Variasi DNA Kloroplas Shorea leprosula Miq. di Indonesia Menggunakan Penanda PCR RFLP

VARIASI DNA KLOROPLAS Shorea leprosula Miq.
DI INDONESIA MENGGUNAKAN
PENANDA PCR-RFLP

RURI SITI RESMISARI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006

PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Variasi DNA Kloroplas
Shorea leprosula Miq. di Indonesia Menggunakan Penanda PCR-RFLP” adalah karya
saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam daftar pustaka dibagian akhir tesis ini.

Bogor, Agustus 2006

Ruri Siti Resmisari
E051020291

ABSTRAK
RURI SITI RESMISARI. Variasi DNA Kloroplas Shorea leprosula, Miq di
Indonesia Menggunakan Penanda PCR-RFLP. Dibimbing oleh ISKANDAR
ZULKARNAEN SIREGAR and ULFAH JUNIARTI SIREGAR

Shorea leprosula, salah satu jenis dari famili Dipterocarpaceae yang mendominasi
hutan hujan tropis di Asia Tenggara. Dalam tesis ini Dipterocarpaceae terdiri dari
banyak jenis yang mempunyai nilai ekonomis dan ekologis yang penting. Penanda
PCR-RFLP digunakan untuk mencari variasi cpDNA Shorea leprosula di Indonesia.
Sampel daun dikumpulkan dari 13 populasi yang berasal dari pulau Jawa, Sumatera
dan Kalimantan. Penelitian dimulai dengan melakukan uji polimorfisme DNA untuk
mencari variasi cpDNA dengan menggunakan kombinasi 4 primer dan 10 enzim
restriksi. Hasil pengujian menujukkan bahwa hanya kombinasi rbcL – Alu I yang
menghasilkan pita yang polimorfik. Kombinasi ini menghasilkan dua haplotipe, yaitu
haplotipe 1 dan haplotipe 2. Haplotipe 1 merupakan haplotipe dominan yang
ditemukan seluruh populasi, sedangkan haplotipe 2 hanya ditemukan di Bukit
Tigapuluh dan PT Asialog di Sumatera, PT. ITCIKU di Kalimantan.

ABSTRACT
RURI SITI RESMISARI. Chloroplast DNA Variation of Shorea leprosula, Miq in
Indonesia assesed by PCR-RFLP Marker. Supervised by ISKANDAR
ZULKARNAEN SIREGAR and ULFAH JUNIARTI SIREGAR

Shorea leprosula is a member of Dipterocarpaceae that occurs predominately
in tropical rain forests of Southeast Asia. Dipterocarps consists of many economical
and ecologically important species. In this paper PCR-RFLP markers were used to
observe cpDNA variation of Shorea leprosula in Indonesia. Leaf samples from
individual plants were collected from 13 populations in Java, Sumatra and
Kalimantan islands. cpDNA polymorphism was assessed using combination of 4
primers and 10 enzyme restrictions. The result showed that only rbcL-Alu I
combination gave polymorphic bands. From these polymorphic bands, two
haplotypes were identified, namely haplotype 1 as dominant haplotype in all
populations and haplotype 2 , which was found only at Bukit Tigapuluh National
Park and Concession Asialog in Sumatra, and Concession ITCIKU in Kalimantan.

© Hak cipta milik Ruri Siti Resmisari, Iskandar Zulkarnaen Siregar,
Ulfah Juniarti Siregar, tahun 2006

Hak cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari
Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
bentuk apapun, baik cetak, fotocopy, mikrofilm dan sebagain ya

VARIASI DNA KLOROPLAS Shorea leprosula Miq.
DI INDONESIA MENGGUNAKAN
PENANDA PCR-RFLP

RURI SITI RESMISARI

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
Pada Program Studi Ilmu Pengetahuan Kehutanan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006

Judul Tesis

:

Variasi DNA Kloroplas Shorea leprosula Miq. di
Indonesia Menggunakan Penanda PCR-RFLP

