AKTIVITAS PENGHAMBATAN TIROSINASE DARI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Tenore) Steen)

  AKTIVITAS PENGHAMBATAN TIROSINASE DARI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) SKRIPSI

  Untuk memenuhi sebagai persyaratan Mencapai Derajat Sarjana S-1

QORI WAHYUNINGSIH 0908010017 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO 2013

  AKTIVITAS PENGHAMBATAN TIROSINASE DARI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) SKRIPSI

  Untuk memenuhi sebagai persyaratan Mencapai Derajat Sarjana S-1

QORI WAHYUNINGSIH 0908010017 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO 2013

  i ii

iii

  

PERNYATAAN

  Yang bertanda tangan dibawah ini, saya: Nama : Qori Wahyuningsih Nim : 0908010017 Program studi : Farmasi Fakultas/Universitas : Farmasi / Universitas Muhammadiyah Purwokerto Menyatakan dengan sebenar- benarnya bahwa skripsi ini adalah hasil dari proses penelitian saya yang telah dilakukan sesuai dengan prosedur penelitian yang benar dengan arahan dari dosen pembimbing dan bukan hasil penjiplakan dari hasil karya orang lain atau terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan penulis juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan orang lain kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

  Demikian pernyataan ini, dan apabila kelak dikemudian hari terbukti ada unsur penjiplakan, maka saya bersedia mempertanggung jawabkan sesuai dengan ketentuan yang berlaku.

  Purwokerto, Agustus 2013 Yang menyatakan,

  Qori Wahyuningsih iv

  MOTTO

  Kegagalan hanya terjadi bila kita menyerah dan Jadikanlah kekecewaan masa lalu menjadi senjata sukses di masa depan v

  PERSEMBAHAN

  Ucapan terima kasih dan sujud syukur atas kehadirat Allah SWT, atas segala rahmat, nikmat dan karunia dan hidayahnya dengan kerendahan hati dan ketulusan hati, saya persembahkan karya ini kepada:

  Abah dan Umi

  H. Irsyad Asro (Alm) dan Hj. Nurhidayah yang selalu mendoakanku, terima kasih atas dukungan, bekal dan kasih sayang yang tulus dan selalu memberiku semangat baik moral, spiritual dan materi. Serta untaian doa yang tidak pernah akan putus.

  Kakak- kakakku Terima kasih atas dukungan motivasi dan perhatiannya selama ini, semoga selanjutnya saya bisa menjadi adik yang lebih baik dan berguna bagi keluarga.

  Calon Pendamping Hidup Yang tercinta Riski Mukjizatulloh, S.H yang telah mengisi hidupku, memberiku perhatian, semangat dan materi serta setia menemaniku dalam suka maupun duka.

  Pembimbing Bu Binar Asrining Dhiani, M.Sc.,Apt dan Ibu Indri Hapsari, M.Si.,Apt selaku pembimbing saya selama proses skripsi ini. Terimakasih atas segala hal yang telah diberikan kepada saya.

  Teman Seperjuangan Terima kasih selalu menemani saya, teruntuk Siti Nuryanti (Bunda), terimakasih atas semangat dan perhatiannya.Terimakasih buat kesabarannya membantu dalam menyelesaikan skripsi saya.Dan terimakasih juga buat Amalia buat kerjasamanya dan doanya selama penelitian skripsi ini.

  Teman- Teman Farmasi Angkatan 2009 dan Assasains Terimakasih atas kebersamaannya, buat teman- teman sepertimas aan, unul, ana, erma, elent, agil, sandra, lita, wina, sukhaebah dan lusi mbot. Dan tidak lupa juga terimakasih buat Damar kartika ratri yang telah senantiasa mendengarkan keluh kesah saya selama 4 tahun ini. vi

  Mantan Penghuni Kost Terimakasih buat mba pipin, lisna dan semua anak fiumy kost, serta terimakasih juga buat ko mplotan anak kos „Nyeplik‟ sepertiIqlimasahara,

  Yuli, Wulan, Wiwi, Titi dan semua teman kost yang tidak bisa saya sebutin satu persatu, terimakasih atas do‟anya selama ini. vii

  INTISARI QORI WAHYUNINGSIH. Aktivitas Penghambatan Tirosinase Dari Ekstrak Etil Asetet Daun Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen).

  Dibawah bimbingan BINAR ASRINING DHIANI dan INDRI HAPSARI.

  Latar Belakang: Paparan sinar matahari (UV) dan paparan radikal bebas dapat

  menyebabkan kulit menjadi kering dan rusak, sehingga proses penuaan dini dapat berlangsung cepat. Sinar UV sangat berperan penting dalam pembentukan pigmen melanin dalam tubuh (Winarsih, 2007). Binahong (Anredera cordifolia) termasuk dalam famili Basellaceae merupakan tanaman yang dikenal mempunyai aktivitas antioksidan yang baik. Sediaan kosmetik pemutih mengharapkan efek antioksidan dan penghambatan melanin. Ekstrak etanol daun binahong tidak memberikan efek sebagai inhibitor tirosinase (Rahayu,2012). Tetapi belum ada laporan ilmiah mengenai aktivitas penghambatan tirosinase ekstrak etil asetat daun binahong.

  Tujuan Penelitian: Menentukan apakah ekstrak etil asetat daun binahong

  mempunyai aktivitas penghambatan tirosinase dan seberapa besar aktivitas penghambatan terhadap tirosinase.

