Persetujuan Pembimbing VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU

  

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

(KCKT) FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR NIKOTIN

DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU

SKRIPSI

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Farmasi Oleh:

  Ayesa Syenina NIM : 088114093

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

  Persetujuan Pembimbing

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU

  Skripsi yang diajukan oleh: Ayesa Syenina

  NIM : 088114093 Telah disetujui oleh:

  Pembimbing Utama (Christine Patramurti, M.Si., Apt.) tanggal

  Complaining does not work as a strategy -The Last Lecture

  Kupersembahkan untuk: Orangtauku dan kakakku terkasih

  Teman-teman dan almamaterku

  

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH

UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

  Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma: Nama : Ayesa Syenina Nomor Mahasiswa : 088114093 Demi kepentingan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:

  VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya ataupun memberi royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

  Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal: 18 Agustus 2011 Yang menyatakan (Ayesa Syenina)

  

PRAKATA

  Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas terselesaikannya skripsi yang berjudul “Validasi Metode Kromatografi Cair

  Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik pada Penetapan Kadar Nikotin dalam Ekstrak Etanolik Daun Tembakau”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

  Proses penyusunan skripsi ini takkan dapat terselesaikan tanpa adanya bantuan dari berbagai pihak, sehingga pada kesempatan ini penulis juga mengucapkan terima kasih kepada : 1.

  Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

  2. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan, nasihat serta dukungan selama penelitian dan penyusunan skripsi.

  3. Jeffry Julianus, M.Si., selaku dosen penguji yang telah memberikan kritik dan saran.

  4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan kritik dan saran.

  5. Rini Dwi Astuti, M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan ijin kepada penulis untuk melakukan penelitian di laboratorium.

  6. Seluruh staf laboratorium kimia: Mas Bimo, Pak Parlan dan Mas Kunto atas bantuannya selama berlangsungnya penelitian.

  7. Staf sekretariat Farmasi: Mas Dwi, Pak Mukimin, dan Mas Narto.

  8.

  11. Teman-teman FST yang telah memberi semangat dan dukungan selama penelitian dan penyusunan skripsi.

  12. Semua orang yang telah membantu dan mendukung penyusunan skripsi yang tidak dapat disebutkan penulis satu per satu.

  Penulis menyadari bahwa karya ini masih belum sempurna, maka dari itu saran dan kritik sangat diharapkan.. Akhir kata penulis meminta maaf apabila ada kesalahan selama penulisan Tugas Akhir ini. Semoga ini dapat bermanfaat untuk semua.

  Yogyakarta, 18 Agustus 2011 Ayesa Syenina

  

DAFTAR ISI

  HALAMAN JUDUL ............................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................. v PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH ................................... vi PRAKATA ............................................................................................................ vii DAFTAR ISI .......................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ................................................................................................. xii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiii DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xv

  INTISARI ........................................................................................................... xvii

  

ABSTRACT ......................................................................................................... xviii

  BAB 1. PENGANTAR ........................................................................................... 1 A. Latar Belakang ............................................................................................. 1

  1. Perumusan masalah .................................................................................. 3

  2. Keaslian karya .......................................................................................... 3

  3. Manfaat penelitian .................................................................................... 4

  a. Manfaat metodologis. ........................................................................... 4

  b. Manfaat praktis. .................................................................................... 4

  B. Tujuan Penelitian ......................................................................................... 4

  BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ................................................................... 5 A. Nikotin ......................................................................................................... 5 B. Ekstrak Tembakau ........................................................................................ 7

  1. Transisi sigma- sigma star (δ→δ*).......................................................... 11

  2. Transisi n- sigma star (n→δ*) ................................................................. 11

  3. Transisi n- phi star (n→π*) ..................................................................... 11

  4. Transisi phi- phi star (π→π*) .................................................................. 12 E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ............................................... 12

  1. Definisi ....................................................................................................... 12

  2. Instrumentasi .............................................................................................. 14

  3. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif ............................................................. 21

  F. Parameter Validasi Metode Analisis .......................................................... 22

  1. Selektifitas atau spesifitas ...................................................................... 23

  2. Linearitas ................................................................................................ 24

  3. Akurasi ................................................................................................... 24

  4. Presisi ..................................................................................................... 25

  5. Sensitivitas .............................................................................................. 26

  6. Rentang (Range) ..................................................................................... 27

  7. Limit of detection (LOD) dan Limit of quantitation (LOQ) .................. 27

  G. Landasan Teori ........................................................................................... 27

  H. Hipotesis ..................................................................................................... 28

  BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 29 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................. 29 B. Variabel Penelitian ..................................................................................... 29 C. Definisi Operasional................................................................................... 30 D. Bahan Penelitian......................................................................................... 30 E. Alat Penelitian ............................................................................................ 31 F. Tata Cara Penelitian ................................................................................... 31

