PENELITIAN KECIL PROYEK FISIOLOGI MIKROB

PENELITIAN KECIL
PROYEK FISIOLOGI MIKROBA
Perbandingan Konsentrasi Amilase Bacillus subtilis yang Terpisahkan dari

Induksi dengan Pati dan Tepung Kulit Pisang
KELOMPOK 4
ALFONSUS ADI SADEWA

10416004

EMILIO JOSHUA WIRATAMA

10416008

DITA DANASTRI

10416014

KARLINA MELLYANI

10416015

FERNANDA RINIA P

10416031

PROTEASE
Katalis hidrolisis protein melalui pelepasan
ikatan peptida
banyak digunakan dalam proses pengolahan makanan,
pengembangan agen terapeutik, dan bidang medis
lainnya, serta industri detergen dan tekstil

(Mukhtar, dkk., 2012)

AMILASE
Pemutus ikatan α-1,4 antara unit
glukosa yang berdekatan
(Bano, dkk., 2011)
secara umum digunakan pada industri
pembuatan kertas, tekstil, farmasi, maupun

pangan

(Mukhtar, dkk., 2012)

LATAR BELAKANG

AMILASE
&
PROTEASE

Merupakan dua enzim
yang penting dalam
industri enzim
(Lebih dari 70% total pasar
industri enzim dunia)

Bacillus subtilis
dapat
memproduksi
amilase dan

protease secara
bersamaan.
(Mukhtar, dkk., 2012)

Sumber karbon, seperti dekstrin, fruktosa, glukosa,
laktosa, maltosa, dan pati tergolong mahal untuk
produksi enzim secara komersial.
(Unakal, 2012)

-

Mengandung pati

-

Dibuat menjadi tepung

-

Dipakai untuk menggantikan pati murni

dalam induksi amilase

-

Lebih murah
(Lanhadi, 2017)

LIMBAH KULIT PISANG

TUJUAN
1. Mengisolasi amilase dan protease dari B. subtilis.
2. Memekatkan amilase dan protease dengan
presipitasi ammonium sulfat.
3. Memisahkan amilase dari protease menggunakan

metode purifikasi afinitas dengan memanfaatkan
insoluble starch dan maltosa.

4. Menentukan pengaruh induksi variasi pati (pati dan
tepung kulit pisang) terhadap produktivitas enzim

amilase dari B. subtilis.

HIPOTESIS
1.Amilase dan protease dapat diisolasi dari B. subtilis.

2.Amilase dan protease dapat dipekatkan dengan
presipitasi oleh ammonium sulfat.
3.Amilase dapat dipisahkan dari protease
menggunakan metode purifikasi afinitas dengan
memanfaatkan adsorbsi oleh insoluble starch dan
elusi oleh maltosa.
4. Induksi dengan pati dan tepung kulit pisang

memiliki efektivitas induksi yang sama dalam
memproduksi enzim amilase dari B. subtilis.

No

Alat

Jumlah

1

Sentrifuga suhu dingin

1

2

Erlenmeyer 100 ml

2

3

Microtube 2 ml

4

ALAT
No

Alat

Jumlah

180

9

Spektrofotometer

1

Tabung reaksi

25

10

Coolbox

1

5

Falcon tube

6

11

Kuvet

32

6

Gelas kimia 100 ml

8
12

Waterbath 30°C

1

13

Erlenmeyer 250 ml

3

14

Gelas ukur 100 ml

1

15

Micropippete 1 mL

1

16

Micropippete 0.1 mL

1

7

Magnetic stirer

2

8

Gelas kimia 50ml

2

BAHAN
No

Bahan

Jumlah

No

Bahan

Jumlah

1
2
3
4
5
6
7
8
8

kultur murni Bacillus subtilis
NB
Pati
Aseton
Maltosa 10%
Ammonium sulfat
Na2HPO4
KH2PO4
Maizena
NaCl
HCl
NA
Larutan KI 0,3 %
Larutan I2 0,2%

