OPTIMASI SUHU DAN LAMA PENDINGINAN DALAM PROSES KRISTALISASI STEVIOSIDA DARI DAUN TANAMAN Stevia rebaudiana Bertonii DENGAN FACTORIAL DESIGN SKRIPSI

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

OPTIMASI SUHU DAN LAMA PENDINGINAN
DALAM PROSES KRISTALISASI STEVIOSIDA DARI
DAUN TANAMAN Stevia rebaudiana Bertonii
DENGAN FACTORIAL DESIGN

SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Mencapai Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :
Fransisca Romana Dyah Kuswantari
NIM : 058114043

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2009

1

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

OPTIMASI SUHU DAN LAMA PENDINGINAN
DALAM PROSES KRISTALISASI STEVIOSIDA DARI
DAUN TANAMANStevia rebaudiana Bertonii
DENGAN FACTORIAL DESIGN

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Mencapai Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi

Oleh :
Fransisca Romana Dyah Kuswantari
NIM : 058114043

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2009

i

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI

TERPUJI

ii

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

iii

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

“APAPUN yang kita lakukan dan yakini...
selama hal itu BENAR
dan
selama kita BERUSAHA DENGAN CARA YANG BENAR....
disertai dengan DOA...
segalanya akan menjadi mungkin
dan
suatu saat akan terjadi KEAJAIBAN
yang akan membuktikan keyakinan kita.....”

Karya ini saya persembahkan untuk:
Keluarga kecil dan Keluarga besarku yang tercinta....
Teman-temanku yang kusayangi....
dan Almamaterku......

iv

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN

TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

v

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas
berkat dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul
“Optimasi Suhu dan Lama Pendinginan dalam Proses Kristalisasi Steviosida
dari Daun Tanaman Stevia Rebaudiana Bertonii dengan Factorial Design”
ini. Skripsi ini merupakan penelitian yang dibiayai oleh Hibah A3.

Penelitian ini dapat terlaksana dengan baik karena adanya dukungan dari
berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada pihakpihak yang bersangkutan, antara lain:
1. Ibu Rita Suhardi M.Si., Apt., selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta
2. Ibu Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt. dan Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si,
selaku dosen pendamping dan dosen penguji yang telah memberikan
kesempatan, bimbingan, dan dukungannya.
3. Ibu Christine Pramurti, S.Si, Apt. dan yang telah memberikan kemudahan
sarana dan prasarana kepada kami.
4. Ibu Agatha Budi Susiana Lestari, M.Si., Apt dan Bapak Jeffry Julianus,
M.Si, atas ketersediaannya sebagai dosen penguji.
5. Ibu Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si., Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro,
M.Si, Romo Drs. Petrus Sunu Hardiyanta, S.J, S.Si., Drs. Antonius Tri
Priantoro, M.For. Sc, yang telah memberi pencerahan dalam pelaksanaan
penelitian ini.

vi

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN

MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

6. Para Dosen, Laboran, serta Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma yang secara langsung

maupun

tak langsung membantu

terlaksananya penelitian ini.
7. Keluargaku tercinta, Bapak, Ibu, Mbak Sari atas pengorbanan, cinta, doa
dan dukungannya.
8. Sahabatku : Nia Detta, Aya, Paulina. Terima kasih atas persahabatan yang
indah dan penghiburannya.
9. Teman-teman “Payung Stevia”: Virginia, Febrian, Totok, Feri, Diana,
Retha, Natalia, Tyas. Terima kasih atas kerjasama, dan kebersamaannya.
10. Seluruh teman-teman

Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta.

Terima kasih atas perhatian dan dukungannya dalam upaya keberhasilan
penelitian ini.
11. Seluruh pihak yang ikut serta dan membantu pelaksanaan penelitian ini
yang tidak dapat disebutkan satu per satu.

Penulis juga memahami masih terdapat kekurangan dalam penelitian ini,
sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran guna kesempurnaan penelitian ini
ini. Akhir kata, semoga laporan ini bermanfaat bagi seluruh pihak yang
menggunakannya.

Yogyakarta, Januari 2009

Penulis

vii

PLAGIAT

PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

viii

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

INTISARI
Tumbuhan stevia (Stevia rebaudiana Bertonii) mengandung
steviosida yang berpotensi sebagai pemanis alternatif nonnutritif. Penelitian
ini tentang optimasi suhu dan lama pendinginan dalam proses kristalisasi
steviosida dari stevia dengan factorial design. Tujuan dari penelitian untuk

mengetahui faktor yang dominan serta berat kristal dan kandungan steviosida
dalam kristal yang optimum dari kombinasi suhu dan lama pendinginan
dalam kristalisasi steviosida.
Penelitian eksperimental ini dengan metode factorial design dua
faktor, yaitu suhu pendinginan dan lama pendinginan, dengan dua level yaitu
level tinggi dan level rendah. Tiap level kemudian ditetapkan berat kristal
dan kandungan steviosida dalam kristal. Contour plot superimposed
persamaan factorial design, digunakan untuk memilih kombinasi yang
optimal antara suhu dan lama pendinginan.
Penelitian ini menghasilkan persamaan factorial design kandungan
steviosida adalah Y = 74,61322 + 0,972842X1 + 0,462996X2 – 0,09092X1X2
dan dari perhitungan Yate’s treatment dihasilkan suhu merupakan faktor
dominan dan terdapat interaksi. Persamaan factorial design berat kristal
adalah Y = 0,2845812+0,0490953X1 + 0,0539127X2 – 0,00336558X1X2 dan
dari perhitungan Yate’s treatment dihasilkan bahwa tidak ada faktor yang
mempengaruhi berat kristal. Kombinasi antara suhu dan lama penyimpanan
dapat menghasilkan kristal dengan berat kristal melebihi 1,2%b/b terhadap
serbuk stevia, dengan kandungan steviosida dalam kristal melebihi 80% b/b.
Kata kunci : Stevia rebaudiana Bertonii, steviosida, suhu pendinginan, lama
pendinginan, kristal, factorial design.

