LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA DASAR II PERCOBA
LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA DASAR II
PERCOBAAN B-2
PEMISAHAN SENYAWA DENGAN KROMATOGRAFI
Disusun oleh:
Nama
: Bella Mega Pahlevi
NIM
: 16/394216/PN/14455
Hari/Tanggal
: Rabu, 12 April 2017
Kelompok
: 13
Partner
: Aulia Hasanah
Fakultas/Prodi
: Pertanian/Agronomi
Asisten
: Khoiria Nur Atika P.
LABORATORIUM KIMIA DASAR
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2017
LAMPIRAN
TINJAUAN PUSTAKA
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh
perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solute-solut ini melewati suatu kolom kromatografi.
Pemisahan solute-solut ini diatur oleh distribusi solute dalam fase gerak dan fase diam.
Penggunaan kromatografi cair secara sukses terhadap suatu masalah yang dihadapi
membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti
jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom,
dan ukuran sampel. Untuk tujuan memilih kombinasi kondisi kromatografi yang terbaik,
maka dibutuhkan pemahaman yang mendasar tentang berbagai macam factor yang
mempengaruhi pemisahan pada kromatografi cair (Gandjar & Rohman, 2007).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponenkomponen sampel.Untuk fase normal (fase diam lebih polar dari fase gerak), kemampuan
elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.Sementara untuk fase terbalik (fase
diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut
(Gandjar & Rohman, 2007).
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan buffer dengan methanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk
pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarurpelarut jenis alcohol.Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum disbanding dengan fase
terbalik
(Gandjar & Rohman, 2007).
Kromatografi adalah suatu metode analitik untuk pemurnian dan pemisahan senyawa-senyawa
organik dan anorganik, metode ini berguna untuk fraksionasi campuran kompleks dan pemisahan
untuk senyawa yang sejenis. Metode-metode kromatografi tidak dapat dikelompokan dengan hanya
meninjau satu macam sifat, artinya dapat dinyatakan teknik-teknik kolom seperti destilasi, ekstraksi
pelarut, penukar ion kedalam satu gelas (Khopkar, 2008).
Kromatografi bermanfaat untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi, komponenkomponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam. Transfer massa antara
fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan
partikel-partikel atau terserap di dalam pori-pori partikel atau terbagi ke dalam sejumlah cairan yang
terikat pada permukaan atau di dalam pori. Ini adalah sorpsi (penyerapan). Laju perpindahan suatu
molekul zat terlarut tertentu di dalam kolom atau lapisan tipis zat penyerap secara langsung
berhubungan dengan bagian-bagian molekul tersebut di antara fase bergerak dan fase diam. Jika ada
perbedaan penahanan secara selektif, maka masing-masing komponen akan bergerak sepanjang
kolom dengan laju yang tergantung pada karakteristik masing-masing penyerapan. Jika pemisahan
terjadi, masing-masing komponen keluar dari kolom pada interval waktu yang berbeda, mengingat
bahwa proses keseluruhannya adalah fenomena migrasi secara diferensial yang dihasilkan oleh
tenaga pendorong tidak selektif berupa aliran fase bergerak (Khopkar, 2008).
Dengan menggunakan cara kromatografi, pemisahan dalam banyak keadaan lebih cepat dan
efektif dari pada sebelumnya dan banyak pemisahan, dapat berhasil yang tidak akan dapat
diusahakan dengan teknik lain., pendobrakan yang tidak ada bandingnya dalam biokimia
mendapatkan pengertian dan fungsi enzim dan protein yang lain telah berasal secara langsung dari
penggunaan
kromatografi
dalam
penelitian
biologik
(Underwood, 1999).
1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan
sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. Kromatografi merupakan pemisahan
campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya. Untuk itu,
kemurnian bahan atau komposisi campuran dengan kandungan yang berbeda dapat
dianalisis dengan benar. Tidak hanya kontrol kualitas, analisis bahan makanan dan
lingkungan, tetapi juga kontrol dan optimasi reaksi kimia dan proses berdasarkan
penentuan analitik dari kuantitas material. Teknologi yang penting untuk analisis dan
pemisahan preparatif pada campuran bahan adalah prinsip dasar kromatograf.
