Laporan Praktikum Isolasi DNA Kromosom d
ISOLASI DNA KROMOSOMAL DAN PLASMID DARI BAKTERI Escherichia coli
Rois Muqsith Fatawy 1)
drh. Bhintarti S.Hastari, M.Biomed2), Festy Aulyaur Rahmah, S.Si2)
Nugroho Adi Maulana3) ,Indhina Reihannisha3)
1)
Mahasiswa Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Negeri Islam Syarif Hidayatullah Jakarta
2)
Dosen Praktikum Biologi Molekuler
3)
Asisten Dosen Biologi Molekuler
Jl. Ir. Djuanda, Tangerang Selatan 15412, Indonesia
Email : rois.muqsith@gmail.com
Oktober 2014
ABSTRAK
DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke
generasi selanjutnya. DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme
prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk
linier. Kromosom adalah suatu struktur makromolekul yang berisi DNA di mana informasi genetik dalam sel
disimpan. sekuens DNA yang terletak pada kromosom disebut DNA Kromosomal. Plasmid sebagai DNA
ekstrakromosomal merupakan molekul DNA pada sel bakteri, berbentuk bulat kecil yang berbeda dan
merupakan tambahan dari molekul DNA utama pada kromosom bakteri. Isolasi DNA merupakan langkah
yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Isolasi DNA
dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari
bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
Kata Kunci : Isolasi, Plasmid, Dna Kromosomal
I.
DASAR TEORI
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan
senyawa kimia yang paling penting dalam
makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang
mengandung informasi genetik makhluk hidup
dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo
2004).
Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan
membentuk genom. Genom meliputi bagian gen
yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel
organisme. DNA genom meliputi gen dan
intergen(Campbell dkk.2004).
DNA organisme prokariot dan eukariot
mempunyai perbedaan bentuk. Organisme
prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular,
sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA
berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti
sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam
inang. Biasanya, plasmid membawa gen yang
sitoplasma (Jusuf, 2001).
menjadi enzim yang pada keadaan tertentu
Kromosom adalah suatu struktur
menguntungkan sel inang, di antaranya resisten
makromolekul yang berisi DNA di mana informasi
terhadap antibiotik, produksi antibiotik, degradasi
genetik dalam sel disimpan. sekuens DNA yang
senyawa organic kompleks, produksi kolkisin,
terletak pada kromosom disebut DNA
produksi enterotoksin, enzim restriksi, dan enzim
Kromosomal. Kata kromosom berasal dari kata
modifikasi (Sudjadi, 2008).
khroma yang berarti warna dan soma yang berarti
badan Kromosom terdiri atas dua bagian, yaitu
sentromer / kinekthor yang merupakan pusat
kromosom berbentuk bulat dan lengan kromosom
yang mengandung kromonema & gen berjumlah
dua buah (sepasang)(Godam, 2008).
Kromosom adalah pembawa gen yang
terdapat di dalam inti sel (nukleus). Kromosom
terdiri dari DNA, RNA (asam ribo nukleat) dan
protein. Kromosom homolog (2n) adalah
kromosom yang terdapat berpasangan dan
memiliki struktur dan komposisi yang sama. sel
yang memiliki 2n kromosom (kromosom
homolog) disebut sel diploid. Bila tidak
berpasangan kromosom diberi simbol n
kromosom. Sel dengan n kromosom adalah sel
haploid, misalnya sel kelamin jantan saja atau sel
kelamin betina saja (Desrizal, 2012).
Plasmid bekteri yang biasanya merupakan
molekul DNA untai ganda dengan ukuran dari 1
kb sampai dengan lebih dari 200 kb. Plasmid ini
terdapat dalam berbagai spesies bakteri dan
merupakan satuan genetik tambahan yang
bereplikasi dengan tidak tergantung pada
kromosom bakteri dan diturunkan kepada anakan.
Akan tetapi, dalam replikasi dan transkripsi tetap
tergantung pada enzim yang terdapat pada sel
Plasmid sebagai DNA ekstrakromosomal
merupakan molekul DNA pada sel bakteri,
berbentuk bulat kecil yang berbeda dan merupakan
tambahan dari molekul DNA utama pada
kromosom bakteri. Kebanyakan plasmid adalah
sirkular dan tersusun dari beberapa ribu pasangan
basa. Plasmid mempunyai titik ori (origin of
replication) sehingga mampu mereplikasi diri
tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi
dimulai dari titik ori hingga semua plasmid
tereplikasi (Pierce, 2005)
Berbagai tipe plasmid telah ditemukan
pada sel bakteri. Distribusi plasmid pada bakteri
bersifat sporadis karena ada bakteri yang
mengandung plasmid tetapi ada juga yang tidak,
misalnya pada sel E.coli terdapat plasmid F yang
menyebabkan bakteri ini mempunyai sifat
konjugatif tertentu. Plasmid F biasa digunakan
sebagai vector untuk membawa DNA yang akan
disisipkan pada genom sel target. Plasmid juga
merupakan alat yang efisien untuk
mengamplifikasi klon DNA karena memiliki kopi
yang sangat banyak per selnya.