ix

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

ABSTRACT
Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii) is plant contain stevioside which
potential as nonnutritive alternative sweeteners. This research is about
optimization of temperature and cooling time in stevioside’s crystallization
from stevia by factorial design. The aim of research are to know primary
factor and the optimum respons from temperature and cooling time
combination in stevioside’s crystallization.
This experimental research with factorial design two factor, that
cooling temperature dan cooling time with two level, high and low level.
Each level determine the crystal weight and stevioside content in crystal.
Contour plot superimpossed from factorial design comparison used to decide
the optimal combination of temperature and cooling time.
The result of this research is factorial design comparison of
stevioside content in crystal, Y = 74,61322 + 0,972842X1 + 0,462996X2 –
0,09092X1X2 and result Yate’s treatment calculations that cooling
temperature was primary factor dan interaction can be evaluated. Factorial
design comparison of crystal weight is Y = 0,2845812+0,0490953X1 +
0,0539127X2 – 0,00336558X1X2 and result Yate’s treatment calculations
that no primary factor. The optimal combination of temperature and cooling
time give crystal weight more than 1,2%w/w of stevia powder, and the
stevioside content in crystal more than 80%w/w.
Keyword : Stevia rebaudiana Bertonii, stevioside,
cooling time, crystal, factorial design.

x

cooling temperature,

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING............................................ ii
HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... iv
PRAKATA ...................................................................................................v
PERNYATAAN KEASLIAAN KARYA .................................................. viii
INTISARI ................................................................................................. ix
ABSTRACT ...................................................................................................x
DAFTAR ISI ................................................................................................ xi
DAFTAR TABEL ...................................................................................... xiii
DAFTAR GAMBAR.................................................................................. xiv
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................xv
BAB I PENGANTAR ....................................................................................1
A. Latar Belakang...........................................................................................1
B. Perumusan Masalah ...................................................................................2
C. Keaslian Penelitian.....................................................................................2
D. Manfaat ...................................................................................................3
E. Tujuan ...................................................................................................3
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .............................................................4
A. Stevia
...................................................................................................4
B. Steviosida ...................................................................................................5
C. Defatisasi ...................................................................................................7
D. Maserasi ...................................................................................................8
E. Elektrokoagulasi ........................................................................................9
F. Kristalisasi ................................................................................................10
G. Kromatografi Lapis Tipis ........................................................................13
H. ImageJ .................................................................................................15
I. Factorial Design .......................................................................................16
J. Landasan Teori..........................................................................................17
K. Hipotesis .................................................................................................18

xi

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

BAB III METODE PENELITIAN ...............................................................19
A. Jenis Rancangan Penelitian......................................................................19
B. Variabel dan Definisi Operasional...........................................................19
1. Variabel Penelitian .............................................................................19
2. Definisi Operasional............................................................................20
C. Alat Penelitian..........................................................................................21
D. Bahan Penelitian ......................................................................................21
E. Jalan Penelitian.........................................................................................22
1. Defatisasi simplisia..............................................................................22
2. Ekstraksi ..............................................................................................22
3. Deklorofilasi ........................................................................................22
4. Klarifikasi dan kristalisasi ...................................................................22
5. Penetapan kandungan steviosida .........................................................23
F. Analisis Data ............................................................................................24
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................25
A. Defatisasi Sampel ....................................................................................25
B. Ekstraksi .................................................................................................25
C. Deklorofilasi ............................................................................................26
D. Klarifikasi dan kristalisasi .......................................................................26
E. Penentuan respon dan factorial design ....................................................27
F. Contour plot .............................................................................................37
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................41
DAFTAR PUSTAKA...................................................................................42
LAMPIRAN .................................................................................................45
BIOGRAFI PENULIS ..................................................................................64

xii

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I Jenis percobaan ................................................................................16
Tabel II. Hasil luas bercak seri baku menggunakan program ImageJ..........29
Tabel III. Kandungan steviosida dalam kristal .............................................30
Tabel IV. Hasil Yate’s treatment kandungan steviosida dalam kristal.........32
Tabel V. Berat kristal....................................................................................34
Tabel VI. Hasil Yate’s treatment berat kristal ..............................................35

xiii

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.
Gambar 2.
Gambar 3.
Gambar 4.
Gambar 5.
Gambar 6.

Tanaman stevia ...........................................................................4
Kandungan glikosida steviol dalam stevia .................................6
Contoh dampak impurities........................................................13
KLT seri baku dan sampel ........................................................28
Kurva baku steviosida...............................................................29
Hubungan suhu pendinginan terhadap kadar steviosida dalam
kristal. .......................................................................................31
Gambar 7. Hubungan lama pendinginan terhadap kadar steviosida dalam
kristal. .......................................................................................31
Gambar 8. Hubungan suhu pendinginan terhadap berat kristal..................36
Gambar 9. Hubungan lama pendinginan terhadap berat kristal .................36
Gambar 10. Contour plot suhu dan lama pendinginan terhadap
kandungan steviosida dalam kristal ........................................38
Gambar 11. Contour plot suhu dan lama pendinginan terhadap berat
kristal.......................................................................................39
Gambar 12. Contour plot superimposed kandungan steviosida dan berat
kristal.......................................................................................40

xiv

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Surat keterangan determinasi ...................................................46
Lampiran 2. Hasil tahapan untuk memperoleh kristal steviosida.................48
Lampiran 3. Penentuan luas bercak menggunakan program ImageJ ...........49
Lampiran 4. Penentuan kandungan steviosida dalam kristal........................52
Lampiran 5. Perhitungan factorial design : kandungan steviosida dalam
kristal .......................................................................................55
Lampiran 6. Konversi berat kristal ...............................................................61
Lampiran 7. Perhitungan factorial design : berat kristal ..............................63

xv

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

BAB I
PENGANTAR

A. Latar Belakang
Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii) adalah tumbuhan herba famili
Asteraceae. Tumbuhan stevia ditemukan di Paraguay. Indonesia merupakan
salah satu produsen tanaman selain Brazil, Korea, Meksiko, USA, Tanzania
dan Kanada (Megeji, Kumar, Singh, Kaul, dan Ahuja, 2005). Stevia telah
dimanfatkan sebagai pemanis oleh masyarakat Paraguay, Jepang, Brasil,
secara tradisional dimanfaatkan sebagai terapi diabetes oleh masyarakat
Paraguay (Leung, A.Y dan Foster,S., 1996).
Daun stevia mengandung glikosida steviol meliputi steviosida,
rebaudiosida, dan dulcosida. Total kandungan glikosida bisa mencapai 10%
berat kering daun (Bruneton, J., 1999). Steviosida dan rebaudiosida
merupakan jenis glikosida steviol yang paling banyak (Gardana, Simonetti,
Canzi, Zanchi, dan