Prinsip kerja pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah pelaksaanan
kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang
seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam. Gel silika (atau alumina) merupakan
fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung
substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak
merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Fase diam- silika gel
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil
dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase
diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT
dalam hal efisiensi dan resolusinya. Penjerap yang paling sering digunakan adalah
silica gel yang merupakan bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon
dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada
permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.
Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der
Waals dan atraksi dipol-dipol dan menggunakan senyawa silika Gel 60 karena lempeng tidak
akan
berpendar
bila
di
lihat
pada
sinar
UV
dibawah
sinar
UV
254
nm.
Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini
menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.
Fasa Gerak – metanol dan petroleum eter.
Pada fasa gerak menggunakan sistem yang paling sederhana ialah campuran 2
pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur
sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah
beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :
Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitif.
Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak
antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silica gel, polaritas
fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan
nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam
pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
Solut-solut ionik dan solute-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut
sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan perbandingan
tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau ammonia masing-masing akan
meningkatkan solute-solut yang bersifat basa dan asam.
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga
mempengaruhi harga R f adalah :
1) Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
2) Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.(Biasanya aktifitas dicapai dengan
pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul-molekul air yang
menempati pusat-pusat serapan dari penyerap). Perbedaan penyerap akan
memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rf meskipun menggunakan
fasa bergerak dan solute yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil
yang sama, jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan
jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.
3) Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap, dalam prakteknya tebal lapisan tidak
dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata.
Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam
daerah yang kecil dari plat.
4) Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa bergerak. Kemurnian dari pelarut yang
digunakan sebagai fasa bergerak dalam kromatografi lapisan tipis adalah sangat
penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai
harus betul-betul diperhatikan.
5) Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
6) Teknik percobaan.
Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya
diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran
penurunan dan mendatar juga digunakan).
7) Jumlah cuplikan yang digunakan.
Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil
penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak
kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada
harga-harga Rf.
8) Suhu. Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini
terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang
disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fasa.
9) Kesetimbangan.
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalarn
kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh
dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan
uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan
dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fasa bergerak lebih cepat
pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah
2. Prinsip Like dissolved like
Larutan satu akan mampu bercampur sempurna dengan larutan lain apabila memiliki
sifat (polaritas) yang sama atau tidak jauh berbeda, dimana suatu zat hanya akan larut pada
pelarut yang sesuai. Zat yang bersifat polar akan terlarut pada pelarut polar dan suatu zat non
polar akan terlarut pada pelarut polar. Bila pencampuran dilakukan antarlarutan yang
memiliki tingkat polaritas yang berbeda, maka akan terbentuk lapisan antarmuka (interface)
yang
yg
dari
sesuai
memisahkan
kedua
digunakan
zat
dgn
fase
larutan.
Adanya
diharapkan
terlarut
tingkat
k
perbedaan
terjadi
polaritas
dr
distribusi
dalam
masing-masing
kepolarannya
(terjadi
pelarut
senyawa
pelarut
yg
pemisahan
yg
selektif) hingga mencapai kesetimbangan.
Praktikum ini membahas mengenai pemisahan senyawa menggunakan kromatografi.
Kromatografi lapis tipis adalah metode yang digunakan untuk pemisahan komponen dari
suatu sampel dimana komponen akan terdistribusi antara 2 fase yaitu fase gerak dan fase
diam. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai sedang fase diam
untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat
berpendarflour dalam sinar ultra violet.
Sebuah garis menggunakan pensil digambar dekat plat KLT bagian bawah 0,5 cm dan
atas 0,5 cm kemudian setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu.
Pelarutnya adalah minyak sereh dan minyak cengkeh. Diberikan penandaan pada garis di plat
KLT tersebut untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan, batas bawah dan batas atas ini
dibuat dengan menggunakan pensil karena pensil mengandung senyawa karbon yang tidak
larut dalam eluen. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak
selayaknya kromatogram dibentuk, oleh karena itu digunakan pensil sebagai penandanya.
Dimana eluen yang digunakan tidak boleh lebih dari 1 cm, hal ini dikarenakan sesuai dengan
prinsip kapilaritas, yaitu untuk menaikkan spot (ascending). Kapilaritas adalah naiknya cairan
eluen melalui pori-pori kapiler lempeng.