Nama

:

Ruri Siti REsmisari

NIM

:

E051020291

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Iskandar Z. Siregar, M.For.Sc
Ketua

Dr. Ir. Ulfah Juniarti Siregar, M.Agr
Anggota

Diketahui
Ketua Program Studi
Ilmu Pengetahuan Kehutanan

Dekan
Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dede Hermawan, M.Sc

Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS

Tanggal Ujian : 19 Juni 2006

Tanggal Lulus :

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kep ada Allah SWT atas segala rahmat
dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul
Variasi DNA Kloroplas Shorea leprosula Miq. di Indonesia Menggunakan Penanda
PCR-RFLP. Penelitian ini dilakukan mulai Maret 2005 hingga September 2005.
Tesis ini di bagi dalam 5 bab, pada bab I diuraikan latar belakang, tujuan,
serta ruang lingkup penelitian. Pada bab II disajikan tinjauan pustaka dengan tujuan
untuk memberikan gambaran singkat tentang S. leprosula, keragaman genetik , DNA
kloroplas dan penanda genetik. Bab III memberikan informasi mengenai metodologi
yang digunakan dalam penelitian termasuk waktu, tempat, bahan dan alat yang
digunakan serta metode analisis data yang digunakan. Hasil dan pembahasan
disajikan pada Bab IV, pada bab ini dijelaskan tentang variasi cpDNA S. leprosula di
Indonesia, kesimpulan dan saran disajikan pada Bab V.
Penulis menyampaikan banyak terima kasih kepada Dr. Ir. Iskandar Z.
Siregar, M.For.Sc dan Dr. Ir. Ulfah Juniarti Siregar, M.Agr sebagai komisi
pembimbing yang telah banyak membantu dan mengarahkan penulis dalam penulisan

tesis ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Departemen Silvikultur
Institut Pertanian Bogor, Inst. of Forest Genetics and Forest Tree Breeding Faculty of
Forest Sciences and Forest Ecology University of Goettingen Germany dan AUNP
(Asean-Eu University Network Programe) yang telah memfasilitasi penulis dalam
penelitian ini. Ungkapan terimakasih juga kami sampaikan kepada bapak, ibu, serta
suami tercinta serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya, serta
semua pihak yang telah ikut membantu penulis mulai dari persiapan hingga
selesainya tesis ini.
Semoga tesis ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2006

Ruri Siti Resmisari

DAFTAR ISI
DAFTAR ISI.............................................................................................................i
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................................ii
DAFTAR TABEL...................................................................................................iii
DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................................iv
PENDAHULUAN ....................................................................................................1
Latar Belakang .....................................................................................................1

Permasalahan........................................................................................................4
Tujuan...................................................................................................................4
Hipotesis ...............................................................................................................4
Manfaat.................................................................................................................4
TINJAUAN PUSTAKA...........................................................................................5
Shorea leprosula Miq...........................................................................................5
Keragaman Genetik ..............................................................................................6
DNA Kloroplas ....................................................................................................7
PCR (Polymerase Chain Reaction)....................................................................10
PCR-RFLP .........................................................................................................14
(Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphisms).14
METODE PENELITIAN .......................................................................................16
Tempat dan waktu penelitian .............................................................................16
Bahan dan Alat Penelitian..................................................................................16
Prosedur Penelitian.............................................................................................16
HASIL DAN PEMBAHASAN ..............................................................................25
Ekstraksi DNA ...................................................................................................25
Amplifikasi denga n PCR....................................................................................27
Uji Polimorfisme ................................................................................................28
Keragaman intra populasi...................................................................................33