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan
untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti
protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama
dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran
(lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini
padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian
adalah kultur bakteri Escherichia coli, EDTA 50
DNA.
mM, larutan sukrosa 25%, EDTA 0,5 M pH 8,
Isolasi DNA merupakan langkah yang
lisozim 10 mg/ml, NaCL 5 M, SDS 20%,
tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada
proteinase-K 5 mg/ml, kloroform, etanol dingin,
dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi
bufer TE, yellow tips, blue tips, bufer PD1,
merupakan teknik untuk memisahkan campuran
RNAse A, bufer PD2, bufer PD3, buffer W1, bufer
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul
wash, Ethanol absolut, bufer elusi, tabung mikro
yang mempunyai berat molekul besar akan berada
1,5 mL, PD column, 2 ml collection tube, blue tips
di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua
2.1 METODE
II.1.1. Isolasi
bagian atas dan pelet pada bagian bawah
langkah yang dilakukan untuk mengendapkan
suatu komponen dari campuran (Alberts, 1994).
Praktikum ini bertujuan supaya mahasiswa
mampu melakukan isolasi DNA kromosomal
bakteri dan juga melakukan isolasi DNA plasmid
sengan metode spin column.
II.
MATERI DAN METODE
2.1. MATERI
Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium
Biologi Dasar, Pusat Laboratorium Terpadu,
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Jakarta pada tanggal 17 Oktober 2014.
Kromosmal
Bakter
Escherichia coli
macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada
(Campbell dkk. 2002). Presipitasi merupakan
DNA
Sebanyak 1,5 ml kultur bakteri
Escherichia coli di sentrifugasi dengan kecepatan
4300 rpm selama 20 menit. Kemudian pelet yang
didapat disuspensikan lagi dengan 60 µL EDTA
50 mM, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 4300
rpm
selama
15
menit.
Pelet
kemudian
ditambahkan dengan 40 µL larutan sukrosa 25%
dan 10,5 EDTA 0,5 M pH 8. Setelah itu
ditambahkan dengan 1,5 µL lisozim 10 mg/ml dan
diinkubasi pada suhu 37 ◦C selama 1 jam. Tahap
selanjutnya yaitu ditambahkan 18 µL NaCL 5 M;
10,5 µL EDTA 0,5 M; 22,5 µL SDS 20%, dan 1,5
µL proteinase-K 5 mg/ml kemudian divortex.
Sediaan di inkubasi pada suhu 50 ◦C selama 1 jam,
kemudian tambahkan klorofom (1:1) dan kocok
pelan selama 20 menit. Selanjutnya sentrifugasi
Alat- alat yang di digunakan dalam praktikum
dengan kecepatan 4300 rpm selama 30 menit.
ini yaitu sentrifuga, mikropipet, vortex, waterbath,
Supernatan dipindahkan (larutan yang terlihat
freezer,dan inkubator.
bening) ke tabung baru yang berisi 2x volume
etanol dingin.
Sentrifugasi dengan kecepatan
10.000 rpm selama 5 menit (jika tidak ada
kecepatan 10.000 rpm bisa dengan menggunakan
Tahap ini dilakukan dengan cara tempatkan
penggandaan waktu, misal 5000 rpm selama 10
PD column dalam pada 2 ml collection tube.
menit). Selanjutnya ditambahkan pelet dengan 30
Kemudian supernata dituang dari tahap setelah
µL bufer TE. Simpan pada suhu -20 ◦C.
neutralisasi, selanjutnya disentrifuga pada 14.000
II.1.2. Isolasi DNA Plasmid dengan Metode
Spin
II.1.2.1.
1,5
2 ml collection tube, kemudian pasang kembali PD
column pada 2 ml collection tube.
Harvesting
Sebanyak
– 16.000 x g selama 30 detik. Cairan dibuang pada
mL
kultur
sel
bakteri
II.1.2.6.
disiapkan dalam tabung mikro 1,5 mL. Kemudian
Tahap ini dilakukan dengan menambahkan
disentrifuga pada 14.000 – 16.000 x g selama 2
600 µL was buffer (pastikan etanol telah
menit kemudian dibuang supernatan.
ditambahkan) ke dalam PD column kemudian
II.1.2.2.
disentrifuga pada 14.000 – 16.000 x g selama 20
Resuspension
detik. Kemudian buang cairan dalam 2 ml
200 µL bufer PD1 Resuspensi dilakukan
collection tube, selanjutnya sentrifuga pada 14.000
dengan menambahkan (pastikan RNAse A telah
– 16.000 g selama 3 menit untuk mengeringkan
ditambahkan I ) kedalam tabung mikro kemudian
PD column.
divortex.
II.1.2.3.
II.1.2.7.
