Pengendalian Biofilm Streptococcus agalactiae pada Permukaan Sisik Ikan dan Plastik PVC dengan Senyawa Antibakteri Bakteri Asam Laktat Perairan Tawar

Lampiran 1. Diagram Alir Penelitian

Sampel air kolam, usus ikan nila
dan endapan air kolam ikan.

Str
Seleksi BAL potensial
(uji antagonis)

Isolasi dan Karakteristik
Bakteri Asam Laktat

Isolat Potensial

Pembentukan

pada berbag
(plastik
Identifikasi Isolat Terpilih

dan

pengamatan h

Isolat Bakteri
Asam Laktat murni

Produksi Senyawa Antibakteri

Pengendalian Biofilm S. agalactiae
tertua pada permukaan plastik dan
sisik ikan oleh senyawa antibakteri
potensial 100% pada pengamatan
waktu kontak 60 menit

Universitas Sumatera Utara

Karakterisa
Karakteristi
Karakteristi

Lampiran 2.

Bagan Alir Isolasi Bakteri Asam Laktat

Air Kolam

10 ml air kolam diencerkan pada
pengenceran 10-4 hingga 10-8 CFU/mL
dengan PBS
diambil 0.1 mL dari pengenceran 10-4
hingga 10-8 CFU/mL
diinkubasi suhu 30oC selama 24-48
jam
dimurnikan pada media MRSA dengan
metode kuadran gores setiap koloni
dengan morfologi yang berbeda,
diinkubasi pada suhu 30oC selama 2448 jam

Kultur aktif

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 3. Bagan Alir Seleksi BAL Potensial Terhadap S.agalactiae

Kultur uji S. agalactiae
Gigi
usia 24 jam

1-2 ose dibuat suspensi cair dalam 9 mL akuades steril
diukur kekeruhannya dengan spektrofotometer hingga OD
= 0,5 pada panjang gelombang 600 nm
dicelupkan cotton bud steril dalam suspensi dan diusapkan
pada media MHA telah mengeras
ditotolkan 1 ujung tumpul tusuk gigi steril kultur 24 jam
kandidat BAL
diinkubasi 24-48 jam pada suhu 28oC
.
Zona bening
disekitar cakram

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 4. Bagan Alir Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Air Kolam

Identifikasi
BAL
- ditumbuhkan pada media NB
- diinkubasi pada suhu 30 oC selama 24 jam

Uji Morfologi

Pewarnaan Gram

- membuat preparat ulas
isolat
- difiksasi di atas Bunsen
- ditetesi dengan kristal
ungu
- diamkan selama 1 menit
- dicuci

dengan
air
mengali
- ditetesi dengan safranin
- diamkan selama 30 detik
- dicuci kembali dengan
air mengalir
- preparat dikeringkan
- diamati
dibawah
mikroskop
-

diamati bentuk koloni
diamati tepi koloni
diamati elevasi koloni
diamati warna koloni

Uji (+) sel berwarna ungu
terhadap kandidat genus BAL

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 5. Bagan Alir Kurva Pertumbuhan BAL Potensial

L. plantarum

diinokulasikan sebanyak 10 ose kedalam 50
ml NB
diinkubasi pada suhu 30oC
diukur
kekeruhannya
dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang
600 nm
dilakukan perhitungan berulang
rentang 3 jam selama 24 jam

setiap

Kurva OD terhadap
rentang waktu 3 jam

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 6. Bagan Alir Pembentukan Sel Biofilm S. agalactiae pada
Permukaan Sisik dan Plastik

Lempeng Permukaan Padat
dibentuk masing-masing seluas 1 cm2
dicuci dengan detergen selama 15 menit.pada bak sonikator,
kemudian bilas dengan akuades steril
disterilkan dengan autoklaf 121oC.
dimasukkan media NB sebanyak 50 mL menumbuhkan
hingga 108 CFU/mL isolat S. agalactiae di dalam botol uji
dimasukkan lempeng padat pada masing-masing botol.
digoyang pada kecepatan 120 rpm pada suhu 30oC selama
1, 3 dan 5 hari.
dibilas 3x dengan akuades steril sebanyak 10 mL untuk
masing-masing jenis lempeng.