Penotolan biasanya dilakukan menggunakan pipa kapiler kaca. Ketika bercak dari
campuran itu mengering, Plat KLT ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi
pelarut yaitu PE, metanol dan campuran PE dan Metanol dengan memperhatikan supaya
pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas
kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari
pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa
kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap
mencegah penguapan pelarut.
Pelarut mulai membasahi plat KLT, pelarut pertama akan melarutkan senyawasenyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan
cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut.
Kromatografi lapis tipis pada praktikum ini menggunakan
substansi tidak berwarna
dilakukan dengan cara pendaflour dan bercak secara kimia.
Fase diam pada sebuah lempengan plat KLT memiliki substansi yang ditambahkan
kedalamnya yaitu eluen seperti metanol dan PE dan campuran metanol dan PE perbandingan
1:1, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti
jika
menyinarkannya
dengan
sinar
UV,
akan
berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercakbercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa menyinarkan
sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi
bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap. Keuntungan menggunakan
UV ialah karena sinar UV tidak merusak senyawa yang dideteksi, sehingga hasil
kromatografi dapat kembali digunakan. Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan,
komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan
yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna yang terjadi.
Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. Harga ini
merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi
konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel. Harga Rf didefinisikan sebagai
perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal.
Pada praktikum ini di peroleh bahwa jarak noda atau bercak yang di timbulkan oleh minyak
sereh cenderung lebih panjang di banding dengan minyak cengkeh baik dengan eluen PE,
eluen metanol, dan campuran eluen PE dan metanol. Ada beberapa factor yang menentukan
harga Rf, yaitu macam pelarut, perbedaan suhu, ukuran dari bejana, Kertas, pengaruh utama
kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macammacam kertas mempengaruhi kesetimbangan partisi dan sifat dari campuran.
Percobaan pada kromatografi lapis tipis ini berkaitan dengan prinsip like disolved
like, yaitu prinsip kelarutan dimana suatu zat hanya akan larut pada pelarut yang sesuai. Zat
yang bersifat polar akan terlarut pada pelarut polar dan suatu zat non polar akan terlarut pada
pelarut polar.
Metanol digunakan sebagai pelarut karena metanol memiliki sifat relatif polar yang
akan mengimbangi silika gel 60 yang bersifat polar sehingga zat akan dapat terlarut. Sesuai
dengan hukum kelarutan like disolves like, artinya kelarutan akan terjadi bila memiliki sifat
kepolaran yang sama; (2) Metanol merupakan pelarut yang universal, seperti halnya etanol
yang dapat melarutkan metabolit-metabolit sekunder di dalam tumbuhan; (3) Pelarut metanol
relatif lebih murah dibandingkan pelarut etanol. Sedangkan, penggunaan Perolium Eter (PE)
yang bersifat semi polar memungkinkan untuk larutan menjadi polar dan dapat melarutkan
larutan polar.
KESIMPULAN
1. Kromatografi lapis tipis adalah metode yang digunakan untuk pemisahan komponen
dari suatu sampel dimana komponen akan terdistribusi antara 2 fase yaitu fase gerak
dan fase diam.
2. Alasan untuk menutup gelas kimia saat adalah untuk meyakinkan bawah kondisi
dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut, kondisi jenuh dalam gelas kimia
dengan uap mencegah penguapan pelarut.
3. Senyawa-senyawa
akan
cenderung
bergerak
pada
lempengan
kromatografi
sebagaimana halnya pergerakan pelarut
4. Agar mengahasilkan flour dan melihat hasil bercak yang di timbulkan maka di
perlukan sinar UV sehingga senyawa dapt berpendar.
5. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis yang merupakan
ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan
merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel.
6. Senyawa-senyawa
akan
cenderung
bergerak
pada
lempengan
kromatografi
sebagaimana halnya pergerakan pelarut.
7. Praktikum pemisahan senyawa dengan metode kromatografi ini menggunakan eluen
metanol dan PE sebagai pelarut karena metanol memiliki sifat relatif polar yang akan
mengimbangi silika gel 60 yang bersifat polar sehingga zat akan dapat terlarut.
