Toksisitas akut ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air dari herba pegagan embun [Hydrocotyle sibthorpiodes Lmk.] terhadap artemia salina leach - USD Repository
TOKSISTAS AKUT EKSTRAK DIETIL ETER DAN EKSTRAK METANOL- AIR DARI HERBA PEGAGAN EMBUN (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) TERHADAP Artemia salina Leach SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh: Maria Rosa Irma Budi Cahyani NIM : 038114065 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007
”Belajarlah pada-Ku
Karna Aku lembut dan rendah hati
Dan jiwa-Ku akan diam dalam damai abadi”
Kupersembahkan karya sederhana ini untuk: Tuhan Yang Maha Esa yang selalu memberkati kehidupanku Bapak, Ibu dan Kakakku yang senantiasa mendoakan dan mendukungku Frederikus Adi Prasetyo yang selalu menyiramiku dengan cinta kasih Serta almamaterku
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan rahmat-Nya yang berlimpah kepada penulis, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul TOKSISTAS AKUT EKSTRAK DIETIL ETER dan EKSTRAK METANOL-AIR dari HERBA PEGAGAN EMBUN (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) terhadap Artemia salina Leach, sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Keberhasilan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan berbagai pihak, baik berupa moril, materiil maupun spirituil. Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku pembimbing dan dosen penguji.
Terima kasih atas bimbingan, masukan, waktu dan perhatiannya selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.
3. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan, perhatian, kritik dan saran demi kesempurnaan skripsi ini.
4. Bapak Ipang Djunarko, S.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan, perhatian, kritik dan saran demi kesempurnaan skripsi ini.
5. Bapak, Ibu, kakakku Indah, beserta keluarga FX. Sulistyono, S.Pd., MM yang telah memberikan dukungan baik material maupun spiritual.
6. Frederikus Adi Prasetyo, atas segala cinta dan semangat yang mampu membuatku bertahan dalam menyelesaikan skripsi ini.
7. Alm. Damianus Bramantyo Idaman, semoga kau berbahagia di sisi-Nya.
Terima kasih atas segala kebersamaan yang pernah terjalin walau hanya sebentar, namun akan selalu terkenang.
8. Devi, Komank, Titien, Ratna, Anien, terima kasih atas persahabatan dan kebersamaan dalam suka maupun duka.
9. Mbak Sinta, Lia, Mbak Dika, Mas Wondo, Apri, Novi, Hartono, kkn_Merry dan kkn_Iin terima kasih kerjasama, bantuan dan dukungannya.
10. Karyawan dan laboran Laboratorium (Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Andre, Mas Parlan, Mas Kunto dan Pak Mukmin) yang telah banyak membantu selama penelitian ini.
11. Semua angkatan ’03 terlebih kelas B dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, yang telah membantu selama penyelesaian skripsi ini.
Semoga Tuhan senanatiasa melimpahkan berkat dan Rahmat-Nya atas segala kebaikan dan ketulusan yang telah diberikan.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran demi penyempurnaan skripsi ini. Akhirnya besar harapan penulis semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu dan berbagai pihak.
Yogyakarta,....................2007 Penyusun
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ………………………………………................................. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN............................................................................. iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................ v PRAKATA ............................................................................................................ vi DAFTAR ISI ........................................................................................................ ix DAFTAR TABEL ................................................................................................. xiii DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xiv
INTISARI............................................................................................................. xv
ABSTRACT .......................................................................................................... xvi BAB I. PENGANTAR ……………………………………………….................
1 A. Latar Belakang ……………………………………………...............
1 1. Perumusan masalah ………………………..................…. ......
2 2. Keaslian penelitian ………………….................………..........
3 3. Manfaat penelitian …………………….................………......
3 B. Tujuan Penelitian …………………………...................……….........
4 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ………………....................………........
5 A. Pegagan Embun ..…………………………..................……….........
5 1. Keterangan botani .. ……………….................………............
5
2. Nama lokal ............…….................……………………..........
15 E. Senyawa yang Diidentifikasi ...............................................................
2. Definisi operasional ...............……………...……………......... 21
1. Variabel penelitian ................. …………………………........... 21
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................. 21 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................................ 21 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ...................................... 21
19 G. Keterangan Empiris .............................................................................. 21
18 F. Kromatografi Lapis Tipis ....................................................................
1. Terpenoid ................. ……………………............................… 17 2. Flavonoid ..................……………….................……...............
17
14 D. Penyarian .............................................................................................
5 3. Uraian tanaman .....………….................…………………......
10 C. Apoptosis .............................................................................................
9 5. Metode BST .............................................................................
3. Lingkungan hidup .....…………………………........................ 8 4. Perkembangan dan siklus hidup ...............................................
2. Morfologi ..............…………………................…….…........... 6
1. Keterangan zoologi .. ………………….................………....... 6
6
6 B. Artemia salina Leach ...........................................................................
5 4. Kandungan kimia .....................................................................