Pietta, 2003). Glikosida steviol berwujud kristal

berwarna putih atau kekuningan, berbau lemah, dan berpotensi sebagai
pemanis dengan tingkat kemanisan sampai hingga 300 kali berbanding
sukrosa (Wallin H., 2004,).
Steviosida secara organoleptik memiliki aftertaste pahit dan berasa
menthol. Fraksinasi dan isolasi glikosida steviol dari ekstrak stevia ternyata
dapat menurunkan aftertaste steviosida. Penurunan aftertaste ini karena
terdapat komponen glikosida steviol yang lain, terutama rebaudiosida yang

1

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

2

memiliki karakter rasa manis yang lebih baik sehingga menutupi aftertaste
steviosida. Sampai saat ini steviosida belum dapat dipisahkan dengan
komponen glikosida steviol yang lain, sehingga melalui isolasi glikosida
steviol dari daun stevia dapat menghasilkan kristal dengan karakter rasa
manis lebih baik dan aftertaste yang minimum (Anonim, 1986a).
Proses kristalisasi terjadi pada larutan supersaturated. Kondisi
supersaturated ini mempengaruhi tingkat kelarutan. Kristal mulai terbentuk
ketika terjadi penurunan kelarutan sehingga tingkat kelarutan sangat
mempengaruhi kristalisasi. Tingkat kelarutan suatu senyawa menurun
seiring dengan penurunan suhu dan peningkatan lama pendinginan
(Cartensen, 2001). Oleh karena itu, perlu dilakukan studi mengenai optimasi
suhu dan lama pendinginan dalam proses kristalisasi steviosida dari daun
stevia.

B. Permasalahan
Berdasarkan

latar

belakang

di

atas

dapat

dideskripsikan

permasalahan sebagai berikut :
1. Apakah faktor suhu pendinginan atau lama pendinginan yang lebih
dominan dalam proses kristalisasi steviosida dari daun tanaman stevia?
2. Apakah diperoleh kombinasi antara suhu dan lama pendinginan untuk
memperoleh kristal steviosida yang baik?

3

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

C. Keaslian Penelitian
Berdasar studi literatur yang dilakukan penulis, tidak ditemukan
penelitian tentang pengaruh suhu dan lama pendinginan dalam proses
kristalisasi steviosida dari daun tanaman Stevia Rebaudina Bertonii dengan
metode factorial design, sehingga penulis melakukan penelitian ini.

D. Manfaat
Berdasarkan latar belakang di atas, manfaat penelitian ini antara lain:
1. Manfaat teoritis
Penelitian ini dapat bermanfaat sebagai sumber informasi mengenai
kombinasi secara optimal antara suhu dan lama pendinginan dalam
proses kristalisasi steviosida.
2. Manfaat metodologis
Penelitian ini dapat dijadikan acuan untuk penelitian eksperimen proses
kristalisasi sejenis.

E. Tujuan
Berdasarkan latar belakang di atas maka tujuan penelitian ini antara
lain:
1. Untuk mengetahui faktor yang dominan di antara suhu pendingian dan
lama pendinginan dalam proses kristalisasi steviosida dari daun stevia.
2. Untuk mengetahui kombinasi yang optimum antara suhu dan lama
pendinginan

untuk

memperoleh

kristal

steviosida

yang

baik.

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA

A. Stevia

Gambar 1. Tanaman stevia (Brandle dan Rosa, 1992).
Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii) adalah herba dari Famili
Asteraceae. yang dapat tumbuh hingga mencapai 80 cm. Stevia memiliki
sinonim Eupatorium rebaudianun Bertonii atau dikenal dengan nama
sweet herb (Leung, A.Y dan Foster, S., 1996).

Stevia ditemukan di

pegunungan Amambay, Paraguay dengan lebih dari 200 varian (Elkins,
R., 1997).
Beberapa faktor yang mempengaruhi pertumbuhan stevia yaitu,
1. Air untuk irigasi, kandungan air yang terlalu banyak dapat
menginduksi kematangan prematur dan menurunkan produksi daun.
2. Suhu, stevia tumbuh dengan baik pada suhu 20 0C hingga 350C.
3. Tanah, stevia tumbuh lebih baik pada tanah yang sedikit asam.
(Rank, A.H., dan Midmore, D.J., 2006).
Stevia sangat berpotensi sebagai pemanis

karena tingkat

kemanisannya 300 kali sukrosa, dan aman bagi penderita diabetes, non
kalori, tidak mempengaruhi kadar gula darah, non toksik, menghambat

4

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

5

pembentukan plak dan caries. Stevia mengandung glikosida, protein,
serat, karbohidrat, fosfor, zat besi, kalsium, kalium, natrium, magnesium,
rutin (flavonoid), zat besi, vitamin C dan vitamin A (Elkins, R., 1997).
Stevia berpotensi sebagai pemanis karena mengandung glikosida.
Kandungan glikosida ini meningkat sesuai dengan usia tanaman dan
berkorelasi dengan ukuran dan tebal daun. Stevia dapat menghasilkan
kandungan glikosida yang tinggi ketika berada di lingkungan tropis.
Kandungan glikosida menurun drastis ketika daun mulai menguning atau
mati (Rank, A.H., dan Midmore, D.J.,2006).

B. Steviosida
Daun stevia mengandung glikosida steviol yang meliputi
steviosida, rebaudiosida, dan dulcosida (Bruneton, J., 1999). Steviosida
dan rebaudiosida merupakan jenis glikosida steviol yang paling banyak,
dengan kadar hingga 3-10% b/b dan 1% b/b terhadap berat daun kering
(Gardana, Simonetti, Canzi, Zanchi, Pietta, 2003).
Beberapa uji toksisitas memberikan hasil bahwa steviosida tidak
toksik, tidak berefek pada fertilitas, dan tidak memberikan efek teratogen
(Leung, A.Y dan Foster, S., 1996).

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

6

Gambar 2. Kandungan glikosida steviol dalam stevia
(Wallin H. , 2004).

