Efek Imunomodulator Ekstrak Etanol Daun Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) Terhadap Respon Hipersensitivitas dan Titer Antibodi Sel Imun Mencit Jantan Chapter III V
BAB III
METODE PENELITIAN
Metode
penelitian
ini
dilakukan
secara
eksperimental
meliputi
pengumpulan bahan, pengolahan bahan, penyiapan hewan percobaan (mencit),
penyiapan bahan uji dan pengujian efek imunomodulator ekstrak etanol daun
mahkota dewa terhadap respon hipersensitivitas tipe lambat dan titer antibodi sel
imun pada hewan percobaan. Data hasil penelitian dianalisis dengan program
SPSS 19 menggunakan uji One Way ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Post
Hoc Tukey.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas
laboratorium, neraca listrik, mortar dan stamfer, neraca hewan, spuit, oral sonde,
plethysmometer digital, centrifuse PLC Series, microtube, microtitration plate, dan
micropipette (Microlit).
3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak etanol
daun mahkota dewa, akuades, CMC Na, sel darah merah sapi (SDMS), tablet
Phosphate Buffered Saline (PBS), heparin (inviclot®), triton dan levamisol
(Askamex®).
3.3 Hewan Percobaan
Menurut penelitian Anatriera (2009). jumlah hewan coba pada penelitian
ini menggunakan rumus Federer yaitu:
16
Universitas Sumatera Utara
(t-1)(n-1)>15
Keterangan:
t : jumlah perlakuan
n : banyaknya sampel setiap perlakuan.
Dengan rumus ini didapat jumlah sampel untuk masing-masing kelompok
adalah minimal 5 (lima) ekor mencit. Total adalah 25 ekor mencit (Lampiran 4).
Hewan yang digunakan adalah mencit jantan berat 30-40 g dibagi 5
kelompok dimana tiap kelompok terdapat 5 ekor yang terdiri dari 1 kelompok
kontrol (CMC 1%), 1 kelompok pembanding (levamisol) dan 3 kelompok uji
(variasi dosis dari ekstrak yaitu 50, 100 dan 200 mg/kg bb).
Sebelum diberi perlakuan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama
kurang lebih satu minggu untuk penyesuaian lingkungan, mengontrol kesehatan
dan berat badan serta menyeragamkan makanannya (Sabina, 2009).
3.4 Ekstrak Etanol Daun Mahkota Dewa
Ekstrak diperoleh dari Hotmaida pada Agustus 2016. Metode ekstraksi
yang digunakan yaitu metode maserasi bertingkat, sesuai dengan yang tertera
dalam Farmakope Indonesia Edisi III (1979).
3.5 Pembuatan Larutan
Pembuatan larutan meliputi kontrol (suspensi CMC Na) 1%, suspensi
ekstrak etanol daun mahkota dewa, suspensi levamisol, phosphate buffered saline
(PBS) dan sel darah merah sapi (SDMS) dan larutan triton.
17
Universitas Sumatera Utara
3.5.1 Pembuatan Suspensi CMC Na 1%
Sebanyak 500 mg CMC Na ditaburkan ke dalam lumpang berisi akuades
panas sebanyak 20 ml. Didiamkan selama 15 menit lalu digerus hingga diperoleh
massa yang transparan,
lalu diencerkan dengan akuades, dihomogenkan dan
dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, dicukupkan volumenya dengan akuades
hingga 50 ml.
3.5.2 Pembuatan Suspensi Ekstrak Etanol Daun Mahkota Dewa 200, 100 dan
50 mg/ kg bb
Untuk dosis 200 mg/kg bb dibuat dengan cara ditimbang 200 mg ekstrak
etanol daun mahkota dewa, kemudian dimasukkan ke dalam lumpang. Kemudian
tuang sedikit demi sedikit suspensi CMC Na 1% sambil digerus hingga homogen,
setelah homogen dituangkan ke dalam labu tentukur 10 ml dan dicukupkan
dengan suspensi CMC Na 1% hingga garis tanda. Begitu juga untuk pembuatan
dosis 100 dan 50 mg/kg bb dilakukan hal yang sama.