  1. Pembuatan Fase Gerak ........................................................................... 31

  1. Selektifitas .............................................................................................. 35

  2. Linearitas dan Rentang ........................................................................... 35

  3. Akurasi ................................................................................................... 35

  4. Presisi ..................................................................................................... 36

  BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 37 A. Pembuatan Fase Gerak ............................................................................... 37 B. Pembuatan Larutan Baku Nikotin .............................................................. 40 C. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Nikotin ................................ 41 D. Preparasi Sampel ........................................................................................ 43 E. Pengamatan Waktu Retensi (t R ) Nikotin .................................................... 44 F. Pembuatan Kurva Baku Nikotin ................................................................ 48 G. Validasi Metode ......................................................................................... 50

  1. Selektifitas .............................................................................................. 50

  2. Linearitas ................................................................................................ 51

  3. Akurasi ................................................................................................... 52

  4. Presisi ..................................................................................................... 55

  5. Rentang ................................................................................................... 56

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 58 A. Kesimpulan ................................................................................................ 58 B. Saran ........................................................................................................... 58 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 59 LAMPIRAN .......................................................................................................... 62 BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 95

  DAFTAR TABEL Tabel I. Karakteristik fisika-kimia dari nikotin ................................................................

  6 Tabel II. UV cutoff solvent yang digunakan sebagai fase gerak .................. 17 Tabel III. Parameter validasi metode untuk tiap jenis prosedur uji ................................

  22 Tabel IV. Rentang kesalahan yang diperbolehkan pada tiap konsentrasi analit............... ................................................................................................

  25 Tabel V. Kriteria penerimaan presisi berdasar kadar analit ................................

  26 Tabel VI. Hasil persamaan regresi linear baku nikotin ................................................................

  49 Tabel VII. Hasil perhitungan resolusi (Rs) sampel ................................................................

  51 Tabel VIII. Hasil persen perolehan kembali (recovery) baku nikotin ................................

  52 Tabel IX. Hasil penetapan recovery baku adisi........................................... 55 Tabel X. Hasil presisi baku nikotin............................................................ 57

  DAFTAR GAMBAR

  Gambar 1. Struktur Nikotin ............................................................................ 5 Gambar 2. Nikotin dalam bentu yang berbeda-beda ................................................................

  5 Gambar 3. Senyawa hasil degradasi nikotin ................................................... 6 Gambar 4.

  7 Tumbuhan Tembakau……………………………………….. Gambar 5. Struktur anabasin, anatabin, dan nornikotin................................

  8 Gambar 6. Transisi elektronik diantara tingkatan energi dalam suatu molekul. ........................................................................................

  11 Gambar 7. Suatu kromatogram .......................................................................13 Gambar 8. Diagram sistem KCKT................................................................ 15 Gambar 9. Skema pompa piston resiprok tunggal ..........................................18 Gambar 10. Skema pompa dual-piston dengan pompa paralel ........................19 Gambar 11. Skema desain pompa dual-piston in-series ...................................19 Gambar 12. Skema loop injector ......................................................................20 Gambar 13. Reaksi silika dengan suatu organochlorosilane............................21 Gambar 14. Protonasi cincin pirolidin pada nikotin dalam suasana asam ........38 Gambar 15. Gugus kromofor dan auksokrom pada nikotin ..............................41

  Gambar 19. Gugus polar dan non polar pada nikotin ................................................................

  46 Gambar 20. Interaksi nikotin dengan fase diam oktadesilsilan (C 18 )..........

  46 Gambar 21. Interaksi nikotin dengan fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6).........................................

  47 Gambar 22. Kromatogram baku nikotin dan sampel ekstrak daun tembakau..................................................................................

  48 Gambar 23. Kurva baku hubungan antara konsentrasi baku nikotin dengan AUCnya......................................................................

  50 Gambar 24. Kromatogram baku nikotin, sampel dan sampel adisi.............

  54 Gambar 25. Kurva rentang konsentrasi akurasi dan presisi metode............

  57

  DAFTAR LAMPIRAN

  Lampiran 1. Certificate of Analysis (COA) baku nikotin ................................63 Lampiran 2. Surat keaslian tumbuhan tembakau.......................................... 64 Lampiran 3. Perhitungan pergeseran pKa nikotin dan pH buffer berdasarkan Kazakevich dan LoBrutto (2007)

   Lampiran 4. Spektrum Nikotin .........................................................................68 Lampiran 5. Kromatogram seri baku nikotin ................................................................