Konservasi Genetik Shorea leprosula................................................................39
SIMPULAN DAN SARAN ...................................................................................41
Simpulan.............................................................................................................41
Saran...................................................................................................................41
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................42

i

DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Rantai DNA ...........................................................................................9
Gambar 2. Letak cpDNA pada sel .........................................................................10
Gambar 3. Prinsip reaksi RCR ..............................................................................12
Gambar 4. Proses amplifikasi PCR........................................................................13
Gambar 5. Bagan alur penelitian di laboratorium ..................................................17
Gambar 6. Peta pengambilan contoh S. leprosula .................................................18
Gambar 7. Letak petB, psaA, trnLF dan rbcL pada peta plasmid cpDNA
Nicotiana tabacum ...............................................................................21
Gambar 8. Hasil Ekstraksi DNA S . leprosula .......................................................25
Gambar 9. Elektrophoresisis cpDNA dengan berbagai pengenceran DNA dari
S . leprosula ..........................................................................................26

Gambar 10. Elektroforegram hasil PCR cpDNA dengan berbagai primer :
(a) petB, (b) psaA, (c) trnLF, (d) rbcL, M = marker bond ...................28
Gambar 11. Elektroforegram hasil uji polimorfisme : (a) psaA-pst I
(monomorfik), (b) petB-Hinf I (monomorfik), (d) rbcL-Alu I
(polimorfik), M= marker bond.............................................................30
Gambar 12. Elektroforegram hasil pemotongan cpDNA dengan menggunakan
kombinasi perlakuan rbcL-Alu 1 ..........................................................32
Gambar 13. Penyebaran cpDNA S. leprosula di Indonesia berdasarkan penanda
PCR-RFLP dengan menggunakan rbcL-Alu1 ......................................35
Gambar 14. Dendogram populasi S. leprosula di Indonesia dengan penanda
RFLP ....................................................................................................38

ii

DAFTAR TABEL
Tabel 1. Lokasi pengambilam contoh S. leprosula ................................................18
Tabel 2. Komposisi bahan-bahan yang digunakan untuk PCR..............................22
Tabel 3. Pengkondisian suhu dan waktu pada mesin PCR untuk primer petB,
psaA, trnLFdan rbcL ...............................................................................22
Tabel 4. Jenis enzim restrksi yang digunakan utuk memotong DNA...................23

Tabel 5. Hasil uji polimorphisme ...........................................................................31
Tabel 6. Haplotipe yang teridentifikasi pada 65 individu S. leprosula
berdasarkan PCR-RFLP terdapat dua haplotipe......................................33
Tabel 7. Frekuensi haplotipe dari 13 populasi .......................................................34
Tabel 8. Hasil perhitungan AMOVA berdasarkan 65 individu yang berasal
dari 13 populasi.......................................................................................35
Tabel 9. Matrik signifikasi nilai (P value) pada level 0.05 ....................................36
Tabel 10. Jarak genetik S. leprosula berdasarkan analisis GSED..........................37

iii

DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Tahapan ekstraksi DNA.....................................................................45
Lampiran 2. Elektroforegram S. leprosula di 13 populasi dengan rbcL-Alu I.......46
Lampiran 3. Transformasi data dari hasil analisis cpDNA Shorea leprosula.......51

iv

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Laju kerusakan hutan di Indonesia, berdasarkan data WALHI (Wahana
Lingkungan Hidup Indonesia) tahun 2004, berada dalam situasi krisis dan kondisi
yang sangat mengkhawatirkan. Pembalakan hutan, baik yang legal maupun ilegal,
telah menyebabkan kerusakan hutan yang sudah tidak terkendali di hampir
seluruh kawasan hutan Indonesia. Tingkat deforestasi saat ini telah mencapai 3,8
juta hektar per tahun (tahun 2004). Hal ini menunjukan bahwa Indonesia telah
kehilangan hutannya seluas 7,2 hektar setiap menitnya. Berdasarkan data WWF
(World Wildlife Fund) tahun 2002, pemerintah Indonesia mengakui bahwa
kerusakan hutan Indonesia selama 50 tahun terakhir sekitar 40% dari tutupan
hutannya (Harsono, 2004).
Tuntutan kebutuhan bahan baku kayu cenderung terus meningkat terutama
jenis kayu keras seperti Jati (Tectona grandis) dan Meranti (Shorea spp.)
(Handadhari, 2002). Laju pembalakan yang dilakukan sekarang kurang diikuti
oleh rehabilitasi lahan yang seimbang. Selain itu, kegiatan pembalakan hutan juga
tidak hanya menyebabkan hilangnya keanekaragaman hayati, hancurnya habitathabitat satwa endemik, juga menyebabkan semakin merosotnya kualitas sumber
daya alam Indonesia.