Lysis
Tahap ini dilakukan dengan menambahkan 50 µL
Proses lisis dilakukan dengan menambahkan
bufer elusi kebagian tengah PD column mantrix.
200 µL bufer PD2 (pastikan pelet sudah larut
Setelah itu dibiarkan minimal 2 menit agar bufer
dalam bufer PD 1 ) kemudian dibolak – balik
elusi terserap sempurna. Sentrifuga kembali cairan
tabung 10x dengan hati-hati (jangan gunakan
dalam 2 ml collection tube ke bagian tengah PD
vortex). Selanjutnya di inkubasi dalam suhu ruang
column matrix. Kemudian disentrifuga pada
minimal 2 menit.
14.000 – 16.000 x g selama 2 menit untuk
II.1.2.4.
mendapatkan DNA murni.
Neutralization
Neutralisasi
dilakukan
dengan
menambahkan 300 µL bufer PD3 kemudian
dibolak – balik tabung 10x (jangan gunakan
vortex). Setelah itu disentrifugasi pada 14.000 –
16.000 x g selama 3 menit.
II.1.2.5.
DNA Binding
III.
HASIL DAN PEMBAHASAN
III.1. HASIL
Praktikum
isolasi
plasmid
biologi
DNA
dari
molekuler
kromosomal
bakteri
tentang
dan
Eschericia
didapatkan hasil sebagai berikut.
DNA
coli
No
Tahapan
Gambar
Keterangan
Isolasi DNA Kromosom
1.
Penamba
Terdapat
han 60
bakteri
kultur
EDTA
2.
50 mM
Penamba
Terbentuknya
han
lapisan
3
klorofor
m
3.
Penamba
Terbentuknya
han
lapisan
2
etonol
dingin
Isolasi DNA Plasmid
1.
Neutraliz
Terdapat DNA
ation
2.
Wash
Terdapat senyawa
kontaminan
3.
DNA
Terdapat
elution
murni
DNA
PEMBAHASAN
Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan,
yaitu: (1)Isolasi sel; (2)Lisis dinding dan membran
sel; (3)Ekstraksi dalam larutan; (4)Purifikasi; dan
(5)Presipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan
isolasiDNA
ada
2,
yaitu
sentrifugasi
dan
presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah
memisahkan substansi berdasarkan berat jenis
dipisahkan
dari
DNA
melalui
sentrifugasi
(Suharsono,2006).
SDS
dan
Proteinase-k
berfungsi
untuk
molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal
mempermudah isolasi DNA. Tahap lysis tetap
sehingga substansi yang lebih berat akan berada di
menggunakan pelet hasil sentrifuge pada tahap
dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
sebelumnya. Pellet ini diresuspensikan ke dalam
terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut
buffer lisis yang terdiri dari: SDS 20% untuk
dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama
menghancurkan membran sel dan denaturasi
mesin
protein, NaCl untuk mendenaturasi DNA dan
sentrifugasi
dengan
kecepatan
yang
bervariasi, contohnya pada praktikum ini kultur
mulai
bakteri
menghancurkan
disentrifuge
dengan
kecepatan
4300
selama 20 menit.
Proteinase-K
Setelah disentrifuge didapatkan pelet (hasil
dari
pemisahan
menghidrolisis
berat
molekul
oleh
RNA,
dinding
5
enzim
sel
mg/mL
lisosim
bakteri,
berfungsi
dan
untuk
memotong-motong atau memutus ikatan peptida
gaya
dari protein-protein sel bakteri tersebut, lalu
sentrifugal) disuspensikan kembali dan timbahkan
campuran tersebut dihomogenkan menggunakan
EDTA yang berfungsi EDTA berfungsi sebagai
vortex agar pemutusan ikatan-ikatan peptida
pengkelat magnesium kalsium yang berperan
tersebut lebih cepat terjadi. Selanjutnya suspensi
dalam menjaga stabilitas membran plasma serta
diinkubasi pada suhu 50oC selamat 1 jam. Hal
menghambat DNAse sehingga molekul DNA tidak
tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja
terdenaturasi. Penambahan sukrosa 25% juga
enzim yang sangat dipengaruhi oleh suhu.
diperlukan untuk meningkatkan tekanan osmotik
Presipitasi
di luar sel yang mampu membantu proses pelisisan
organik
(Suharsono,2006).
menghilangkan sisa protein (Triwibowo,2005).
Kemudian dilanjutkan pada ekstraksi DNA
menggunakan
seperti
Lisozim
fenol
kloroform
ditambahkan
atau
pelarut
berguna
untuk
guna
untuk
dengan tujuan agar didapat ekstrak dari nukleus.
perusakan atau pembuangan dinding sel yang telah
DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel
dilisiskan oleh larutan sukrosa dan EDTA. NaCl
selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan
berfungsi untuk penggabungan kembali pelet
komponen
dengan larutan yang telah ditambahkan pada cara
polisakarida
penyusun
dan
sel
protein
lainnya
agar
DNA
seperti
yang
kerja
sebelumnya,
SDS
berfungsi
untuk
didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol
melarutkan protein pada membran sel darah putih
seringkali
pendenaturasi
dan larutan EDTA berfungsi melindungi DNA dari
protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol
aktivitas DNAse sehingga DNA tidak rusak
menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan
sementara proteinase-K merupakan salah satu
digunakan
sebagai
mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat
enzim yang digunakan untuk merusak protein
yang ada (Triwibowo,2005).
