay method validation needs to be done to determine whether the methods used to give reliable results.
This study is a non-experimental descriptive studies. In this study, the system used the stationary phase silica gel 60 F 254 and the mobile phase n-hexane : toluene : diethylamine (15,25:5,75:4). After separation by TLC then performed quantitative analysis using a densitometer. Validation parameters studied were selectivity, linearity, accuracy, and precision.
The results showed that this method has good selectivity with resolution of three sample replications consecutively are 1,58; 1,89, and 1,88; good linearity at concentrations of 1-5 ppm with r = 0,999; the value of and CV for the nicotine concentrations of 1 ppm, 3 ppm and 5 ppm consecutively are 98,72 – 102,46% and 1,50%; 99,90 – 101,80% and 0,78%; 98,23 – 100,55% and 0,96%. Based on these results, the TLC-densitometry method has good validity to establish the levels of nicotine in the ethanolic extract tobacco’s leaves.
Keywords : nicotine, TLC-densitometry, validity method
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Indonesia merupakan negara yang kaya akan biodiversitasnya. Obat
berbasis tumbuhan telah melekat di dalam kehidupan masyarakat sejak dahulu kala sehingga peran tanaman berkhasiat obat sangat besar bagi kesehatan masyarakat. Berbagai tanaman obat dan ribuan tanaman berpotensi obat di Indonesia mengandung beraneka ragam jenis senyawa kimia alami. Salah satunya yaitu tanaman tembakau ( L.). Tembakau biasa digunakan sebagai bahan baku dalam pembuatan rokok, pestisida, selain itu juga berpotensi sebagai obat. Kandungan kimia yang paling besar dalam tembakau yaitu nikotin.
Nikotin adalah senyawa organik kelompok seperti
Nikotin tidak hanya memberikan dampak negatif bagi kesehatan karena keberadaannya dalam rokok, namun nikotin dapat memberikan dampak positif karena nikotin memiliki potensi sebagai agen terapetik, yaitu sebagai obat parkinson, obat alzheimer, serta obat (Domino, 1999). Simplisia daun tembakau dengan kandungan nikotinnya dapat lebih bermanfaat dengan dikembangkannya menjadi obat herbal dalam bentuk sediaan farmasetis. Obat herbal memiliki peran penting dalam bidang kesehatan bahkan bisa menjadi produk andalan Indonesia.
2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pada tahap pengembangan simplisia menjadi obat herbal perlu diketahui dosis yang efektif untuk pengobatan, sehingga perlu dilakukan analisis kuantitatif berupa penetapan kadar terlebih dahulu. Penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau perlu dilakukan untuk mengetahui jumlah zat aktif yang nantinya akan berpengaruh terhadap khasiat obat herbal tersebut. Metode yang dipilih untuk penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau yaitu metode kromatografi lapis tipis (KLT)-densitometri. KLT cocok untuk analisis obat di laboratorium farmasi karena metodenya sederhana, cepat dalam pemisahan, sensitif, dan memerlukan jumlah cuplikan yang sangat sedikit (Khopkar, 1990). Nikotin dapat ditetapkan kadarnya dengan metode KLT- densitometri karena terdapat perbedaan interaksi antara nikotin dan senyawa- senyawa lain dalam ekstrak dengan fase diam dan fase gerak yang digunakan.
Untuk dapat menetapkan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau diperlukan serangkaian penelitian terdahulu yaitu optimasi dan validasi metode. Dalam hal ini, peneliti mengambil bagian pada tahap validasi metode KLT-densitometri pada penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau. Tahapan validasi metode ini menggunakan sistem yang telah dioptimasi pada penelitian sebelumnya yaitu menggunakan fase diam silika gel 60 F 254 dan fase gerak n-heksan: toluen: dietilamin (15,25:5,75:4). Optimasi metode penting dilakukan sebelum melakukan validasi metode karena akan memberikan jaminan kepada proses validasi yaitu pemisahan yang optimal dengan nilai resolusi 3 kali replikasi sampel berturut-turut adalah 1,58; 1,89; dan 1,88; interaksi analit dengan fase diam dan fase gerak yang setimbang ditunjukkan
3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dengan bentuk " kromatogram yang runcing dan simetris yang dilihat dari nilai " dari 3 kali replikasi pada konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi adalah 1, serta reprodusibilitas nilai R f dan dengan CV berturut- turut adalah 1,79% dan 0%. Suatu metode analisis harus divalidasi ketika suatu metode menggunakan sistem baru yang belum divalidasi sebelumnya. Tujuan dari validasi yaitu untuk memberikan jaminan bahwa metode analisis yang digunakan memenuhi parameter-parameter validasi yang meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, dan presisi. Oleh karena itu, tahapan validasi metode merupakan tahapan yang penting untuk dilakukan dalam suatu penetapan kadar senyawa untuk dapat memberikan hasil yang dapat dipercaya.