Steviosida memiliki tingkat kemanisan hingga 300 kali bila
dibandingkan 0,4% sukrosa, 150 kali bila dibandingkan 4% sukrosa, 100
kali bila dibandingkan 10% sukrosa (Leung, A.Y dan Foster, S., 1996;
Anonim, 1986a).

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

7

Steviosida memiliki karakter sebagai berikut :
1.

Larut

dalam aquadest

dan

etanol

(Anonim,

2007),

metanol,

isopropilalkohol, piridin. Tetapi steviosida tidak larut dalam aseton,
kloroform, dan eter (Morita, Takasutki, Fujita, Kashihara, Isamura,
Yao, 1978).
2. Titik leleh 248 sampai dengan 2500C
3. Rotasi dalam metanol : [α]D25 -200 (Morita, et.al, 1978).
Berdasar sifat steviosida maka isolasi steviosida dapat dilakukan dengan
ekstraksi menggunakan pelarut aquadest dan alkanol, seperti metanol,
etanol, n-propil alkohol, dan isopropil alkohol (Morita, et al., 1978).
Steviosida stabil terhadap panas dan asam (Leung, A.Y dan
Foster, S., 1996). Steviosida stabil selama 1 jam hingga suhu 1200C, dan
terdekomposisi pada suhu 1400C. Steviosida stabil pada penyimpanan
suhu kamar dapat hingga kurun waktu 4 bulan.

Steviosida tidak

terdekomposisi pada lingkungan asam hingga pH 1 (Felicia, Neli, Mihai,
2003).

C. Defatisasi
Ekstraksi

menggunakan

soxhlet

memiliki

prinsip

sampel

ditempatkan pada chamber pengekstraksi dan pelarut dipanaskan lalu
direfluks. Pada setiap sirkulasi, sejumlah senyawa nonvolatil (lemak)
terlarut dalam pelarut. Pada akhir ekstraksi senyawa nonvolatil ini
terkonsentrasi pada beker. Waktu ekstraksi ini dapat dikurangi dengan

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

8

peningkatan temperatur. Pertama kali sampel dipanaskan, lemak terlarut
dalam pelarut, dan diikuti dengan pembersihan sampel selama tahap
pembilasan (Blum-Fretz, Baumann, Feife, 2007).
Proses ekstraksi lemak dari sampel menggunakan soxhlet
meliputi :
1. Ekstraksi : sampel ditempatkan pada pelarut yang mendidih, sampel
dan alat dipanaskan.
2. Pembilasan : katup tanki akan terbuka dan tertutup sesuai dengan
level pelarut.
3. Pengeringan : solven pelarut diuapkan dan ditempatkan di refluks,
sehingga pelarut mengembun dan dapat digunakan lagi.
4. Setelah ekstraksi berakhir, beker yang mengandung ekstrak kemudian
dipisahkan dan dipekatkan
Soxletasi ini umum digunakan untuk mengekstraksi lemak dari sampel
(Blunm-Frenz, et al., 2007).

D. Maserasi
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Penyarian
adalah kegiatan penarikan zat

yang dapat larut dengan pelarut cair.

Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif
yang mudah larut dalam cairan penyari, dan tidak mengandung zat yang
mudah mengembang dalam cairan penyari. Cairan penyari yang digunakan
dapat berupa air, etanol, air-etanol atau pelarut lain (Anonim, 1986b).

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

9

Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara
pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah
diusahakan. Kerugian cara maserasi adalah pengerjaannya lama dan
penyarian yang kurang sempurna (Anonim, 1986b).
Ekstrak

adalah

sediaan

pekat

yang

diperoleh

dengan

mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani
menggunakan plarut yang sesuai. Ekstrak cair adalah sediaan cair simplisia
nabati yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet
atau sebagai pelarut dan pengawet (Anonim, 1995).

E. Elektrokoagulasi
Elektrokoagulasi adalah cara untuk mengkoagulasi bahan koloidal
dalam suatu larutan dengan bantuan Al3+ dan Fe3+ sebagai koagulan,
dengan bantuan induksi elektrokimia pada elektrode (Mechelhoff, Kelsall,
Graham, 2008). Jika larutan mengandung ion logam maka ion logam akan
direduksi menjadi logamnya dan terdapat pada batang katoda. Dari reaksi
tersebut, pada anoda akan dihasilkan gas, buih dan flok Al(OH)3.
Selanjutnya flok yang terbentuk akan mengikat logam yang ada di dalam
larutan, sehingga flok akan memiliki kecenderungan mengendap (Sunardi,
2007). Pada proses elektrokoagulasi terjadi reaksi berikut :
1. Anoda (oksidasi) : Al ↔ Al3+ + 3e2. Katoda (reduksi) : 2 H2O + 2e- ↔ 2OH- + H2
3. Al (s) + 3H2 ↔ Al(OH)3 (s) + 1,5 H2

(AR, Rahmani, 2008).

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

10

F. Kristalisasi
Padatan dapat dibagi menjadi kristal dan amorf (Cartensen,
J.T, 1998). Amorf adalah padatan terbentuk dari molekul yang tidak
memiliki orientasi lokasi dan pergerakan yang random sehingga yang
kurang stabil (energi) dibandingkan kristal (Cartensen, J.T, 2001). Amorf
bersifat anisotropik karena memiliki sifat mekanik, elektrik, magnetik, dan
optik yang bervariasi (Mullin, J.W, 2001). Kristal terbentuk dari molekul
yang tertata sehingga lebih stabil (Cartensen, J.T, 2001). Berbeda dengan
amorf kristal bersifat isotropik karena memiliki sifat yang seragam
(Mullin, J.W, 2001).
Kristal terbentuk karena transformasi fase yaitu:
1. Perubahan fase cair ke padat-kristal terbentuk dari pelelehan atau
larutan.
2. Perubahan dari fase gas ke padat-kristalisasi terjadi melalui sublimasi
3. Perubahan dari fase padat ke fase padat lain, disertai dengan perubahan
bentuk kristal. Fenomena ini disebut rekristalisasi (Flint, Y., 1986).
Pada pembentukan terjadi transformasi senyawa dari fase cair ke
fase padat. Pada umumnya fase cair bersifat isotropik, tetapi pada
transformasi fase cair ke kristal terdapat fase antara yang disebut fase
mesomorf, yaitu fase di mana larutan bersiat anisotropik yang disebut kristal
cair (Mullin, J.W, 2001).
Proses pembentukan kristal terjadi ketika larutan dalam kondisi
supersaturated

dan

supercooling

(Mullin,

J.W,

2001).

