Efek Imunomodulator Fraksi n-Heksan Daun Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) Terhadap Respon Hipersensitivitas Dan Titer Antibodi Sel Imun Mencit Jantan Chapter III V
BAB III
METODE PENELITIAN
Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan tahapan
penelitian yaitu penyiapan sampel, skrining simplisia, karakterisasi simplisia,
penyiapan hewan percobaan dan pengujian respon hipersensitivitas tipe dan titer
antibodi pada hewan percobaan. Data hasil penelitian dianalisis secara ANAVA
(analisis variansi) dan Kruskal-Wallis dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tukey
menggunakan SPSS (Statistical Product and Service Solution) versi 17.0 dan
Mann Whitney.
2.1. Alat dan Bahan
2.1.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas
laboraturium,microtiration plate96, microtube, mortir dan stamfer, neraca hewan,
neraca listrik, oral sonde, mikro pipet, plethysmometer digital,spuit 1ml, dan
centrifuge PLC series, kandang mencit.
2.1.2 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunnakan dalam penelitian ini adalah fraksi n-Heksan
daun mahkota dewa, Natrium Carboxy Methyl Cellulose (CMC) Na, akuades, sel
darah merah sapi (SDMS), larutan Phosphate Buffered Saline (PBS), larutan
tritron, tablet levamisol, heparin (inviclot®).
Universitas Sumatera Utara
2.2
Hewan percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah mencit jantan
dengan berat badan 20-35 gram yang berumur 8-12 minggu.Sebelum digunakan,
mencit dipelihara selama 2 minggu dalam kandang yang baik untuk menyesuaikan
diri dengan lingkungannya, dan diberi makan pelet hewan serta air.
2.3
Fraksi n-heksan Daun Mahkota Dewa (FHDMD)
Fraksi diperoleh dari Amos P. Lumban Tobing pada Juni 2016. Metode
fraksinasi yang digunakan yaitu metode maserasi, sesuai dengan yang tertera
dalam Farmakope Indonesia Edisi III (1979).
Serbuk simplisia dan mahkota dewa dimaserasi dengan 75 bagian pelarut nheksan sampai seluh serbuk terendam, ditutupi dan dibiarkan selama 5 hari
terlindung dari cahaya, sambil sesekali diaduk. Kemudian sampel disaring dan
filtat diproleh, sedangkan residu di rendam kembali menggunakan 25 bagian nheksan, dimasukkan dalam wadah dan disimpan ditempat yang terlindung dari
cahaya selama 2 hari (Ditjen POM, 1979). Seluruh maserat digabung dan
dipekatkan dengan bantuan alat rotary evaporator pada temperature ±40ºC,
kemudian dikeringkan dengan freeze dryer pada suhu -40ºC sampai diperoleh
fraksi kental.
2.4
Penyiapan Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan adalah mencit jantan dengan berat 20-35 g dibagi 5
kelompok, 1 kelompok untuk kontrol pembawa, 1 kelompok untuk kontrol positif,
dan 3 kelompok uji. Tiap kelompok terdiri dari 5 ekor mencit.Sebelum digunakan
Universitas Sumatera Utara
sebagi hewan percobaan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama kurang
lebih satu minggu dalam kandang yang baik pada suhu ruangan untuk
penyesuaian lingkungan, pengontrolan kesehatan dan berat badan. Mencit diberi
makan pelet hewan dan tetap diberi air minum.
Penentuan besar sampel dihitung dengan rumus Federer (Arkeman dan
David, 2006) sebagai berikut:
(n-1) (t-1) ≥ 15
Keterangan:
n= besar sampel
t= jumlah kelompok perlakuan
jumlah hewan yang digunakan 5 ekor. Perhitungan jumlah hewan yang digunakan
dapat dilihat pada (Lampiran 6).