~
6g
200 g
60 ml
4g
10 g
397,5 mg
72 mg
100 g
4,5 g
3 ml
0,5 gr
18 mg
12 mg

14

Butanol

60 ml

15

BSA 1 mg/ml

20 mg

16

Ninhidrin

8g

17

Tips Kuning

50

18

Tips Biru

50

19
21

Kapas lemak
Alumunium foil

200 g
1 pack

22

Tepung kulit pisang

6, 67 g

22

Akuades

5L

9
10
11

CARA
KERJA

PENYIAPAN ENZIM
Sampel P
Bacillus subtilis
50 ml NB + 0,2% Pati / 250 ml
24 jam, 180 rpm, 30°C

Bacillus subtillis
(NA-stok kultur)

Bacillus subtilis
50 ml NB / 250 ml
24 jam

Sampel B
Bacillus subtilis
50 ml NB + 6,67 g tepung
kulit pisang / 250 ml
24 jam, 180 rpm, 30°C

CARA
KERJA

PENYIAPAN ENZIM
Supernatan hasil sentrifugasi
sampel P, dinamakan SP1P,
diletakkan pada
ice bath selama 5 menit

Sentrifugasi dingin
8000g, 20 menit

Supernatan hasil sentrifugasi
sampel B dinamakan SP1B,
diletakkan pada
ice bath selama 5 menit

CARA
KERJA

Np (pati)

PRESIPITASI PROTEIN
Pellet digabung dan diresuspensi
dengan 5mL pBS pH 6.5 serta
disimpan dalam es

Nb (banana)
B
S
A

25 ml SP1P dan
SP1B ditambahkan
BSA hingga
konsentrasi akhir
0,2 mg/ml

Ditambahkan 5 g
ammonium sulfat hingga
konsentrasi akhir mencapai
85% (suhu tetap 0°C),
diaduk 10 menit

Disentrifugasi 10000 g
10 menit, supernatan
dibuang

CARA
KERJA

PURIFIKASI AMILASE
DENGAN INSOLUBLE STARCH

Cp (pati)

Cb (banana)
20 ml SP1P dan
SP1B dalam gelas
kimia 100 ml
diaduk

Dipindahkan 5 ml ke
Falcon tube

CARA
KERJA

PURIFIKASI AMILASE
DENGAN INSOLUBLE STARCH
Up (pati)
Ub (banana)

masing-masing 15 ml
SP1P dan SP1B ditambah
4 gram insoluble starch,
diaduk 30 menit

Disentrifugasi dingin 10000 g
10 menit

Supernatan yang
dihasilkan dipindahkan ke
Falcon tube

CARA
KERJA

PURIFIKASI AMILASE
DENGAN INSOLUBLE STARCH
Pp (pati)
Pb (banana)

Maltosa

Pellet hasil sentrifugasi
sebelumnya, diresuspensi
dengan 10mL maltosa 10%,
diaduk 30 menit

Disentrifugasi dingin 10000 g
10 menit

Supernatan yang
dihasilkan dipindahkan ke
Falcon tube

CARA
KERJA

PROTEASE ASSAY
Ninhidrin

C
U

P

Ditambahkan 0.2 mL reagen
ninhidrin ke seluruh tabung,
diinkubasi 10 menit pada 37°C

N

BSA

Ditambahkan 0.4 mL BSA 1
mg/mL ke setiap tabung reaksi
kosong yang telah dinamai
sesuai dengan jenis sampel
(Cp,Up,Pp,Np,Cb,Ub,Pb,Nb)

Ditambahkan 0.2 mL sampel
enzim sesuai label ke tabung
reaksi dan sampel enzim
digantikan oleh deion untuk
blanko dengan BSA dan
diinkubasi 30 menit pada
30°C

seluruh larutan
diukur
absorbansinya
pada λ=570 nm

CARA
KERJA

AMILASE ASSAY
Akuades

I2/KI

Diambil 1 mL dari setiap tabung,
dimasukkan ke tabung reaksi berisi
iodin 0,5 mL serta ditambahkan
akuades 3,5 ml
BSA