8. Beberapa factor yang menentukan harga Rf, yaitu macam pelarut, perbedaan suhu,
ukuran dari bejana, Kertas
PERCOBAAN B-2
PEMISAHAN SENYAWA DENGAN KROMATOGRAFI
Disusun oleh:
Nama
: Bella Mega Pahlevi
NIM
: 16/394216/PN/14455
Hari/Tanggal
: Rabu, 12 April 2017
Kelompok
: 13
Partner
: Aulia Hasanah
Fakultas/Prodi
: Pertanian/Agronomi
Asisten
: Khoiria Nur Atika P.
LABORATORIUM KIMIA DASAR
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2017
LAMPIRAN
TINJAUAN PUSTAKA
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh
perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solute-solut ini melewati suatu kolom kromatografi.
Pemisahan solute-solut ini diatur oleh distribusi solute dalam fase gerak dan fase diam.
Penggunaan kromatografi cair secara sukses terhadap suatu masalah yang dihadapi
membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti
jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom,
dan ukuran sampel. Untuk tujuan memilih kombinasi kondisi kromatografi yang terbaik,
maka dibutuhkan pemahaman yang mendasar tentang berbagai macam factor yang
mempengaruhi pemisahan pada kromatografi cair (Gandjar & Rohman, 2007).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponenkomponen sampel.Untuk fase normal (fase diam lebih polar dari fase gerak), kemampuan
elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.Sementara untuk fase terbalik (fase
diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut
(Gandjar & Rohman, 2007).
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan buffer dengan methanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk
pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarurpelarut jenis alcohol.Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum disbanding dengan fase
terbalik
(Gandjar & Rohman, 2007).
Kromatografi adalah suatu metode analitik untuk pemurnian dan pemisahan senyawa-senyawa
organik dan anorganik, metode ini berguna untuk fraksionasi campuran kompleks dan pemisahan
untuk senyawa yang sejenis. Metode-metode kromatografi tidak dapat dikelompokan dengan hanya
meninjau satu macam sifat, artinya dapat dinyatakan teknik-teknik kolom seperti destilasi, ekstraksi
pelarut, penukar ion kedalam satu gelas (Khopkar, 2008).
Kromatografi bermanfaat untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi, komponenkomponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam. Transfer massa antara
fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan
partikel-partikel atau terserap di dalam pori-pori partikel atau terbagi ke dalam sejumlah cairan yang
terikat pada permukaan atau di dalam pori. Ini adalah sorpsi (penyerapan). Laju perpindahan suatu
molekul zat terlarut tertentu di dalam kolom atau lapisan tipis zat penyerap secara langsung
berhubungan dengan bagian-bagian molekul tersebut di antara fase bergerak dan fase diam. Jika ada
perbedaan penahanan secara selektif, maka masing-masing komponen akan bergerak sepanjang
kolom dengan laju yang tergantung pada karakteristik masing-masing penyerapan. Jika pemisahan
terjadi, masing-masing komponen keluar dari kolom pada interval waktu yang berbeda, mengingat
bahwa proses keseluruhannya adalah fenomena migrasi secara diferensial yang dihasilkan oleh
tenaga pendorong tidak selektif berupa aliran fase bergerak (Khopkar, 2008).
Dengan menggunakan cara kromatografi, pemisahan dalam banyak keadaan lebih cepat dan
efektif dari pada sebelumnya dan banyak pemisahan, dapat berhasil yang tidak akan dapat
diusahakan dengan teknik lain., pendobrakan yang tidak ada bandingnya dalam biokimia
mendapatkan pengertian dan fungsi enzim dan protein yang lain telah berasal secara langsung dari
penggunaan
kromatografi
dalam
penelitian
biologik
(Underwood, 1999).
1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan
sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. Kromatografi merupakan pemisahan
campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya. Untuk itu,
kemurnian bahan atau komposisi campuran dengan kandungan yang berbeda dapat
dianalisis dengan benar. Tidak hanya kontrol kualitas, analisis bahan makanan dan
lingkungan, tetapi juga kontrol dan optimasi reaksi kimia dan proses berdasarkan
penentuan analitik dari kuantitas material. Teknologi yang penting untuk analisis dan
pemisahan preparatif pada campuran bahan adalah prinsip dasar kromatograf.