2.5
Penyiapan Kontrol, Bahan Uji, dan Antigen
Penyiapan kontrol, bahan uji, dan antigen meliputi penyiapan CMC
0,5%,penyiapan suspensi levamisol, penyiapan suspensi fraksi n-heksan daun
mahkota dewa dan penyiapan sel darah merah sapi.
2.5.1 Penyiapan Suspensi CMC Na 0,5%
Sebanyak 0,5 gNa-CMC ditaburkan dalam lumpang yang berisi aquadest
yang dipanaskan. Didiamkan selama 15 menit lalu digerus hingga diperoleh
massa yang transparan, diencerkan dengan aquadest, dihomogenkan dan
dimasukkan ke labu tentukur 100 ml,dicukupkan volumenya dengan aquadest
hingga 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
2.5.2 Penyiapan Suspensi levamisol
Pengambilan tablet levamisol yaitu dengan cara ditimbang dan digerus tidak
kurang dari 20 tablet. Ditimbang serbuk yang telah dihaluskan tersebut kemudian
ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan lebih kurang 25 mg levamisol
(Depkes, 1995).
Pembuatan suspensi levamisol dilakukan dengan cara sebagai berikut:
levamisol 29,46 mg (setara dengan 25 mg levamisol) sebanyak 0,25 mg ditimbang
dan dimasukkan kedalam lumpang. Digerus serbuk kemudian ditambahkan
suspensi CMC Na 0,5% secukupnya. Digerus hingga homogen dan dituangkan
kedalam labu tentukur 25 ml,ditambahkan suspensi CMC Na 0,5% sampai batas
tanda. Perhitungan serbuk levamisol yang ditimbang dapat dilihat pada (Lampiran
4).
2.5.3 Penyiapan Suspensi Fraksi n-heksan Daun Mahkota Dewa (FHDMD)
Untuk dosis 100 mg/kg BB dibuat dengan cara sebagai berikut; Ditimbang
100 mg fraksi n-heksan daun mahkota dewa, kemudian dimasukkan ke dalam
lumpang. Kemudian tuang sedikit demi sedikit suspensi CMC Na 0,5% sambil
digerus hingga homogen, setelah homogen dituangkan ke dalam labu tentukur 10
ml dan dicukupkan dengan suspensi CMC Na 0,5% hingga garis tanda. Begitu
juga untuk pembuatan dosis 25 mg/kg BB dan 50 mg/kg BB dilakukan hal yang
sama.
2.5.4 Penyiapan Phosphate Buffered Saline (PBS)
Pembuatan PBS dilakukan dengan cara sebagai berikut: melarutkan 1 tablet
PBS dalam 200 ml aquadest (sigma).
Universitas Sumatera Utara
2.5.5 Penyiapan Sel Darah Merah Sapi (SDMS)
Penyiapan dan pembuatan SDMS dilakukan dengan cara sebagai berikut:
Darah segar dikumpulkan dari sapi yang disembelih, diperoleh 500 ml. Kemudian
ditambahkan 1,5 ml antikoagualan dan dimasukkan ke dalam termos yang berisi
es.
Darah sapi segar yang telah diberi antikoagulan dimasukkan dalam tabung
sentrifus sebanyak 5 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5
menit untuk memisahkan plasma dari sel darah merah. Lapisan atas yang berupa
plasma dibuang dan lapisan bawah yang berupa endapan sel darah merah
ditambahkan larutan PBS sebanyak 3 ml. Tabung kemudian dibolak-balik dengan
perlahan-lahan
sampai
SDMS
tercampur
secara
homogen,
kemudian
disentrifugasi lagi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Lapisan atas yang
jernih dibuang dan lapisan bawah adalah SDMS murni. SDMS ditambahkan PBS
sebanyak 3 ml homogenkan sehingga diperoleh SDMS 50%. Kemudian diambil
0,2 ml SDMS 50%, ditambahkan larutan PBS sebanyak 10 ml sehingga diperoleh
SDMS 1% (Emelda, 2015).