  69 Lampiran 6. Perolehan AUC seri baku nikotin............... ................................................................

  77 Lampiran 7. Persamaan dan gambar kurva baku nikotin ................................................................

  78 Lampiran 8. Kromatogram dan perhitungan resolusi sampel ................................

  79 Lampiran 9. Kromatogram baku nikotin untuk validasi metode ................................

  81 Lampiran 10. Perolehan nilai AUC dan contoh perhitungan konsentrasi terukur baku nikotin ................................................................................................

  89 Lampiran 11. Perhitungan persen perolehan kembali (recovery) dan koefisien variasi (KV)………….............................................

  90 Lampiran 12. Kromatogram sampel dan sampel adisi………………………......................................................

  91

  96 dan KV baku nikotin adisi………………………............... Lampiran 14. Kromatogram blanko pelarut buffer

  97 asetat:metanol:asetonitril (40:54:6)……………………….

  

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

(KCKT) FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR NIKOTIN

DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU

  

INTISARI

  Nikotin merupakan suatu jenis alkaloid yang ditemukan dalam daun tembakau. Manfaat farmakologis dari nikotin belakangan ini telah banyak diteliti oleh sejumlah ilmuwan, dan beberapa diantaranya menemukan potensi nikotin dalam mengobati berbagai macam penyakit. Penetapan kadar nikotin di dalam ekstrak etanolik daun tembakau dapat dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik. Untuk menjamin hasil yang terpercaya, maka perlu dilakukan validasi metode terlebih dahulu.

  Penelitian ini mengikuti jenis dan rancangan penelitian observasional deskripif. Sistem kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dalam penelitian ini menggunakan kolom fase diam okta desilsilan (C

  18 ) dan fase gerak buffer

  asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) dengan kecepatan alir 1,2 mL/menit. Detektor yang digunakan dalam penelitian ini adalah detektor UV pada panjang gelombang 260 nm.

  Parameter validasi metode pada penelitian ini meliputi selektifitas, linearitas, akurasi, presisi dan rentang. Hasil penelitian menunjukkan selektifitas yang baik dengan nilai resolusi (Rs) sebesar 1,531 serta linearitas yang baik dengan koefisien korelasi (r) 0,9996 pada konsentrasi 0,01-0,09 ppm. Perolehan nilai rentang persen recovery dan KV untuk konsentrasi 0,01; 0,05 dan 0,09 ppm secara berurutan adalah 88,56-112,64% dengan KV 11,97%; 99,02-101,78% dengan KV 1,37% serta 100,34-101,62% dengan KV 0,63%, sedangkan nilai

  

recovery adisi baku nikotin yang diperoleh adalah 82,7127-100,6181% dengan

  KV 9,767%. Metode KCKT fase terbalik ini memenuhi kriteria validasi metode pada rentang konsentrasi 0,05-0,09 ppm.

  Kata kunci: nikotin, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), validasi metode

  

METHOD VALIDATION OF REVERSED PHASE HIGH

PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY FOR THE

DETERMINATION OF NICOTINE IN TOBACCO LEAVES ETHANOLIC

EXTRACT

ABSTRACT

  Nicotine is an alkaloid found in tobacco leaves. Scientists have recently discovered that nicotine may have the pharmacological properties to be used in the treatment of various illnesses. The amount of nicotine in tobacco leaves ethanolic extract can be determined by using reversed phase high performance liquid chromatography (HPLC). To guarantee a reliable result, it is therefore necessary to validate the method.

  This research is conducted with a descriptive observational plan and design. The HPLC system used for the quantitative analysis of nicotine consists of octadecylsilane (C

  18 ) as the stationary phase and a mixture of acetate buffer:

  methanol: acetonitrile (40:54:6) as the mobile phase with a flow rate of 1.2 mL/minute. The detector used in this research is UV detector with the experimental wavelength of 260 nm.

  The parameters of method validation used in this research are selectivity, linearity, accuracy, precision, and range. The results of this research indicates that this method is of good selectivity and linearity with a resolution (Rs) of 1.531 and a correlation coefficient (r) of 0.9996 at 0.05-0.09 ppm. The percentage of recovery and coefficient of variation obtained at 0.01; 0.05 and 0.09 ppm were 88.56-112.64% with a CV 11.97%; 99.022-101.778% with a CV 1.37% and 100.338-101.618% with a CV 0.63% respectively, as for the recovery for the standard addition was 82.7127-100.6181% with a CV of 9.767%. Therefore, this reversed phase HPLC method fulfills the criteria of method validation at a range of concentration 0.05-0.09 ppm.