Kondisi

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

11

supersaturated dapat tercapai dengan penguapan pelarut dan penurunan
suhu, sehingga menurunkan kelarutan suatu senyawa (Flint, Y., 1986).
Hubungan antara suhu dan kelarutan dinyatakan melalui persamaan van’t
ln( x) =
Hoff :
keterangan

ΔH f ⎡ 1 1 ⎤
−
R ⎢⎣ Tf T ⎥⎦

(1)

x

: fraksi mol zat terlarut dalam pelarut

T

: suhu larutan (K)

Tf

: suhu fusi atau titik lebur solute (K)

∆Hf

: entalpi fusi dari solute (J/mol)

R

: konstanta gas (8,314 J/mol.K) (Mullin, J.W, 2001).

Proses kristalisasi juga dipengaruhi oleh lama pendinginan
sehingga terdapat waktu optimum dalam proses kristalisasi senyawa
tertentu. Proses pendinginan untuk memperoleh kristal dimulai pada saat
suhu konstan dan berakhir dalam waktu tertentu. Dengan demikian dapat
diketahui bahwa suhu dan

lama pendinginan berpengaruh proses

kristalisasi (Flint, Y., 1986).
Sebelum kristal terbentuk, dalam larutan harus terdapat sejumlah
badan padat atau nukleus yang menjadi pusat pengristalan. Nukleasi dapat
terbentuk secara spontan maupun diinduksi. Nukleasi dapat diinduksi
dengan pengadukan, shok mekanik, friksi, maupun tekanan ekstrim.

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

12

Sampai saat ini nukleasi dapat dibedakan menjadi:
1. Primer
a. Homogen (spontan)
b. Heterogen (diinduksi dengan partikel asing)
2. Sekunder (diinduksi dengan kristal)

(Mullin, J.W, 2001).

Nukleasi dapat terjadi ketika larutan berada pada kondisi
supersaturated dengan ∆G rendah. ∆G didefinisikan sebagai energi yang
dibutuhkan 1 mol senyawa untuk berpindah dari kondisi supersaturated
dengan konsentrasi C ke kondisi saturated.
ΔG = − RT ln[C / S ] = − RT ln[q ]

keterangan :

(2)

R : konstanta gas (8,314 J/mol.K)
T : suhu absolut (K)
C/S = q : rasio supersaturated

S menunjukkan konsentrasi larutan yang setimbang dengan fase padat,
sehingga persamaan di atas menunjukkan energi yang ditransfer oleh 1 mol
senyawa dari larutan ke fase kristal (Cartensen, J.T, 2001).
Setelah nukleasi, terjadi pertumbuhan kristal. Pertumbuhan
kristal ini merupakan proses peningkatan ukuran kristal. Kristal dapat
tumbuh melalui penempelan senyawa dengan sifat yang sama karena
penurunan energi permukaan pada nukleus, adsorbsi, pembentukan lapisan
(Mullin, J.W, 2001).

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

13

Pembentukan kristal juga dipengaruhi oleh impurities.
Impurities ini dapat mempengaruhi proses nukleasi maupun pertumbuhan
kristal. Pada proses nukleasi peningkatan jumlah impurities dapat
meningkatkan pembentukan lapisan koloidal sehingga menghambat proses
nukleasi. Jika impurities berupa senyawa yang larut maka dapat
menyebabkan perubahan kesetimbangan kelarutan, sedang jika impurities
berupa senyawa tak larut maka efek yang terjadi tidak dapat diprediksi
(Mullin, J.W, 2001).
Pada proses pertumbuhan kristal impurities menyebabkan
pertumbuhan paralel dan twinning atau macle. Pertumbuhan paralel dan
twinning dapat terlihat pada produk akhir kristal. Pertumbuhan paralel
terjadi ketika terjadi pertumbuhan kristal yang tidak normal secara
vertikal, sedang twinning atau macle terjadi secara horisontal (Mullin, J.W,
2001).

(a)

(b)

Gambar 3. Contoh dampak impurities (a) pertumbuhan paralel
(b) twinning atau macle

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

14

G. Kromatogafi Lapis Tipis
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan tipe kromatografi
planar. KLT ini mengidentifikasi senyawa berdasar kemampuan migrasi
yang dideskripsikan dalam nilai Rf (retardation factor).
Rf = jarak elusi sampel .
jarak elusi fase gerak

(3)

Nilai Rf dapat bervariasi dari 0 hingga 1, atau dari 0 hingga 100 jika
dikalikan dengan 100 disebut hRf (Sherma, J. dan Fried, B., 1996).
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap
berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30µm. Fase gerak
merupakan campuran pelarut yang murni sehingga memiliki daya elusi
sehingga nilai Rf antara 0,2-0,8 (Gandjar, I.G, dan Rohman, A., 2007).
Migrasi fase gerak pada lapisan fase gerak disebabkan gaya kapiler dan
kecepatan fase gerak yang menurun sesuai dengan peningkatan jarak elusi
(Sherma, J., dan Fried, B., 1996).
Deteksi senyawa pada plat KLT dapat secara fisika, kimia,
maupun biologi. Deteksi secara kimia menggunakan pereaksi semprot
iodin untuk identifikasi beberapa senyawa organik dengan memberikan
warna coklat (Gandjar, I.G, dan Rohman, A., 2007), sedangkan vanilinasam sulfat digunakan untuk mendeteksi senyawa organik yang
mengandung alkohol dan keton dengan memberikan warna hitam setelah
dilakukan pemanasan (Gritter, Bobbit, Schwarting, 1991; Gandjar, I.G,
dan Rohman, A., 2007).