C. Bahan dan Alat Penelitian ..................................................................... 23
1. Bahan penelitian................. …………………………............... 23
2. Alat Penelitian...............……………...…………….................. 23
D. Tatacara Penelitian ............................................................................... 24
1. Determinasi herba pegagan embun ........…………….............. 24
2. Pengumpulan bahan ............………………………………...... 24 3. Pembuatan simplisia .....………………………………............
24
4. Penyarian ................................................................................... 25 5. Pembuatan Air Laut Buatan (ALB)...................………….......
27
6. Penetasan telur ....…………………………………................... 27
7. Pembuatan larutan uji ……......................................................... 28
9. Uji toksisitas akut dengan metode BST ..................................... 28 10. Uji KLT ekstrak aktif pegagan embun ........................... .......
29
11. Analisis hasil ........................................................................... 30
BAB IV. HASIL PENELITIAN dan PEMBAHASAN ........................................ 31 A. Identifikasi Tanaman ............................................................................ 31 B. Pengumpulan Bahan ............................................................................. 31 C. Pembuatan Simplisia ............................................................................ 32 D. Penyarian Herba Pegagan Embun Menggunakan Pelarut Dietil Eter dan Metanol ........................................................................................
33 E. Air Laut Buatan (ALB) ……...............................................................
36 E. Penetasan Siste ....................................................................................
37 F. Toksisitas Akut dengan Metode BST .................................................
39
G. Uji Kualitatif Ekstrak aktif dengan KLT ............................................
50 BAB V. KESIMPULAN dan SARAN ...................................................
57 A. Kesimpulan .......................................................................................
57 B. Saran ..................................................................................................
57 DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................
58 LAMPIRAN .................................................................................................. .....
61 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. .....
67
DAFTAR TABEL Tabel I. Kriteria ketoksikan akut ........................................................ ....... 14 Tabel II. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak Dietil eter herba pegagan embun................................................
46 Tabel III. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak metanol-air herba pegagan embun ................................................ 48 Tabel IV. Hasil KLT pemeriksaan terpenoid dalam ekstrak dietil eter herba pegagan embun .............................................................................
51 Tabel V. Hasil KLT pemeriksaan flavonoid dalam ekstrak dietil eter herba pegagan embun .............................................................................. 53
DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Bagian-bagian tubuh artemia dewasa .................................................. 7 Gambar 2. Siklus hidup artemia biseksual ............................................................ 9 Gambar 3. Siklus sel .............................................................................................. 18 Gambar 4. Bagan mekanisme terjadinya apoptosis ............................................... 41 Gambar 5. Mekanisme monoterpenoid menginduksi apoptosis ........................... 42 Gambar 6. Mekanisme flavonoid menginduksi apoptosis .................................... 43 Gambar 7. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak dietil eter herba pegagan embun .......................................................................... 47 Gambar 8. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak metanol-air herba pegagan embun .......................................................................... 49 Gambar 9. Reaksi vanilin asam sulfat untuk pemeriksaan senyawa terpenoid ....
52 Gambar 10. Reaksi dengan uap amonia untuk pemeriksaan senyawa flavonoid ... 54
INTISARI
Penyakit kanker merupakan salah satu ancaman yang utama terhadap kesehatan. Kanker termasuk urutan kelima terbanyak sebagai penyebab kematian. Sedangkan sediaan antikanker hingga saat ini sangat terbatas, oleh karena itu perlu dilakukan pencarian terhadap senyawa-senyawa antikanker yang baru. Herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) diduga mengandung senyawa yang berkhasiat sebagai antikanker namun sampai saat ini belum ada penelitian mengenai hal ini. Untuk mengetahui aktivitas herba pegagan embun sebagai obat antikanker maka dilakukan uji pendahuluan dengan menggunakan metode Brine Shrimp
Lethalithy Test (BST), yang dinyatakan dengan harga Median Lethal Concentration
50 (LC 50 ).
Penelitian ini merupakan eksperimental murni dengan rancangan penelitian
Posttest Only Control Group Design . Penelitian dilakukan dengan menggunakan
ekstrak metanol-air dan ekstrak dietil eter herba pegagan embun. Ekstrak diperoleh dengan metode perkolasi. Sampel uji dibuat seri konsentrasi 125, 250, 500, 1000, dan 2000 µg/ml. Kontrol menggunakan air laut buatan, replikasi dilakukan 5 kali. Jumlah larva Artemia salina Leach yang mati pada tiap konsentrasi dihitung setelah 24 jam perlakuan. Nilai LC
50 dihitung dengan analisis probit. Ekstrak dikatakan toksik
apabila harga LC
50
≤ 1000 µg/ml. Dari ekstrak yang paling toksik ( paling aktif ) dilakukan identifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung di dalamnya.
Hasil penelitian menunjukkan harga LC
50 ekstrak metanol-air sebesar 769
µg/ml dan ekstrak dietil eter 229 µg/ml, sehingga ekstrak dietil eter lebih toksik dibandingkan ekstrak metanol-air. Identifikasi kandungan golongan senyawa dengan KLT menunjukkan bahwa ekstrak dietil eter mengandung flavonoid dan terpenoid. Kata kunci : Herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.), BST,
Artemia , LC 50 , KLT, flavonoid, terpenoid.
ABSTRACT
Cancer disease is one of the main threats for health. Cancer is included in the four biggest deathly causes. Meanwhile, the dosage of anti cancer is very limited nowadays, therefore it is necessary to find out some new anti cancer compounds.