  Keywords: nicotine, high performance liquid chromatography (HPLC), method validation

BAB 1 PENGANTAR A. Latar Belakang Nikotin merupakan suatu jenis alkaloid alami yang terdapat dalam daun

  dan batang tembakau, Nicotiana tabacum dan Nicotiana rustica, dalam kadar 0,5- 8%. Sebagian besar masyarakat menganggap bahwa nikotin adalah zat yang berbahaya dan merugikan kesehatan tubuh serta tidak memiliki manfaat. Hal ini dikarenakan oleh sifatnya yang toksik dan adiktif (Landoni, 1991), namun ternyata nikotin juga memiliki manfaat yang cukup besar dalam bidang kesehatan.

  Beberapa ilmuwan menemukan bahwa nikotin merangsang pelepasan neurotransmitter tertentu, diantaranya adalah serotonin, dopamine, dan norepinephrine, dimana ketidakseimbangan ketiga neurotransmitter ini dapat menyebabkan terjadinya depresi. Dengan demikian, nikotin berpotensi dalam mengobati depresi, schizophrenia, penyakit Alzheimer dan penyakit Parkinson (Anonim, 2006).

  Besarnya potensi nikotin memungkinkan dikembangkannya suatu sediaan farmasi menggunakan ekstrak daun tembakau dengan nikotin sebagai zat aktifnya.

  Sebelum dapat digunakan dalam pembuatan sediaan farmasi, ekstrak daun tembakau sangat penting untuk distandarisasi. Salah satu aspek standarisasi adalah dapat digunakan sebagai acuan dalam formulasi sediaan farmasi ekstrak tembakau (Saifudin dkk., 2011).

  Dalam proses standarisasi, diperlukan suatu metode yang tervalidasi dalam menetapkan kadar nikotin dalam ekstrak tembakau. Pemilihan metode analisis kuantitatif yang memiliki spesifitas, linearitas, akurasi dan presisi yang baik merupakan suatu aspek yang sangat penting agar diperoleh hasil yang

  

acceptable (dapat diterima) pada saat penetapan kadar. Pada penelitian ini peneliti

akan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik.

  Dasar pemilihan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik pada penelitian ini adalah karena sampel yang digunakan, yaitu ekstrak tembakau, tidak hanya mengandung nikotin, namun juga beberapa senyawa lainnya, sehingga dibutuhkan suatu metode yang dapat memisahkan senyawa multikomponen sekaligus mengkuantifikasinya. Berdasarkan hasil optimasi yang telah dilakukan dalam rangkaian penelitian ini, sistem kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik memberikan kondisi optimal menggunakan fase diam kolom oktadesilsilan (C

  18 ) dan fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) dengan kecepatan alir 1,2 mL/menit.

  1. Perumusan masalah

  Berdasarkan latar belakang di atas, maka rumusan masalahnya adalah apakah penetapan kadar nikotin dalam ekstrak tembakau secara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik menggunakan fase diam kolom oktadesilsilan (C ) dan fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6) dengan kecepatan

  18

  alir 1,2 mL/menit telah memenuhi parameter validasi: spesifitas, linearitas, akurasi, presisi dan rentang ?

  2. Keaslian karya

  Penelitian mengenai nikotin yang telah dilakukan adalah penetapan kadar nikotin dalam sampel biologis menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), kromatografi gas, spektrofotometri massa, dan kromatografi cair- MS (LC-MS) (Nakajima, Yamamoto, Kuroiwa, Yokoi, 2000); penetapan kadar nikotin dalam macam-macam merk rokok (Alali, Massadeh, 2002); penetapan kadar nikotin dalam tembakau dengan metode LC-MS-MS serta penetapan kadar nikotin dalam sediaan farmasi dengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (Vlase,

  Filip, Mîndruţău, and Leucuţa, 2005). Berdasarkan studi pustaka di atas, maka belum pernah ada penelitian penetapan kadar nikotin dalam ekstrak tembakau dengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik.

3. Manfaat penelitian

  a. Manfaat metodologis. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan alternatif metode penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau, yaitu menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik dengan validitas yang baik.

  b. Manfaat praktis. Diharapkan dengan penelitian ini metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik dapat dijadikan metode alternatif dalam penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau.