3.5.3 Pembuatan Suspensi Levamisol 25 mg/kg bb
Pengambilan sampel tablet levamisol yaitu dengan cara ditimbang dan
digerus tidak kurang dari 20 tablet. Ditimbang serbuk yang telah dihaluskan
tersebut kemudian ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan lebih kurang
25 mg levamisol (Depkes, 1995: Wiratmi 2014).
Pembuatan suspensi levamisol dilakukan dengan cara sebagai berikut:
levamisol 29,46 mg (setara dengan 25 mg levamisol) dan dimasukan kedalam
lumpang. Digerus serbuk kemudian ditambahkan suspensi CMC Na 1%
secukupnya. Digerus hingga homogen dan dituangkan kedalam labu tentukur 25
18
Universitas Sumatera Utara
ml, dan kemudian ditambahkan suspensi CMC Na 1% sampai batas tanda
(Wiratmi, 2014). Perhitungan serbuk levamisol yang ditimbang dapat dilihat pada
Lampiran 5 halaman 40.
3.5.4 Pembuatan Larutan Phosphate Buffered Saline (PBS)
Pembuatan larutan PBS dilakukan dengan cara 1 tablet PBS terlebih
dahulu digerus lalu dilarutkan dalam 200 ml akuades.
3.5.5 Pembuatan Sel Darah Merah Sapi (SDMS)
Penyiapan dan pembuatan SDMS dilakukan dengan cara sebagai berkut:.
Darah segar dikumpulkan dari darah sapi yang disembelih, diperoleh 500 ml.
Kemudian ditambahkan 1,5 ml heparin dan dimasukkan ke dalam termos yang
berisi es.
Darah sapi segar yang telah diberi antikoagulan dimasukkan ke dalam
tabung sentrifus sebanyak 5 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm
selama 5 menit untuk memisahkan plasma dari sel darah merah. Lapisan atas yang
berupa plasma dibuang dan lapisan bawah yang berupa endapan sel darah merah
(1 ml) ditambahkan PBS sebanyak tiga kali volume SDMS (3 ml). Tabung
kemudian dibolak balik dengan perlahan-lahan sampai SDMS tercampur secara
homogen, kemudian disentrifugasi kembali. Prosedur ini diulang sebanyak tiga
kali. Lapisan atas yang jernih dibuang dan lapisan bawah adalah SDMS murni (1
ml). SDMS dipipet, dan ditambahkan PBS (1 ml) dengan volume yang sama
banyak sehingga diperoleh SDMS 50% (2 ml). Kemudian diambil 0,2 ml SDMS
50%, ditambahkan larutan PBS hingga 10 ml, sehingga diperoleh SDMS 1%
(Emelda, 2015).
19
Universitas Sumatera Utara
3.5.6 Pembuatan Larutan Triton
Pembuatan larutan triton dengan cara sebagai berikut: ditimbang NaCl
sebanyak 0,2 gram, dilarutkan dalam akuabides 100 ml, kemudian 2 tetes triton
lalu diaduk hingga homogen.
3.6 Uji Respon Hipersensitivitas
Efek imunomodulator ekstak etanol daun mahkota dewa ditentukan
dengan
mengukur
volume
respon
hipersensitivitas
menggunakan
uji
pembengkakan telapak kaki hewan uji (foot paw swelling test) (Lakhsmi, 2003;
Ray 1996).