(Hydrcotyle sibthorpiodes Lmk.) is considered contains merit
Pagagan embun herbs
compounds as the anti cancer, but there is no research about it until now. For knowing the activity of Pegagan embun herbs as anti cancer medicine, it needs to do a preliminary examination using Brine Shrimp Lethality Test (BST) method, which is presented with the value Median Lethal Concentration 50 (LC50).
This research is pure experimental with Posttest Only Control Group Design as the research design. This research is elaborated using water methanol extract and pegagan herbs diethyl ether extract. The extracts are gained through percolation method. Concentration serials of examination sample made are 125, 250, 500, 1000, and 2000 µg/ml. Control for the research used is artificial sea water and the replication is made 5 times. Number of Artemia salina larva Leach that dies in every concentration is counted after 24 hours of treatment. LC50 is counted using probit analysis. Extract is said to be toxic if the rate of LC50
≤ 1000 µg/ml. From the most toxic extract (most active) is being identified using thin layer chromatography (TLC) to know the compounds type contained in it.
The result of the research shows the LC 50 rate of water methanol extract as mush as 769 µg/ml and diethyl ether extract as much as 229 µg/ml, so that diethyl ether extract is more toxic than water methanol extract. The identification of compounds type using TLC shows that diethyl ether extract contains flavonoid and terpenoid. Keywords: Pegagan embun herbs (Hydrocotyle sibthorpodes Lmk), BST, Artemia, LC50, TLC, flavonoida, terpenoid.
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker adalah suatu penyakit sel dengan ciri atau gangguan atau
kegagalan mekanisme pengatur multiplikasi dan fungsi homeostatis lainnya pada organisme multiseluler dan bersifat metastatis (Tanu, 1998). Sampai saat ini penyakit kanker masih menjadi salah satu penyakit yang ditakuti masyarakat. Menurut Siswandono dan Soekardjo (2000) sampai saat ini masih sedikit sekali obat antikanker yang bekerja secara selektif untuk pengobatan jenis kanker tertentu. Berbagai usaha penganggulangan terhadap penyakit ini telah dilakukan namun hasil yang didapat belum maksimal, seperti pembedahan, terapi radiasi dan kemoterapi.
Cara lain yang dipilih sebagian masyarakat adalah dengan memanfaatkan bahan alam. Salah satu penelitiannya dilakukan terhadap herba pegagan embun.
Herba pegagan embun diduga mengandung senyawa yang berkhasiat sebagai antikanker (Anonim, 2002). Herba pegagan embun mengandung beberapa senyawa antara lain terpenoid minyak atsiri (trans-
β-farnesene, β-pinene, α- pinene, β-caryophyllene, α-humulene, camphene, dan ocimene yang keberadaannya dinyatakan dalam monoterpenoid dan sesquiterpenoid) dan flavonoid.
Aktivitas sitotoksik herba pegagan embun disebabkan karena adanya kandungan senyawa terpenoid (khususnya monoterpenoid dan sesquiterpenoid) program kematian sel. Terpenoid menginduksi apoptosis melalui jalur Fas/Fas ligand (Rajesh, Rachele, Stenzel and Howard, 2003) dan flavonoid menginduksi apoptosis dengan mencegah terjadinya mutasi p53 (Albert, Johnson, Lewis, Raff, Roberts and Walter, 2002). Kelarutan senyawa monoterpenoid dan sesquiterpenoid sangat besar dalam pelarut dietil eter (Harborne, 1987), sedangkan flavonoid sangat larut dalam metanol dan air. Oleh karena itu dalam penelitian ini digunakan ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun.
Skrining aktivitas sitotoksik dari ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun dilakukan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). Prinsip metode ini adalah uji toksisitas akut terhadap larva Artemia salina L. dengan penentuan nilai LC
50 setelah perlakuan 24 jam (Meyer, Ferrigni,
Putnam, Jacobsen, Nichols, and McLaughlin, 1982). Suatu senyawa dikatakan mempunyai potensi toksik jika nilai LC < 1000
50 μg/ml. Keberadaan senyawa
monoterpenoid dan sesquiterpenoid serta flavonoid di dalam ekstrak toksik herba pegagan embun dipastikan melalui profil Kromatografi Lapis Tipis.
1. Perumusan masalah
a. Apakah ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun mempunyai potensi toksik terhadap larva artemia? b. Ekstrak manakah yang mempunyai potensi toksik lebih tinggi terhadap larva artemia? c. Golongan senyawa apakah yang terkandung dalam ekstrak toksik herba pegagan embun?
2. Keaslian penelitian
Penelitian yang pernah dilakukan terhadap herba pegagan embun adalah isolasi dan identifikasi beberapa senyawa seperti monoterpenoid, sesquiterpenoid, fenol dan minyak atsiri menggunakan metode Gas Liquid Chromatography (GLC) oleh Anonim (2002). Telah diketahui bahwa kandungan dari herba pegagan embun berkhasiat sebagai antitumor (Anonim, 2002). Tetapi sejauh penelusuran pustaka, belum pernah dilakukan penelitian mengenai toksisitas akut ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun terhadap larva artemia.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan memberikan informasi yang berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan terutama dalam bidang farmasi mengenai seberapa besar aktivitas ketoksikan dari ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun dengan metode BST.
b. Manfaat praktis Ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun dapat digunakan sebagai bahan dalam skrining awal terhadap senyawa yang berpotensi sebagai antikanker dengan metode BST.