  Metode Penelitian: Jenis penelitian ini adalah jenis penelitian eksperimental

  dengan rancangan randomized block design dengan menguji beberapa seri konsentrasi ekstrak etil asetat daun binahong(50, 100, 200, 400 dan 800 µg/ml). Variasi seri konsentrasi tersebut diuji aktivitas penghambatan tirosinase dengan kontrol positif hidroquinon. Aktivitas penghambatan tirosinase diukur dengan mengamati perubahan atau pembentukan dopakrom pada panjang gelombang 490 nm menggunakan microplate reader 96 sumuran.

  

Hasil: Nilai IC ekstrak etil asetat daun binahong sebesar 299,1 µg/ml sedangkan

  50 nilai IC dari kontrol positif (hidrokuinon) yaitu 16,34 µg/ml.

50 Kesimpulan: Ekstrak etil asetat daun binahong mempunyai aktivitas terhadap penghambatan tirosinase rendah daripada hidrokuinon.

  Kata Kunci: Daun binahong, Aktivitas penghambatan tirosinase.

  viii

  ABSTRACT QORI WAHYUNINGSIH.Tyrosinase Inhibition Activity of Ethyl Acetate Extract from Binahong Leaves (Anredera cordifolia (Tenor) Steen).

  Under Supervision of BINAR ASRINING DHIANI and INDRI HAPSARI.

  Backgroun: The exposure of sun ray (UV) and free radicals can cause skin

  damage and dried skin, therefore the aging process is occured. UV rays take a role on melanine pigment production (Winarsih, 2007). Binahong (Anredera

  cordifolia ) which belongs to Basellaceae family is one of plants which has

  antioxidant activity. Whitening product expect dual effect the antioxidant effect and inhibition of melanin production. Ethanol extract of binahong leaves was not exhibitedtyrosinase inhibition (Rahayu, 2012). There is no scientific reports of tyrosinase inhibition activity of ethyl acetate extract of binahong leaves.

  Research Objectives:To determine tyrosinase inhibition activity of ethyl acetate extract of binahong leaves and determine level of inhibition activity of tyrosinase. Research method: The type of this research was an experimental research with

  randomized block design by testing a serial concentration of ethyl acetate extract of binahong (50, 100, 200, 400 and 800 µg/ml). This variation of concentration series was assayed its inhibition activity of tyrosinase with hydroquinone as the positive control. Inhibition activity of tyrosinase was measured by observing the change color caused by the formation of dopachrome at wavelength 490 nm using 96 wells microplate reader.

  Result: IC 50 value of ethyl acetate extract of binahong leaves was 299,1 µg/ml

  whereas IC

50 value of positive control (hydroquinone) was 16,34 µg/ml.

  Conclusion:Ethyl acetate extract of binahong leaves possessed tyrosinase inhibition activity although lower than hydroquinone. Keywords: Binahong leaves, tyrosinase inhibition activity.

  ix

KATA PENGANTAR

  Segala Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, atas nikmat, hidayah, karunia, dan segala petunjuknya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul

  “AKTIVITAS PENGHAMBATAN TIROSINASE DARI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN BINAHONG (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) ”.Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk mencapai

  gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Purwokerto.

  Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar- besarnya kepada Ibu Binar Asrining Dhiani, M.Sc.,Apt selaku pembimbing I dan Ibu Indri Hapsari, M.Si.,Apt selaku pembimbing II yang telah berkenan memberikan saran, nasehat, dan koreksinya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas skripsi ini.

  Penyelesaian penulisan skripsi ini tidak lepas dari bantuan, bimbingan dan dukungan semua pihak, untuk itu penulis mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Dr. Nunuk Aries Nurulita. M.Si.,Apt, selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto.

  2. Retno Wahyuningrum, M.Si., Apt dan Wiranti Sri Rahayu, M.Si.,Apt selaku penguji yang telah memberikan koreksi terhadap skripsi ini.

  3. Abah, Umi dan Kakak- kakakku tercinta yang telah memberikan doa dan semangat serta dorongan baik spiritual maupun materiil.

  4. Seluruh dosen dan staf karyawan Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto.

  5. Semua teman- teman Farmasi Angkatan 2009 terutama anak- anak Assasains terima kasih atas dukungan dan kerjasamanya selama penyusunan skripsi ini.

  6. Semua pihak yang telah membantu selama penulis melaksanakan penelitian dan penulisan skripsi ini hingga selesai yang tidak dapat disebutkan satu persatu. x

  Akhir kata penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna, yang disebabkan oleh keterbatasan penulis.Semoga skripsi ini bermanfaat bagi pembaca dan penulis pada khususnya.

  Purwokerto, 28 Agustus 2013 Qori Wahyuningsih xi

  DAFTAR ISI Halaman

  HALAMAN JUDUL ........................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN ............................................................................ ii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. iii PERNYATAAN .................................................................................................. iv MOTTO .............................................................................................................. v PERSEMBAHAN ............................................................................................... vi

  INTISARI ............................................................................................................ viii

  ABSTRACT .......................................................................................................... ix

  KATA PENGANTAR ........................................................................................ x DAFTAR ISI ....................................................................................................... xii DAFTAR TABEL ............................................................................................... xv DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xvi DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xvii

  BAB I PENDAHULUAN ............................................................................ 1 A. Latar Belakang ............................................................................ 1 B. Perumusan Masalah ................................................................... 2 C. Tujuan Penelitian ....................................................................... 2 D. Manfaat Penelitian ..................................................................... 3 BAB II TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 4 A. Binahong .................................................................................... 4