Disiapkan tabung-tabung
reaksi dan setiap tabung
ditambahkan 5 mL buffer
fosfat 0.1M dan 75 µL
larutan pati soluble 2%

Untuk tabung
dengan waktu
inkubasi 0 menit
25 µL sampel enzim, masing-masing
segera diukur
ditambahkan ke dalam tabung reaksi absorbansinya
dan sampel enzim diganti deion untuk pada λ=550nm,
blanko (untuk waktu inkubasi 0 dan 20 dengan blanko
menit masing-masing dibuat duplo),
akuades
kemudian dihomogenisasi

CARA
KERJA

AMILASE ASSAY

Larutan dengan waktu
inkubasi 20 menit,
diinkubasi pada water
bath 30°C

Setelah inkubasi 20 menit,
diukur absorbansinya pada
λ=550 nm

HASIL

AMYLASE ASSAY

Selisih Absorbansi Amylase Assay yang
Diinkubasi pada Waktu Inkubasi 0 menit
dan 20 menit (Kulit Pisang)

Selisih Absorbansi Amylase Assay yang
Diinkubasi pada Waktu Inkubasi 0 menit dan
20 menit (Pati)
0,02

0,025

0,016

0,02

0,015

0,0185

0,0175

0,015
0,01

ABSORBANSI

ABSORBANSI

Hasil Pengukuran
Absorbansi

0,00735

0,005
0,0015
0
C

-0,005

U
-0,0025

P

N

0,01

0,0065

0,005
0
-0,005

C

U

-0,01
-0,015

-0,01365

-0,02
SAMPEL

P

SAMPEL

N

HASIL

Hasil Penghitungan
Aktivitas Enzim

AMYLASE ASSAY
Dengan:
Unit enzim = Kenaikan
absorbansi / Volume
sampel (ml)

Aktivitas Enzim (Pati)
0,64

1

0,6

0,8

0,5

0,6

0,4

UNIT ENZIM / ML

UNIT ENZIM / ML

0,7

Aktivitas Enzim (Kulit Pisang)

0,294

0,3
0,2
0,1

0,06

0
-0,1

C

Tidak ada
aktivitas enzim
U

P

N

0,74

0,7

0,4

0,26

0,2
0
-0,2

C

U

P

-0,4
-0,6

Enzim tidak berhasil terisolasi

-0,8

-0,2
SAMPEL

SAMPEL

N

HASIL

AMYLASE ASSAY

Perbandingan
Aktivitas Enzim

Perbandingan Unit Enzim pada Pati dan Kulit
Pisang
0,8

0,74

UNIT ENZIM / ML

0,7

0,64

0,6

0,5
0,4
0,26

0,3
0,2
0,1

0,06

0
C

N

SAMPEL
Pati

Pisang

HASIL

PROTEASE ASSAY

Absorbansi Protease Assay (Pati)
0,7

0,62475

Absorbansi Protease Assay (Kulit
Pisang)

0,608

0,5

0,6

0,4

ABSORBANSI

ABSORBANSI

0,414
0,35535

0,3
0,2

0,4765

0,4715

0,48

0,5

0,46
0,44

0,4327

0,42

0,4105

0,4
0,38

0,1

0,36

0
C

U

P
SAMPEL

N

C

U

P
SAMPEL

N

PEMBAHASAN

C

U

P

N

Komponen
selain sel

Bagian yang tidak
terikat oleh
maizena

Bagian yang
terikat oleh
maizena

Semua protein
yang
terendapkan

Amilase + Protease

Protease

Amilase

Amilase + Protease

PEMBAHASAN
Cp Terdapat
aktivitas enzim
amilase
melalui nilai
aktivitas enzim
yang positif

Amylase Assay

Up Nilai aktiivtas enzim
negatif, menunjukkan
tidak adanya enzim
amilase pada sampel
ini (tidak terserap oleh
maizena)