B. Tujuan Penelitian
1. Menetapkan nilai LC
50 ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun.
2. Mengetahui ekstrak mana yang mempunyai efek toksik lebih tinggi terhadap larva artemia.
3. Mengetahui golongan senyawa yang terkandung pada ekstrak toksik herba pegagan embun melalui profil kromatografi lapis tipis.
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Pegagan Embun 1. Keterangan botani Pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) mempunyai sinonim Hydrocotyle rotundifolia, Roxb. dan Hydrocotyle formosana Masamune yang termasuk dalam familia Umbelliferae (Apiaceae) (Anonim, 2002).
2. Nama lokal
Pegagan embun, antanan beurit, antanan lembut (Sunda); Andem, katepa’n, rending, semanggi (Jawa); Salatun: take cena (Madura), tikim, patikim; Tian husui (Cina) (Anonim, 2002).
3. Uraian tanaman
Pegagan embun merupakan tanaman yang tumbuh merayap dengan ramping, dapat tumbuh subur di tempat yang lembab, terbuka maupun teduh, di pinggir jalan, pinggir selokan, lapangan rumput dan di tempat lain sampai setinggi kira-kira 22500 m dari permukaan laut. Tanaman pegagan embun mempunyai batang yang lunak dan berongga dengan panjang 45 cm/lebih, berdaun tunggal berseling, mempunyai tangkai panjang berbentuk bulat atau reniform dengan pinggir terbagi menjadi 5-7 lekukan dangkal, serta berwarna hijau. Bunga tanaman pegagan embun merupakan bunga majemuk berbentuk bongkol yang keluar dari ketiak daun dan berwarna kuning (Anonim,2002).
4. Kandungan kimia
Herba pegagan embun yang berkhasiat untuk mengobati tumor, reumatik, infeksi saluran nafas, gangguan pencernaan, dan masalah kulit mempunyai kandungan kimiawi yang antara lain terdiri dari: terpenoid minyak atsiri (trans-
β- farnesene, β-pinene, α-pinene, β-caryophyllene, α-humulene, camphene, dan ocimene yang keberadaannya dinyatakan dalam monoterpenoid dan sesquiterpenoid) dan flavonoid (quersetin 3-galaktosid) (Anonim, 2002).
B. Artemia salina Leach
1. Keterangan zoologi
Artemia (Artemia salina Leach) yang digunakan dalam penelitian ini termasuk dalam familia Artemidae (Oemarjati dan Wardhana, 1990).
1. Morfologi
a. Telur Istilah untuk telur artemia yang benar adalah siste, yaitu telur yang telah berkembang lebih lanjut menjadi embrio dan kemudian, diselubungi oleh cangkang yang tebal dan kuat. Cangkang ini berguna untuk melindungi embrio terhadap pengaruh kekeringan, benturan keras, sinar ultraviolet dan mempermudah penguapan, sehingga ia sangat tahan terhadap keadaan lingkungan yang buruk (Mudjiman, 1989).
b. Burayak Apabila telur-telur artemia direndam dalam air laut yang bersuhu 25 ºC, akan menetas dalam waktu 24-36 jam. Dari dalam cangkang keluar beruyak
(larva) yang dikenal dengan istilah nauplius. Dalam perkembangan selanjutnya burayak akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis) setelah itu berubah menjadi artemia dewasa.
c. Artemia dewasa Bentuk artemia dewasa lebih sempurna, dengan ukuran panjang sekitar 1 cm dan beratnya 10 mg. Bentuk artemia dewasa menyerupai udang kecil, bagian kepala berukuran lebih besar kemudian mengecil pada bagian ekor. Panjang ekor kurang lebih sepertiga dari total panjang tubuh. Dibagian kepala terdapat sepasang mata dan sepasang antenula (sungut). Pada bagian tubuh terdapat sebelas pasang kaki atau secara khusus disebut torakopoda, antara ekor dan pasangan kaki belakang terdapat sepasang alat kelamin, penis pada jantan dan ovarium pada betina (Mudjiman, 1989).
Gambar 1. Bagian-bagian tubuh artemia dewasa (Mudjiman, 1989) Artemia tidak dapat bertahan hidup pada suhu kurang dari 6 ºC atau lebih dari 35 ºC. Akan tetapi, hal ini sangat jelas tergantung pada ras dan kebiasaan tempat hidup mereka. Suhu yang baik untuk pertumbuhan artemia berkisar antara 25-30 º C. Telur artemia yang kering akan bertahan pada suhu -273ºC dan 100ºC.
Daya tahan artemia terhadap perubahan kandungan ion-ion kimia dalam air ternyata juga sangat tinggi.