2.6
Uji Respon Hipersensitivitas
Efek imunomodulator fraksi n-heksan daun mahkota dewa ditentukan
dengan
mengukur
volume
respon
hipersensitivitasmenggunakan
uji
pembengkakan telapak kaki hewan uji (foot paw swelling test) (Lakshmi, 2003;
Ray, 1996).
Sebanyak 25 ekor mencit dibagi menjadi 5 kelompok dengan pembagian
sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
a
Kelompok I diberi suspensi CMCNa 0,5%sebagai kontrol pelarut.
b
Kelompok II diberi suspensi fraksi n-heksan Daun Mahkota Dewa
(FHDMD) dengan dosis 25 mg/kg bb.
c
Kelompok III diberi FHDMD dengan dosis 50 mg/kg bb.
d
Kelompok IV diberi FHDMD dengan dosis 100 mg/kg bb.
e
Kelompok V diberi suspensi levamisol dengan dosis 25 mg/kg bb sebagai
kontrol positif.
Tiap kelompok diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah sapi (SDMS)
1%secara intraperitoneal pada hari ke-0. Kemudian pada hari berikutnya diberikan
perlakuan satu kali setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sendi kaki mencit
sebelah kanan diberi tanda batas pengukuran volume kaki mencit.Volume kaki
mencit diukur sebagai volume awal (V0).Kemudian mencit diinjeksikan dengan
0,1 ml sel darah merah sapi (SDMS) 1% secara intraplantar pada telapak kaki
sebelah kanan.
Pada hari kedelapan (setelah 24 jam) diukur volume pembengkakan kaki
mencit
dengan
plethysmometer
digital.
Pengukuran
dilakukan
dengan
mencelupkan kaki mencit ke dalam tabung yang berisi larutan triton terlihat pada
kenaikan skala pada plethysmometer sebagai volume waktu tertentu (Vt) kaki
mencit. Volume pembengkakan kaki mencit ditentukan berdasarkan selisih antara
volume waktu tertentu (Vt) dengan volume awal (V0) (Shivaprasad, 2006).
2.7
Uji Titer Antibodi
Tiap kelompok diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah sapi (SDMS)
1% secara intraperitoneal pada hari ke-0. Kemudian diberikan perlakuan satu kali
Universitas Sumatera Utara
setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sampel darah masing-masing mencit
diambil melalui pembuluh darah vena di bagian ekor. Sampel darah dikumpulkan
dalam tabung mikro (microtube), kemudian dilakukan pemusingan 1900 rpm
dengan alat sentrifugasi selama 10 menit dan diambil serumnya.
Nilai titer atibodi ditentukan dengan metode hemaglutinasi. Duapuluh lima
mikroliter (25 µl) serum diteteskan ke dalam lubang microtitration plate96
lubang, ditambahkan larutan PBS dengan volume yang sama, dan diencerkan dua
kali lipat (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1024; 1:2048)
kemudian ditambahkan SDMS dengan volume yang sama dengan volume serum
dan PBS. Kemudian diamati penggumpalan yang terjadi (Makare, et al., 2001;
Puri, et al., 1993). Nilai titer antibodi ditentukan berdasarkan pengenceran terakhir
dimana antibodi masih terdeteksi melalui hemaglutinasi terlihat secara visual.
Nilai titer antibodi tersebut selanjutnya ditransformasikan dengan [2log(titer)+1]
(Hargono, 2000).