Sebanyak 25 ekor mencit dibagi menjadi 5 kelompok dengan pembagian 1
kelompok kontrol pelarut, 1 kelompok kontrol positif, dan 3 kelompok uji. Tiap
kelompok terdiri dari 5 ekor mencit jantan. Hewan dikelompokkan sebagai
berikut:
Kelompok I
: diberi sediaan suspensi CMC Na 1%
Kelompok II : diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 50 mg/kg BB
Kelompok III : diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 100 mg/kg BB
Kelompok IV : diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 200 mg/kg BB
Kelompok V : diberi sediaan suspensi Levamisol dengan dosis 25 mg/kg BB
Tiap kelompok diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah sapi (SDMS)
1% dalam larutan PBS secara intraperitonial pada hari ke-0. Perlakuan pemberian
ekstrak etanol daun mahkota dewa dumulai dari hari ke-1 dan diberikan satu kali
setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sendi kaki mencit sebelah kanan diberi
tanda batas pengukuran volume kaki mencit. Volume kaki mencit diukur sebagai
20
Universitas Sumatera Utara
volume awal (V0). Kemudian mencit diinjeksikan dengan 0,1 ml suspensi SDMS
1% dalam larutan PBS secara intraplantar pada telapak kaki sebelah kanan.
Pada hari kedelapan (setelah 24 jam) diukur volume pembengkakan kaki
mencit
dengan
plethysmometer
digital.
Pengukuran
dilakukan
dengan
mencelupkan kaki mencit ke dalam tabung yang berisi larutan triton sampai tanda
batas pengukuran. Perubahan volume larutan triton terlihat pada angka analog
yang tertera pada alat sebagai volume waktu tertentu (Vt) kaki mencit. Volume
pembengkakan kaki mencit ditentukan berdasarkan selisih antara volume waktu
tertentu (Vt) dengan volume awal (V0) (Shivaprasad, 2006).
3.7 Uji Titer Antibodi
Pada kelompok mencit diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah sapi
dalam larutan PBS secara intraperitonial pada hari ke-0. Perlakuan pemberian
ekstrak etanol daun mahkota dewa dimulai dari hari ke-1 dan diberikan satu kali
setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sampel darah pada masing masing
mencit diambil melalui pembuluh darah vena bagian ekor. Sampel darah
diikumpulkan dalam tabung mikro (microtube), kemudian dilakukan pemusingan
1900 rpm dengan alat sentrifugasi selama 10 menit, lalu diambil serumnya.
Nilai titer antibodi ditentukan dengan teknik hemaglutinasi. 25 µl serum
diteteskan kedalam sumur microtitration plate 96 ke lubang pertama yang
sebelumnya pada tiap lubang telah ditambahkan 25 µl PBS, kemudian dari lubang
pertama diambil 25 µl dipindahkan ke lubang kedua, dari lubang kedua dipipet 25
µl ke lubang ketiga begitu seterusnya untuk lubang yang lain yang berisi 25 µl
PBS (1:2 ; 1:4 ; 1:8 ; 1:16 ; 1:32 ; 1:64 ; 1:128 ; 1:256 ; 1:512; 1:1024 ; 1:2048).
21
Universitas Sumatera Utara
Kemudian tiap lubang ditambahkan SDMS 1% sebanyak 25 µl. Setelah itu
didiamkan selama 1 jam dan diamati hemaglutinasi secara visual (Makare, 2001:
Puri, 1993). Nilai titer antibodi ditentukan berdasarkan pengenceran terakhir
dimana antibodi masih terdeteksi melalu hemaglutinasi yang terlihat secara visual.
Nilai titer antibodi tersebut selanjutnya ditransformasikan dengan [2log(titer)+1]
(Hargono, 2000).
3.8 Analisis Statistik
Data hasil penelitian dianalisis dengan One-way analisys of varience
(ANOVA) dan dilanjutkan dengan uji lanjut Post Hoc Tukey pada program
Statisic Product and Service Solution (SPSS) versi 19.
22
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini digunakan ekstrak etanol daun mahkota dewa yang
sama dengan ekstrak yang digunakan Hotmaida (2016). Hasil skrinning fitokimia
yang telah dilakukan Hotmaida diperoleh ekstrak etanol mengandung senyawa
golongan alkaloida, flavonoid, saponin, tannin, glikosida dan steroid/triterpenoid.
Hasil pemeriksaan karakteristik simplisia diperoleh kadar air 1,65%, kadar abu
total 4,18%, dan kadar abu tidak larut asam 0,09%.