Lisis sel dalam isolasi DNA plasmid
digunakan
DNA plasmid mempunyai ukuran yang
buffer
P1
dan
P2.
Buffer
P1
sebelumnya telah ditambah dengan enzim RNAse
jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk
A untuk perusakan dinding dan lisis sel. Pada pH
memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan
12-12,5 ikatan hidrogen dari DNA kromosom non
perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur
supercoiled akan terdenaturasi, heliks ganda
isolasi DNA kromosom. Setelah proses kultur
terurai dan kedua rantai polipeptida memisah.
bakteri di sentrifuge 14000-16000 rpm yang
Penambahan P2 akan memperjelas proses ini
kemudian dibuang supernatannya. Setelah itu pada
untuk mengecek apakah denaturasi ini telah
tahapan resuspensi ditambahkan RNAse berfungsi
berhasil dengan baik atau tidak (Sudjadi,2008).
untuk mendegradasi RNA
Hasil isolasi DNA yang didapat dari
Kemudian dilakukan penambahan etanol
percobaan ini adalah seperti benang-benang halus
absolut berguna untuk mengendapkan kromosom
yang berwarna putih. Benang-benang tersebut
karena
yang
merupakan kumpulan DNA yang berbentuk
ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi
kromatin. Kromatin terdiri dari sejumlah molekul
DNA kromosom yang mengendap. Kromosom
DNA yang beruntai ganda yang sangat panjang
yang didapatkan berupa pellet ditambahkan bufer
dan massa protein dasar yang agak kecil serta
TE.
hampir sama besarnya yang dinamakan histon
perbedaan
polaritas,
etanol
Pemurnian atau isolasi DNA plasmid
menggunakan
metode
lebih sedikit (sebagian diantaranya bersifat asam
pemurnian berdasarkan konformasi DNA (dengan
dan berukuran lebih besar daripada histon) dan
denaturasi alkali). Kebanyakan DNA plasmid
sejumlah kecil RNA. Heliks DNA berantai ganda
berada dalam sel sebagai molekul yang sangat
dalam setiap kromosom memiliki panjang yang
berlilitan (supercoiled) atau disebut covalently
besarnya ribuan kali diameter nukleus sel. Salah
closed circular (CCC) DNA. DNA kromosom jauh
satu tujuan molekul ini, khususnya histon adalah
lebih longgar ikatan kedua untainya. Molekul
untuk memadatkan DNA.
supercoiled
kit
ini
ini
jauh
menggunakan
disamping protein non histon dalam jumlah yang
lebih
tahan
terhadap
Presipitasi adalah sentrifuge supernatan beserta
denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA
campurannya dengan kecepatan 6000 rpm selama
kromosom dan dapat dipisahkan dengan dua cara
20 menit. Hasil yang diperoleh adalah pelet yang
yaitu: denaturasi dengan alkali, dan pemurnian
mengandung DNA plasmid dan supernatan yang
berdasarkan kerapatan apung (bouyant density)
mengandung larutan NaOAc dan ethanol absolut.
atau dikenal dengan istilah equilibrium density
Sehingga, yang diambil pada tahap ini adalah
gradient centrifugation atau sentrifugasi isopiknik
bagian pellet dan yang dibuang adalah bagian
(Sudjadi,2008).
supernatan.
KESIMPULAN
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga
yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa
dan protein, serta pemurnian DNA.
Suharsono dan Widyastuti. 2006. Penuntun
Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan
Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati
dan Bioteknologi. IPB.
Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. Erlangga.
Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N.A. 2002. Biologi 5th ed. Erlangga.
Jakarta
Jusuf. 2001. Genetika I: Struktur dan Ekspresi
gen. Sagung Seto. Jakarta
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Kasinius.
Yogyakarta.
Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. Erlangga.
Jakarta
Wolfe, S. L. 1993. Molecular and cellular
biology. Wodsworth Publishing Company.