2.8
Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS versi
17.0.Data ditentukan homogenitas dan normalitasnya untuk menentukan analisis
statistik yang digunakan.Data dianalisis dengan menggunakan uji ANAVA satu
arah (One-Way ANOVA) dan Kruskal-Wallis untuk menentukan perbedaan ratarata diantara perlakuan. Dilanjutkan dengan menggunakan uji Post Hoc Turkey
pada data yang normal dan uji Mann Whitney pada data yang tidak normal untuk
mengetahui variabel mana yang memiliki perbedaan. Berdasarkan nilai signifikan,
P
METODE PENELITIAN
Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan tahapan
penelitian yaitu penyiapan sampel, skrining simplisia, karakterisasi simplisia,
penyiapan hewan percobaan dan pengujian respon hipersensitivitas tipe dan titer
antibodi pada hewan percobaan. Data hasil penelitian dianalisis secara ANAVA
(analisis variansi) dan Kruskal-Wallis dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tukey
menggunakan SPSS (Statistical Product and Service Solution) versi 17.0 dan
Mann Whitney.
2.1. Alat dan Bahan
2.1.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas
laboraturium,microtiration plate96, microtube, mortir dan stamfer, neraca hewan,
neraca listrik, oral sonde, mikro pipet, plethysmometer digital,spuit 1ml, dan
centrifuge PLC series, kandang mencit.
2.1.2 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunnakan dalam penelitian ini adalah fraksi n-Heksan
daun mahkota dewa, Natrium Carboxy Methyl Cellulose (CMC) Na, akuades, sel
darah merah sapi (SDMS), larutan Phosphate Buffered Saline (PBS), larutan
tritron, tablet levamisol, heparin (inviclot®).
Universitas Sumatera Utara
2.2
Hewan percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah mencit jantan
dengan berat badan 20-35 gram yang berumur 8-12 minggu.Sebelum digunakan,
mencit dipelihara selama 2 minggu dalam kandang yang baik untuk menyesuaikan
diri dengan lingkungannya, dan diberi makan pelet hewan serta air.
2.3
Fraksi n-heksan Daun Mahkota Dewa (FHDMD)
Fraksi diperoleh dari Amos P. Lumban Tobing pada Juni 2016. Metode
fraksinasi yang digunakan yaitu metode maserasi, sesuai dengan yang tertera
dalam Farmakope Indonesia Edisi III (1979).
Serbuk simplisia dan mahkota dewa dimaserasi dengan 75 bagian pelarut nheksan sampai seluh serbuk terendam, ditutupi dan dibiarkan selama 5 hari
terlindung dari cahaya, sambil sesekali diaduk. Kemudian sampel disaring dan
filtat diproleh, sedangkan residu di rendam kembali menggunakan 25 bagian nheksan, dimasukkan dalam wadah dan disimpan ditempat yang terlindung dari
cahaya selama 2 hari (Ditjen POM, 1979). Seluruh maserat digabung dan
dipekatkan dengan bantuan alat rotary evaporator pada temperature ±40ºC,
kemudian dikeringkan dengan freeze dryer pada suhu -40ºC sampai diperoleh
fraksi kental.
2.4
Penyiapan Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan adalah mencit jantan dengan berat 20-35 g dibagi 5
kelompok, 1 kelompok untuk kontrol pembawa, 1 kelompok untuk kontrol positif,
dan 3 kelompok uji. Tiap kelompok terdiri dari 5 ekor mencit.Sebelum digunakan
Universitas Sumatera Utara
sebagi hewan percobaan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama kurang
lebih satu minggu dalam kandang yang baik pada suhu ruangan untuk
penyesuaian lingkungan, pengontrolan kesehatan dan berat badan. Mencit diberi
makan pelet hewan dan tetap diberi air minum.
Penentuan besar sampel dihitung dengan rumus Federer (Arkeman dan
David, 2006) sebagai berikut:
(n-1) (t-1) ≥ 15
Keterangan:
n= besar sampel
t= jumlah kelompok perlakuan
jumlah hewan yang digunakan 5 ekor. Perhitungan jumlah hewan yang digunakan
dapat dilihat pada (Lampiran 6).
2.5
Penyiapan Kontrol, Bahan Uji, dan Antigen
Penyiapan kontrol, bahan uji, dan antigen meliputi penyiapan CMC
0,5%,penyiapan suspensi levamisol, penyiapan suspensi fraksi n-heksan daun
mahkota dewa dan penyiapan sel darah merah sapi.
