Deteksi dan Analisis Ekspresi Transgen (PhGH) Pada Ikan Lele Dumbo (Clarias gariepinus) Transgenik F3

52

Lampiran. 1. Alat dan Bahan Penelitian

Tube racks

Microtubes

Micropipette

Microtips

Vortex

Mesin PCR (Thermal cycler)

Centrifuge

Elektroforesis

53

Lampiran 1. Lanjutan

Komputer

Freezer

Cetakan agar

Chiller on ice (IsoFreeze)

GelDoc (UV Transilluminator)

Qubit 2.0 fluorometri (invitrogen)

Hot Plate

Chiller template (IsoFreeze)

54

Lampiran 1. Lanjutan

Embrio

Larva

kit ekstraksi DNA

Qubit dsDNA HS Assay Kit

kit ekstraksi RNA (Tri Reagent)

Kit sintesis DNA

TAE Buffer

Agarose

55

Lampiran 2. Dokumentasi Kegiatan Penelitian

Proses pengambilan sampel embrio dan larva (collecting sample)

Proses Ekstraksi DNA dan RNA

Proses pencampuran sampel dengan reagent menggunakan vortex

Proses sentrifugasi sampel

56

Lampiran 2. Lanjutan

Cek konsentrasi genom

Amplifikasi DNA melalui PCR

Proses elektroforesis

Prose visualisasi UV Transilluminator

57

Lampiran 3. Perhitungan volume reagent dan amplifikasi PCR
Perhitungan volume reagent PCR
Bahan

Volume

Volume

(Reagent)

(µL)

(µL)

Nuklease Free Water (NFW)

3,5 µL x 15

52,5 µL

Master Mix

12,5 µL x 15

187,5 µL

Primer Forward

2 µL x 15

30 µL

Primer Reverse

2 µL x 15

30 µL

Total

300 µL / 15 = 20 µL

Template (Sampel)

@5 µL
Total volume

25 µL/ sampel

Tahapan amplifikasi PCR
Tahapan

Suhu

Waktu

Jumlah Siklus

(oC)
Pre Denaturation

95

3 menit

1 kali

Denaturation

94

30 detik

35 kali

Annealing

55

1 menit

35 kali

Extension

72

1 menit

35 kali

Final PCR

72

10 menit

1 kali

58

Lampiran 4. Data konsentrasi genom DNA embrio dan larva Transgenik F3
Konsentrasi DNA Genom Embrio

No

1

2

3

Sampel

Ulangan

Konsentrasi

Rata-

(ng/mL)

rata

1

1570

Embrio 1

2

1490

4749 (+) x

3

1490

1221 (+)

4

1470

5

1450

1

3800

Embrio 2

2

3770

4836 (+) x

3

3720

4458 (+)

4

3640

5

3650

1

1700

Embrio 3

2

1680

4854 (+) x

3

1680

4837 (+)

4

1640

5

1620

Kemurnian
STDEV

(Absorban
280/260)

1494

45,60

3716

70,92

1664

32,86

1,8 – 2,0

59

Lampiran 4. Lanjutan
Konsentrasi DNA Genom Larva

No

1

2

3

Sampel

Ulangan

Konsentrasi

Rata-

(ng/mL)

rata

1

85600

Larva 1

2

83200

4749 (+) X

3

82900

1221 (+)

4

82700

5

82300

1

86700

Larva 2

2

86500

4836 (+) X

3

86100

4458 (+)

4

85800

5

85700

1

60300

Larva 3

2

60300

4854 (+) X

3

59400

4837 (+)

4

59500

5

59100

Kemurnian
STDEV

(Absorban
280/260)

83340

1304,99

86160

433,58

59720

549,54

1,8 – 2,0

60

Lampiran 5. Data konsentrasi genom RNA embrio dan larva Transgenik F3
Konsentrasi RNA Genom Embrio

No

1

2

3

4

Sampel

Ulangan

Konsentrasi
(ng/mL)

1

188 x 104

Embrio 1

2

179 x 104

4749 (+) X

3

179 x 104

1221 (+)

4

176 x 104

5

174 x 104

1

150 x 104

Embrio 2

2

145 x 104

4836 (+) X

3

139 x 104

4458 (+)

4

137 x 104

5

134 x 104

1

235 x 104

Embrio 3

2

227,5 x 104

4854 (+) X

3

213 x 104

4837 (+)

4

213 x 104

5

212 x 104

Embrio 4

1

124 x 104

4773 (-) X

2

122,5 x 104

Ratarata

Kemurnian
STDEV

(Absorban
280/260)

1792
000

53572,
38

1410
000

64420,
49
1,8 – 2,0

2201
000

105261
,57

1190
000

41683,
33

61

3

116,5 x 104

4

118 x 104

5

114 x 104

1

159 x 104

Embrio 5

2

157,5 x 104

4826 (-) X

3

154 x 104

4817 (+)

4

150,5 x 104

5

147,5 x 104

1

214 x 104

Embrio 6

2

207 x 104

1172 (-) X

3

203 x 104

4742 (-)

4

199,5 x 104

5

196,5 x 104

4450 (+)

5

6

1537
000

47775,
51

2040
000

68282,
50

62

Lampiran 5. Lanjutan
Konsentrasi RNA Genom Larva
Kemurnian
No

1

2

Sampel

4

Konsentrasi
(ng/mL)

1

117 x 104

Larva 1

2

111,5 x 104

[ 4749 (+) x

3

113 x 104

1221 (+) ]

4

107 x 104

5

107 x 104

1

103 x 104

Larva 2

2

100 x 104

4836 (+) x

3

93 x 104

4458 (+)

4

92 x 104

5

92 x 104

1

114,5 x 104

2

113 x 104

3

112 x 104

4

109 x 104

5

107,5 x 104

Larva 4

1

4773 (-) X

2

Larva 3

3

Ulangan

4854 (+) x
4837 (+)

Rata- STDEV
rata

1111

42485,

000

29157

9600

51478,

00

1507

(Absorban
280/260)

1,8 – 2,0

1112

28853,

000

07609

173,5 x 104

1665

47565,

168,5 x 104

000

74398

63

3

166 x 104

4

163 x 104

5

161,5 x 104

1

128 x 104

Larva 5

2

125 x 104

4826 (-) X

3

123,5 x 104

4817 (+)

4

121 x 104

5

120 x 104

1

139 x 104

Larva 6

2

136,5 x 104

1172 (-) X

3

137 x 104

4742 (-)

4

134,5 x 104

5

133 x 104

4450 (+)

5

6

1235

32015,

000

62119

1360

23184,

000

04624