Belmont
LAMPIRAN
Kultur bakteri di sentrifuse
50 μl, ditetesi ke Pd colum
KIT
Pengambilan supernatan
Pengambilan bufer elusi
Pelet
pengambilan bufer
wash
Kultur di sentrifuse slma 1 mnt
kloroform
Etanol dingin
lpisan Dna, protein,
Kromosomal+kloroform
plasmid+Pd3+sentrifuse
Krmsomal+klofrom+dikocok 20menit
Pengambilan supernatan
Lapisan DNA, protein, kloroform
Pellet
Kromosomal+kloroform+dikocok 20 menit
Plasmid+PD3+sentrifuge
Rois Muqsith Fatawy 1)
drh. Bhintarti S.Hastari, M.Biomed2), Festy Aulyaur Rahmah, S.Si2)
Nugroho Adi Maulana3) ,Indhina Reihannisha3)
1)
Mahasiswa Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Negeri Islam Syarif Hidayatullah Jakarta
2)
Dosen Praktikum Biologi Molekuler
3)
Asisten Dosen Biologi Molekuler
Jl. Ir. Djuanda, Tangerang Selatan 15412, Indonesia
Email : rois.muqsith@gmail.com
Oktober 2014
ABSTRAK
DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke
generasi selanjutnya. DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme
prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk
linier. Kromosom adalah suatu struktur makromolekul yang berisi DNA di mana informasi genetik dalam sel
disimpan. sekuens DNA yang terletak pada kromosom disebut DNA Kromosomal. Plasmid sebagai DNA
ekstrakromosomal merupakan molekul DNA pada sel bakteri, berbentuk bulat kecil yang berbeda dan
merupakan tambahan dari molekul DNA utama pada kromosom bakteri. Isolasi DNA merupakan langkah
yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Isolasi DNA
dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari
bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
Kata Kunci : Isolasi, Plasmid, Dna Kromosomal
I.
DASAR TEORI
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan
senyawa kimia yang paling penting dalam
makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang
mengandung informasi genetik makhluk hidup
dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo
2004).
Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan
membentuk genom. Genom meliputi bagian gen
yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel
organisme. DNA genom meliputi gen dan
intergen(Campbell dkk.2004).
DNA organisme prokariot dan eukariot
mempunyai perbedaan bentuk. Organisme
prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular,
sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA
berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti
sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam
inang. Biasanya, plasmid membawa gen yang
sitoplasma (Jusuf, 2001).
menjadi enzim yang pada keadaan tertentu
Kromosom adalah suatu struktur
menguntungkan sel inang, di antaranya resisten
makromolekul yang berisi DNA di mana informasi
terhadap antibiotik, produksi antibiotik, degradasi
genetik dalam sel disimpan. sekuens DNA yang
senyawa organic kompleks, produksi kolkisin,
terletak pada kromosom disebut DNA
produksi enterotoksin, enzim restriksi, dan enzim
Kromosomal. Kata kromosom berasal dari kata
modifikasi (Sudjadi, 2008).
khroma yang berarti warna dan soma yang berarti
badan Kromosom terdiri atas dua bagian, yaitu
sentromer / kinekthor yang merupakan pusat
kromosom berbentuk bulat dan lengan kromosom
yang mengandung kromonema & gen berjumlah
dua buah (sepasang)(Godam, 2008).
Kromosom adalah pembawa gen yang
terdapat di dalam inti sel (nukleus). Kromosom
terdiri dari DNA, RNA (asam ribo nukleat) dan
protein. Kromosom homolog (2n) adalah
kromosom yang terdapat berpasangan dan
memiliki struktur dan komposisi yang sama. sel
yang memiliki 2n kromosom (kromosom
homolog) disebut sel diploid. Bila tidak
berpasangan kromosom diberi simbol n
kromosom. Sel dengan n kromosom adalah sel
haploid, misalnya sel kelamin jantan saja atau sel
kelamin betina saja (Desrizal, 2012).
Plasmid bekteri yang biasanya merupakan
molekul DNA untai ganda dengan ukuran dari 1
kb sampai dengan lebih dari 200 kb. Plasmid ini
terdapat dalam berbagai spesies bakteri dan
merupakan satuan genetik tambahan yang
bereplikasi dengan tidak tergantung pada
kromosom bakteri dan diturunkan kepada anakan.
Akan tetapi, dalam replikasi dan transkripsi tetap
tergantung pada enzim yang terdapat pada sel
Plasmid sebagai DNA ekstrakromosomal
merupakan molekul DNA pada sel bakteri,
berbentuk bulat kecil yang berbeda dan merupakan
tambahan dari molekul DNA utama pada
kromosom bakteri. Kebanyakan plasmid adalah
sirkular dan tersusun dari beberapa ribu pasangan
basa. Plasmid mempunyai titik ori (origin of
replication) sehingga mampu mereplikasi diri
tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi
dimulai dari titik ori hingga semua plasmid
tereplikasi (Pierce, 2005)
Berbagai tipe plasmid telah ditemukan
pada sel bakteri. Distribusi plasmid pada bakteri
bersifat sporadis karena ada bakteri yang
mengandung plasmid tetapi ada juga yang tidak,
misalnya pada sel E.coli terdapat plasmid F yang
menyebabkan bakteri ini mempunyai sifat
konjugatif tertentu. Plasmid F biasa digunakan
sebagai vector untuk membawa DNA yang akan
disisipkan pada genom sel target. Plasmid juga
merupakan alat yang efisien untuk
mengamplifikasi klon DNA karena memiliki kopi
yang sangat banyak per selnya.
