BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tanaman sawo ( Manilkara zapota) - Uji Antibakteri Daun Sawo (Manilkara zapota) Terhadap Bakteri Eschericia Coli, dan Staphylococcus Aureus
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tanaman sawo ( Manilkara zapota)
Sawo berasal dari Amerika Tengah dan Meksiko. Di India, Sri lanka, Filipina, Meksiko, Venezuela, Guatemala, dan Amerika Tengah buah sawo sudah dibudidayakan secara komersial. Di Indonesia, sawo pada umumnya dibudidayakan sebagai tanaman pekarangan untuk dinikmati buahnya, sementara di daerah Sumatera, Jawa Barat, Jawa Tengah, Jawa Timur, dan Nusa Tenggara Barat.
Gambar 2.1 Daun dan buah sawoSawo adalah pohon buah yang berumur panjang. Pohon dan buahnya dikenal dengan beberapa nama seperti sawo, sauh atau sauh manila. Pohon yang besar dan rindang dapat tumbuh hingga 30-40 m, bercabang rendah, batang sawo berkulit kasar abu-abu kehitaman sampai coklat tua. Seluruh bagiannya mengandung lateks, getah berwarna putih susu yang kental. Daun tunggal terletak berseling, sering mengumpul pada ujung ranting. Helai daun bertepi rata sedikit berbulu, hijau tua mengkilap, bentuk bundar telur jorong sampai agak lanset 1,5x 3,5-15 cm, pangkal dan ujungnya bentuk baji, bertangkai 1-3, 5 cm, tulang daun utama menonjol disisi sebelah bawah.
Klasifikasi dari tanaman sawo adalah: Kerajaan : Plantae Divisi : Spermatophyta (tumbuhan berbiji) Kelas : Dicotyledonae ( biji berkeping dua)
Ordo : Ericates Famili : Sapotaceae Genus : Manilkara atau Achras Spesies : Manilkara zapota atau Achras zapota (Dalimartha, S, 2006)
2.1.1 Metabolit sekunder tanaman sawo
Pada saat sekarang kimia bahan alam terutama tertuju pada pembentukan struktur dan sifat- sifat metabolit sekunder. Pada hakekatnya tidak ada perbedaan yang tajam antara metabolit biokimia primer dengan metabolit sekunder. Karakteristik utama fungsi metabolit sekunder pada dasarnya tidak diketahui. Ia didefenisikan tidak hanya sekedar sebagai hasil yang tak berguna (waste product); tetapi juga sangat sedikit diketahui sifat-sifat metabolit sekunder. Produksi metabolit sekunder berkaitan dengan beberapa faktor luar, seperti replikasi pertumbuhan, pembungaan, musim, suhu, habitat, panjangnya siang hari, dan sebagainya.
Sebagai contoh daun tumbuhan oak muda mengandung sedikit tanin namun konsentrasi naik selama musim panas dan mencapai maksimum pada musim gugur. Hal ini memeberi kesan bahwa tanaman seperti oak, membentuk tanin dalam jumlah yang besar untuk menahan serangan terhadap berbagai jenis binatang. Kita dapat mendifinisikan metabolit sekunder sebagai bahan kimia non-nutrisi yang mengontrol spesies biologi dalam lingkungan, atau dengan perkataan lain metabolit sekunder memainkan peranan penting dalam koeksistensi dan koevolusi spesies. (Sastrohamidjojo, 1996)
Menurut Dalimartha (2006)bBerdasarkan penelitian, daun dan batang sawo ternyata mengandung flavonoida. Disamping itu daunnya juga mengandung saponin dan batangnya juga mengandung tanin. (Dalimartha, S, 2006)
2.1.2 Flavonoida
Tidak ada benda yang begitu menyolok seperti flavonoid yang memberikan kontribusi keindahan dan kesemarakan pada bunga dan buah-buahan di alam. Flavin memberikan warna kuning atau jingga, antosianin memberikan warna merah, ungu, atau biru, yaitu semua warna yang terdapat pada pelangi kecuali warna hijau. Secara biologis flavonoid memainkan peranan penting dalam kaitan penyerbukan pada tanaman oleh serangga.