2.5.1 Penyiapan Suspensi CMC Na 0,5%
Sebanyak 0,5 gNa-CMC ditaburkan dalam lumpang yang berisi aquadest
yang dipanaskan. Didiamkan selama 15 menit lalu digerus hingga diperoleh
massa yang transparan, diencerkan dengan aquadest, dihomogenkan dan
dimasukkan ke labu tentukur 100 ml,dicukupkan volumenya dengan aquadest
hingga 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
2.5.2 Penyiapan Suspensi levamisol
Pengambilan tablet levamisol yaitu dengan cara ditimbang dan digerus tidak
kurang dari 20 tablet. Ditimbang serbuk yang telah dihaluskan tersebut kemudian
ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan lebih kurang 25 mg levamisol
(Depkes, 1995).
Pembuatan suspensi levamisol dilakukan dengan cara sebagai berikut:
levamisol 29,46 mg (setara dengan 25 mg levamisol) sebanyak 0,25 mg ditimbang
dan dimasukkan kedalam lumpang. Digerus serbuk kemudian ditambahkan
suspensi CMC Na 0,5% secukupnya. Digerus hingga homogen dan dituangkan
kedalam labu tentukur 25 ml,ditambahkan suspensi CMC Na 0,5% sampai batas
tanda. Perhitungan serbuk levamisol yang ditimbang dapat dilihat pada (Lampiran
4).
2.5.3 Penyiapan Suspensi Fraksi n-heksan Daun Mahkota Dewa (FHDMD)
Untuk dosis 100 mg/kg BB dibuat dengan cara sebagai berikut; Ditimbang
100 mg fraksi n-heksan daun mahkota dewa, kemudian dimasukkan ke dalam
lumpang. Kemudian tuang sedikit demi sedikit suspensi CMC Na 0,5% sambil
digerus hingga homogen, setelah homogen dituangkan ke dalam labu tentukur 10
ml dan dicukupkan dengan suspensi CMC Na 0,5% hingga garis tanda. Begitu
juga untuk pembuatan dosis 25 mg/kg BB dan 50 mg/kg BB dilakukan hal yang
sama.
2.5.4 Penyiapan Phosphate Buffered Saline (PBS)
Pembuatan PBS dilakukan dengan cara sebagai berikut: melarutkan 1 tablet
PBS dalam 200 ml aquadest (sigma).
Universitas Sumatera Utara
2.5.5 Penyiapan Sel Darah Merah Sapi (SDMS)
Penyiapan dan pembuatan SDMS dilakukan dengan cara sebagai berikut:
Darah segar dikumpulkan dari sapi yang disembelih, diperoleh 500 ml. Kemudian
ditambahkan 1,5 ml antikoagualan dan dimasukkan ke dalam termos yang berisi
es.
Darah sapi segar yang telah diberi antikoagulan dimasukkan dalam tabung
sentrifus sebanyak 5 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5
menit untuk memisahkan plasma dari sel darah merah. Lapisan atas yang berupa
plasma dibuang dan lapisan bawah yang berupa endapan sel darah merah
ditambahkan larutan PBS sebanyak 3 ml. Tabung kemudian dibolak-balik dengan
perlahan-lahan
sampai
SDMS
tercampur
secara
homogen,
kemudian
disentrifugasi lagi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Lapisan atas yang
jernih dibuang dan lapisan bawah adalah SDMS murni. SDMS ditambahkan PBS
sebanyak 3 ml homogenkan sehingga diperoleh SDMS 50%. Kemudian diambil
0,2 ml SDMS 50%, ditambahkan larutan PBS sebanyak 10 ml sehingga diperoleh
SDMS 1% (Emelda, 2015).