Untuk perkembangan artemia yang baik, mereka membutuhkan kadar garam yang tinggi. Sebab pada kadar garam yang tinggi dapat terhindar dari musuh-musuh yang tidak dapat hidup pada kadar garam yang tinggi. Sedangkan untuk pertumbuhan telur (siste) dibutuhkan kadar garam yang lebih rendah daripada batas tertentu. Batas ini berlainan untuk setiap jenis artemia (Mudjiman, 1989).
Agar artemia dapat hidup lebih baik, kadar oksigen terlarutnya harus mendekati titik kejenuhan, yaitu sekitar 3 ppm (bagian per juta). Terhadap perubahan-perubahan kadar oksigen terlarut ini, sebenarnya artemia sangat pandai menyesuaikan diri. Pada kadar oksigen yang hanya 1 ppm, artemia masih juga dapat bertahan. Sebaliknya, merekapun dapat hidup pada kejenuhan oksigen lebih
6 dari 1,5 x 10 ppm (Mudjiman, 1989).
Pengaruh pH terhadap kehidupan artemia muda dan dewasa belum jelas namun berpengaruh terhadap penetasan telur. Apabila pH untuk penetasan kurang dari 8, maka efisiensi penetasan akan menurun. Siste banyak yang tidak menetas atau waktu penetasannya menjadi lebih panjang (Mudjiman,1989).
4. Perkembangan dan siklus hidup
Ditinjau dari segi cara berkembang biaknya, ada dua jenis artemia yaitu jenis biseksual dan jenis partenogenetik. Jenis biseksual tidak dapat berkembang biak secara parthenogenesis, dan sebaliknya jenis partenogenetik tidak dapat berkembang biak secara biseksual (Mudjiman, 1989).
Pada perkembangbiakan biseksual maupun parthenogenesis dapat terjadi secara ovovivipar maupun ovipar. Cara ovovivipar yang keluar dari induknya sudah berupa burayak atau larva (nauplis), sedangkan cara ovipar yang keluar dari induknya berupa telur bercangkang. Sebutan yang tepat untuk telur ini yaitu siste karena berisi embrio. Apabila telur artemia berada dalam lingkungan yang sesuai misalnya kadar garam, suhu, dan pH yang sesuai maka telur dapat memetas menjadi nauplis dalam waktu 14 hari menjadi artemia dewasa (Mudjiman, 1989).
Gambar 2. Siklus hidup artemia biseksual (Mudjiman, 1989) a. Penggunaan artemia pada metode BST Artemia digunakan sebagai hewan coba dalam praskrining aktivitas antikanker di National Cancer Institute (NCI), Amerika Serikat. Metode ini sering digunakan untuk skrining awal terhadap senyawa aktif yang terdapat di dalam ekstrak tanaman karena murah, cepat, mudah (tidak memerlukan kondisi aseptis), dan dapat dipercaya. Metode BST juga memiliki kekurangan karena artemia tidak mampu mendeteksi senyawa yang dalam aktivitas fisiologinya memerlukan aktivasi di dalam tubuh mamalia seperti 6-merkaptopurin dan siklofosfamida (Meyer et al., 1982). Meskipun pengujian ini tidak dapat mendeteksi senyawa yang dibutuhkan untuk aktivasi metabolik pada mamalia, tetapi uji BST ini dapat dipercaya sebagai detektor aktivitas biologik (Solis, Wright, Gupta, and Phillipson 1992).
Uji larva udang ini juga dapat digunakan untuk skrining awal terhadap senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antitumor karena uji ini sering sekali mempunyai korelasi yang positif dengan potensinya sebagai antitumor (Anderson, Goets, and Mc Laughin, 1991). Penggunaan larva artemia memang tidak spesifik untuk antitumor, namun dapat menunjukkan kemampuannya untuk memonitor kemungkinan adanya efek toksik secara lebih cepat dibandingkan dengan prosedur pengujian sitotoksitas menggunakan biakan sel kanker (Meyer et
al ., 1982).
Kemampuan artemia untuk mendeteksi efek sitotoksik sangat dimungkinkan karena artemia mempunyai kesamaan sistem enzim dengan sistem enzim pada mamalia, yaitu tipe DNA-dependent RNA polymerase dan oubaine
- + +
(Solis et al., 1993), sehingga senyawa
sensitive Na dan K dependent ATPase maupun ekstrak yang mempunyai aktivitas pada sistem tersebut dapat terdeteksi.
DNA-dependent RNA polymerase merupakan sistem enzim yang berperan dalam
sistesis protein (polinukleotida). RNA polymerase akan berikatan dengan DNA pada tahap transkripsi di dalam nukleus. Dalam hal ini DNA berperan sebagai cetakan dalam pembuatan nukleotida RNA yang baru. RNA, khususnya RNA messenger (mRNA) inilah yang membawa pesan genetik, yang kemudian akan diterjemahkan RNA translasi (tRNA) dalam proses sintesis protein (Campbell, Recee, and Mitchell, 2002).
Na -K ATPase ditemukan dalam semua bagian tubuh manusia. Na -K ATPase mengkatalisis hidrolisis ATP menjadi ADP serta menggunakan tenaga
untuk menggerakkan 3 Na keluar dari sel dalam pertukaran bagi tiap 2 K yang digerakkan ke dalam sel bagi tiap mol ATP yang dihidrolisis. Ouabain merupakan
penghambat Na -K ATPase yang paling aktif, di mana tempatnya berikatan yaitu pada subunit terkecil dari suatu kompleks enzim dan letaknya tak jauh dari tempat berikatannya ATP. Suatu penghambat (inhibitor) dalam darah manusia akan
- bersaing dengan ikatan ouabain dan memungkinkan mengontrol transport Na -K .