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan
untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti
protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama
dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran
(lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini
padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian
adalah kultur bakteri Escherichia coli, EDTA 50
DNA.
mM, larutan sukrosa 25%, EDTA 0,5 M pH 8,
Isolasi DNA merupakan langkah yang
lisozim 10 mg/ml, NaCL 5 M, SDS 20%,
tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada
proteinase-K 5 mg/ml, kloroform, etanol dingin,
dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi
bufer TE, yellow tips, blue tips, bufer PD1,
merupakan teknik untuk memisahkan campuran
RNAse A, bufer PD2, bufer PD3, buffer W1, bufer
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul
wash, Ethanol absolut, bufer elusi, tabung mikro
yang mempunyai berat molekul besar akan berada
1,5 mL, PD column, 2 ml collection tube, blue tips
di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua
2.1 METODE
II.1.1. Isolasi
bagian atas dan pelet pada bagian bawah
langkah yang dilakukan untuk mengendapkan
suatu komponen dari campuran (Alberts, 1994).
Praktikum ini bertujuan supaya mahasiswa
mampu melakukan isolasi DNA kromosomal
bakteri dan juga melakukan isolasi DNA plasmid
sengan metode spin column.
II.
MATERI DAN METODE
2.1. MATERI
Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium
Biologi Dasar, Pusat Laboratorium Terpadu,
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Jakarta pada tanggal 17 Oktober 2014.
Kromosmal
Bakter
Escherichia coli
macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada
(Campbell dkk. 2002). Presipitasi merupakan
DNA
Sebanyak 1,5 ml kultur bakteri
Escherichia coli di sentrifugasi dengan kecepatan
4300 rpm selama 20 menit. Kemudian pelet yang
didapat disuspensikan lagi dengan 60 µL EDTA
50 mM, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 4300
rpm
selama
15
menit.
Pelet
kemudian
ditambahkan dengan 40 µL larutan sukrosa 25%
dan 10,5 EDTA 0,5 M pH 8. Setelah itu
ditambahkan dengan 1,5 µL lisozim 10 mg/ml dan
diinkubasi pada suhu 37 ◦C selama 1 jam. Tahap
selanjutnya yaitu ditambahkan 18 µL NaCL 5 M;
10,5 µL EDTA 0,5 M; 22,5 µL SDS 20%, dan 1,5
µL proteinase-K 5 mg/ml kemudian divortex.
Sediaan di inkubasi pada suhu 50 ◦C selama 1 jam,
kemudian tambahkan klorofom (1:1) dan kocok
pelan selama 20 menit. Selanjutnya sentrifugasi
Alat- alat yang di digunakan dalam praktikum
dengan kecepatan 4300 rpm selama 30 menit.
ini yaitu sentrifuga, mikropipet, vortex, waterbath,
Supernatan dipindahkan (larutan yang terlihat
freezer,dan inkubator.
bening) ke tabung baru yang berisi 2x volume
etanol dingin.
Sentrifugasi dengan kecepatan
10.000 rpm selama 5 menit (jika tidak ada
kecepatan 10.000 rpm bisa dengan menggunakan
Tahap ini dilakukan dengan cara tempatkan
penggandaan waktu, misal 5000 rpm selama 10
PD column dalam pada 2 ml collection tube.
menit). Selanjutnya ditambahkan pelet dengan 30
Kemudian supernata dituang dari tahap setelah
µL bufer TE. Simpan pada suhu -20 ◦C.
neutralisasi, selanjutnya disentrifuga pada 14.000
II.1.2. Isolasi DNA Plasmid dengan Metode
Spin
II.1.2.1.
1,5
2 ml collection tube, kemudian pasang kembali PD
column pada 2 ml collection tube.
Harvesting
Sebanyak
– 16.000 x g selama 30 detik. Cairan dibuang pada
mL
kultur
sel
bakteri
II.1.2.6.
disiapkan dalam tabung mikro 1,5 mL. Kemudian
Tahap ini dilakukan dengan menambahkan
disentrifuga pada 14.000 – 16.000 x g selama 2
600 µL was buffer (pastikan etanol telah
menit kemudian dibuang supernatan.
ditambahkan) ke dalam PD column kemudian
II.1.2.2.
disentrifuga pada 14.000 – 16.000 x g selama 20
Resuspension
detik. Kemudian buang cairan dalam 2 ml
200 µL bufer PD1 Resuspensi dilakukan
collection tube, selanjutnya sentrifuga pada 14.000
dengan menambahkan (pastikan RNAse A telah
– 16.000 g selama 3 menit untuk mengeringkan
ditambahkan I ) kedalam tabung mikro kemudian
PD column.
divortex.
II.1.2.3.
II.1.2.7.
Lysis
Tahap ini dilakukan dengan menambahkan 50 µL
Proses lisis dilakukan dengan menambahkan
bufer elusi kebagian tengah PD column mantrix.