Aktivitas enzim amilase pada Pp lebih
rendah dari Np karena tidak semua
enzim dapat terelusi oleh maltosa,
walaupun telah teradsorbsi oleh
maizena,

Pp Terdapat
aktivitas enzim
amilase karena
dapat diserap oleh
maizena dan terelusi
oleh maltosa

Np Terdapat
aktivitas enzim
amilase yang
sangat tinggi karena
terendapkan oleh
amonium sulfat

PEMBAHASAN
Cb Terdapat
aktivitas enzim
amilase
melalui nilai
aktivitas enzim
yang positif

Amylase Assay

Ub Nilai aktiivtas
enzim positif,
menunjukkan
adanya enzim
amilase pada
sampel ini

Pb Aktivitas enzim negatif
karena pati dari pisang tidak
begitu soluble sehingga enzim
amilase cenderung terikat
pada pati ini dan tidak dapat
teradsorbsi oleh maizena

Nb Terdapat
aktivitas enzim
karena dapat
diendapkan
oleh amonium
sulfat

PEMBAHASAN

Protease Assay

Cp
Mengandung
protease
karena berupa
campuran
yang tidak
dipurifikasi

Up Nilai
absorbansi tinggi
karena
merupakan
bagian yang tidak
dapat diadsorbsi
oleh maizena

Cb
Mengandung
protease
karena berupa
campuran
yang tidak
dipurifikasi

Ub Nilai absorbansi
positif karena protease
merupakan bagian
yang tidak dapat
diadsorbsi oleh
maizena sehingga
tidak terendapkan,

Pp Terdeteksi
adanya aktivitas
enzim protease
yang terbawa
pada pellet (tidak
murni hanya
amilase)

Pb Nilai
absorbansi positif,
ada protease
yang terbawa
pada pellet
bersama dengan
maizena

Np Nilai
absorbansi
menunjukkan
protease
terendapkan
oleh amonium
sulfat

Nb Nilai
absorbansi
menunjukkan
protease
terendapkan
oleh amonium
sulfat

KENDALA
1. Saat melakukan sentrifugasi, sampel perlu dimasukkan ke
dalam microtube 1,5 ml terlebih dahulu sehingga diperlukan

waktu yang lebih banyak dan memengaruhi timeline
pengerjaan.
2. Pati pada pisang kurang soluble dan menyebabkan metode

purifikasi melalui afinitas menunjukkan hasil yang tidak sesuai
dengan hipotesis awal sehingga hasil perbandingan dengan
pati murni menjadi bias.
3. Terjadi kesulitan pada beberapa pemisahan antara pellet
dan supernatan.
4. Keterbatasan mobilitas menyebabkan pengukuran absorbansi
terhadap waktu kurang akurat.

KESIMPULAN
1.Amilase dan protease dapat diisolasi dari B. subtilis.
2.Amilase dan protease dapat dipekatkan dengan ammonium
sulfat.

3.Amilase dapat dipisahkan dari protease dengan metode
purifikasi afinitas dengan memanfaatkan adsorbsi oleh
insoluble starch dan elusi oleh maltosa (untuk induksi dengan
pati soluble).
4. Induksi dengan pati untuk sampel C memberikan aktivitas
enzim yang lebih rendah, yaitu 0,06 unit enzim/ml dari tepung
kulit pisang sebesar 0,74 unit enzim/ml sedangkan aktivitas
enzim sampel N pati lebih tinggi, yaitu 0,64 unit enzim/ml dari

tepung kulit pisang sebesar 0,26 unit enzim/ml , untuk sampel P
dan U tidak dapat dibandingkan.

SARAN
1. Sebelum pisang digunakan untuk menginduksi amilase, sebaiknya ditentukan terlebih
dahulu kadar patinya.
2. Untuk memisahkan protease dengan amilase pada hasil induksi dengan tepung kulit
pisang diperlukan metode lain selain purifikasi dengan insoluble starch dan elusi maltosa,

atau dapat pula dengan cara menyaring pati yang insoluble dengan metode yang
efektif.