2+ + +
Na -K ATPase secara tidak langsung mempengaruhi transport Ca di
2+ + +
dalam jantung. Jika kerja Na -K ATPase dihambat oleh ouabain maka Ca akan meningkat, keadaan ini sangat bermanfaat dalam terapi payah jantung karena akan memudahkan kontraksi otot jantung. Pada hewan, pemeliharaan tekanan dan
volume sel yang normal tergantung atas pompa Na dan K . Tanpa pompa ini, Cl
- dan Na akan memasuki sel menuruni perbedaan konsentrasinya, serta air akan
Artemia dinilai sukup akurat mewakili model sel kanker, hal ini telah dibuktikan oleh Meyer (1982) lewat penelitiannya. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa suatu ekstrak yang berpotensi toksik dan bersifat sitotoksik, ketika diujikan pada artemia juga memberikan hasil yang sama.
b. Parameter toksisitas Toksisitas merupakan suatu istilah relatif yang biasa digunakan untuk membandingkan apakah zat kimia yang satu lebih toksik dari yang lain. Uji toksisitas tidak khas yaitu uji toksisitas yang dirancang untuk mengevaluasi keseluruhan potensi toksik suatu senyawa pada aneka ragam jenis hewan uji.
Termasuk dalam uji toksisitas tidak khas ialah uji toksisitas akut. Uji toksisitas akut merupakan uji toksisitas dengan pemberian suatu senyawa yang diberikan dengan dosis tunggal pada hewan uji tertentu dan pengamatan dilakukan selama 24 jam. Maksud uji toksisitas akut adalah untuk menentukan gejala toksik sebagai akibat pemberian suatu senyawa dan untuk menentukan tingkat letalitasnya (Loomis, 1978). Selain uji toksisitas akut, di dalam uji toksisitas tidak khas termasuk pula uji toksisitas subkronis dan uji toksisitas kronis. Uji toksisitas yang khas yaitu uji toksisitas yang dirancang untuk mengevaluasi secara rinci potensi toksik yang spesifik suatu senyawa pada aneka ragam hewan uji. Termasuk dalam uji ini ialah uji potensial, uji kekarsinogenikan, uji kemutagenikan, uji keteratogenikan, uji mata dan uji kulit.
Tolok ukur pengamatan potensi ketoksikan meliputi tolok ukur kualitatif dan kuantitatif. Tolok ukur kualitatif terdiri dari mekanisme efek toksik, wujud efek toksik, sifat efek toksik dan gejala klinis. Tolok ukur kuantitatif berupa LC
50 ,
yaitu konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian pada 50% hewan uji. Dalam tolok ukur kuantitatif ini terdapat hubungan antara konsentrasi dengan ketoksikan suatu senyawa. Hubungan antara konsentrasi-respon lebih banyak digunakan dalam evaluasi ketoksikan suatu senyawa karena tujuannya lebih ditujukan pada resiko (ukuran kemungkinan timbulnya potensi toksik pada sekelompok hewan uji).
Uji toksisitas akut digunakan untuk menentukan harga LD
50 atau LC
50
suatu senyawa bilamana lama pengamatan tidak ditunjukkan, maka dianggap bahwa pengamatan dilakukan selama 24 jam (Donatus, 2001). Parameter LC
50
digunakan dalam metode BST dan bukan LD
50 karena dalam hal ini larva artemia
terpejani senyawa toksik yang ada pada media hidupnya, yaitu Air Laut Buatan (ALB). Uji toksisitas akut dengan hewan uji Artemia salina Leach digunakan sebagai uji pendahuluan pada penelitian yang mengarah pada uji sitotoksik. Suatu senyawa disebut toksik jika harga LC
50 dari uji toksisitas akut < 1000 µg/ml (Meyer et al., 1982).
Parameter yang digunakan untuk menunjukkan adanya aktivitas biologis suatu senyawa pada artemia adalah kematian. Keuntungan penggunaan arrtemia sebagai hewan uji adalah kesederhanaan dalam pelaksanaan, waktu relatif singkat, dan konsentrasi kecil sudah dapat menimbulkan aktivitas biologis (Meyer et al., 1982)
Tabel I. Kriteria ketoksikan akut (Loomis, 1978)
KRITERIA LC
50 (µg/ml)
Luar biasa toksik 1 atau kurang Sangat toksik 1 – 50
Cukup toksik 50 – 500 Sedikit toksik 500 – 5000
Praktis tidak toksik 5000 – 15.000 Relatif kurang berbahaya
≥ 15.000
C. Apoptosis
Kematian sel (apoptosis) meruoakan bagian penting dalam perkembangan manusia, yang terjadi selama proses oogenesis, perkembangan otak dan pada pembentukan kaki serta tangan. Apoptosis melibatkan gen-gen khusus dan jalur pemberi signal yang mendasari program kematian sel. Apoptosis dapat terjadi pada suatu sel tanpa menyebabkan kerusakan pada sel dan jaringan di sekitarnya (Rajesh, et al., 2003).