4.1 Hasil Uji Efek Imunomodulator
Pengujian efek imunomodulator ekstrak etanol daun mahkota dewa yang
dilakukan dengan metode respon hipersensitivitas tipe lambat dan titer antibodi
digunakan untuk melihat pengaruh ekstrak terhadap aktivitas dan mekanisme
sistem imun seluler dan imun humoral yang melibatkan sel T dan sel B serta
plasma yang berfungsi memproduksi antibodi (Nafrialdi, 2007). Respon imun
spesifik humoral dapat dilihat dari parameter peningkatan hemaglutinasi
sedangkan repon imun seluler dilihat dari parameter pembengkakan kaki mencit.
Menurut Makare, et al. (2001), kombinasi kedua metode tersebut mempunyai
keuntungan diantaranya memungkinkan dua komponen respon imun diukur pada
spesies yang sama dibawah kondisi ideal, relatif sederhana dan tidak mahal.
Uji respon hipersensitivitas tipe lambat merupakan pengujian efek
imunomodulator terkait dengan respon imun spesifik. Respon hipersensitivitas
tipe lambat merupakan respon imun seluler yang melibatkan aktivasi sel Th yang
akan melepaskan sitokin dan meningkatkan aktivitas makrofag sehingga dapat
23
Universitas Sumatera Utara
meningkatkan reaksi inflamasi yang ditandai dengan pembengkakan kaki hewan
uji (Roitt, 2002).
Pengukuran nilai titer antibodi dilakukan dengan menggunakan metode
hemaglutinasi. Hemaglutinasi adalah ikatan antara sel darah merah sebagai
antigen dengan antibodi sehingga menimbulkan suatu gumpalan endapan yang
dapat dilihat. Pada lingkungan dengan pH netral, sel darah merah bermuatan
sehingga terjadi aksi tolak menolak antar sel. Oleh karena itu sel darah merah
yang digunakan disuspensikan dalam larutan penyangga dengan pH netral + 7
(PBS) untuk menjaga agar sel darah merah tetap dalam kondisi netral, sehingga
tetap bermuatan negatif. Hemaglutinasi terbentuk karena adanya ikatan silang
antara sel darah merah dengan antibodi. Antibodi yang mempunyai kemampuan
lebih besar untuk berikatan dengan sel darah merah adalah IgM. IgM mempunyai
ukuran yang lebih besar dan valensi yang tinggi, sehingga dapat melawan
rintangan elektrik dan membentuk ikatan silang dengan sel darah merah sehingga
menyebabkan aglutinasi. Antibodi lainnya seperti IgG mempunyai ukuran dan
valensi yang lebih kecil, sehingga kemampuan IgG melawan rintangan elektrik
lebih lemah dibandingkan dengan IgM (Kuby, 1994).
4.1.1 Uji Respon Hipersensitivitas Tipe Lambat
Data hasil penelitian dapat dilihat pada tabel 1 berikut.
Tabel 4.1 Pembengkakan Kaki Mencit dan Nilai Titer Antibodi (Mean + SD)
Mean + SD
NO
Perlakuan
ΔV
[2Log (titer)+1]
1.
CMC Na 1%
0,17 + 0,027
2,32 + 0,268
2.
EEDMD 50 mg/kg bb
0,25 + 0,044
3,04 + 0,328
3.
EEDMD 100 mg/kb bb
0,4 + 0,033
3,4 + 0
4
EEDMD 200 mg/kb bb
0,7 + 0,051
4,008 + 0,427
5.
Levamisol
0,77 + 0,047
4,25 + 0,328
24
Universitas Sumatera Utara
Volume pembengkakan kaki mencit yang terjadi pada tiap kelompok
perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.1.