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

15

KLT dapat digunakan untuk identifikasi kualitatif dan
kuantitatif. Parameter KLT yang digunakan untuk identifikasi kualitatif
adalah nilai Rf. Analisis kuantitatif dengan KLT dapat dilakukan dengan 2
cara, yaitu dengan pengukuran luas bercak dan dengan pengerokan bercak
lalu menetapkan kadar senyawa dalam bercak dengan metode lain
(Gandjar, I.G, dan Rohman, A., 2007). Pengukuran luas bercak dapat
dilakukan secara visual maupun dengan bantuan alat. Luas bercak
meningkat seiring dengan peningkatan jumlah senyawa. Pengukuran luas
bercak ini dilakukan pada bercak sampel dan standar pada plat yang sama
untuk mengurangi sistematik eror (Stahl, E., 1969).
Steviosida dapat diidentifikasi dengan KLT menggunakan fase
gerak kloroform : metanol : aquadest (30:20:4). Fase diam yang digunakan
ialah Silica gel 60F254, dengan ketebalan lapisan fase diam 0,25 mm.
Metode elusi untuk steviosida adalah dengan teknik asending (Morita, et
al., 1986).

H. ImageJ
ImageJ merupakan program yang dikembangkan oleh National
Institutes of Health (NIH) yang digunakan untuk menganalisis gambar.
Program ImageJ dapat digunakan untuk menganalisis jarak antar partikel,
skala pengukuran, mengukur area, dan mengelompokkan partikel
(Reinking, L., 2001). Dengan demikian program ImageJ ini dapat
digunakan untuk mengukur luas bercak pada KLT, dan dapat digunakan

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

16

untuk menghitung kadar senyawa pada bercak (Furutani, Itoh, Ijuin,
Tsujita, Takenawa, 2006). Aplikasi ImageJ telah dilakukan oleh Bart, et.al
(2007) pada analisis semikuantitatif lipid dengan menganalisis area bercak
hasil KLT.

I. Factorial Design
Factorial design digunakan untuk menjelaskan pengaruh efek
dari faktor yang berbeda, atau kondisi terhadap respon yang dihasilkan
(Bolton S. , 1990). Factorial design dapat digunakan untuk mengontrol
dua

atau lebih variabel bebas dan mendeterminasikan efek pada tiap

variabel tersebut. Oleh karena itu, desain penelitian dengan factorial
design harus memiliki dua atau lebih variabel bebas pada satu waktu dan
efek terhadap variabel tergantung yang sama (De Muth, J. E., 1999).
Level ialah nilai dari masing-masing faktor. Berikut ini
merupakan desain percobaan untuk factorial design dua faktor (22) :

Simbol
1
a
b
ab

Prosedur

optimasi

Tabel I. Jenis percobaan
Faktor a
Faktor b
Level rendah Level rendah
Level tinggi Level rendah
Level rendah Level tinggi
Level tinggi
Level tinggi

dapat

diperoleh

melalui

persamaan

yang

mendeskripsikan hasil percobaan sebagai fungsi level faktor. Persamaan
polinomial dapat disusun jika terdapat hubungan antara faktor dan hasil

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

17

percobaan. Persamaan factorial design yang digunakan untuk menganalisis
percobaan faktorial 22 adalah :
Y = βo + β1.X1 + β2.X2 + β12.X1.X2

(4)

Keterangan :
Y : respon yang diukur
Xi : level faktor
βi : koefisien faktor yang diperoleh dari respon desain formulasi
βo : intersep

(Bolton S., 1990).

Factorial design memungkinkan kontrol variabel-variabel bebas,
dan mendeterminasikan efek masing-masing variabel bebas terhadap
variabel tergantung. Keuntungan utama dari factorial design adalah dapat
digunakan untuk mengevaluasi efek lebih dari satu variabel, kedua
variabel secara terpisah, dan kombinasi dari keduanya (De Muth, J. E. ,
1999).

J. Landasan Teori
Stevia merupakan salah satu tumbuhan yang berpotensi sebagai
pemanis pengganti gula karena kandungan glikosida steviol dalam Stevia,
terutama steviosida yang memiliki tingkat kemanisan hingga 300 kali
dibanding gula. Kristal steviosida dapat diperoleh melalui kristalisasi. Prinsip
dari pembentukan kristal adalah terjadi perubahan fase ke fase padat.
Salah satu cara kristalisasi adalah melalui pendinginan larutan.
Kristalisasi dengan proses pendinginan ini dipengaruhi oleh suhu dan lama

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

18

pendinginan. Kristalisasi dengan proses pendinginan berdasar perubahan fase
cair menjadi fase padat sehingga proses ini terjadi ketika senyawa menjadi
tidak larut. Suhu pendinginan ini mempengaruhi tingkat kelarutan steviosida.
Tingkat kelarutan steviosida menurun seiring dengan penurunan suhu. Lama
pendinginan juga mempengaruhi proses kristalisasi steviosida karena terdapat
range waktu kristalisasi terjadi. Dengan demikian perlu dilakukan penelitian
tentang kondisi pendinginan yaitu suhu dan lama pendinginan yang optimum
dalam proses kristalisasi steviosida dari daun stevia.
Respon berat kristal dan kandungan steviosida dalam kristal yang
diperoleh dianalisis menggunakan Yate’s treatment untuk mengetahui
pengaruh suhu dan lama pendinginan terhadap respon. Kombinasi suhu dan
lama pendinginan untuk menghasilkan kristal steviosida dengan respon
optimum diperoleh melalui contour plot superimposed

menggunakan

persamaan factorial design yang diperoleh.

K. Hipotesis
1. Hipotesis 1 :

Ada faktor utama penentu berat kristal dan kandungan
steviosida dalam kristal.

2. Hipotesis 2 :

Kristal dengan kandungan steviosida dan berat kristal
yang

optimum

superimposed.

diperoleh

melalui

contour

plot

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

BAB III
METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental dengan metode factorial
design.

B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah suhu (2 dan 140C) dan
lama pendinginan (12 dan 24 jam).
b. Variabel tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah berat kristal dan
kandungan steviosida dalam kristal.
c. Variabel terkendali
Variabel terkendali dalam penelitian ini adalah :
1) Simplisia yang digunakan ialah Stevia rebaudiana Bertonii
berumur 4 bulan, dari Tawangmangu, Jawa Tengah.
2) Suhu defatisasi, dikendalikan dengan suhu 55-66oC.
3) pH pada tahap klarifikasi dan kristalisasi
4) Jumlah kaolin yang ditambahkan yaitu 3% b/v.
5) Volume eter untuk ekstraksi, yaitu 70 ml (3 tahap).