B. Tujuan Penelitian

  Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan apakah metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik yang menggunakan fase diam kolom oktadesilsilan (C

  18 ) dan fase gerak buffer asetat:metanol:asetonitril (40:54:6)

  dengan kecepatan alir 1,2 mL/menit dalam penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau telah memenuhi parameter validasi: spesifitas, linearitas, akurasi, presisi dan rentang pada penetapan kadar nikotin dalam ekstrak etanolik daun tembakau.

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Nikotin Nikotin adalah suatu jenis alkaloid yang paling banyak ditemukan dalam daun tembakau Nicotiana tabacum dan Nicotiana rustica (Vlase dkk., 2005).

Gambar 1. Struktur molekul nikotin (Anonim, 1999).

Nikotin merupakan amin tersier yang tesusun atas cincin piridin dan cincin pirolidin yang bersifat toksik dan karsinogenik (Alali dan Massadeh, 2002). Nikotin dapat ditemukan dalam beberapa bentuk, yaitu sebagai bentuk

  diprotonasi, monoprotonasi, dalam basa bebas. Saat berada pada bentuk terprotonasi, atom nitrogen pada cincin piridin bersifat lebih asam dibandingkan yang terdapat pada cincin pirolidin (Karbalaie, Ghotbi, Taghikhani dan Yamini, 2009). berwarna kecoklatan. Dalam suatu penelitian saat suatu larutan yang mengandung nikotin dipaparkan pada udara terbentuk senyawa degradasi nikotin yaitu,

  

methylamine , myosmine dan nicotine-N-1-oxide, sedangankan saat larutan yang

  mengandung campuran nikotin dan cotinine dibiarkan terpapar udara selama beberapa minggu didapatkan jumlah cotinine bertambah (Crooks, 1999).

  Karakteristik dari nikotin dapat dilihat pada Tabel I (Domino, 1999).

  (a) (b) (c)

Gambar 3. Senyawa hasil degradasi nikotin. (a)1’S,2’S dan 1’R,2’S nicotine-N-1-oxide (b)

myosmine-N-oxide dan (c) cotinine (Crooks, 1999).

  

Tabel I. Karakteristik fisika-kimia dari nikotin

Bentuk Cair

Warna Tidak berwarna

Rumus Molekul C H N

_{10 14 2} Bobot molekul 162,23

Berat jenis 1,0097

_o

Titik didih C 246

  Pka 8,5 262

  Λ maksimum (nm)

  Efek negatif nikotin telah lama diketahui masyarakat, namun dewasa ini perkembangan medis telah ditemukan beberapa manfaat dari nikotin. Nikotin dapat meningkatkan konsentrasi, proses belajar dan ingatan karena adanya peningkatan asetilkolin (Karbalaie dkk., 2009). Selain itu, terdapat beberapa

  

Parkinson , para ilmuwan menemukan bahwa nikotin dapat mengurangi penyakit

  yang disebut dyskinesias yang diderita oleh penderita Parkinson sebagai dampak dari pengobatannya, berdasarkan Science Daily seorang ilmuwan menyatakan bahwa nikotin telah mengurangi terjadinya tremor dan bahwa nikotin kemungkinan berfungsi sebagai neuroprotector bagi pasien (LeChat, 2010).

B. Ekstrak Tembakau

  Tembakau (Nicotiana tabacum L.) termasuk dalam famili yang banyak ditemukan diberbagai daerah di Indonesia seperti di Provinsi Sumatera Utara, Jawa Barat, Jawa Tengah, D.I. Yogyakarta, Jawa Timur, Bali, NTB, Lampung dan Sulawesi Selatan. Terdapat dua jenis tembakau yang dibedakan berdasarkan iklim yaitu tembakau musim kemarau/Voor-OOgst (VO)

  (a) dan tembakau musim penghujan/Na-Oogst (NO) (Anonim , 2011).

  Ekstrak tumbuhan merupakan material yang diperoleh dengan cara menyari bahan tumbuhan dengan pelarut tertentu. Sehingga, ekstrak tembakau merupakan material yang berasal dari tumbuhan tembakau yang diperoleh dengan cara menyari tumbuhan tembakau dengan pelarut yang sesuai (Saifudin, Rahayu dan Teruna, 2011).

  Terdapat beberapa jenis ekstrak yaitu: ekstrak cair, ekstrak kental, dan ekstrak kering. Ekstrak cair jika hasil ekstraksi masih bisa dituang, biasanya kadar air lebih dari 30%. Ekstrak kental jika memiliki kadar air antara 5-30%. Ekstrak kering jika mengandung air kurang dari 5% (Saifudin dkk., 2011).