dimasukkan ke dalam 9 mL NaCl 0.9 % dan 0.5 g serbuk
kaca (glass bead).
divortek selama 2 menit untuk melepas biofilm tersisa
dilakukan pengenceran berseri
dari tiap pengenceran berseri disebar 1 mL dari pada media
PCA
diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam
dihitung jumlah koloni yang tumbuh

Biofilm

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 7. Produksi Senyawa Antibakteri BAL

Kultur AK5

diinokulasikan sebanyak
kedalam 50 mL NB

10

ose

diinkubasi pada suhu 30 oC selama 15
jam
dipipet sebanyak 10 mL ke dalam
masing-masing tabung sentrifugasi
disentrifugasi 10.000 rpm pada suhu
4oC selama 15 menit
dipipet supernatan yang terpisah
dengan peletnya ke dalam botol steril
disimpan pada suhu 4oC dan botol tidak
tembus cahaya jika tidak langsung
digunakan

Senyawa antibakteri BAL

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 8. Bagan Alir Pengendalian Biofilm S. agalactiae
Lempeng Biofilm

dipreparasi berdasarkan jumlah
berdasarkan perlakuan sebelumnya

sel

tertinggi

dibilas 3x dengan akuades steril untuk melepas sel
planktonik
dimasukkan dalam masing-masing tabung steril,
ditambahkan 9 mL formulasi 100% senyawa
antibakteri BAL digoyang pada kecepatan 120 rpm.
dibilas 3x dengan akuades steril untuk melepas
planktonik yang masih tersisa
dimasukkan ke dalam 9 mL NaCl 0.9 % dan 0.5 g
serbuk kaca (glass bead).
divortek selama 2 menit untuk melepas biofilm

tersisa
dilakukan pengenceran berseri
dari tiap pengenceran berseri disebar 1 mL dari pada
media PCA
diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam
dihitung jumlah koloni yang tumbuh
Jumlah sel biofilm
yang tersisa

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 9. Bagan Alir Aktivitas Senyawa Anti Bakteri terhadap pH

Senyawa Antibakteri
Ekstrak Kasar BAL AK 5
555GB55%555%5%
dipipet 2 mL kedalam tabung reaksi
diatur pH dengan menambahkan HCl 0,1 N
dan NaOH 0,1N secara terpisah sehingga
mencapai variasi pH 2, 4, 6, 8, 10 dan 12
dipipet sebanyak 15 µ l suspensi pada kertas
cakram steril
diamati sensitifitasnya dengan metode
cakram terhadap bakteri uji S. agalactiae
.
Zona hambat

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 10 . Bagan Alir Aktivitas Senyawa Anti Bakteri terhadap Suhu

Senyawa Antibakteri
Ekstrak Kasar BAL AK 5

dipipet 2 ml kedalam tabung reaksi
di inkubasi pada inkubator termofil suhu
280C, 40 0C, 60 0C, 80 0C selama 15 menit.
dipipet sebanyak 15 µ l suspensi pada kertas
cakram steril
diamati sensitifitasnya dengan metode
cakram terhadap bakteri uji S. agalactiae
Zona hambat

.

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 11. Bagan Alir Aktivitas Senyawa Antibakteri terhadap Surfaktan

Senyawa Antibakteri
Ekstrak Kasar BAL AK 5

dipipet 1 mL kedalam tabung reaksi
dipipet 0,1 mL surfaktan EDTA dan Tween
80 masing-masing tabung reaksi
dipipet sebanyak 15 µ l suspensi pada kertas
cakram steril
diamati sensitifitasnya dengan metode
cakram terhadap bakteri uji S. agalactiae
Zona hambat

.

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 12. Foto Bahan Penelitian

Glassbeads (manik-manik
kaca)
Isolat S. agalactiae

Lempeng sisik ikan

Lempeng plastik PVC

Universitas Sumatera Utara