  1. Sistematika Tanaman ........................................................... 4

  2. Nama Daerah ........................................................................ 4

  3. Morfologi ............................................................................. 4

  3.1 Daun............................................................................... 4

  3.2 Rhizoma ......................................................................... 5

  3.3 Bunga ............................................................................. 5

  3.4 Akar. .............................................................................. 5

  4. Khasiat................................................................................... 5 xii

  5. Kandungan Kimia ................................................................. 6

  1. Pembuatan buffer fosfat ........................................................ 15

  ... 16

  50

  6. Pengujian aktivitas inhibisi tirosinase dan penentuan IC

  5. Pembuatan larutan L-DOPA ................................................. 16

  4. Pembuatan larutan tirosinase ................................................ 16

  b. Pembuatan seri konsentrasi hidroquinon ........................ 16

  a. Pembuatan larutan stok Hidroquinon .............................. 16

  3. Pembuatan larutan kontrol positif hidroquinon..................... 16

  b. Pembuatan seri konsentrasi sampel ................................. 16

  a. Pembuatan larutan stok sampel ....................................... 15

  2. Pembuatan larutan sampel..................................................... 15

  G. Uji Penghambatan Tirosinase .................................................... 15

  5.1 Flavonoid ........................................................................ 6

  5. Identifikasi kandungan senyawa .......................................... 14

  4. Pembuatan ekstrak daun binahong ........................................ 13

  3. Pengeringan bahan ................................................................ 13

  2. Determinasi bahan ................................................................. 13

  1. Pengumpulan bahan .............................................................. 13

  BAB III METODE PENELITIAN .................................................................. 11 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................ 11 B. Variabel Penelitian ...................................................................... 11 C. Definisi Variabel Operasional ..................................................... 11 D. Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................... 12 E. Bahan dan Alat ........................................................................... 12 F. Cara Penelitian ........................................................................... 13

  C. Hydroquinon ............................................................................... 9

  B. Melanin dan Enzim Tirosinase.................................................... 7

  5.4 Alkaloid ........................................................................... 7

  5.3 Saponin ............................................................................ 7

  5.2 Polifenol .......................................................................... 6

  H. Analisis Data ............................................................................... 17 xiii

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 18 A. Determinasi tanaman .................................................................. 18 B. Penyiapan simplisia ..................................................................... 18 C. Pembuatan ekstrak etil asetat daun Binahong ............................. 19 D. Uji Aktivitas Inhibisi Tirosinase dan Penentuan IC50 ................ 20 E. Identifikasi Kandungan Senyawa ................................................ 23 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 26

  5.1. Kesimpulan ............................................................................... 26

  5.2. Saran .......................................................................................... 26 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 27 LAMPIRAN ........................................................................................................ 31 xiv

  

DAFTAR TABEL

Halaman

  Tabel 1. Persentase inhibisi aktivitas penghambatan tirosinase ekstrak etil asetat daun binahong .................................................................... 21 Tabel 2. Identifikasi kandungan senyawa ekstrak etil asetat daun binahong ................................................................................................. 23 Tabel 3. Absorbansi Hidroquinon(kontrol positif) ......................................... 40 Tabel 4. Absorbansi kontrol negatif ............................................................... 40 Tabel 5. Absorbansi ekstrak etil asetat daun binahong .................................. 40 xv

  

DAFTAR GAMBAR

Halaman

  Gambar 1. Daun Binahong (Anredera cordifolia) ............................................ 5 Gambar 2. Skema reaksi terbentuknya melanin ............................................... 9 Gambar 3. Kurva hubungan non linier dari log konsentrasi ekstrak etil asetat daun binahong terhadap persen inhibisi ....................... 22 Gambar 4.Kurva hubungan non linier dari log konsentrasi kontrol positif (hidroquinon) terhadap persen inhibisi ................. 22 xvi

  DAFTAR LAMPIRAN Halaman

  Lampiran 1.Surat keterangan determinasi daun binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) ......................................... 32

  Lampiran 2. Hasil persentase inhibisi ekstrak etil asetat daun binahong ....... 34 Lampiran 3. Hasil persentase inhibisi hidroquinon ........................................ 35 Lampiran 4.Hasil aktivitas penghambatan tirosinase ..................................... 36 Lampiran 5.Perhitungan pembuatan buffer fosfat pH 6,8............................... 37 Lampiran 6. Perhitungan pembuatan larutan L-DOPA .................................. 38 Lampiran 7. Perhitungan persentase inhibisi ................................................ 41 Lampiran 8. Gambar pelaksanaan penelitian ................................................ 47 Lampiran 9. Gambar uji aktivitas penghambatan tirosinase ......................... 48 Lampiran 10.Gambar identifikasi kandungan senyawa ................................ 49 Lampiran 11.Gambar hasil pengamatan kromatografi lapis tipis ekstrak etilasetat daun binahong ............................................... 50 Lampiran 12. Gambar alat dan bahan .......................................................... 51 xvii

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Permasalahan Paparan sinar matahari (UV) dan paparan radikal bebas dapat

  menimbulkan kulit menjadi kering dan rusak, sehingga proses penuaan dini dapat berlangsung cepat.Sinar UV sangat berperan penting dalam pembentukan pigmen melanin dalam tubuh (Winarsi, 2007).