Sejumlah flavonoid mempunyai rasa pahit hingga dapat bersifat menolak sejenis ulat
15
tertentu. Senyawa flavonoid adalah senyawa yang mengandung C terdiri atas dua inti fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. (Sastrohamidjojo, 1996)
Gambar 2.2 Struktur Flavonoida2.1.3 Saponin
Saponin yang terdiri dari dua kelompok, yaitu steroid dan triterpenoid. Sifat- sifat saponin adalah:
1. Mempunyai rasa pahit
2. Dalam larutan air membentuk busa yang stabil
3. Menghemolisa eritrosit
4. Merupakan racun kuat untuk ikan dan amfibi
5. Membentuk persenyawaan dengan kolesterol dan hidrok- sisteroid lainnya
6. Sulit untuk dimurnikan dan diidentifikasi
7. Berat molekul relatif tinggi, dan analisisnya hanya menghasilkan formula empiris yang
mendekati (http://ff.unair.ac.id/sito/index/php/2010/06)
Gambar 2.3 Struktur saponin2.1.4 Tanin
Tanin adalah suatu senyawa polifenol yang berasal dari tumbuhan, berasa pahit dan kelat, yang bereaksi dengan menggumpalkan protein, atau berbagai senyawa organik lainnya termasuk asam amino dan alkaloid. Pengertian tanin kini meluas, mencakup aneka senyawa polifenol berukuran besar yang mengandung cukup banyak gugus hidroksil dan gugus lain yang sesuai untuk membentuk perikatan kompleks yang kuat dengan protein dan makromolekul yang lain. Senyawa- senyawa tanin ditemukan pada banyak jenis tanaman, pelbagai senyawa ini berperan penting untuk melindungi tumbuhan dari pemangsaan oleh herbivora dan hama , serta dalam pengaturan pertumbuhan. Tanin yang terkandung dalam buah muda menimbulkan rasa kelat (sepat), perubahan-perubahan yang terjadi pada senyawa tanin bersama berjalannya waktu berperan penting dalam proses pemasakn buah. Tanin terutama dimanfaatkan orang untuk menyamak kulit agar awet dan mudah digunakan. Tanin juga digunakan untuk menyamak jala, tali, dan layar agar lebih tahan terhadap air laut. Tanin yang terkandung pada minuman seperti teh, kopi, anggur dan bir memberikan aroma dan rasa sedap yang khas. Bahan kunyahan seperti gambir memanfaatkan tanin yang terkandung di dalamnya untuk memberikan rasa kelat ketika makan sirih. Sifat pengelat itu sendiri menjadikan banyak tumbuhan yang mengandung tanin dijadikan sebagai bahan obat-obatan. (http:// id.wikipedia.org/wiki/tanin)
Gambar 2.4 Struktur Tanin2.1.2. Manfaat sawo
Buah sawo atau Manilkara zapota atau Achras zapota, selain aromanya yang harum dan rasanya yang manis, buah ini sangat dikenal oleh masyarakat Indonesia. Buah sawo biasanya dikonsumsi dalam keadaan matang dan segar. Buah sawo memiliki kandungan mineral yang cukup baik. Buah ini merupakan sumber kalium yang baik, selain kaya kalium, sawo juga mengandung sejumlah mineral penting lainnya. Kandungan mineral lainnya per 100 gram buah sawo adalah kalsium (21 mgl), magnesium (12 mgl), fosfor (12 mgl), selenium( 0,6 mgl), seng (0,1 mgl), dan tembaga (0,09 mgl). Sawo juga kaya akan vitamin
C. Vitamin C berperan penting dalam metabolisme tembaga. Didalam sawo terkandung fosfor dan kalsium sehingga baik bagi kesehatan tulang kita. Didalam sawo terkandung vitamin A yang tinggi, sehingga baik bagi kesehatan mata. Didalam buah sawo juga terkandung vitamin E yang baik untuk kesehatan kulit dan juga protein yang baik untuk anak. Selain buahnya yang sedap disantap, sawo ternyata memiliki khasiat untuk mengatasi beberapa penyakit, menghentikan diare, menyembuhkan radang mulut, dan mengobati disentri. (http://apotekherbal.biz/buah/khasiat/kandungan/manfaatsawo/2012)
2.2 Bakteri
Bakteri, dari kata Latin bacterium (jamak, bacteria), adalah kelompok raksasa dari mahluk organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniselular (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus/inti sel. Bakteri pertama kali ditemukan oleh Anthony van Leeuwenhoek pada 1674 dengan menggunakan mikroskop buatannya sendiri.