Prinsip kerja pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah pelaksaanan
kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang
seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam. Gel silika (atau alumina) merupakan
fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung
substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak
merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Fase diam- silika gel
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil
dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase
diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT
dalam hal efisiensi dan resolusinya. Penjerap yang paling sering digunakan adalah
silica gel yang merupakan bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon
dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada
permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.
Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der
Waals dan atraksi dipol-dipol dan menggunakan senyawa silika Gel 60 karena lempeng tidak
akan
berpendar
bila
di
lihat
pada
sinar
UV
dibawah
sinar
UV
254
nm.
Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini
menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.
Fasa Gerak – metanol dan petroleum eter.
Pada fasa gerak menggunakan sistem yang paling sederhana ialah campuran 2
pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur
sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah
beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :
Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitif.
Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak
antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silica gel, polaritas
fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan
nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam
pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
Solut-solut ionik dan solute-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut
sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan perbandingan
tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau ammonia masing-masing akan
meningkatkan solute-solut yang bersifat basa dan asam.
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga
mempengaruhi harga R f adalah :
1) Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
2) Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.(Biasanya aktifitas dicapai dengan
pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul-molekul air yang
menempati pusat-pusat serapan dari penyerap). Perbedaan penyerap akan
memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rf meskipun menggunakan
fasa bergerak dan solute yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil
yang sama, jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan
jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.
3) Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap, dalam prakteknya tebal lapisan tidak
dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata.
Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam
daerah yang kecil dari plat.
4) Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa bergerak. Kemurnian dari pelarut yang
digunakan sebagai fasa bergerak dalam kromatografi lapisan tipis adalah sangat
penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai
harus betul-betul diperhatikan.
5) Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
6) Teknik percobaan.
Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya
diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran
penurunan dan mendatar juga digunakan).
7) Jumlah cuplikan yang digunakan.
Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil
penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak
kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada
harga-harga Rf.
8) Suhu. Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini
terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang
disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fasa.
9) Kesetimbangan.
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalarn
kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh
dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan
uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan
dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fasa bergerak lebih cepat
pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah
2. Prinsip Like dissolved like
Larutan satu akan mampu bercampur sempurna dengan larutan lain apabila memiliki
sifat (polaritas) yang sama atau tidak jauh berbeda, dimana suatu zat hanya akan larut pada
pelarut yang sesuai. Zat yang bersifat polar akan terlarut pada pelarut polar dan suatu zat non
polar akan terlarut pada pelarut polar. Bila pencampuran dilakukan antarlarutan yang
memiliki tingkat polaritas yang berbeda, maka akan terbentuk lapisan antarmuka (interface)
yang
yg
dari
sesuai
memisahkan
kedua
digunakan
zat
dgn
fase
larutan.
Adanya
diharapkan
terlarut
tingkat
k
perbedaan
terjadi
polaritas
dr
distribusi
dalam
masing-masing
kepolarannya
(terjadi
pelarut
senyawa
pelarut
yg
pemisahan
yg
selektif) hingga mencapai kesetimbangan.
Praktikum ini membahas mengenai pemisahan senyawa menggunakan kromatografi.
Kromatografi lapis tipis adalah metode yang digunakan untuk pemisahan komponen dari
suatu sampel dimana komponen akan terdistribusi antara 2 fase yaitu fase gerak dan fase
diam. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai sedang fase diam
untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat
berpendarflour dalam sinar ultra violet.
Sebuah garis menggunakan pensil digambar dekat plat KLT bagian bawah 0,5 cm dan
atas 0,5 cm kemudian setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu.
Pelarutnya adalah minyak sereh dan minyak cengkeh. Diberikan penandaan pada garis di plat
KLT tersebut untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan, batas bawah dan batas atas ini
dibuat dengan menggunakan pensil karena pensil mengandung senyawa karbon yang tidak
larut dalam eluen. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak
selayaknya kromatogram dibentuk, oleh karena itu digunakan pensil sebagai penandanya.
Dimana eluen yang digunakan tidak boleh lebih dari 1 cm, hal ini dikarenakan sesuai dengan
prinsip kapilaritas, yaitu untuk menaikkan spot (ascending). Kapilaritas adalah naiknya cairan
eluen melalui pori-pori kapiler lempeng.