  Pigmen melanin merupakan suatu pigmen yang dapat melindungi kulit dari paparan sinar matahari.Proses pembentukan melanin ini terjadi dengan bantuan enzim dan sinar UV yang terdapat dalam sinar matahari. Dengan bantuan enzim tirosinase produksi melanin menjadi berlebih dan mengakibatkan hiperpigmentasi kulit.Hiperpigmentasi menyebabkan bercak warna coklat pada kulit.Untuk mencegah produksi melanin yang berlebih dapat digunakan inhibitor tirosinase.

  Inhibitor tirosinase pada saat ini banyak digunakan dalam produk kosmetik dan farmasi sebagai penghambat produksi melanin menjadi berlebih pada lapisan epidermis dan membuat kulit tampak lebih putih (Arung et al, 2006).Mekanisme kerja enzim tirosinase dengan menghambat aktivitas enzim yaitu dengan mereduksi bahan yang dapat menyebabkan oksidasi dopakuinon.

  Kombinasi antioksidan dan inhibitor tirosinase dapat ditemukan dari bahan alam ataupun senyawa sintetik.Penemuan dari suatu senyawa antioksidan dan inhibitor tirosinase telah ditemukan pada bahan kosmetik untuk mencegah terbentuknya melanin yaitu hidroquinon, merkuri, asam kojat, arbutin, dan asam askorbat (Kim et al, 2005).

  Hidroquinon digunakan dalam tambahan bahan kosmetik untuk memperoleh efek pemutih dengan menghilangkan flek gelap pada kulit.Akan tetapi, penggunaan dalam jangka waktu panjang dapat menyebabkan kelainan pada ginjal (nephropathy) profirasi sel, dan bersifat karsinogenik dan teratogenik (Wester et al., 1999).

  Untuk mencegah penuaan dini tubuh kita perlu adanya antioksidan.Salah satu sumber tanaman obat yang memiliki potensi sebagai antioksidan adalah tanaman binahong (Anredera cordifolia).Binahong (Anredera cordifolia) termasuk dalam famili Basellaceae merupakan tanaman yang dikenal mempunyai aktivitas antioksidan yang baik.Daun binahong diduga mengandung asam oleanolat (Hammond et al., 2006).Asam oleanolat merupakan golongan triterpenoid yang memiliki antioksidan yang terdapat pada tanaman (Liu, 1995).

  Penelitian lebih lanjut tentang tanaman obat binahong pernah dilakukan oleh Rahayu (2012) bahwa ekstrak dari etanol daun binahong tidak memberikan efek sebagai inhibitor tirosinase.Maka dari itu peneliti tertarik untuk menguji aktivitas penghambatan tirosinase dari ekstrak etil asetat daun binahong (Anredera cordifolia).

  B. Perumusan masalah

  1. Apakah ekstrak etil asetat daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steen) mempunyai aktivitas penghambatan terhadap tirosinase?

  2. Berapa besar aktivitas penghambatan terhadap tirosinasedari ekstrak etil asetat daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steen)?

  C. Tujuan Penelitian

  Penelitian ini dilakukan dengan tujuan:

  1. Untuk menentukan apakah ekstrak etil asetat daun binahong mempunyai aktivitas terhadap tirosinase.

  2. Untuk menentukanIC

  50 aktivitas penghambatan tirosinase dari ekstrak etil asetat daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steen).

D. Manfaat Penelitian

  Dari penelitian ini akan diperoleh bahan pemutih alami yang dapat mencegah hiperpigmentasi dari bahan alam yang mempunyai aktivitas terhadap penghambatan tirosinase yang relatif lebih aman digunakan oleh masyarakat.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen) Menurut Depkes (2006), klasifikasi tumbuhan Binahong adalah sebagai

  berikut:

  1. Sistematika Tanaman : Divisio : Spermatophyta Sub Divisio : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Bangsa : Caryophyllales Suku : Basellaceae Marga : Anredera Jenis : Anredera cordifolia (Tenore) Steen.

  Sinonim : Boussingaultia baselloides Auct. Non H.B.K, Boussingaultia gracillis Miers, Boussingaultia Cordifolia Ten.

  2. Nama daerah Indonesia : Binahong Cina : Teng san chi Inggris : Heartleaf Madeira vine, Madeira vine (Mus,2008).

  3. Morfologi

  a. Daun Tanaman binahong berdaun tunggal, sangat pendek tangkainya

  (subsessile), pertulangan menyirip, tersusun berseling, daun berwarna hijau muda, berbentuk seperti jantung (cordata), memiliki panjang sekitar 5-10 cm dan lebar sekitar 3-7 cm, helaian daun tipis lemas, ujung runcing, pangkal berlekuk (emerginatus), tepi rata atau bergelombang, dan permukaan halus, licin, dan bisa dimakan (Susetya, 2011). b. Rhizoma Tanaman binahong memiliki rhizoma. Rhizoma adalah umbi yang terdapat di dalam tanah, bercabang dan tumbuh menjalar, dari ujungnya dapat tumbuh tunas yang muncul di permukaan tanah dan dapat merupakan suatu tumbuhan baru. Biasanya rhizoma merupakan tempat penyimpanan cadangan makanan (Setiaji, 2009).

  c. Bunga Tanaman binahong memiliki bunga majemuk berbentuk majemuk rimpang, bertangkai panjang, muncul di ketiak daun, mahkota berwarna putih sampai krem berjumlah lima helai tidak berlekatan, panjang helai mahkota sekitar 0,5 - 1 cm dan memiliki bau yang harum (Susetya, 2012).

  d. Akar Tanaman binahong mempunyai akar tunggang yang berdaging lunak dan berwarna coklat kotor (Susetya, 2012).