Bakteri dapat diartikan sebagai kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk kedalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil, serta memiliki peranan besar dalam kehidupan di bumi. Bakteri dapat ditemukan di hampir semua tempat, tanah, air, udara, dalam simbiosis dengan organisme lain maupun sebagai agen parasit, bahkan dalam tubuh manusia.
Berdasarkan bentuknya bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar yaitu:
1. Kokus adalah bakteri yang berbentuk seperti bola dan mempunyai beberapa variasi seperti: mikrokokus (kecil dan tunggal), diplokokus (berganda dua), tetrakokus (bergandeng empat), sarcina (bergerombol membentuk kubus), staphylokokus (bergerombol), streptokokus (membentuk rantai).
2. Basil adalah kelompok bakteri berbentuk batang atau silinder, dan mempunyai variasi seperti, diplobasilus (jika bergandengan dua-dua), streptobasilus (jika bergandengan membentuk rantai).
3. Spiral adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi seperti, Vibrio (berbentuk koma, lengkung kurang dari setengah lingkaran), spiral (jika lengkung lebih dari setengah lingkaran), spirochete (jika lengkung membentuk struktur yang fleksibel). (Tamher, 2008)
Gambar. 2.2 Bentuk- bentuk bakteri
2.2.1 Bakteri gram negatif dan gram positif
Seperti prokariota (artinya organisme yang tidak memiliki selaput inti) pada umumnya, semua bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana. Struktur bakteri yang paling penting adalah dinding sel. Bakteri dapat diklasifikasikan berdasarkan metode pewarnaan gram menjadi dua kelompok besar, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarnaan Gram meliputi 3 proses utama, yaitu pengecatan dengan kristal violet, dekolorisasi (penghapusan warna) dengan etil alkohol atau aseton, kemudian counterstaining atau pemberian pewarna kontras menggunakan air fukhsin. Pada awal pengecatan, semua bakteri akan berwarna ungu, proses dekolorisasi dan pemberian warna kontrasl;ah yang membedakan antara kedua jenis bakteri ini. Bakteri gram positif akan menunjukkan warna ungu karena memiliki lapisan peptidoglikan tebal yang menahan kristal violet selama pengecatan gram.
1. Gram positif Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal, memiliki cytoplasmic lipid membran, terdapat asam teichoic dan lipoid yang membentuk lapisan asam lipoteichoic, beberapa spesies memilki kapsul polisakarida, dan beberapa spesies memiliki flagellum. Dinding sel bakteri gram positif lebih tipis 20 sampai dengan 80 nm dan tersusun dari 60 sampai 80 persen peptidoglikan yang secara berkesinambungan (Wesley Volk, 1992)
2. Gram negatif Menurut Tamher (2008) bakteri gram negatif memiliki lapisan luar, lipo-polisakarida terdiri atas membran dan lapisan peptidoglikan yang tipis terletak pada periplasma ( diantara lapisan luar dan membran sitoplasmik). Sangat sulit untuk memberikan rincian umum secara ringkas tentang bakteri gram negatif karena organisme ini sangat bermacam- macam dalam sifat struktural dan mengenai fungsional. Sejauh ini, subdivisi berdasarkan pada sifat struktural tidak begitu penting bertepatan dengan subdivisi berdasarkan atas sifat funsionalnya, seperti pada cara enrgi hasil metabolisme. Mungkin tidak dituliskan bahwa bakteri gram negatif termasuk kedalam semua prokariotik fotosintetik, yang dapat ditetapkan dengan jelas ke dalam tiga kelompok taksonomi, kebanyakan bakteri kemoautotrop; dan beberapa grup lainnya kemoheterotrop. (Roger, 1977)
Tabel 2.1 Perbedaan penyusun dinding sel antara bakteri gram positif dan gram negatif Pembanding Gram positif Gram negatifKetebalan 15-23 nm 10-15 nm Asam teikoat Ada Tidak ada Sifat tahan asam Ada Tidak ada Variasi asam amino Sedikit Beberapa
(Grupta , 2011)
2.2.2 Bakteri Escherichia coli
E.coli umumnya merupakan flora normal saluran pencernaan manusia dan hewan. Sejak
1940 di Amerika Serikat telah ditemukan strain-strain E.coli yang tidak merupakan flora normal saluran pencernaan. Strain tersebut dapat menyebabkan diare pada bayi . E.coli dalam jumlah yang banyak bersama-sama tinja, akan mencemari lingkungan. E.coli merupakan bakteri batang gram negatif, tidak berkapsul, umumnya mempunyai fimbria dan bersifat motile. Sel E.coli mempunyai ukuran panjang 2,0-6,0 um dan lebar 1,1-1,5 um, tersusun tunggal, berpasangan. E.coli tumbuh pada suhu antara 10-40 C dengan suhu optimum 37
C, dengan pH optimum untuk pertumbuhannya 7-7,5, pH minimum pada 4 dan maksimum pada 9.