1. Permasalahan
Apakah metode KLT-densitometri pada penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau memenuhi parameter-parameter validasi yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, dan presisi?
2. Keaslian Penelitian
Penelitian mengenai penetapan kadar nikotin dengan metode KLT- densitometri yang pernah dilakukan yaitu penentuan kadar nikotin dalam asap rokok (Susanna, Hartono, dan Fauzan, 2003), #
$ % & ' ( (Tyrpien, Dobosz,
Chrosciewicz, ,Ciolecka, Wielkoszyński, dan Janoszka, 2003), analisis nikotin dalam asap dan filter rokok (Fidrianny, Supradja, dan Soemardji, 2004).
Berdasarkan penelitian di atas, penelitian validasi metode penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau dengan metode KLT-
4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
densitometri fase diam silika gel 60 F 254 dan fase gerak n-heksan: toluen: dietilamin (15,25:5,75:4) ini belum pernah dilakukan sebelumnya.
3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan ilmiah tentang penggunaan metode KLT-densitometri fase diam silika gel 60 F 254 dan fase gerak n-heksan: toluen: dietilamin (15,25:5,75:4) pada penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau.
b. Manfaat praktis. Hasil penelitian diharapkan dapat memberikan informasi mengenai selektivitas, linearitas, akurasi, dan presisi metode penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau secara KLT-densitometri yang dapat digunakan untuk penetapan kadar nikotin sebagai langkah awal untuk penetapan dosis terapetik.
B. Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas metode penetapan kadar nikotin secara KLT-densitometri dengan fase diam silika gel 60 F 254 dan fase gerak n-heksan: toluen: dietilamin (15,25:5,75:4) apakah memenuhi parameter-parameter validasi yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, dan presisi sehingga dapat digunakan untuk penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Nikotin Nikotin merupakan suatu alkaloid dari daun tanaman tembakau, L. Berwarna kekuningan, bersifat volatil, sangat higroskopis,
dapat berubah warna menjadi cokelat apabila terpapar cahaya atau udara. Titik didih 247°C, dengan dekomposisi. Indeks refraktif 1,5280. Nikotin larut dalam air, etanol, eter, dan kloroform. Nikotin dapat diekstraksi dengan pelarut organik dari larutan yang bersifat alkalis (Clarke, 1969).
Gambar 1. Struktur nikotin
Jumlah nikotin sekitar 2-8% dari berat kering daun tembakau, sedangkan alkaloid lainnya seperti anabasin, anatabin, dan nornikotin jumlahnya lebih rendah dibandingkan nikotin. Namun, jumlah masing-masing jenis alkaloid relatif berbeda dari semua alkaloid pada berbagai spesies (Domino, 1999).
Nikotin mengandung dua jenis gugus amin tersier yang bersifat basa dengan pKa cincin piridin adalah 3,04 sedangkan pKa pada cincin pirolidin adalah 7,84. Nilai pKa pada cincin aromatik piridin lebih rendah dikarenakan efek
2
hibridisasi sp yang menyebabkan orbital s bertambah sehingga elektron-elektron dalam orbital lebih terikat kuat pada nukleus (Crooks, 1999).