  Gambar1. Daun Binahong (Anredera cordifolia)

  4. Khasiat Daun Anredera cordifolia (Tenore) Steen yang dikenal dengan sebutan binahong ini berkhasiat sebagai obat diabetes dan sebagai analgesik

  (mengurangi rasa nyeri), serta bisa untuk penghalus kulit. Untuk mengobati diabetes yaitu sebanyak ± 50 gram daun binahong direbus dengan 2 gelas air sampai mendidih, lalu setelah mendidih kemudian didinginkan terlebih dahulu dan selanjutnya disaring. Hasil saringan tersebut setelah dingin diminum sekaligus.Untuk penghalus kulit,menggunakan daun binahong yang dicuci bersih lalu ditumbuk sampai lumat tidak berbentuk.Hasil tersebut dalam pemakain 2x dalam satu minggu yang digunakan sebagai masker penghalus kulit (Depkes, 2006).

  5. Kandungan Kimia Dari hasil penelitian pendahuluan Universitas Gadjah Mada, dinyatakan bahwa pada kulturin vitro daun binahong mengandung flavonoid, saponin, alkaloid, dan terpenoid (Manoi,2009).

  a. Flavonoid Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran jarang sekali digunakan hanya flavonoid dalam jaringan tumbuhan.Dalam tumbuhan,aglikon flavonoid (yaitu flavonoid tanpa gula terikat) terdapat dalam berbagai struktur.Aglikon flavonoid adalah polifenol yang mempunyai sifat kimia seperti senyawa fenol yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa.

  Flavonoid merupakan senyawa yang larut dalam air, sebagian dapat diekstraksi dengan etanol 70% dan tetap ada dalam lapisan air setelah lapisan ekstrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, sehingga warna berubah apabila ditambah basa atau ammonia (Harborne,1987).

  b. Polifenol Kelarutan polifenol mudah larut dalam air karena bersifat polar dan umumnya berikatan dengan gula sebagai glikosida dan biasanya terdapat dalam vakuola sel. Untuk mendeteksi senyawa fenol sederhana ialah dengan menambahkan larutan besi (III) klorida dan uji daya reduksi dalam air atau etanol dengan penambahan pereaksi Fehling A dan Fehling B pada ekstrak sehingga menimbulkan warna merah bata atau merah yang kuat. Ekstraksi senyawa fenol dengan etanol mendidih biasanya mencegah terjadinya oksidasi enzim (Harborne,1987).

  c. Saponin Saponin tidak dapat larut dalam pelarut non polar, paling cocok diekstraksi dengan etanol atau methanol panas 70-96% dan kemudian lipid dan pigmen disingkirkan dari ekstrak dengan memakai benzene. Untuk mengetahui adanya saponin dapat dilakukan uji sederhana yaitu dengan mengocok ekstrak dari tumbuhan dalam tabung reaksi dengan air panas selama 30 menit, apabila terbentuk busa yang tahan lama pada permukaan cairan paling tidak tetap stabil selama 30 menit, maka adanya saponin dapat dipastikan ada (Harborne,1987).

  d. Alkaloid Alkaloid mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom N, biasanya dalam gabungan sebagai bagian dari sistem siklik. Alkaloid biasanya tanpa warna, kebanyakan berbentuk kristal, hanya sedikit yang berupa cairan. Senyawa alkaloid dapat dideteksi dengan pereaksi Dragendorf (Harborne,1987).

B. Melanin dan Enzim tirosinase

  Melanin yang disebut dengan melanosom merupakan pigmen atau zat warna alami pada organel khusus termasuk makhluk hidup.Melanin mempunyai dua bentuk yaitu

  1. Eumelanin memiliki sifat tidak larut dalam air dan berwarna cokelat gelap- hitam di dalam retina mata.

  2. Feomelanin memiliki sifat larut dalam basa dan memberikan warna kuning-merah pada rambut.

  Kedua bentuk tersebut disintesis dari oksidasi tirosin oleh enzim tirosinase.Enzim tirosinase yang dikenal dengan polifenol oksidase merupakan enzim kunci yang mempunyai peran dalam biosintesis melanin di dalam sel tumbuhan, mikroorganisme dan juga mamalia. Biosintesis melanin oleh enzim tirosinase dilakukan dengan mengatalisis orto-hidroksilasi tirosin menjadi 3,4- dihidroksilfenilalanin atau DOPA (monofenolase) dan oksidasi DOPA menjadi dopakuinon (difenolase). o-Kuinon yang dihasilkan ini dapat bertransformasi menjadi pigmen, baik dengan reaksi enzimatis maupun reaksi non-enzimatis (Likhitwitayawuid, 2008).

  Enzim tirosinase pada mamalia berperan dalam reaksi pigmentasi kulit atau perubahan warna kulit menjadi coklat, mata, dan rambut.Enzim tirosinase ini juga dapat menyebabkan reaksi pencoklatan pada produk pangan seperti pada buah-buahan dan sayuran yang mengakibatkan menurunnya harga jual dan nutrisi yang terkandung dalam bahan pangan tersebut (Likhititwiyawuid, 2008).Reaksi pencoklatan pada produk pangan dipengaruhi oleh konsentrasi enzim tirosinase dan substrat, ketersediaan oksigen, pH dan suhu (Chang et al. 2007).