Gambar 2.3 Sel bakteri E. coliE.coli patogen menimbulkan gastroenteritis akut yang terutama menyerang anak-anak di
bawah dua tahun dan infeksi di luar saluran pencernaan yaitu infeksi saluran kemih, usus buntu, peritonitis, radang empedu, dan infeksi pada luka bakar. (Sukamto et all,1998)
2.2.3. Bakteri Staphylococcus aureus
Staphylococcus adalah organisme yang umumnya terdapat di berbagai bagian tubuh manusia, termasuk hidung, tenggorokan, kulit, dan karenanya mudah memasuki makanan.
Organisme ini dapat berasal dari orang yang mengolah makanan yang merupakan penular atau yang menderita infeksi patogenik (membentuk nanah). (Irianto, Koes, 2006)
Staphylococcus aureus merupakan patogen utama pada manusia. Bakteri ini bersifat gram
positif, berbentuk bulat dengan diameter 0,5-1,5 µm yang biasanya tersusun menyerupai anggur, beberapa isolat memiliki kapsul. (Sukamto et all, 1998)
Gambar 2.4 Sel bakteri Staphylococcus aureus2.3 Antibakteri
Antibakteri adalah zat yang dapat mengganggu pertumbuhan atau bahkan mematikan bakteri dengan cara mengganggu metabolisme mikroba yang merugikan atau menghambat aktivitas mikroorganisme. Antibakteri hanya dapat digunakan jika mempunyai sifat toksik selektif, artinya dapat membunuh bakteri yang menyebabkan penyakit tetapi tidak beracun bagi penderitanya. Mekanisme kerja dari senyawa antibakteri diantaranya yaitu:
1. Merusak dinding sel
2. Mengganggu permeabilitas sel
3. Menghambat aktivitas enzim
4. Menghambat sintesa asam nukleat dan protein Berdasarkan aktivitasnya zat antibakteri dapat dibedakan menjadi dua jenis yaitu bakteriostatik (zat antibakteri yang memiliki aktivitas menghambat pertumbuhan bakteri, namun tidak mematikannya) dan bakterisida (zat antibakteri yang aktivitasnya membunuh bakteri). (Fardiaz , 2011)
2.4 Media
Beberapa bakteri dapat tumbuh pada berbagai medium, bakteri lain memerlukan media khusus. Media merupakan bahan nutrisi yang disiapkan untuk pertumbuhan mikroba. Agar- agar merupakan kompleks polisakarida, dihasilkan oleh alga laut dan digunakan untuk pemadat pada makanan. Keunggulan agar adalah sedikit organisme yang dapat mendegradasi, mencair pada suhu yang sama dengan air, namun tetap dalam keadaan cair sampai suhu sekitar 40 C , untuk kegiatan laboratorium diletakkan pada penangas air suhu
50 C. Pada suhu ini agar tidak merusak bakteri, juga dapat dicampur dalam penangas air sehingga didapat suspensi bakteri yang seragam. Berdasarkan kandungannya ada beberapa jenis media, yaitu:
1. Media kimia pasti Penyiapan media harus mempertimbangkan penyediaan energi sumber karbon, nitrogen, sulfur dan fosfor. Media ini merupakan media yang komposisi kimia diketahui dengan pasti.
2. Media kompleks Kebanyakan bakteri dan fungi heterotrof secara rutin ditumbuhkan pada media kompleks, yaitu media yang komposisi pasti bahan kimia sedikit beragam dari satu kultur ke kultur lain. Media ini biasanya terdiri dari ekstrak yeast, daging sapi, tumbuhan, atau protein yang sudah dicerna.
3. Media anaerobik Karena anaerob dapat terbunuh jika terkena oksigen, maka ada media khusus, yaitu media reduksi. Media ini mengandung bahan seperti natrium tioglikolat yang dapat berikatan dengan oksigen terlarut dan menghilangkan oksigen pada medium.