  Dalam ekstrak daun tembakau, komponen yang paling banyak terkandung di dalamnya adalah nikotin. Selain itu terdapat pula beberapa senyawa alkaloid yang berada dalam jumlah yang lebih sedikit yaitu anabasin, anatabin, dan nornikotin. Jumlah alkaloid-alkaloid ini bervariasi dalam tiap spesies Nicotiana (Domino, 1999).

  

Gambar 5. Struktur anabasin, anatabin, dan nornikotin (Jacob, Hatsukami, Severson, Hall,

Yu dan Benowitz, 2002).

C. Standarisasi Ekstrak

  Standarisasi merupakan suatu rangkaian proses yang melibatkan berbagai metode analisis fisik dan mikrobiologi berdasarkan kriteria umum keamanan (toksikologi) terhadap suatu ekstrak alam (tumbuhan obat). Standarisasi secara normatif ditujukan untuk memberikan efikasi yang terukur secara farmakologis dan menjamin keamanan. Terdapat dua aspek dalam standarisasi analisis kuantitatif terhadap metabolit sekunder dilakukan dengan tujuan menjaga konsistensi dan keseragaman khasiat obat herbal (Saifudin dkk., 2011).

2. Aspek parameter non spesifik.

  Berfokus pada aspek kimia, mikrobiologi dan fisis yang akan mempengaruhi keamanan konsumen dan stabilitas (Saifudin dkk., 2011).

D. Spektrofotometer UV

  Metode spektroskopik dalam analisis didasarkan pada pengukuran radiasi elektromagnetik yang diserap oleh analit. Radiasi elektromagnetik didefinisikan sebagai suatu bentuk energi yang ditransmisikan melalui ruang kosong pada kecepatan yang tinggi dan tidak membutuhkan adanya media untuk transmisinya, sehingga dapat melewati ruang yang vakum. Radiasi elektromagnetik ini berupa aliran partikel-partikel kecil atau gelombang energi yang dinyatakan dengan foton atau quanta. Dalam spektrofotometri UV radiasi, elektromagnetik yang dikenakan pada analit adalah pada panjang gelombang antara 200-400 nm (Skoog, West, Holler, 1994).

  Energi dari foton bergantung pada frekuensi radiasi yang diberikan oleh : (1)

• 34

  Dimana h adalah konstanta Planck (6,63 x 10 J s), sehingga hubungan antara energi radiasi dengan panjang gelombang dan angka gelombang adalah :

  Penyerapan radiasi sinar ultraviolet oleh spesies atom atau molekul (M) dapat dipertimbangkan sebagai proses dua langkah; yang pertama adalah melibatkan eksitasi sebagaimana ditunjukkan oleh persamaan berikut :

  (3) M + hv → M*

  Hasil reaksi antara M dengan foton (hv) merupakan partikel yang tereksitasi secara elektronik yang disimbolkan dengan M*. Keberadaan M* sangat singkat dan umumnya diakhiri dengan sebuah relaksasi yang melibatkan konversi energi eksitasi menjadi panas seperti pada persamaan di bawah :

  (4) M*→ M + panas

  Penyerapan sinar UV pada umumnya dihasilkan oleh eksitasi elektron- elektron ikatan. Penyerapan radiasi ultraviolet dibatasi oleh sejumlah gugus fungsional (yang disebut dengan kromofor) yang mengandung elektron valensi dengan tingkat energi eksitasi yang relatif rendah. Elektron yang terlibat pada penyerapan radiasi ultraviolet ada tiga yaitu elektron sigma (δ); elektron phi (π); dan non bonding electron (Gandjar dan Rohman, 2007).

  Transisi-transisi elektronik yang terjadi diantara tingkat-tingkat energi di dalam suatu molekul terdapat empat, yaitu transisi sigma- sigma star (δ→δ*); transisi n- sigma star (n→δ*); transisi n-phi star (n→π*) dan transisi phi-phi star

  (b) , 2011).

  (π→π*) seperti terlihat pada Gambar 6 (Anonim

  

Gambar 6. Transisi elektronik diantara tingkatan energi dalam suatu molekul

1.

   Transisi sigma-sigma star (δ→δ*)

  Energi yang dibutuhkan untuk transisi ini besarnya sesuai dengan energi sinar yang frekuensinya terletak diantara UV vakum (< 180 nm), sehingga jenis transisi ini kurang bermanfaat untuk analisis dengan cara spektrofotometri UV (Gandjar dan Rohman, 2007).