19

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

20

d. Variabel tak terkendali
Variabel tak terkendali dalam penelitian ini adalah :
1) Cara penanaman dan pemeliharaan, yaitu penyiraman,
pemupukan, dan penyiangan.
2) Cara pembuatan simplisia, yaitu kondisi dan cara pengeringan
simplisia.
3) Viskositas larutan
4) Kandungan impurities dalam larutan sampel.

2. Definisi operasional
a. Suhu pendinginan adalah suhu yang digunakan dalam proses
kristalisasi steviosida yaitu 20C dan 140C
b. Lama pendinginan adalah waktu yang digunakan dalam proses
kristalisasi steviosida yaitu 12 jam dan 24 jam.
c. Kristal steviosida adalah kristal yang terbentuk dari daun stevia
dengan perlakuan suhu (2 0C dan 140C) dan lama pendinginan (12
jam dan 24 jam).
d. Berat kristal adalah berat kristal yang terbentuk dengan perlakuan
suhu (2 0C dan 140C) dan lama pendinginan (12 jam dan 24 jam),
dihitung terhadap berat serbuk daun stevia dan dinyatakan dalam
satuan %b/b.
e. Kandungan steviosida adalah kandungan steviosida dalam kristal
yang terbentuk dengan perlakuan suhu (20C dan 140C) dan lama

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

21

pendinginan (12 jam dan 24 jam), dihitung terhadap berat kristal
dan dinyatakan dalam satuan %b/b.
f.

Steviosida yang dimaksud adalah senyawa yang setara dengan
Steviosida p.a (Sigma-Stevioside 53572, 037K47152).

g. Kristal steviosida yang optimum adalah kristal dengan berat kristal
melebihi 1,2% terhadap serbuk daun stevia, dengan kandungan
steviosida dalam kristal melebihi 80%.

C. Alat Penelitian
Alat soxhletasi, Vacuum Rotary Evaporator (IKAVA® VC 2
RV 05-ST), timbangan analitik (ScalTec SB22), oven, corong pisah,
water bath, pipet tetes, dan alat-alat gelas yang lain.

D. Bahan Penelitian
Simplisia stevia dari B2P2TO2T (Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional), Tawangmangu,
Jawa Tengah, Steviosida p.a (Sigma-Stevioside 53572, 037K47152),
heksan, etanol 96%, TLC Aluminium Sheets 20×20cm Kieselgel G F254,
methanol p.a (E. Merck), kloroform p.a (E. Merck), aquabides, aquadest,
eter, kalsium oksida, kaolin, asam sitrat, pereaksi semprot iodin, pereaksi
semprot vanilin asam sulfat.

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

22

E. Jalan Penelitian
1. Defatisasi simplisia
Simplisia dibersihkan dari tanah dan pengotor lalu
dikeringkan dan diserbuk. 50 g serbuk simplisia kemudian
disoxhletasi dengan pelarut heksan. Soxhletasi dilakukan 2 kali
sirkulasi selama 2 x 8 jam. Residu sampel siap diekstraksi.

2. Ekstraksi
Serbuk hasil defatisasi ditimbang sebanyak 512 g,
kemudian ditambahkan pelarut etanol 96% : aquadest (1:1) 12,8 L
dan dilakukan maserasi selama 6 jam.

3. Deklorofilasi
Maserat dideklorofilasi mengggunakan elektrokoagulasi,
dengan perlakuan voltase 32 Volt, suhu 500C, jarak elektroda 1,5cm.

4. Klarifikasi dan kristalisasi
Ekstrak hasil deklorofilasi diatur hingga pH 3 dengan asam
sitrat. Ekstrak kemudian diklarifikasi menggunakan kaolin 3% b/v
dan disaring. Ekstrak hasil klarifikasi diatur hingga pH 10,5 dengan
CaO. Larutan disaring dan diatur hingga pH 7 dengan asam sitrat.
Filtrat diekstraksi menggunakan eter (3 tahap, masing-masing 70 ml
eter). Fase aquadest diambil dan dipekatkan hingga volume 200 ml.

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

23

Larutan sampel yang sudah pekat kemudian dibagi menjadi 8
masing-masing 25 ml dan didinginkan hingga terbentuk kristal.
Setiap larutan dikenai perlakuan pendinginan dengan suhu 20C dan
140C, selama 12 jam dan 24 jam. Kristal yang terbentuk kemudian
dikeringkan pada suhu 80 hingga 900C hingga bobot tetap dan
dilakukan penetapan kadar steviosida dalam kristal.

5. Penetapan kandungan steviosida
Penetapan kandungan steviosida menggunakan Kromatografi Lapis
Tipis (KLT), dengan
Fase diam

: TLC Aluminium Sheets 20×20cm Kieselgel G F254

Fase gerak

: kloroform : metanol: aquabides (30:20:4)

Deteksi

: semprot iodin, kemudian semprot vanilin-asam
sulfat dan dipanaskan hingga terbentuk bercak
hitam.

a. Kurva Baku
Larutan standar steviosida 1 mg/ml dalam aquabides.
Larutan standar kemudian ditotolkan pada fase diam dengan
volume 2,4,6,8,10,14 µl, lalu dikembangkan bersamaan dengan
sampel. Analisis luas bercak dilakukan dengan program ImageJ
kemudian dilakuan penentuan persamaan kurva baku.

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

24

b. Preparasi sampel
Preparasi sampel dilakukan dengan menimbang 10 mg
kristal yang terbentuk kemudian dilarutkan dengan aquabidest
hingga volume 10 ml.

Masing-masing sampel ditotolkan

sebanyak 8µl pada fase diam, lalu dikembangkan. Analisis AUC
bercak dilakukan dengan program ImageJ kemudian penentuan
kandungan steviosida dengan persamaan kurva baku.