4. Media selektif dan diferensial Media selektif dibuat untuk menekan pertumbuhan bakteri yang tidak diinginkan dan meningkatkan pertumbuhan bakteri yang diinginkan. Media diferensial berfungsi untuk memudahkan mengenali koloni organisme yang diinginkan dengan organisme lain yang tumbuh di media yang sama. (Suryanto, Erman, 2006)
2.5 Sterilisasi
Bahan atau peralatan yang digunakan dalam bidang mikrobiologi harus dalam keadaan steril. Steril artinya tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya, baik yang mengganggu atau yang merusak media atau mengganggu kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan. Setiap proses baik fisika, kimia, dan mekanik yang membunuh semua bentuk hidup terutama mikroorganisme disebut dengan sterilisasi. Dalam abad 18 orang mensterilkan medium cukup dengan mendidihkan medium tersebut beberapa jam. Dengan cara ini matilah semua mikroba. Cara demikian dipakai oleh Spallanzani untuk membuktikan tidak mungkinnya abiogenesis. Jenis- jenis sterilisasi antara lain:
1. Sterilisasi secara fisik
Cara ini dapat dipakai bila selama sterilisasi dengan bahan kimia tidak akan berubah akibat temperatur tinggi atau tekanan tinggi. Cara membunuh mikroba ini dengan memakai panas.
Pemanasan Basah 1. Otoklaf : alat ini serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap air.
Otoklaf memiliki satu ruangan yang mampu menahan tekanan diatas 1 atm. Dalam otoklaf, yang mensterilkannya adalah panas basah, bukan pada tekanannya. Oleh karena itu, setelah air dalam tangki mendidih dan mulai terbentuk uap air, maka uap air ini akan mengalir ke ruang pensterilan guna mendesak keluar semua udara didalamnya. Alat-alat dan bahan yang akan disterilkan lebih baik ditempatkan dalam beberapa botol yang agak kecil dari pada dikumpulkan dalam satu botol yang besar.
2. Tyndallisasi : metode ini berupa mendidihkan medium dengan uap beberapa menit saja. Sehabis didiamkan satu hari, selama itu spora-spora sempat tumbuh menjadi bakteri vegetatif, maka medium tersebut dididihkan lagi selama beberapa menit. Akhirnya pada hari ketiga, medium tersebut dididihkan sekali lagi. Dengan jalan demikian diperoleh medium yang steril, dan zat-zat organik yang terkandung di dalamnya tidak mengalami banyak perubahan.
3. Pasteurisasi : adalah suatu cara disinfeksi dengan pemanasan yang pertama kalinya dilakukan oleh Pasteur dengan maksud untuk mengurangi jumlah mikroorganisme pembusuk didalam anggur dengan tanpa merusak anggur tersebut. Suhu yang dipergunakan pada pasteurisasi adalah sekitar 65
C, dan waktu yang digunakan adlah 30 menit.
Pemanasan kering
1. Oven : Sterilisasi ini dengan menggunakan udara panas. Alat-alat yang disterilkan ditempatkan dalam oven dimana suhunya dapat mencapai 160- 180
C. Caranya adalah dengan memanaskan udara dalam oven tersebut dengan gas atau listrik. Olek karena daya penetrasi panas kering tidak sebaik panas basah, maka waktu yang diperlukan pada sterilisasi cara ini lebih lama yakni 1-2 jam. Cara ini baik dipergunakan untuk mensterilisasi alat-alat gelas seperti cawan petri, pipet, tabung reaksi, labu, dan lain sebagainya.
2. Pembakaran ( incineration) : merupakan cara sterilisasi yang 100% efektif, tetapi cara ini terbatas penggunaannya. Cara ini biasa dipergunakan untuk mensterilkan alat penanam kuman ( jarum ose). Yakni dengan membakarnya sampai pijar, dengan cara ini semua bentuk hidup akan dimusnahkan.
Penyinaran dengan sinar gelombang pendek Mikroorganisme di udara dapat dibunuh dengan penyinaran memakai sinar ultra violet. Panjang gelombang yang dapat membunuh mikroorganisme adalah antara 220-290 nm, radiasi yang paling efektif adalah 253,7 nm. Untuk memperoleh hasil yang baik, maka bahan- bahan yang disterilkan, baik yang berupa cairan, gas atu aerosol harus dilewatkan atau ditempatkan langsung dibawah sinar ultra ungu dalam lapisan-lapisan tipis. Absorpsi radiasi sinar ultra ungu menyebabkan modifikasi kimiawi nukleoprotein dan menimbulkan hubungan silang antara pasangan-pasangan molekul timin, sehingga menimbulkan salah baca dari kode genetik, yang berakibat mutasi yang akan merusak fungsi vital organisme.