2.6
Uji Respon Hipersensitivitas
Efek imunomodulator fraksi n-heksan daun mahkota dewa ditentukan
dengan
mengukur
volume
respon
hipersensitivitasmenggunakan
uji
pembengkakan telapak kaki hewan uji (foot paw swelling test) (Lakshmi, 2003;
Ray, 1996).
Sebanyak 25 ekor mencit dibagi menjadi 5 kelompok dengan pembagian
sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
a
Kelompok I diberi suspensi CMCNa 0,5%sebagai kontrol pelarut.
b
Kelompok II diberi suspensi fraksi n-heksan Daun Mahkota Dewa
(FHDMD) dengan dosis 25 mg/kg bb.
c
Kelompok III diberi FHDMD dengan dosis 50 mg/kg bb.
d
Kelompok IV diberi FHDMD dengan dosis 100 mg/kg bb.
e
Kelompok V diberi suspensi levamisol dengan dosis 25 mg/kg bb sebagai
kontrol positif.
Tiap kelompok diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah sapi (SDMS)
1%secara intraperitoneal pada hari ke-0. Kemudian pada hari berikutnya diberikan
perlakuan satu kali setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sendi kaki mencit
sebelah kanan diberi tanda batas pengukuran volume kaki mencit.Volume kaki
mencit diukur sebagai volume awal (V0).Kemudian mencit diinjeksikan dengan
0,1 ml sel darah merah sapi (SDMS) 1% secara intraplantar pada telapak kaki
sebelah kanan.
Pada hari kedelapan (setelah 24 jam) diukur volume pembengkakan kaki
mencit
dengan
plethysmometer
digital.
Pengukuran
dilakukan
dengan
mencelupkan kaki mencit ke dalam tabung yang berisi larutan triton terlihat pada
kenaikan skala pada plethysmometer sebagai volume waktu tertentu (Vt) kaki
mencit. Volume pembengkakan kaki mencit ditentukan berdasarkan selisih antara
volume waktu tertentu (Vt) dengan volume awal (V0) (Shivaprasad, 2006).
2.7
Uji Titer Antibodi
Tiap kelompok diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah sapi (SDMS)
1% secara intraperitoneal pada hari ke-0. Kemudian diberikan perlakuan satu kali
Universitas Sumatera Utara
setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sampel darah masing-masing mencit
diambil melalui pembuluh darah vena di bagian ekor. Sampel darah dikumpulkan
dalam tabung mikro (microtube), kemudian dilakukan pemusingan 1900 rpm
dengan alat sentrifugasi selama 10 menit dan diambil serumnya.
Nilai titer atibodi ditentukan dengan metode hemaglutinasi. Duapuluh lima
mikroliter (25 µl) serum diteteskan ke dalam lubang microtitration plate96
lubang, ditambahkan larutan PBS dengan volume yang sama, dan diencerkan dua
kali lipat (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1024; 1:2048)
kemudian ditambahkan SDMS dengan volume yang sama dengan volume serum
dan PBS. Kemudian diamati penggumpalan yang terjadi (Makare, et al., 2001;
Puri, et al., 1993). Nilai titer antibodi ditentukan berdasarkan pengenceran terakhir
dimana antibodi masih terdeteksi melalui hemaglutinasi terlihat secara visual.
Nilai titer antibodi tersebut selanjutnya ditransformasikan dengan [2log(titer)+1]
(Hargono, 2000).
2.8
Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS versi
17.0.Data ditentukan homogenitas dan normalitasnya untuk menentukan analisis
statistik yang digunakan.Data dianalisis dengan menggunakan uji ANAVA satu
arah (One-Way ANOVA) dan Kruskal-Wallis untuk menentukan perbedaan ratarata diantara perlakuan. Dilanjutkan dengan menggunakan uji Post Hoc Turkey
pada data yang normal dan uji Mann Whitney pada data yang tidak normal untuk
mengetahui variabel mana yang memiliki perbedaan. Berdasarkan nilai signifikan,
P