0.9
*
Volume Pembengkakan (ml)
0.8
*
0.7
0.6
0.5
*+
0.4
*+
0.3
+
0.2
0.1
0
CMC Na
EEDMD 50
EEDMD 100
EEDMD 200
Levamisole
Gambar 4.1 Volume Pembengkakan Kaki Mencit Pada Berbagai Perlakuan
(Data = Mean + SD, n = 5)
Keterangan:
* = P
METODE PENELITIAN
Metode
penelitian
ini
dilakukan
secara
eksperimental
meliputi
pengumpulan bahan, pengolahan bahan, penyiapan hewan percobaan (mencit),
penyiapan bahan uji dan pengujian efek imunomodulator ekstrak etanol daun
mahkota dewa terhadap respon hipersensitivitas tipe lambat dan titer antibodi sel
imun pada hewan percobaan. Data hasil penelitian dianalisis dengan program
SPSS 19 menggunakan uji One Way ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Post
Hoc Tukey.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas
laboratorium, neraca listrik, mortar dan stamfer, neraca hewan, spuit, oral sonde,
plethysmometer digital, centrifuse PLC Series, microtube, microtitration plate, dan
micropipette (Microlit).
3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak etanol
daun mahkota dewa, akuades, CMC Na, sel darah merah sapi (SDMS), tablet
Phosphate Buffered Saline (PBS), heparin (inviclot®), triton dan levamisol
(Askamex®).
3.3 Hewan Percobaan
Menurut penelitian Anatriera (2009). jumlah hewan coba pada penelitian
ini menggunakan rumus Federer yaitu:
16
Universitas Sumatera Utara
(t-1)(n-1)>15
Keterangan:
t : jumlah perlakuan
n : banyaknya sampel setiap perlakuan.
Dengan rumus ini didapat jumlah sampel untuk masing-masing kelompok
adalah minimal 5 (lima) ekor mencit. Total adalah 25 ekor mencit (Lampiran 4).
Hewan yang digunakan adalah mencit jantan berat 30-40 g dibagi 5
kelompok dimana tiap kelompok terdapat 5 ekor yang terdiri dari 1 kelompok
kontrol (CMC 1%), 1 kelompok pembanding (levamisol) dan 3 kelompok uji
(variasi dosis dari ekstrak yaitu 50, 100 dan 200 mg/kg bb).
Sebelum diberi perlakuan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama
kurang lebih satu minggu untuk penyesuaian lingkungan, mengontrol kesehatan
dan berat badan serta menyeragamkan makanannya (Sabina, 2009).
3.4 Ekstrak Etanol Daun Mahkota Dewa
Ekstrak diperoleh dari Hotmaida pada Agustus 2016. Metode ekstraksi
yang digunakan yaitu metode maserasi bertingkat, sesuai dengan yang tertera
dalam Farmakope Indonesia Edisi III (1979).
3.5 Pembuatan Larutan
Pembuatan larutan meliputi kontrol (suspensi CMC Na) 1%, suspensi
ekstrak etanol daun mahkota dewa, suspensi levamisol, phosphate buffered saline
(PBS) dan sel darah merah sapi (SDMS) dan larutan triton.
17
Universitas Sumatera Utara
3.5.1 Pembuatan Suspensi CMC Na 1%
Sebanyak 500 mg CMC Na ditaburkan ke dalam lumpang berisi akuades
panas sebanyak 20 ml. Didiamkan selama 15 menit lalu digerus hingga diperoleh
massa yang transparan,
lalu diencerkan dengan akuades, dihomogenkan dan
dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, dicukupkan volumenya dengan akuades
hingga 50 ml.
3.5.2 Pembuatan Suspensi Ekstrak Etanol Daun Mahkota Dewa 200, 100 dan
50 mg/ kg bb
Untuk dosis 200 mg/kg bb dibuat dengan cara ditimbang 200 mg ekstrak
etanol daun mahkota dewa, kemudian dimasukkan ke dalam lumpang. Kemudian
tuang sedikit demi sedikit suspensi CMC Na 1% sambil digerus hingga homogen,
setelah homogen dituangkan ke dalam labu tentukur 10 ml dan dicukupkan
dengan suspensi CMC Na 1% hingga garis tanda. Begitu juga untuk pembuatan
dosis 100 dan 50 mg/kg bb dilakukan hal yang sama.