200 µL bufer PD2 (pastikan pelet sudah larut
Setelah itu dibiarkan minimal 2 menit agar bufer
dalam bufer PD 1 ) kemudian dibolak – balik
elusi terserap sempurna. Sentrifuga kembali cairan
tabung 10x dengan hati-hati (jangan gunakan
dalam 2 ml collection tube ke bagian tengah PD
vortex). Selanjutnya di inkubasi dalam suhu ruang
column matrix. Kemudian disentrifuga pada
minimal 2 menit.
14.000 – 16.000 x g selama 2 menit untuk
II.1.2.4.
mendapatkan DNA murni.
Neutralization
Neutralisasi
dilakukan
dengan
menambahkan 300 µL bufer PD3 kemudian
dibolak – balik tabung 10x (jangan gunakan
vortex). Setelah itu disentrifugasi pada 14.000 –
16.000 x g selama 3 menit.
II.1.2.5.
DNA Binding
III.
HASIL DAN PEMBAHASAN
III.1. HASIL
Praktikum
isolasi
plasmid
biologi
DNA
dari
molekuler
kromosomal
bakteri
tentang
dan
Eschericia
didapatkan hasil sebagai berikut.
DNA
coli
No
Tahapan
Gambar
Keterangan
Isolasi DNA Kromosom
1.
Penamba
Terdapat
han 60
bakteri
kultur
EDTA
2.
50 mM
Penamba
Terbentuknya
han
lapisan
3
klorofor
m
3.
Penamba
Terbentuknya
han
lapisan
2
etonol
dingin
Isolasi DNA Plasmid
1.
Neutraliz
Terdapat DNA
ation
2.
Wash
Terdapat senyawa
kontaminan
3.
DNA
Terdapat
elution
murni
DNA
PEMBAHASAN
Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan,
yaitu: (1)Isolasi sel; (2)Lisis dinding dan membran
sel; (3)Ekstraksi dalam larutan; (4)Purifikasi; dan
(5)Presipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan
isolasiDNA
ada
2,
yaitu
sentrifugasi
dan
presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah
memisahkan substansi berdasarkan berat jenis
dipisahkan
dari
DNA
melalui
sentrifugasi
(Suharsono,2006).
SDS
dan
Proteinase-k
berfungsi
untuk
molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal
mempermudah isolasi DNA. Tahap lysis tetap
sehingga substansi yang lebih berat akan berada di
menggunakan pelet hasil sentrifuge pada tahap
dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
sebelumnya. Pellet ini diresuspensikan ke dalam
terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut
buffer lisis yang terdiri dari: SDS 20% untuk
dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama
menghancurkan membran sel dan denaturasi
mesin
protein, NaCl untuk mendenaturasi DNA dan
sentrifugasi
dengan
kecepatan
yang
bervariasi, contohnya pada praktikum ini kultur
mulai
bakteri
menghancurkan
disentrifuge
dengan
kecepatan
4300
selama 20 menit.
Proteinase-K
Setelah disentrifuge didapatkan pelet (hasil
dari
pemisahan
menghidrolisis
berat
molekul
oleh
RNA,
dinding
5
enzim
sel
mg/mL
lisosim
bakteri,
berfungsi
dan
untuk
memotong-motong atau memutus ikatan peptida
gaya
dari protein-protein sel bakteri tersebut, lalu
sentrifugal) disuspensikan kembali dan timbahkan
campuran tersebut dihomogenkan menggunakan
EDTA yang berfungsi EDTA berfungsi sebagai
vortex agar pemutusan ikatan-ikatan peptida
pengkelat magnesium kalsium yang berperan
tersebut lebih cepat terjadi. Selanjutnya suspensi
dalam menjaga stabilitas membran plasma serta
diinkubasi pada suhu 50oC selamat 1 jam. Hal
menghambat DNAse sehingga molekul DNA tidak
tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja
terdenaturasi. Penambahan sukrosa 25% juga
enzim yang sangat dipengaruhi oleh suhu.
diperlukan untuk meningkatkan tekanan osmotik
Presipitasi
di luar sel yang mampu membantu proses pelisisan
organik
(Suharsono,2006).
menghilangkan sisa protein (Triwibowo,2005).
Kemudian dilanjutkan pada ekstraksi DNA
menggunakan
seperti
Lisozim
fenol
kloroform
ditambahkan
atau
pelarut
berguna
untuk
guna
untuk
dengan tujuan agar didapat ekstrak dari nukleus.
perusakan atau pembuangan dinding sel yang telah
DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel
dilisiskan oleh larutan sukrosa dan EDTA. NaCl
selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan
berfungsi untuk penggabungan kembali pelet
komponen
dengan larutan yang telah ditambahkan pada cara
polisakarida
penyusun
dan
sel
protein
lainnya
agar
DNA
seperti
yang
kerja
sebelumnya,
SDS
berfungsi
untuk
didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol
melarutkan protein pada membran sel darah putih
seringkali
pendenaturasi
dan larutan EDTA berfungsi melindungi DNA dari
protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol
aktivitas DNAse sehingga DNA tidak rusak
menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan
sementara proteinase-K merupakan salah satu
digunakan
sebagai
mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat
enzim yang digunakan untuk merusak protein
yang ada (Triwibowo,2005).