  2. Transisi n-sigma star (n→δ*)

  Jenis transisi ini terjadi pada senyawa organik jenuh yang mengandung atom-atom yang memiliki elektron bukan ikatan (elektron n). Energi yang diperlukan untuk transisi jenis ini lebih kecil dibanding transisi

  δ→δ*, sinar yang diserap mempunyai panjang gelombang 150-200 nm (Gandjar dan Rohman, 2007).

  3. Transisi n-phi star (n→π*)

  Jenis transisi ini terjadi pada molekul organik yang mempunyai gugus gelombang ini secara teknis dapat diaplikasikan pada spektrofotometer (Gandjar dan Rohman, 2007).

4. Transisi phi-phi star (π→π*)

  Dalam kebanyakan transisi π→π*, molekul dalam keadaan dasar relatif non polar, dan keadaan terkesitasinya lebih polar dibandingkan keadaan dasar

  (Gandjar dan Rohman, 2007).

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) 1. Definisi

  Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau biasa disebut juga dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik, serta dalam cairan biologis. KCKT dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif (Rohman, 2009).

  KCKT ini tergolong kromatografi kolom, sebagaimana kromografi kolom lainnya sampel yang melalui kolom akan mengalami pemisahan senyawa- senyawa di dalamnya. Jika kekuatan interaksi masing-masing senyawa berbeda- beda maka senyawa-senyawa tersebut akan terpisah menjadi puncak-puncak tersendiri. Progres dari pemisahan kromatografi ini akan dimonitor oleh suatu detektor yang sesuai yang terletak pada ujung kolom. Hasil yang diperoleh akan

  

Gambar 7. Suatu kromatogram

  Pemisahan senyawa dalam KCKT diatur oleh distribusi senyawa dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair secara sukses terhadap suatu masalah yang dihadapi membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).

  Teori mengenai KCKT dapat dibagi menjadi 2 aspek yaitu aspek kinetik dan aspek termodinamik. Aspek kinetik dari KCKT bertanggung jawab atas pelebaran kromatogram, sedangkan aspek termodinamik mempengaruhi waktu retensi analit dalam kolom. Bila dilihat dari segi analisis, faktor kinetik mempengaruhi lebar dari puncak kromatogram (efisiensi) dan faktor termodinamik akan memperngaruhi letak puncak pada kromatogram (selektivitas). Sedangkan dilihat dari segi praktis, efisiensi pemisahan pada KCKT lebih berkaitan dengan optimasi instrumen, dimensi kolom dan geometri partikel.

  Tipe KCKT yang paling banyak digunakan adalah kromatografi partisi, dimana fase diamnya berupa cairan yang tidak bercampur (immiscible) dengan cairan fase gerak. Bentuk awal dari kromatografi partisi yang digunakan adalah kolom liquid-liquid, namun kolom tersebut sekarang telah digantikan dengan kolom liquid-bonded-phase. Pada kromatografi liquid-liquid cairan ditahan pada tempatnya dengan adsorpsi fisik, sedangkan pada kromatografi liquid-bonded-

  

phase fase diam cair ditahan dengan ikatan secara kimia sehingga menghasilkan

packing kolom yang jauh lebih stabil (Skoog dkk., 1998).

  Model partisi dapat digunakan dalam menjelaskan mekanisme retensi. Dalam model partisi, diumpamakan adanya dua fase yang berbeda (fase gerak dan fase diam) dan terjadi ekuilibrium seketika dari analit yang terpartisi antara kedua fase tersebut. Koefisien partisi dari analit dinyatakan sebagai :

  (5) dimana faktor retensi dari analit dinyatakan sebagai rasio jumlah analit pada fase diam terhadap jumlah analit pada fase gerak (Kazakevich dan LoBrutto, 2007).

2. Instrumentasi

  Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam

  

Gambar 8. Diagram sistem KCKT. (a) wadah fase gerak; (b) pompa; (c) autosampler atau

injector; (d) kolom; (e) detector; (f) sistem pendataan (Snyder, Kirkland dan Dolan, 2010).

  a.

  Wadah Fase gerak. Alat KCKT yang baru dilengkapi dengan satu atau lebih wadah gelas, yang mengandung 500mL atau lebih fase gerak. Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert) (Gandjar dan Rohman, 2007). Degassing (penghilangan gas) biasanya dilakukan terlebih dahulu pada fase gerak untuk menghilangkan gas yang mungkin terdapat di dalamnya. Adanya gas dapat menyebabkan flow rate yang tidak reprodusibel serta dapat mengganggu detektor (Skoog, Holler dan Crouch, 1998).

  Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, buffer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut. Oleh karena itu, fase gerak harus disaring terlebih dahulu sebelum digunakan pada KCKT (Gandjar dan Rohman, 2007).

  b.