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Alkaloid utama dalam tanaman tembakau meliputi nikotin, nornikotin, anabasin dan anatabin. Struktur dari masing-masing senyawa dapat dilihat pada gambar di bawah ini.
b a d c
Gambar 2. Alkaloid utama dalam tembakau, a = nikotin, b = nornikotin, c = anabasin, d =
anatabin (Bush, Hempfling, dan Burton, 1999)
Penelitian menunjukkan bahwa kandungan nikotin dalam tembakau dapat digunakan untuk sebagai agen terapi untuk penyakit Parkinson dan Alzheimer karena nikotin dapat meningkatkan reseptor nikotinat yang berpengaruh pada peningkatan asetilkolin dalam otak. Asetilkolin berperan penting untuk fungsi otak dan memori (Hamilton, 2011).
B. Tembakau
Tembakau ( L.) merupakan tanaman yang termasuk dalam famili . Tanaman ini dapat tumbuh sampai dengan 3 m. Daun tanaman tembakau berbentuk bulat lonjong (oval) atau bulat, tergantung pada varietasnya. Daun yang berbentuk bulat lonjong ujungnya meruncing, sedangkan yang berbentuk bulat, ujungnya tumpul. Daun memiliki tulang-tulang menyirip,
7
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
bagian tepi daun agak agak bergelombang dan licin. Lapisan atas da tas daun terdiri atas lapisan parenkim palis palisade dan parenkim berongga pada bagian b gian bawah. Jumlah daun dalam satu tanam tanaman sekitar 28 - 32 helai (Anonim, 2011).
Gambar 3. Tanaman tembakau
Tembakau Vo au Vorstenlanden adalah produk dari daun tembak tembakau ( L.) tipe Vorst Vorstenlanden yang ditanam di Surakarta dan Yo an Yogyakarta tepat waktu dipanen saat saat musim penghujan, dikeringkan di los pe los pengering serta difermentasi dan disort disortasi (Standar Nasional Indonesia, 1995).
Jenis tembaka bakau dibagi dua berdasarkan waktu tanam dan m dan masa panennya, yaitu tembakau musim musim kemarau dan tembakau musim penghuj nghujan. Tembakau adalah dalah tembakau yang ditanam pada akhir mus r musim hujan dan dipanen pada musim k usim kemarau, sedangkan tembakau ! ad adalah tembakau yang ditanam pada m ada musim kemarau dan dipanen pada awal mus al musim penghujan (Cahyono, 1998).
C. Ekstrak Tembakau
Ekstrak temb tembakau adalah sediaan pekat yang dipe diperoleh dengan mengekstraksi daun ke aun kering yang diperoleh dari tanaman L.
Proses ekstraksi zat ak zat aktif dari tanaman tembakau ini menggunaka unakan pelarut yang
8
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).
Ekstraksi atau penyarian merupakan pemindahan massa zat aktif yang semula berada dalam sel, ditarik oleh cairan penyari tertentu sehingga terjadi pelarutan zat aktif dalam cairan penyari. Metode penyarian dipilih berdasarkan zat aktif yang terkandung dalam simplisia dan stabilitas zat aktif tersebut dalam cairan penyari (Anonim, 1986).
Terutama pada ekstraksi cair-cair, sedapat mungkin terdapat perbedaan kerapatan yang besar antara pelarut dan bahan ekstraksi. Hal ini dimaksudkan agar kedua fase dapat dengan mudah dipisahkan kembali setelah pencampuran (pemisahan dengan gaya berat). Bila beda kerapatannya kecil, seringkali pemisahan harus dilakukan dengan menggunakan gaya sentrifugal (misalnya dalam ekstraktor sentrifugal).
Ekstrak dan pelarut biasanya dipisahkan dengan cara penguapan maupun destilasi, maka titik didih kedua bahan itu tidak boleh terlalu dekat, dan keduanya tidak membentuk aseotrop. Ditinjau dari segi ekonomi, akan menguntungkan jika pada proses ekstraksi titik didih pelarut tidak terlalu tinggi atau dengan panas penguapan yang rendah (Rahayu, 2009).
9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
D. Kromatografi Lapis Tipis
1. Tinjauan Umum
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam ( ) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik (Gandjar dan Rohman, 2007).
Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan komponen- komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang atau pelarut pengembang campur (Mulja dan Suharman, 1995).