  Senyawa yang dapat menghambat proses pembentukan melanin disebut inhibitor tirosinase. Inhibitor tirosinase juga dapat membantu proses penyembuhan penyakit hiperpigmentasi dan melanogenesis pada kulit (Batubara et al. 2010). Inhibitor tirosinase pada saat ini banyak digunakan dalam produk kosmetik dan farmasi sebagai penghambat produksi melanin berlebih pada lapisan epidermis dan membuat kulit tampak lebih putih (Arung et al. 2006).

  Mekanisme kerja enzim tirosinase untuk menghambat aktivitas enzim tirosinase adalah mereduksi bahan yang dapat menyebabkan oksidasi dopakuinon.Inhibitor tirosinase dapat bekerja secara kompetitif dan non- kompetitif dengan substrat tirosinase yaitu L-tirosin dan L-DOPA. Inhibitor tirosinase yang spesifik akan berikatan kovalen dengan enzim tirosinase sehingga enzim menjadi tidak aktif selama reaksi katalitik berlangsung (Chang, 2009). Gambar 2.Skema reaksi terbentuknya melanin(Balsam dan Sagarin, 1972).

C. Hydroquinon

  C

  6 H

  6 O

  2 BM= 110,11

  1,4- Benzenediol: p-Dihydroxybenzene: Hydroquinol: Quinol: Eldoquin and Eldopaque (Elder) (Seymour, 1975)

  Hidrokuinon merupakan zat aktif bahan kimia yang biasanya digunakan sebagai tambahan bahan kosmetik sebagai pemutih karena mampu secara efektif menghilangkan flek gelap pada kulit (Ningsih, 2009).

  Mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 100,5% C

6 H

  6 O 2 , dihitung terhadap zat anhidrat.Pemeriannya berupa berbentuk jarum

  halus, putih dan mudah menjadi gelap apabila terkena cahaya dan udara.Kelarutannya mudah larut dalam air, dalam etanol dan dalam eter (Depkes RI, 1995).

  Hidroquinon merupakan golongan zat obat keras yang hanya dapat digunakan berdasarkan dari resep dokter (Badan Pengawas Obat dan Makanan).Kegunaan hidroquinon sebagai agen pencerah kulitdigunakan untuk mengurangi hiperpigmentasi kulit seperti noda, melasma, chloasma, bintik- bintik dan lentigo (Seymour, 1975).

  Hidroquinon bekerja dengan mempengaruhi enzim tirosinase sehingga dapat menghambat oksidasi enzimatik tirosin menjadi DOPA, serta oksidasi DOPA menjadi melanin juga terhambat (Katzung, 1995).Sel pembentuk pigmentasi terletak pada lapisan basal epidermis.Jumlah dan besarnya melanin yang terbentuk dapat menentukan warna kulit (Wasitaatmadja, 1997).

BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini menggunakan jenis penelitian eksperimental dengan rancangan randomized block design. B. Variabel Penelitian Dalam penelitian ini, variabel yang digunakan antara lain :

  1. Variabel bebas : Konsentrasi ekstrak etil asetat daun binahong (Anrederacordifolia).

  2. Variabel tergantung : Persentase penghambatan tirosinase oleh ekstrak etil asetatdaun binahong (Anredera cordifolia)

  3. Variabel terkendali :Suhu penyimpanan, pelarut dan waktu, PH, panjang gelombang pada microplate reader.

C. Definisi Variabel Operasional

  Ekstrak etil asetat daun Binahong adalah ekstrak daun Binahong (Anredera cordifolia) yang diperoleh dengan cara merendam serbuk simplisia dengan pelarut etil asetat selama dua hari disertai pengadukan, kemudian filtrat yang dihasilkan dari proses maserasi tersebut diuapkan hingga diperoleh ekstrak kental daun binahong.

  Konsentrasi yang digunakan pada penghambatan tirosinase pada ekstrak etil asetat daun binahong menggunakan konsentrasi yang berbeda- beda yaitu 50, 100, 200, 400, dan 800 µg/ml.

  Persentase penghambatan tirosinase dinyatakan dengan nilaiIC

  50 yaitu

  konsentrasi larutan inhibitor yang dibutuhkan untuk menghambat 50% aktivitas tirosin-tirosinase. Aktivitas tirosinasemerupakan aktivitas penghambatan yang ditentukan dengan tirosinase. Inhibitor tirosinase mereduksi bahan yang dapat menyebabkan oksidasi dopakuinon.Semakin kecil nilai IC maka aktivitas penghambatan terhadap melanin tinggi.

  50 Suhu penyimpanan (temperatur) pada penelitian ini adalah 25ºC. Pengaturan temperatur ini dilakukan untuk menguji aktivitas terhadap enzim tirosinase, karena kerja dari enzim sangat spesifik sehingga mampu untuk menghambat.

  Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah DMSO, karena DMSO merupakan pelarut yang kepolarannya sangat tinggi ketika di larutkan dengan ekstrak.Waktu yang diperlukan untuk sampel agar mampu bereaksi dengan enzim adalah 10 menit. Sedangkan waktu yang diperlukan untuk mereaksikan substrat dengan enzim yaitu 20 menit. Hal ini dilakukan karena kerja enzim sangat spesifik, sehingga perubahan sedikit saja pada kondisi kerjanya, dapat mempengaruhi aktivitas enzim.

  Panjang gelombang yang digunakan pada aktivitas penghambatan tirosinase ini menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 490 nm.