2. Sterilisasi secara kimia
Antiseptik kimia biasanya dipergunakan dan dibiarkan menguap seperti halnya alkohol.Umumnya isopropil alkohol 70-90 % adalah yang termurah namun merupakan antiseptik yang sangat efisien dan efektif. Penambahan yodium pada alkohol akan meningkatkan daya disinfeksinya. Dengan atau tanpa yodium, isopropil tidak efektif terhadap spora. Solusi terbaik untuk membunuh spora adalah campuran formaldehid dengan alkohol, tetapi solusi ini terlalu toksik untuk dipakai sebagai antiseptik. Zat- zat kimia yang dapat dipakai untuk sterilisasi antara halogen (senyawa klorin, yodium), alkohol, fenol, hidrogen, peroksida, deterjen, logam- logam berat (Hg, Ag, As, Zn), aldehida, gas ETO (oksida etilen), uap formaldehid, beta-propilakton.
3. Sterilisasi secara mekanik
Beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan atau penguraian, maka sterilisasi yang dilakukan adalah dengan cara mekanik, misalnya dengan saringan. Dalam mikrobiologi, penyaringan secara fisik yang paling banyak digunakan adalah dengan penggunaan filter khusus, misalnya filter Berkefeld, filter Chamberland, dan filter Seitz. Jenis filter yang dipakai atau yang akan dipergunakan tergantung pada tujuan penyaringan dan benda yang akan disaring. Penyaringan dapat dilakukan dengan mengalirkan gas atau cairan melalui suatu bahan penyaring yang memiliki pori-pori cukup kecil untuk menahan mikroorganisme dengan ukuran tertentu. Saringan akan tercemar sedangkan cairan atau gas yang melaluinya akan steril. Alat saring tertentu juga mempergunakan bahan yang dapat mengabsorpsi mikroorganisme. Penyaringan dilakukan untuk mensterilkan substansi yang peka terhadap panas seperti serum, enzim, toksin kuman, ekstrak sel. (Waluyo Lud, 2007)
2.6 Pengujian aktivitas antibakteri
Pengujian aktivitas antibaketri dapat dilakukan dengan salah satu cara dari dua metode pokok dibawah ini, yaitu:
1. Metode Dilusi Cara ini dapat digunakan untuk menentukan kadar hambat minimal (KHM) dan kadar bunuh minimal (KBM) dari bahan antibakteri. Prinsip metode ini adalah: Meggunakan satu seri tabung reaksi yang diisi media cair dan sejumlah tertentu sel mikroba yang diuji. Kemudian masing-masing tabung diisi dengan bahan yang telah diencerkan secara serial. Selanjutnya seri tabung diinkubasi pada suhu 37 C selama 18-24 jam dan diamati terjadinya kekeruhan pada tabung. Konsentrasi terendah bahan pada tabung yang ditunjukkan dengan hasil biakan yang mulai tampak jernih 9 tidak ada pertumbuhan mikroba) adalah KHM dari bahan uji. Selanjutnya biakan dari semua tabung yang jernih diinokulasikan pada media agar padat, diinkubasikan dan keesokan harinya diamati ada tidaknya koloni mikroba yang tumbuh. Konsentrasi terendah obat pada biakan padat yang ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan koloni mikroba adalah KBM dari bahan terhadap bakteri uji. (Tim Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Unibraw , 2011)
2. Metode Difusi Cakram Prinsip dari metode ini adalah: Bahan uji yang dijenuhkan keadaan blank dish (cakram kertas). Cakram kertas yang mengandung bahan tertentu ditanam pada media pembenihan agar padat yang telah dicampur mikroba tertentu yang akan diuji, kemudian diinkubasi 35 C selama 18-24 jam. Selanjutnya diamati adanya zona bening disekitar cakram kertas yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan mikroba. Selama inkubasi, bahan uji berdifusi dari cakram kertas ke dalam agar tersebut, sebuah zona inhibisi dengan demikian akan terbentuk. Diameter zona sebanding dengan dengan jumlah bahan uji yang ditambahkan kedalam cakram kertas.
Metode ini secara rutin digunakan untuk menguji sensivitas antibiotik untuk bakteri pathogen. (Madigan , 2011)