Kromatogram pada KLT merupakan noda-noda yang terpisah setelah visualisasi dengan cara fisika atau kimia. Visualisasi secara fisika yaitu dengan melihat noda kromatogram yang mengabsorpsi radiasi ultraviolet atau berfluoresensi dengan radiasi ultraviolet. Visualisasi dengan cara kimia adalah dengan mereaksikan kromatogram dengan pereaksi warna lewat pemberian uap zat kimia atau pencelupan ke dalam pereaksi penampak warna yang memberikan warna atau fluoresensi yang spesifik (Mulja dan Suharman, 1995).
Parameter karakteristik pada KLT yaitu harga R f ( ) yang didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal (Roth, 1994). Angka R f berjangka antara 0,00 sampai 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal (Stahl, 1985).
10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
R f = (Dean, 1995)
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin, jika terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda (Gandjar dan Rohman, 2007).
Kromatografi lapis tipis (KLT) bersama-sama dengan kromatografi kertas dengan berbagai macam variasinya dirujuk sebagai kromatografi planar.
Dibandingkan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan kromatografi gas (KG), KLT mempunyai beberapa keuntungan yaitu : a. Kromatografi lapis tipis memberikan fleksibilitas yang lebih besar, dalam hal memilih fase gerak.
b. Berbagai macam teknik untuk optimasi pemisahan seperti pengembangan 2 dimensi, pengembangan bertingkat, dan pembaceman penjerap dapat dilakukan pada KLT.
c. Proses kromatografi sederhana dan dapat dihentikan kapan saja.
d. Semua komponen dalam sampel dapat dideteksi (Rohman, 2009).
2. Sistem KLT
a. Fase diam. Penjerap yang paling sering digunakan pada KLT adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (suatu mekanisme perpindahan solut dari fase diam ke fase gerak atau sebaliknya) yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorpsi. Lapisan tipis yang digunakan
11
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang digunakan sebagai pemisahan kiral (Rohman, 2009).
Silika gel memiliki permukaan yang terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar karenanya gugus ini mampu membentuk ikatan hidrogen dengan solut-solut yang agak polar sampai sangat polar. Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu mendeaktifkan permukaan silika gel karena air akan menutup sisi aktif silika gel. Hal seperti ini dapat diatasi dengan memanaskan pada suhu 105 ºC (Gandjar dan Rohman, 2007).
Semakin polar solut maka semakin tertahan kuat ke dalam adsorben silika gel ini. Solut-solut non polar tidak mempunyai afinitas atau mempunyai sedikit afinitas terhadap adsorben polar, sementara solut-solut yang terpolarisasi memiliki afinitas yang kecil terhadap adsorben polar disebabkan adanya interaksi dipol atau interaksi-interaksi yang diinduksi oleh dipol (Gandjar dan Rohman, 2007).
b. Fase gerak. Pemilihan pelarut yang digunakan untuk senyawa yang akan dianalisis dengan metode KLT harus dapat melarutkan analit dengan sempurna, mudah menguap, serta dapat membasahi lapisan penyerap (Sherma dan Fried, 1996).
Fase gerak adalah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak di dalam fase diam yaitu lapisan berpori karena adanya gaya kapiler. Digunakan pelarut bertingkat mutu analitik sebagai fase
12
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
gerak dan bila diperlukan sistem pelarut multikomponen, maka harus berupa suatu campuran sederhana mungkin terdiri atas maksimum tiga komponen (Stahl, 1985).
Pemilihan sistem pelarut untuk mencapai sistem pemisahan yang diperlukan mungkin melibatkan beberapa percobaan, tetapi pilihan pelarut cukup terbatas dengan pertimbangan interferensi respon detektor atau kerusakan yang mungkin terjadi dari fase diam (Dean, 1995).
Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak: 1) fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif 2) daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga R solut
f terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan (Rohman, 2009).
E. Densitometri
Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang mendasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada KLT. Densitometri lebih dititikberatkan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar kecil, yang mana diperlukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT (Rohman, 2009).
Untuk evaluasi bercak hasil KLT secara densitometri, bercak di dengan sumber sinar dalam bentuk celah ( ) yang dapat dipilih baik panjangnya maupun lebarnya. Sinar yang dipantulkan diukur dengan sensor cahaya (fotosensor). Perbedaan antara signal optik daerah yang tidak mengandung bercak
13
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dengan daerah yang mengandung bercak dihubungkan dengan banyaknya analit yang ada melalui kurva kalibrasi yang telah disiapkan dalam lempeng yang sama.