Lisis sel dalam isolasi DNA plasmid
digunakan
DNA plasmid mempunyai ukuran yang
buffer
P1
dan
P2.
Buffer
P1
sebelumnya telah ditambah dengan enzim RNAse
jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk
A untuk perusakan dinding dan lisis sel. Pada pH
memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan
12-12,5 ikatan hidrogen dari DNA kromosom non
perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur
supercoiled akan terdenaturasi, heliks ganda
isolasi DNA kromosom. Setelah proses kultur
terurai dan kedua rantai polipeptida memisah.
bakteri di sentrifuge 14000-16000 rpm yang
Penambahan P2 akan memperjelas proses ini
kemudian dibuang supernatannya. Setelah itu pada
untuk mengecek apakah denaturasi ini telah
tahapan resuspensi ditambahkan RNAse berfungsi
berhasil dengan baik atau tidak (Sudjadi,2008).
untuk mendegradasi RNA
Hasil isolasi DNA yang didapat dari
Kemudian dilakukan penambahan etanol
percobaan ini adalah seperti benang-benang halus
absolut berguna untuk mengendapkan kromosom
yang berwarna putih. Benang-benang tersebut
karena
yang
merupakan kumpulan DNA yang berbentuk
ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi
kromatin. Kromatin terdiri dari sejumlah molekul
DNA kromosom yang mengendap. Kromosom
DNA yang beruntai ganda yang sangat panjang
yang didapatkan berupa pellet ditambahkan bufer
dan massa protein dasar yang agak kecil serta
TE.
hampir sama besarnya yang dinamakan histon
perbedaan
polaritas,
etanol
Pemurnian atau isolasi DNA plasmid
menggunakan
metode
lebih sedikit (sebagian diantaranya bersifat asam
pemurnian berdasarkan konformasi DNA (dengan
dan berukuran lebih besar daripada histon) dan
denaturasi alkali). Kebanyakan DNA plasmid
sejumlah kecil RNA. Heliks DNA berantai ganda
berada dalam sel sebagai molekul yang sangat
dalam setiap kromosom memiliki panjang yang
berlilitan (supercoiled) atau disebut covalently
besarnya ribuan kali diameter nukleus sel. Salah
closed circular (CCC) DNA. DNA kromosom jauh
satu tujuan molekul ini, khususnya histon adalah
lebih longgar ikatan kedua untainya. Molekul
untuk memadatkan DNA.
supercoiled
kit
ini
ini
jauh
menggunakan
disamping protein non histon dalam jumlah yang
lebih
tahan
terhadap
Presipitasi adalah sentrifuge supernatan beserta
denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA
campurannya dengan kecepatan 6000 rpm selama
kromosom dan dapat dipisahkan dengan dua cara
20 menit. Hasil yang diperoleh adalah pelet yang
yaitu: denaturasi dengan alkali, dan pemurnian
mengandung DNA plasmid dan supernatan yang
berdasarkan kerapatan apung (bouyant density)
mengandung larutan NaOAc dan ethanol absolut.
atau dikenal dengan istilah equilibrium density
Sehingga, yang diambil pada tahap ini adalah
gradient centrifugation atau sentrifugasi isopiknik
bagian pellet dan yang dibuang adalah bagian
(Sudjadi,2008).
supernatan.
KESIMPULAN
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga
yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa
dan protein, serta pemurnian DNA.
Suharsono dan Widyastuti. 2006. Penuntun
Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan
Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati
dan Bioteknologi. IPB.
Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. Erlangga.
Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N.A. 2002. Biologi 5th ed. Erlangga.
Jakarta
Jusuf. 2001. Genetika I: Struktur dan Ekspresi
gen. Sagung Seto. Jakarta
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Kasinius.
Yogyakarta.
Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. Erlangga.
Jakarta
Wolfe, S. L. 1993. Molecular and cellular
biology. Wodsworth Publishing Company.
Belmont
LAMPIRAN
Kultur bakteri di sentrifuse
50 μl, ditetesi ke Pd colum
KIT
Pengambilan supernatan
Pengambilan bufer elusi
Pelet
pengambilan bufer
wash
Kultur di sentrifuse slma 1 mnt
kloroform
Etanol dingin
lpisan Dna, protein,
Kromosomal+kloroform
plasmid+Pd3+sentrifuse
Krmsomal+klofrom+dikocok 20menit
Pengambilan supernatan
Lapisan DNA, protein, kloroform
Pellet
Kromosomal+kloroform+dikocok 20 menit
Plasmid+PD3+sentrifuge