DAFTAR PUSTAKA
BBC. 2014. Temperature, pH, and Enzymes. [online], www .bbc .co .uk, diakses pada 21 April 2018 pukul 03.02 WIB
Emaga, T. H., Andrianaivo, R. H., Wathelet, B., Tchango, J. T., & Paquot, M.2007. Effects of the stage of maturation and varieties on the chemical composition of banana
and plantain peels. Food chemistry, 103(2), 590-600.
Hadisoewignyo, L., 1Foe, K. dan Tjandrawinata, R.R. 2017. Isolation and characterization of Agung banana peel starch from East Java Indonesia International Food
Research Journal 24(3): 1324-1330
Hang T. Vu, Christopher J. Scarlett, Quan V. Vuong. (2018) Phenolic compounds within banana peel and their potential uses: A review. Journal of Functional Foods 40,
pages 238-248.
Happi Emaga, T. ; Bindelle, J. ; Agneesens, R. ; Buldgen, A. ; Wathelet, B. ; Paquot, M., 2011. Ripening influences banana and plantain peels composition and energy
content. Trop. Anim. Health Prod., 43 (1): 171-177
Ophardt, C. 2017. Starch and Iodine. [online], https:// chem .libretexts .org, diakses pada 21 April 2018 pukul 02.41 WIB
Ramli, S., Ismail, N., Alkarkhi, A. F. M., & Easa, A. M. (2010). The Use of Principal Component and Cluster Analysis to Differentiate Banana Peel Flours Based on Their Starch
and Dietary Fibre Components. Tropical Life Sciences Research, 21(1), 91–100.
Schwimmer , S. & Balls, A. K. 1949. STARCHES AND THEIR DERIVATIVES AS ADSORBENTS FOR MALT α -AMYLASE. J. Biol. Chem.180:883-894
Tkachuk, R. 1975. COMPETITIVE AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF WHEAT a-AMYLASE. FEBS Letters. 52(1):66-68
McDonald, A. M. L., Stark, J. R. 1987. A CRITICAL EXAMINATION OF PROCEDURES FOR THE ISOLATION OF BARLEY STARCH. J. Inst. Brew. 94:125-132
Zamri, Y. 2016. Production of Biodegradeable plastics of banana peel. Journal of Petrochemical Engineering Volume 1
Thermofisher. 2018. Covalent Immobilization of Affinity Ligands. [online] http:// www .thermofisher .com. Diakses 21 April 2018 pukul 12.20.
Priest, F. G. 1977. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. Bacteriology. Review. 41:711-753.
Morikawa, M. "Beneficial Biofilm Formation by Industrial Bacteria Bacillus subtilis and Related Species". Journal of Bioscience and Bioengineering. 2006; Vol.101, No.1, 1-8.
Coleman, G. & Grant, M. A. 1966. Characteristics of a-amylase formation by Bacillus subtilis. Nature. 211: 306.
Mukhtar H., Haq I.U. Concomitant production of two proteases and alpha-amylase by a novel strain of Bacillus subtilis in a microprocessor controlled bioreactor. Braz J
Microbiol. 2012;43:1072–1079.
Unakal C., Kallur R.I., Kaliwal B.B. Production of α-amylase using banana waste by Bacillus subtilis under solid state fermentation. Eur J Exp Biol. 2012;2:1044–1052
Berg, J., Tymoczko, J., Gatto, G., Styryer, L. 2015. Biochemistry 8th Edition. USA. Jogn Wiley and Sons. halaman 68 dan 73
Wingfield, P. T. (2001). Protein Precipitation Using Ammonium Sulfate. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et Al.], APPENDIX 3,
Appendix–3F. http://doi.org/10.1002/0471140864.psa03fs13
Entrez Genome Project, 2003.Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 [online] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject?cmd=Retrieve&dopt=Overview&list_uids=76 diakses
21 April 2018
Friedman, M. 2004. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino
Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52: 385−406 doi: 10.1021/jf030490p