Pengukuran densitometri dapat dibuat dengan absorbansi atau dengan fluoresensi (Rohman, 2009).
Kromatografi lapis tipis densitometri merupakan salah satu dari metode analisa kuantitatif. Penetapan kadar suatu senyawa dengan metode ini dilakukan dengan mengukur kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT. Pada umumnya pengukuran kerapatan bercak tersebut dibandingkan dengan kerapatan bercak senyawa standar yang dielusi bersama-sama (Hardjono, 1983).
Densitometer dapat bekerja secara serapan atau fluoresensi. Kebanyakan densitometer mempunyai sumber cahaya, monokromator untuk memilih panjang gelombang yang cocok, sistem untuk memfokuskan sinar pada lempeng, pengganda foton, dan rekorder (Gandjar dan Rohman, 2007).
Noda yang kecil dan intensif akan menghasilkan suatu puncak yang sempit dan tajam, sebaliknya noda yang lebar dan kurang intensif akan menghasilkan puncak yang lebar maupun tumpul. Penelusuran bercak dapat dilakukan secara horizontal maupun vertikal (Mintarsih, 1990).
Terdapat dua model pembacaan pada densitometri yaitu model pemantulan ( ) dan transmitan. Model refleksi mengukur jumlah cahaya yang dipantulkan dari permukaan dengan menggunakan lampu yang berbeda sebagai lampu UV/VIS. Lampu halogen dan tungsten cocok digunakan untuk sinar tampak, sedangkan lampu xenon dan deuterium digunakan pada sinar UV. Monokromator digunakan untuk menghasilkan cahaya monokromatis. Cahaya
14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI yang dihamburkan diukur dengan ") " , ") , dan ") .
Hasil dari detektor dikonversikan ke dalam sinyal tertentu. Kekurangan model ini adalah pengaruh posisi bercak terhadap sinyal yang dihasilkan. Kesalahan yang signifikan disebabkan karena perbedaan konsentrasi profil sampel dengan baku. (Sherma dan Fried,1996).
a b Gambar 4. Ilustrasi model (a) refleksi (b) transmisi. L= , D= , F= ( ), P= plate, MF= , MC= (Sherma dan Fried,1996)
Pengukuran dengan model transmitan adalah mengukur absorbansi substansi dalam rentang cahaya tampak. Detektor fotometrik mengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan pada sisi plat yang tidak berfluoresensi. Sinyal yang dihasilkan merupakan fungsi dari jumlah molekul yang mengabsorbsi cahaya dari lampu. Kelebihan model ini adalah fluktuasi transmisi akibat perbedaan posisi bercak maupun gradien konsentrasi yang diabaikan. Model ini lebih sensitif dibandingkan model refleksi karena semua molekul dalam bercak mempengaruhi sinyal, tidak hanya molekul yang berada pada permukaan dalam model refleksi.
Kekurangan model ini adalah adanya interferensi latar yang dominan (Sherma dan Fried,1996).
15
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pada umumnya sumber radiasi pada densitometer memberikan rentang gelombang penentuan 200-630 nm. Lampu D (Deuterium) dipakai untuk
2
pengukuran pada daerah ultraviolet dan lampu tungstein untuk pengukuran pada daerah sinar tampak. Untuk penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi. Sama seperti pada spektrofotometri, pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau absorpsi dan refleksi pada panjang gelombang maksimal (Mulja dan Suharman, 1995).
Gambar 5. CAMAG's TLC 3 densitometer (Camag, 2005)
Ada dua cara penetapan dengan alat densitometer. Pertama, setiap kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan dielusi bersama dalam satu lempeng, kemudian Area Under Curve (AUC) sampel dibandingkan dengan AUC zat baku. Yang kedua, dengan membuat kurva hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku diperoleh dengan membuat totolan zat baku pada pelat KLT dengan bermacam-macam konsentrasi (minimal tiga macam konsentrasi). Bercak yang diperoleh dicari AUC dengan densitometer. Berdasarkan kurva baku diperoleh persamaan: y = bx + a, di mana x adalah banyaknya zat yang ditotolkan dan y adalah AUC (Supardjan, 1987).