3.5.3 Pembuatan Suspensi Levamisol 25 mg/kg bb
Pengambilan sampel tablet levamisol yaitu dengan cara ditimbang dan
digerus tidak kurang dari 20 tablet. Ditimbang serbuk yang telah dihaluskan
tersebut kemudian ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan lebih kurang
25 mg levamisol (Depkes, 1995: Wiratmi 2014).
Pembuatan suspensi levamisol dilakukan dengan cara sebagai berikut:
levamisol 29,46 mg (setara dengan 25 mg levamisol) dan dimasukan kedalam
lumpang. Digerus serbuk kemudian ditambahkan suspensi CMC Na 1%
secukupnya. Digerus hingga homogen dan dituangkan kedalam labu tentukur 25
18
Universitas Sumatera Utara
ml, dan kemudian ditambahkan suspensi CMC Na 1% sampai batas tanda
(Wiratmi, 2014). Perhitungan serbuk levamisol yang ditimbang dapat dilihat pada
Lampiran 5 halaman 40.
3.5.4 Pembuatan Larutan Phosphate Buffered Saline (PBS)
Pembuatan larutan PBS dilakukan dengan cara 1 tablet PBS terlebih
dahulu digerus lalu dilarutkan dalam 200 ml akuades.
3.5.5 Pembuatan Sel Darah Merah Sapi (SDMS)
Penyiapan dan pembuatan SDMS dilakukan dengan cara sebagai berkut:.
Darah segar dikumpulkan dari darah sapi yang disembelih, diperoleh 500 ml.
Kemudian ditambahkan 1,5 ml heparin dan dimasukkan ke dalam termos yang
berisi es.
Darah sapi segar yang telah diberi antikoagulan dimasukkan ke dalam
tabung sentrifus sebanyak 5 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm
selama 5 menit untuk memisahkan plasma dari sel darah merah. Lapisan atas yang
berupa plasma dibuang dan lapisan bawah yang berupa endapan sel darah merah
(1 ml) ditambahkan PBS sebanyak tiga kali volume SDMS (3 ml). Tabung
kemudian dibolak balik dengan perlahan-lahan sampai SDMS tercampur secara
homogen, kemudian disentrifugasi kembali. Prosedur ini diulang sebanyak tiga
kali. Lapisan atas yang jernih dibuang dan lapisan bawah adalah SDMS murni (1
ml). SDMS dipipet, dan ditambahkan PBS (1 ml) dengan volume yang sama
banyak sehingga diperoleh SDMS 50% (2 ml). Kemudian diambil 0,2 ml SDMS
50%, ditambahkan larutan PBS hingga 10 ml, sehingga diperoleh SDMS 1%
(Emelda, 2015).
19
Universitas Sumatera Utara
3.5.6 Pembuatan Larutan Triton
Pembuatan larutan triton dengan cara sebagai berikut: ditimbang NaCl
sebanyak 0,2 gram, dilarutkan dalam akuabides 100 ml, kemudian 2 tetes triton
lalu diaduk hingga homogen.
3.6 Uji Respon Hipersensitivitas
Efek imunomodulator ekstak etanol daun mahkota dewa ditentukan
dengan
mengukur
volume
respon
hipersensitivitas
menggunakan
uji
pembengkakan telapak kaki hewan uji (foot paw swelling test) (Lakhsmi, 2003;
Ray 1996).
Sebanyak 25 ekor mencit dibagi menjadi 5 kelompok dengan pembagian 1
kelompok kontrol pelarut, 1 kelompok kontrol positif, dan 3 kelompok uji. Tiap
kelompok terdiri dari 5 ekor mencit jantan. Hewan dikelompokkan sebagai
berikut:
Kelompok I
: diberi sediaan suspensi CMC Na 1%
Kelompok II : diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 50 mg/kg BB
Kelompok III : diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 100 mg/kg BB
Kelompok IV : diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 200 mg/kg BB
Kelompok V : diberi sediaan suspensi Levamisol dengan dosis 25 mg/kg BB
Tiap kelompok diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah sapi (SDMS)
1% dalam larutan PBS secara intraperitonial pada hari ke-0. Perlakuan pemberian
ekstrak etanol daun mahkota dewa dumulai dari hari ke-1 dan diberikan satu kali
setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sendi kaki mencit sebelah kanan diberi
tanda batas pengukuran volume kaki mencit. Volume kaki mencit diukur sebagai
20
Universitas Sumatera Utara
volume awal (V0). Kemudian mencit diinjeksikan dengan 0,1 ml suspensi SDMS
1% dalam larutan PBS secara intraplantar pada telapak kaki sebelah kanan.