  D. Waktu dan Tempat Penelitian

  Penelitian ini dilakukan selama7 bulan dari bulan Februari hingga bulan Juli 2013. Tempat penelitian di Laboratorium Botani dan Genetika FKIP UMP, Laboratorium Biologi Farmasi UMP, dan Laboratorium Farmakologi Toksikologi UMP.

  E. Bahan dan Alat

  Bahan yang dipakaipada penelitian ini adalah daun binahong (Anredera

  

cordifolia ),etil asetat teknis (Bratachem), .2 O (Merck),

  .2 O (Merck), hidroquinon (p.a), L-DOPA(Sigma),DMSO (Merck), enzim tirosinase (Sigma), aquabidest (widatra), methanol (Merck), asam stearat (Merck), asam asetat (Merck), asam format (Merck), toluen (Merck), aseton (Merck ) dan dietil amina (Merck).

  Alat yang dipakai dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas seperti beaker

  

glass, erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, pipet volume, pipet tetes (pyrex),

  timbangan analitik (SHIMADZU AUW220D), pH meter (Metrohm),

  

stopwatch , mikropipet (Eppendorf research plus) dan microplate reader

TM (Biorad imark ).

F. Cara Penelitian

  1. Pengumpulan bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun binahong

  (Anredera cordifolia) yang didapatkan di Desa Dukuhwaluh Kecamatan Kembaran Kabupaten Banyumas Provinsi Jawa Tengah.

  2. Determinasi bahan Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika

  FKIP UMP.Determinasi dimaksudkan untuk menetapkan kebenaran sampel yang digunakan dalam penelitian. Determinasi daun binahong dilakukan dengan mencocokkan ciri dari morfologi yang ada pada tanaman daun binahong terhadap kepustakaan Flora of Java (Backer & Bakhuizen van den Brink volume 1).

  3. Pengeringan bahan dan penyerbukan Daun binahong yang telah dipanen kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang menempel pada permukaan daun binahong.Setelah itu ditiriskan sampai semua sisa- sisa air pencucian tidak ada lagi pada daun binahong. Daun binahong kemudian dikeringkan pada lemari pengering yang terdapat pada Laboratorium Teknologi Farmasi pada suhu 30ºC, karena ruang- ruang dalam lemari pengering tersebut dalam kondisi hampa udara sehingga penyisiran air terjadi secara cepat dan aman dari material pada suhu rendah.Bahan yang sudah kering selanjutnya dapat diserbuk dengan mesin penyerbuk kemudian di ayak dengan nomor ayakan 20/60.

  4. Pembuatan ekstrak etil asetat daun binahong Metode untuk pembuatan ekstrak daun binahong menggunakan metode perendaman (maserasi) yaitu dengan cara sebanyak 350 mg serbuk daun binahong dengan menggunakan cairan penyari etil asetatselama 2 hari atau 48 jam yang disertai pengadukan. Caranya untuk hari petama, rendam 350 mg serbuk daun binahong dengan 3,5 liter pelarut etil asetat disertai pengadukan. Selanjutnya untuk hari kedua saring dengan kain penyaring dan ampas tersebut diekstraksi kembali dalam etil asetat 3,5 liter. Dalam kegiatan maserasi ini, banyaknya cairan penyari yang digunakan perbandingan 1:10 (BPOM, 2004).Kemudianmaseratdikumpulkan dan diuapkan penyariannya hingga diperoleh ekstrak kental daun binahong(Depkes RI, 1986).

  5. Identifikasi kandungan senyawa ekstrak etil asetat daun binahong

  a. Identifikasi Flavonoid Fase diam : silica gel F 254 Fase gerak : etil asetat : asam format : asam asetat glacial : air

  (100:11:11:27) Deteksi : difenilboriloksietilamina LP Bercak sinar uv : berpendar kuning intensif, hijau dan jingga(Depkes RI, 1987) Hasil positif, tampak bercak berpendar kuning dalam sinar tampak.

  b. Identifikasi Saponin Pembentukan busa yang mantap sewaktu mengektraksi tumbuhan dan waktu memekatkan ekstrak tumbuhan, merupakan bukti adanya saponin tetapi biasanya lebih baik lagi bila uji sederhana itu dipastikan dengan cara KLT dan pengukuran spectrum (Harbone, 1987).

  Uji dengan KLT yaitu Fase diam : silica gel F 254 Fase gerak : etil asetat : metanol : air (100:13,5:10) Deteksi : anisaldehid-asam sulfat LP.

  Hasil positif, jika dengan pereaksi ini saponin membentuk bercak biru atau kadang-kadang kekuningan apabila diamati pada sinar tampak (Depkes RI, 1987).

  c. Identifikasi Tanin Fase diam : silika gel F 254 Fase gerak : toluen P : aseton P : asam format (5:4:1)

  Deteksi : FeCl

3 Pembanding : asam galat

  Jika setelah disemprot dengan FeCl menghasilkan warna hitam

  3

  kehijauan berarti positif mengandung Tanin (Pratiwi, 2008). Larutan akan berubah menjadi biru kehitaman atau hijau kehitaman. Warna biru menunjukkan bahwa simplisia mengandung tannin galat.Warna hijau kehitaman menunjukkan adanya tannin katekol (Depkes RI, 1987).

  d. Identifikasi Alkaloid Fase diam : silica gel F 254 Fase gerak : toluena : etil asetat : dietil amina (70:20:10) Deteksi : Dragendrof LP Bercak sinar biasa : jingga sampai merah tua Jika setelah disemprot dengan dragendrof, setelah dilihat sinar tampak alkaloid membentuk warna hijau kekuningan berarti negatif mengandung alkaloid.