Penotolan biasanya dilakukan menggunakan pipa kapiler kaca. Ketika bercak dari
campuran itu mengering, Plat KLT ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi
pelarut yaitu PE, metanol dan campuran PE dan Metanol dengan memperhatikan supaya
pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas
kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari
pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa
kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap
mencegah penguapan pelarut.
Pelarut mulai membasahi plat KLT, pelarut pertama akan melarutkan senyawasenyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan
cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut.
Kromatografi lapis tipis pada praktikum ini menggunakan
substansi tidak berwarna
dilakukan dengan cara pendaflour dan bercak secara kimia.
Fase diam pada sebuah lempengan plat KLT memiliki substansi yang ditambahkan
kedalamnya yaitu eluen seperti metanol dan PE dan campuran metanol dan PE perbandingan
1:1, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti
jika
menyinarkannya
dengan
sinar
UV,
akan
berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercakbercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa menyinarkan
sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi
bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap. Keuntungan menggunakan
UV ialah karena sinar UV tidak merusak senyawa yang dideteksi, sehingga hasil
kromatografi dapat kembali digunakan. Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan,
komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan
yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna yang terjadi.
Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. Harga ini
merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi
konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel. Harga Rf didefinisikan sebagai
perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal.
Pada praktikum ini di peroleh bahwa jarak noda atau bercak yang di timbulkan oleh minyak
sereh cenderung lebih panjang di banding dengan minyak cengkeh baik dengan eluen PE,
eluen metanol, dan campuran eluen PE dan metanol. Ada beberapa factor yang menentukan
harga Rf, yaitu macam pelarut, perbedaan suhu, ukuran dari bejana, Kertas, pengaruh utama
kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macammacam kertas mempengaruhi kesetimbangan partisi dan sifat dari campuran.
Percobaan pada kromatografi lapis tipis ini berkaitan dengan prinsip like disolved
like, yaitu prinsip kelarutan dimana suatu zat hanya akan larut pada pelarut yang sesuai. Zat
yang bersifat polar akan terlarut pada pelarut polar dan suatu zat non polar akan terlarut pada
pelarut polar.
Metanol digunakan sebagai pelarut karena metanol memiliki sifat relatif polar yang
akan mengimbangi silika gel 60 yang bersifat polar sehingga zat akan dapat terlarut. Sesuai
dengan hukum kelarutan like disolves like, artinya kelarutan akan terjadi bila memiliki sifat
kepolaran yang sama; (2) Metanol merupakan pelarut yang universal, seperti halnya etanol
yang dapat melarutkan metabolit-metabolit sekunder di dalam tumbuhan; (3) Pelarut metanol
relatif lebih murah dibandingkan pelarut etanol. Sedangkan, penggunaan Perolium Eter (PE)
yang bersifat semi polar memungkinkan untuk larutan menjadi polar dan dapat melarutkan
larutan polar.
KESIMPULAN
1. Kromatografi lapis tipis adalah metode yang digunakan untuk pemisahan komponen
dari suatu sampel dimana komponen akan terdistribusi antara 2 fase yaitu fase gerak
dan fase diam.
2. Alasan untuk menutup gelas kimia saat adalah untuk meyakinkan bawah kondisi
dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut, kondisi jenuh dalam gelas kimia
dengan uap mencegah penguapan pelarut.
3. Senyawa-senyawa
akan
cenderung
bergerak
pada
lempengan
kromatografi
sebagaimana halnya pergerakan pelarut
4. Agar mengahasilkan flour dan melihat hasil bercak yang di timbulkan maka di
perlukan sinar UV sehingga senyawa dapt berpendar.
5. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis yang merupakan
ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan
merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel.
6. Senyawa-senyawa
akan
cenderung
bergerak
pada
lempengan
kromatografi
sebagaimana halnya pergerakan pelarut.
7. Praktikum pemisahan senyawa dengan metode kromatografi ini menggunakan eluen
metanol dan PE sebagai pelarut karena metanol memiliki sifat relatif polar yang akan
mengimbangi silika gel 60 yang bersifat polar sehingga zat akan dapat terlarut.
8. Beberapa factor yang menentukan harga Rf, yaitu macam pelarut, perbedaan suhu,
ukuran dari bejana, Kertas