Pada hari kedelapan (setelah 24 jam) diukur volume pembengkakan kaki
mencit
dengan
plethysmometer
digital.
Pengukuran
dilakukan
dengan
mencelupkan kaki mencit ke dalam tabung yang berisi larutan triton sampai tanda
batas pengukuran. Perubahan volume larutan triton terlihat pada angka analog
yang tertera pada alat sebagai volume waktu tertentu (Vt) kaki mencit. Volume
pembengkakan kaki mencit ditentukan berdasarkan selisih antara volume waktu
tertentu (Vt) dengan volume awal (V0) (Shivaprasad, 2006).
3.7 Uji Titer Antibodi
Pada kelompok mencit diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah sapi
dalam larutan PBS secara intraperitonial pada hari ke-0. Perlakuan pemberian
ekstrak etanol daun mahkota dewa dimulai dari hari ke-1 dan diberikan satu kali
setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sampel darah pada masing masing
mencit diambil melalui pembuluh darah vena bagian ekor. Sampel darah
diikumpulkan dalam tabung mikro (microtube), kemudian dilakukan pemusingan
1900 rpm dengan alat sentrifugasi selama 10 menit, lalu diambil serumnya.
Nilai titer antibodi ditentukan dengan teknik hemaglutinasi. 25 µl serum
diteteskan kedalam sumur microtitration plate 96 ke lubang pertama yang
sebelumnya pada tiap lubang telah ditambahkan 25 µl PBS, kemudian dari lubang
pertama diambil 25 µl dipindahkan ke lubang kedua, dari lubang kedua dipipet 25
µl ke lubang ketiga begitu seterusnya untuk lubang yang lain yang berisi 25 µl
PBS (1:2 ; 1:4 ; 1:8 ; 1:16 ; 1:32 ; 1:64 ; 1:128 ; 1:256 ; 1:512; 1:1024 ; 1:2048).
21
Universitas Sumatera Utara
Kemudian tiap lubang ditambahkan SDMS 1% sebanyak 25 µl. Setelah itu
didiamkan selama 1 jam dan diamati hemaglutinasi secara visual (Makare, 2001:
Puri, 1993). Nilai titer antibodi ditentukan berdasarkan pengenceran terakhir
dimana antibodi masih terdeteksi melalu hemaglutinasi yang terlihat secara visual.
Nilai titer antibodi tersebut selanjutnya ditransformasikan dengan [2log(titer)+1]
(Hargono, 2000).
3.8 Analisis Statistik
Data hasil penelitian dianalisis dengan One-way analisys of varience
(ANOVA) dan dilanjutkan dengan uji lanjut Post Hoc Tukey pada program
Statisic Product and Service Solution (SPSS) versi 19.
22
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini digunakan ekstrak etanol daun mahkota dewa yang
sama dengan ekstrak yang digunakan Hotmaida (2016). Hasil skrinning fitokimia
yang telah dilakukan Hotmaida diperoleh ekstrak etanol mengandung senyawa
golongan alkaloida, flavonoid, saponin, tannin, glikosida dan steroid/triterpenoid.
Hasil pemeriksaan karakteristik simplisia diperoleh kadar air 1,65%, kadar abu
total 4,18%, dan kadar abu tidak larut asam 0,09%.