Karakteristik apoptosis bila ditinjau dari segi morfologi : 1. penyusutan sel : sel menjadi lebih kecil dan kehilangan kontak dengan sel- sel yang berada di sekelilingnya.
2. terjadi ”blebbing” yaitu adanya tonjolan-tonjolan kecil di permukaan membran sel.
3. pemecahan sel membentuk ”badan apoptotik” dan terjadi fagositosis dari pecahan-pecahan sel ini oleh makrofag.
Apoptosis diatur oleh berbagai jalur pemberi signal yang kesemuanya itu melibatkan caspase. Caspase merupakan kelompok dari sistein protease, yaitu suatu enzim yang bertugas mencerna protein. Dalam tubuh manusia, kebanyakan caspase berada dalam bentuk inaktif yang kemudian akan diaktivasi melalui proses proteolisis menjadi bentuk yang lebih aktif.
Monoterpenoid/sesquiterpenoid berpotensi menginduksi apoptosis melalui jalur Fas/Fas ligand. Potensi monoterpenoid/sesquiterpenoid dalam menginduksi apoptosis disebabkan karena monoterpenoid/sesquiterpenoid dapat menghambat peralihan fase G /M dalam siklus sel (Rajesh, et al 2003). Flavonoid menginduksi
2 apoptosis dengan mencegah terjadinya mutasi p53 (Albert et al., 2002).
D. Penyarian
Kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair disebut dengan istilah penyarian. Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang dapat larut melalui lapisan- lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut.
Untuk melakukan penyarian harus diketahui zat aktif yang dikandungnya sehingga mempermudah pemilihan cairan penyari serta cara penyarian yang tepat.
Secara umum ada 4 metode penyarian yaitu maserasi, infundasi, perkolasi dan destilasi uap (Anonim, 1986).
Perkolasi merupakan cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyarian melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Metode perkolasi digunakan dalam penelitian ini karena dapat menyari zat aktif lebih optimal dibandingkan dengan menggunakan metode maserasi. Hal tersebut dikarenakan: 1. aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang terjadi dengan larutan yang konsentrasinya lebih rendah, sehingga meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi. 2. ruangan diantara butir-butir serbuk simplisia membentuk saluran tempat mengalir cairan penyari. Oleh karena kecilnya cairan kapiler tersebut, maka kecepatan pelarut cukup untuk mengurangi lapisan atas, sehingga dapat meningkatkan perbedaan konsentrasi (Anonim, 1986).
Selain itu, perkolasi lebih efisien bila dibandingkan dengan maserasi karena prosesnya yang berkesinambungan di mana cairan penyari yang telah jenuh akan digantikan dengan cairan penyari yang lebih segar terus-menerus (Silva, Lee, Kinghorn, 1998)
Prinsip perkolasi adalah sebagai berikut : serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori, cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dapat dilalui sampai mencapai keadaan jenuh, gerak ke bawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan di atasnya, dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk menahan. Kekuatan yang berperan dalam perkolasi antara lain : gaya berat, kekentalan, daya larut, tegangan permukaan, difusi osmosa, adhesi, daya kapiler dan daya geseran (Anonim, 1986).
Alat yang digunakan untuk perkolasi adalah perkolator, cairan yang digunakan untuk menyari yang disebut cairan penyari atau menstrum, larutan zat aktif yang keluar dari perkolator disebut sari atau perkolat, sedang sisa setelah dilakukan penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi (Anonim, 1986).
E. Senyawa Yang Diidentifikasi
1. Terpenoid
Senyawa terpenoid pada umumnya terdapat dalam sitoplasma sel tumbuhan serta berperan penting baik dalam pertumbuhan dan metabolisme maupun pada ekologi tumbuhan. Terpenoid terdiri atas beberapa macam senyawa, mulai dari komponen minyak atsiri, yaitu monoterpena dan sesquiterpena, diterpena, triterpena, sterol serta pigmen karotenoid. Semua senyawa terpenoid berasal dari molekul isoprena CH
2 =C(CH 3 )-CH=CH
2. Terpenoid biasanya dapat
diekstraksi dari jaringan tumbuhan dengan menggunakan petroleum eter, dietil eter atau kloroform (Harborne, 1987). Senyawa terpenoid berpotensi sebagai agen antikanker karena mempunyai sifat sitotoksik yaitu dengan menahan peralihan fase G /M dalam siklus sel(Rajesh et al., 2003).
2
Gambar 3. Siklus sel (Katzung and Trevor. 1993)
Menurut (Mursyidi, 1990), senyawa terpenoid dapat dipisahkan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Fase gerak yang digunakan yaitu toluen-etil asetat (93:7 v/v). Sedangkan fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254 atau selulosa. Terpenoid dideteksi dengan menggunakan pereaksi vanilin asam sulfat.