G. Uji Penghambatan Tirosinase

  1. Pembuatan Buffer Fosfat Cara membuat buffer fosfat yaitu dengan melarutkan 17,79 g

  .2 O ke dalam 100 mL aquades, kemudian sebanyak 13,79 g .2 O juga dilarutkan ke dalam 100 mL aquades. Setelah itu mengambil larutan sebanyak 46,3 mLdari dan 53,7 mL dicampurkan dan ukur dengan pH meter, sehingga diperoleh larutan buffer fosfat dengan pH 6,8 (Sambrook and David, 2001).

  2. Pembuatan Larutan Sampel (ekstrak etil asetat daun binahong)

  a. Pembuatan Larutan Stok Sampel Konsentrasi 1000 ppm Larutan stok dibuat dengan cara menimbang seksama 0,01 grekstrak etil asetat daun binahongyang dilarutkan dalam 10 mL

  DMSO. b. Pembuatan Seri Konsentrasi Sampel Dari larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm dipipet sebanyak

  0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 mL dimasukkan dalam labu ukur 5 mL dan ditambahkan dengan DMSO sampai dengan tanda sehingga diperoleh konsentrasi 50, 100, 200, 400, 800 ppm.

  3. Pembuatan Larutan Kontrol Positif Hidroquinon

  a. Pembuatan Larutan Stok Hidroquinon Konsentrasi 1000 ppm Larutan stok dibuat dengan cara menimbang seksama 10 mg hidroquinon dilarutkan dalam 10 mL DMSO.

  b. Pembuatan Seri Konsentrasi Hidroquinon Dari larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm dipipet sebanyak

  0,25 mL yang dilarutkan dalam 5 mL DMSO (50 ppm). Dari konsentrasi 50 ppm di pipet sebanyak 0,137; 0,275; 0,55; 1,1; 2,2 mL dimasukkan dalam labu ukur 5 mL dan ditambahkan dengan DMSO sampai dengan tanda sehingga diperoleh konsentrasi 1,375; 2,75; 5,5; 11; 22 ppm.

  4. Pembuatan Larutan Tirosinase Larutan tirosinase dibuat dengan cara melarutkan serbuk tirosinase sebanyak 0,250mg ke dalam larutan buffer fosfat 0,02 M pH 6,8 dalam 2 mL. Larutan ini dibuat dalam keadaan segar.

  5. Pembuatan larutan L-DOPA Larutan baku L-DOPA 0,85 mM dibuat dengan melarutkan 24,65 mg

  L-DOPA ke dalam 25 mL larutan buffer fosfat pH 6,8. Kemudian dipipet sebanyak 1,7 mL dimasukkan kedalam labu takar 10 mL dan ditambahkan larutan buffer fosfat 0,02 M pH 6,8 hingga tanda. Sehingga diperoleh konsentrasinya 2,5 mM.

  6. Pengujian Aktivitas Inhibisi Tirosinase dan Penentuan IC

  50 Pengujian ini menggunakan mikroplate 96 sumuran, caranya dengan

  memasukkan 120 µL larutan buffer fosfat 0,02 pH 6,8, tambahkan 40 µL larutan tirosinase, ditambahkan 20 µL larutan sampel. Setelah itu, larutantersebut di inkubasi pada suhu 25

  o

  Cselama 10 menit.Tambahkan 20

  µL larutan L-DOPA 0,02 M. Lalu inkubasi selama 20 menit pada suhu

  o

  25 C kemudian ukur absorbansinya diukur pada panjang gelombang 490 nm pada alat microplatereader.

  Absorbansi yang diperoleh diubah dalam bentuk persen inhibisi dengan menggunakan rumus : [ (A-B)-(C-D)] x 100%.

  A-B Keterangan: A = Absorbansi larutan tanpa sampel + enzim

  B = Absorbansi larutan tanpa sampel tanpa enzim C = Absorbansi larutan sampel + enzim D = Absorbansi larutan sampel tanpa enzim H.

   Analisis Data

  Dalam analisis data hasiluji aktivitas penghambatan tirosinasemenggunakan regresi non linier pada program GradhPad Prism

  versi 4.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika Program Studi Pendidikan Biologi Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Muhammadiyah Purwokerto dengan menggunakan buku Flora of Java Vol. 1 (Backer & Bakhuizen van den Brink, 1963). Tujuan dilakukannya

  determinasi tanaman untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas dari tanaman yang akan diambil untuk menghindari kesalahan dalam pengumpulan bahan serta mencegah kemungkinan tercampurnya dengan tanaman lain.

  Caranya dengan mencocokkan tanaman dengan kunci- kunci determinasi sehingga dapat dipastikan kebenaran tanaman yang akan digunakan dalam penelitian. Hasil determinasi spesimen tumbuhan tersebut merupakan Anredera yang termasuk dalam familia Basellaceae, dan di Indonesia dikenal dengan nama Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen). Dengan kunci determinasi sebagai berikut: 1b-2b-3b-4b-12b-13b-14b-17b-18b-18b-20b-21b-22b-23b-24b-25b-26b-27a- 28b-29b-30b-31b-403b-404b-405b-414a-415b-451b-466b-467b-468b-469b- 470e-

  541a……………..(49. Basellaceae) 49. Basellaceae. 1b…….(2. Anredera)