4.1 Hasil Uji Efek Imunomodulator
Pengujian efek imunomodulator ekstrak etanol daun mahkota dewa yang
dilakukan dengan metode respon hipersensitivitas tipe lambat dan titer antibodi
digunakan untuk melihat pengaruh ekstrak terhadap aktivitas dan mekanisme
sistem imun seluler dan imun humoral yang melibatkan sel T dan sel B serta
plasma yang berfungsi memproduksi antibodi (Nafrialdi, 2007). Respon imun
spesifik humoral dapat dilihat dari parameter peningkatan hemaglutinasi
sedangkan repon imun seluler dilihat dari parameter pembengkakan kaki mencit.
Menurut Makare, et al. (2001), kombinasi kedua metode tersebut mempunyai
keuntungan diantaranya memungkinkan dua komponen respon imun diukur pada
spesies yang sama dibawah kondisi ideal, relatif sederhana dan tidak mahal.
Uji respon hipersensitivitas tipe lambat merupakan pengujian efek
imunomodulator terkait dengan respon imun spesifik. Respon hipersensitivitas
tipe lambat merupakan respon imun seluler yang melibatkan aktivasi sel Th yang
akan melepaskan sitokin dan meningkatkan aktivitas makrofag sehingga dapat
23
Universitas Sumatera Utara
meningkatkan reaksi inflamasi yang ditandai dengan pembengkakan kaki hewan
uji (Roitt, 2002).
Pengukuran nilai titer antibodi dilakukan dengan menggunakan metode
hemaglutinasi. Hemaglutinasi adalah ikatan antara sel darah merah sebagai
antigen dengan antibodi sehingga menimbulkan suatu gumpalan endapan yang
dapat dilihat. Pada lingkungan dengan pH netral, sel darah merah bermuatan
sehingga terjadi aksi tolak menolak antar sel. Oleh karena itu sel darah merah
yang digunakan disuspensikan dalam larutan penyangga dengan pH netral + 7
(PBS) untuk menjaga agar sel darah merah tetap dalam kondisi netral, sehingga
tetap bermuatan negatif. Hemaglutinasi terbentuk karena adanya ikatan silang
antara sel darah merah dengan antibodi. Antibodi yang mempunyai kemampuan
lebih besar untuk berikatan dengan sel darah merah adalah IgM. IgM mempunyai
ukuran yang lebih besar dan valensi yang tinggi, sehingga dapat melawan
rintangan elektrik dan membentuk ikatan silang dengan sel darah merah sehingga
menyebabkan aglutinasi. Antibodi lainnya seperti IgG mempunyai ukuran dan
valensi yang lebih kecil, sehingga kemampuan IgG melawan rintangan elektrik
lebih lemah dibandingkan dengan IgM (Kuby, 1994).
4.1.1 Uji Respon Hipersensitivitas Tipe Lambat
Data hasil penelitian dapat dilihat pada tabel 1 berikut.
Tabel 4.1 Pembengkakan Kaki Mencit dan Nilai Titer Antibodi (Mean + SD)
Mean + SD
NO
Perlakuan
ΔV
[2Log (titer)+1]
1.
CMC Na 1%
0,17 + 0,027
2,32 + 0,268
2.
EEDMD 50 mg/kg bb
0,25 + 0,044
3,04 + 0,328
3.
EEDMD 100 mg/kb bb
0,4 + 0,033
3,4 + 0
4
EEDMD 200 mg/kb bb
0,7 + 0,051
4,008 + 0,427
5.
Levamisol
0,77 + 0,047
4,25 + 0,328
24
Universitas Sumatera Utara
Volume pembengkakan kaki mencit yang terjadi pada tiap kelompok
perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.1.
0.9
*
Volume Pembengkakan (ml)
0.8
*
0.7
0.6
0.5
*+
0.4
*+
0.3
+
0.2
0.1
0
CMC Na
EEDMD 50
EEDMD 100
EEDMD 200
Levamisole
Gambar 4.1 Volume Pembengkakan Kaki Mencit Pada Berbagai Perlakuan
(Data = Mean + SD, n = 5)
Keterangan:
* = P