2. Flavonoid
Senyawa fenol alam, flavonoid terdapat dalam hampir semua tumbuhan dari bangsa algae hingga Gymnospermae. Di dalam tumbuhan, flavonoid biasanya berikatan dengan gula sebagai glikosida. Molekul yang berikatan dengan gula disebut aglikon. Aglikon flavonoid adalah polifenol sehingga flavonoid mempunyai sifat kimia fenol (Mursyidi,1990). Golongan senyawa flavonoid bersifat polar karena mempunyai gugus hidroksil yang tidak tersulih atau mempunyai suatu gula, sehingga pada umumnya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar. Golongan senyawa flavonoid bersifat polar sehingga pada umumnya
(MeOH), butanol (BuOH), aseton, dimetilsulfoksida (DMSO) serta air. Gula yang terikat pada flavonoid cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air, dengan demikian campuran pelarut dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida.
Efek flavonoid terhadap macam-macam organisme sangat banyak macamnya dan dapat menjelaskan mengapa tumbuhan yang mengandung flavonoid dipakai dalam pengobatan tradisional (Mursyidi, 1990). Menurut Anonim (2006), flavonoid merupakan salah satu jenis metabolit sekunder yang diduga menunjukkan adanya aktivitas sebagai antikanker. Flavonoid sebagai senyawa antikanker pada prinsipnya bersifat sitotoksik, antimetabolit, antimitotik/mitostatik, menghambat salah satu atau beberapa fase siklus metabolisme sel (Colis, 1874 cit Santa, 1998).
Adanya senyawa flavonoid dalam suatu bahan dapat dianalisis dengan KLT. Biasanya digunakan fase diam selulosa dan fase gerak seperti n-butanol- asam asetat-air (4:1:5 v/v) diambil lapisan atas, kloroform-etil asetat (60:40 v/v), dan kloroform-aseton-asam format (75:16,5:8,5 v/v). Deteksi terhadap bercak yang timbul setelah pengembangan dapat menggunakan sinar UV, pereaksi semprot seperti sitroborat, pereaksi alumunium klorida, dan antimoni triklorida (Wagner, Brady, dan Zgainski, 1984).
F. Kromatografi Lapis Tipis
Metode pemisahan fisikokimia yang banyak digunakan dalam berbagai penelitian adalah Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Campuran senyawa yang akan dipisahkan berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita pada lempeng kromatografi, selanjutnya dikembangkan dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (Stahl, 1985).
Fase diam (lapisan penjerap) dibuat dari salah satu penjerap yang khusus digunakan untuk KLT. Penjerap yang umum digunakan adalah silika gel, alumunium oksida, kieselgur, selulosa dan lain-lain. Fase gerak ialah medium yang terdiri dari satu atau beberapa pelarut, bergerak di dalam fase diam yang merupakan lapisan berpori, yang dipengaruhi oleh gaya kapiler. Pelarut yang digunakan memiliki tingkat mutu analitik dan jika perlu dapat digunakan campuran pelarut yang terdiri dari 3 jenis pelarut (Stahl, 1985).
Deteksi senyawa pada plat KLT paling sederhana adalah jika senyawa yang menunjukkan penyerapan di daerah UV dengan panjang gelombang 254 nm (gelombang pendek) atau gelombang 365 nm (gelombang panjang) (Stahl, 1985). Deteksi senyawa pada plat KLT biasanya juga dilakukan dengan penyemprotan dan karena permukaan lebih sempit, maka penyemprotannya merupakan prosedur nisbi yang sederhana (Harborne, 1987).
Harga Rf yang diperoleh pada KLT tidak tetap, berkisar antara 0,00-1,00 dan ditentukan hanya dua desimal. Bilangan hRf merupakan angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berkisar antara 0-100. Harga Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standar (Stahl, 1985). Jarak pengembangan senyawa pada kromatografi biasanya dapat digunakan untuk identifikasi senyawa yang dianalisa.
Jarak titik pusat bercak dari titik awal
Rf = ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Jarak garis depan dari titik awal
Kelebihan khas KLT adalah keserbagunaan, kecepatan, dan kepekannya.Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan bahwa di samping selulosa, sejumlah penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada plat kaca atau penyangga lain dan digunakan untuk kromatografi. Kecepatan KLT yang lebih besar disebabkan oleh sifat penjerap yang lebih padat bila disaputkan pada plat dan merupakan keuntungan bila digunakan untuk menelaah senyawa labil. Kepekaan KLT sedemikian rupa sehingga bila diperlukan dapat dipisahkan bahan yang jumlahnya kurang dari ukuran µg (Harborne, 1987).
G. Keterangan Empiris
Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan data empiris tentang potensi toksik ekstrak metanol-air dan ekstrak dietil eter herba pegagan embun terhadap larva artemia dengan metode BST yang dinyatakan dalam LC
50 , serta untuk memperoleh profil kromatografi lapis tipis ekstrak aktif herba pegagan embun.
Data empiris yang diperoleh melalui uji toksisitas akut ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun ini memungkinkan untuk dilakukan eksplorasi guna mendapatkan senyawa toksik yang dapat dilanjutkan dengan uji sitotoksisitas untuk mendapatkan senyawa antikanker.
BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan Posttest Only Control Group Design. B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas Jenis ekstrak yang digunakan yaitu ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol- air herba pegagan embun dengan berbagai seri konsentrasi.