  Fase gerak pada KCKT. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi (Gandjar dan Rohman, 2007). Terdapat dua jenis elusi yaitu elusi isokratik dimana komposisi dari fase gerak konstan selama proses elusi, dan elusi gradient dimana komposisi fase gerak dapat diubah-ubah selama proses elusi (Kar, 2005).

  Fase gerak yang biasanya digunakan dalam KCKT fase terbalik adalah campuran hidro organik. Senyawa organik yang umumnya digunakan adalah metanol dan asetonitril atau campuran keduanya. Senyawa-senyawa lainnya yang dapat digunakan dalam fase gerak untuk penyesuaian selektivitas adalah tetrahidrofuran, IPA, dan DMSO (Kazakevich dan LoBrutto, 2007).

  Konsentrasi dari larutan organik dalam fase gerak merupakan faktor dominan yang mempengaruhi retensi analit dalam sistem KCKT. Pertimbangan dalam memilih solven fase gerak meliputi kompatibilitas antar solven, kelarutan sampel dalam eluen, polaritas, transmisi cahaya, viskositas, stabilitas dan pH.

  Solven yang digunakan sebagai fase gerak harus dapat bercampur serta tidak menentukan UV cutoff masing-masing solven. Solven yang memiliki nilai UV

  

cutoff lebih tinggi dibandingkan panjang gelombang sampel yang dianalisis tidak

  dapat digunakan. Tabel II menunjukkan nilai UV cutoff untuk beberapa solven yang sering digunakan. Solven yang terlalu kental dapat menyebabkan bentuk puncak yang melebar (Kazakevich dan LoBrutto, 2007).

  

Tabel II. UV cutoff solvent yang digunakan sebagai fase gerak (Kazakevich dan LoBrutto,

2007).

  Terkadang dalam fase gerak juga ditambahkan buffer. Buffer umumnya digunakan dalam fase gerak untuk mengkontrol selektivitas dan resolusi analit, saat pH dari fase gerak ≈ pKa analit (analit berada pada bentuk 50% terionisasi) maka perubahan pada nilai pH akan memberikan perubahan waktu retensi dan pemisahan yang maksimum. Namun hal ini hanya berlaku pada perubahan pH 1 unit dari nilai pKa analit, diluar rentang tersebut analit akan berada pada bentuk terionisasi atau pada bentuk molekul (tidak terionisasi) dan waktu retensinya tidak akan bergantung dengan adanya perubahan pH (Snyder dkk., 2010). dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit (Rohman, 2009).

  Pompa KCKT dapat diklasifikasikan berdasarkan rentang kecepatan alir, mekanisme kerjanya atau berdasarkan metode pencampurannya. Pompa yang biasa digunakan dalam analisis umumnya memilki rentang kecepatan alir 0,001- 10 mL/menit. Kebanyakan pompa menggunakan mekanisme resiprok. Sedangkan berdasarkan metode pencampurannya biasanya menggunakan kondisi pencampuran tekanan rendah atau tekanan tinggi (Ahuja dan Dong, 2005).

  

Gambar 9. Skema pompa piston resiprok tunggal

  Kebanyakan pompa KCKT menggunakan desain piston resiprok seperti Gambar 9 diatas. Pada gambar dapat dilihat terdapat cam bermotor yang dapat menjalankan piston secara depan ke belakang untuk mengalirkan solven melalui suatu vulva

  

inlet dan outlet. Sedangkan Gambar 10 merupakan pompa yang menggunakan

  piston ganda dimana terdapat satu motor yang menjalankan dua piston pada

  

Gambar 10. Skema pompa dual-piston dengan pompa paralel.

  Dalam perkembangannya, model pompa resiprok disempurnakan dengan berbagai macam modifikasi seperti pada desain dual piston in-series yang kini banyak digunakan, dimana pada model ini, dua piston dijalankan oleh motor yang terpisah. Terdapat juga pre-piston yang disinkronisasi dengan piston sekunder untuk memberikan aliran yang lebih halus dan komposisi yang lebih akurat. Model pompa ini dapat dilihat pada gambar di bawah ini (Ahuja dan Dong 2005).

  

Gambar 11. Skema desain pompa dual-piston in-series

d.

  Tempat penyuntikan sampel. Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom. (Gandjar dan Rohman, 2007).

  

loop ini tersedia untuk volume antara 0,5µL-2mL. Pada saat posisi mengisi, loop

  untuk sampling terisolasi dari fase gerak dan terbuka terhadap atmosfer. Suatu

syringe digunakan untuk mengambil sampel dan memasukannya ke dalam loop.