F. Analisis Data
Analisis data dilakukan untuk mengetahui faktor yang
mempengaruhi respon serta kondisi proses kristalisasi steviosida dari
daun stevia untuk memperoleh respon optimum. Faktor yang dimaksud
adalah suhu dan lama pendinginan. Respon yang diperoleh yaitu berat
kristal dan kandungan steviosida dianalisis dengan Yate’s treatment
untuk mengetahui faktor yang mempengaruhi respon.
Persamaan faktorial dua faktor yaitu Y = βo + β1.X1 + β2.X2 +
β12.X1.X2 diperoleh pada masing-masing respon. Persamaan ini dibuat
contour plot untuk mengetahui kombinasi faktor dengan respon yang
diinginkan yaitu kandungan steviosida terbesar dan kristal yang terberat.
Contour plot kedua respon digabung untuk memperoleh contour plot
superimposed. Daerah yang gabungan pada contour plot superimposed
menunjukkan kondisi suhu dan lama pendinginan
karakter kristal steviosida yang baik.

optimum dengan

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Defatisasi Simplisia
Simplisia yang digunakan ialah daun stevia (Stevia Rebaudiana Bertonii)
berasal dari B2P2TO2T (Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman
Obat dan Obat Tradisional), Tawangmangu, Jawa Tengah. Simplisia ini telah
dideterminasi oleh B2P2TO2T (Lampiran 1). Simplisia ini kemudian disortir
untuk memisahkan pengotor dan batang, dikeringkan dan diserbuk. Setelah
diserbuk, simplisia didefatisasi dengan soxhletasi. Defatisasi dilakukan untuk
menghilangkan senyawa non polar (lemak) karena lemak ini dapat menganggu
proses kristalisasi. Defatisasi ini menggunakan pelarut heksan karena merupakan
pelarut sangat non polar dengan polaritas 0,1 (Gandjar, 2007) sehingga
diharapkan semua senyawa non polar dapat dipisahkan.

B. Ekstraksi
Ekstraksi dilakukan untuk menarik steviosida dari daun stevia. Pemilihan
pelarut aquadest dan etanol karena steviosida sangat larut dalam aquadest dan
etanol (Anonim, 2007). Etanol 96% juga dapat meminimalkan perkembangan
mikroba sesuai dengan ketentuan Farmakope Indonesia edisi IV di mana ekstraksi
menggunakan pelarut aquadest dan etanol. Komposisi pelarut yang digunakan
adalah aquadest : etanol 96% (1:1) dengan volume 100 ml dan suhu 500C.

25

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

26

C. Deklorofilasi
Deklorofilasi bertujuan untuk menghilangkan klorofil sehingga gangguan
kristalisasi berkurang dan meningkatkan acceptabilitas kristal yang terbentuk.
Deklorofilasi dilakukan menggunakan elektrokoagulasi dengan voltase 32 cm,
jarak elektrode 1,5 cm, dan suhu 50 0C. Elektrokoagulasi bekerja dengan
mengkoagulasi bahan koloidal seperti klorofil dalam suatu larutan dengan bantuan
Al3+ sebagai koagulan. Pada proses ini terjadi reduksi H2O dan oksidasi logam
aluminium menghasilkan gas, buih dan flok logam hidroksida yaitu Al(OH)3.
Selain itu, selama proses ini logam Mg2+ di dalam klorofil tereduksi menjadi
logam Mg0 (Sunardi, 2007). Flok Al(OH)3 memiliki daya adsorbsi yang kuat
terhadap

logam

sehingga

logam

Mg

(magnesium)

Teradsorbsinya magnesium ini mengakibatkan klorofil

akan

teradsorbsi.

mengendap bersama

dengan AlOH3 sehingga mudah dipisahkan dari maserat.

D. Klarifikasi dan Kristalisasi
Pada tahap ini dilakukan klarifikasi dengan penambahan asam sitrat
hingga pH larutan menjadi 3. Pada pH 3 ini asam sitrat dapat berfungsi sebagai
agen pengkelat logam, protein dan agen pewarna, sehingga senyawa yang tidak
bisa dihilangkan pada tahap deklorofilasi dapat berkurang.
Ekstrak kemudian difiltrasi menggunakan kaolin. Kaolin dipilih karena
merupakan agen pengabsorbsi dye yang kuat karena memiliki banyak pori dan
kerja kaolin sebagai decoloring agent optimum pada pH 3 (Asmatulu, 2002).
Kaolin bekerja dengan menjerap dye pada pori-pori dalam serbuk kaolin.

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

27

Setelah filtrasi dengan kaolin, filtrat ditambahkan CaO. CaO dapat
mengurangi impurities yang bersifat basa dengan mengikat senyawa basa pada
permukaan CaO sehingga senyawa basa teradsorbsi di permukaaan CaO. CaO ini
tidak larut air sehingga mudah mengendap dan dapat dipisahkan. Setelah
penambahan CaO dilakukan ekstraksi dengan eter untuk senyawa non polar yang
belum dapat dipisahkan pada proses sebelumnya. Ekstraksi ini merupakan tahap
terakhir proses klarifikasi.
Fase aquadest hasil ekstraksi kemudian diambil dan diberi perlakuan
suhu dan lama pendinginan untuk proses kristalisasi. Suhu yang digunakan adalah
20C dan 140C sedang lama pendinginan yang digunakan 12 dan 24 jam. Perlakuan
suhu dan lama pendinginan ini dipilih berdasar penelitian Kumar, S. (1986)
sehingga suhu dan lama pendinginan tersebut merupakan kondisi pembentukan
kristal steviosida.

E. Penentuan Respon dan Factorial Design
Respon yang diukur adalah berat kristal yang diperoleh dan kandungan
steviosida dalam kristal.
1. Kandungan steviosida dalam kristal
Kandungan steviosida diperoleh melalui pengukuran luas bercak hasil
KLT (gambar 4) yang diolah menggunakan program ImageJ. Bercak kurva
baku dan sampel dilakukan pada satu lempeng untuk mengendalikan faktor
yang mempengaruhi elusidasi pada plat KLT. Luas bercak tiap totolan pada
kurva baku diukur untuk menentukan persamaan kurva baku (Tabel II).

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI

28

Rf
1,00

0,50

2

4

6 8 10
seri baku

12 14

11

12 b1 b2 a1 a2 ab1 ab2
sampel

0,00

Gambar 4. KLT seri baku dan sampel
Keterangan :
Fase diam : TLC Aluminium Sheets 20×20cm Silica gel GF254
Fase gerak : kloroform : metanol: aquabides (30:20:4)
Deteksi
: sem