Pengembangan skema pengalihan lapangan kerja

penebangan hutan sebaiknya dialihkan ke dalam program rehabilitasi hutan
dengan menggunakan dana rehabilitasi hutan. Hasil penelitian South-Central
Kalimatan Production Forest Project (SCKFP) kerjasama Dephut-Uni Eropa di
Kalimantan Selatan merekomendasikan rehabilitasi hutan yang dilakukan
diantaranya dengan menanam Meranti (Shorea spp.).
Shorea leprosula merupakan salah satu jenis Meranti Merah yang tumbuh
di hutan hujan dataran rendah.

Kayunya mudah dikerjakan dan tidak mudah

mengkerut. Banyak digunakan sebagai bahan baku meubel, kayu lapis dan vinir.
Termasuk ke dalam kelas awet dan kuat III – IV. Meranti jenis ini merupakan
kayu unggulan yang memiliki nilai ekonomis tinggi, tetapi dengan eksploitasi
yang terus menerus dan upaya pembudidayaan yang tidak seimbang, kayu jenis

meranti ini akan semakin langka pada masa mendatang. Budidaya meranti dalam
skala besar (pola HTI) mempunyai kendala dalam pengadaan bibitnya (Murjahid,
2003). Ditambahkan oleh Sudarmonowati et al. (2004), bahwa kurang majunya
pembangunan sektor kehutanan di Indonesia, karena kurang ketersediaan bibit
yang bermutu. Dua diantara faktor penting yang berpengaruh pada penyediaan
bibit bermutu adalah sumber bibit yang unggul dan teknik propagasi yang mapan.
Untuk mewujudkan faktor penting ini,

diperlukan satu penelitian untuk

mengetahui potensi genetik yang ada, mengingat aspek genetik meranti masih
sedikit keterangannya. Penelusuran variasi genetik penting dilakukan, sehingga
sebelum dilakukan suatu program konservasi dan perbaikan genetik dalam upaya
penyediaan

bibit

bermutu,

informasi

yang

dibutuhkan

sudah

tersedia.

Berdasarkan pada fenomena tersebut, mutlak tersedianya kondisi genetik yang
memadai sehingga tercipta suatu sistem konservasi genetik yang mapan.
Analisis genetik merupakan cara yang dapat digunakan untuk menduga
karakteristik genetik mengkonfirmasi sifat unggul yang telah diamati berdasarkan
pengamatan morfologi di lapangan. Manfaat dari analisis genetik ini, antara lain
selain dapat mendeteksi sifat unggul pada saat kecambah atau bahkan fase embrio
untuk program pemuliaan bibit, juga menunjang program konservasi karena dapat
mendeteksi tingkat kepunahan jenis di suatu lokasi jauh hari sebelum penurunan
populasi tersebut jelas terlihat. Aplikasi nyata lainnya dari analisis genetik adalah
hubungan anak, tetua, dan kerabatnya yang ditanam di lain tempat dapat
diketahui, sehingga gambaran asal individu tersebut dapat diketahui.

Teknik

analisis genetik ini, juga lebih menghemat tenaga dan biaya karena dapat
mencegah penanaman bibit yang tidak unggul. Manfaat lain dari analisis genetik
ini adalah dapat mengetahui evolusi dari suatu jenis tanaman, mendeteksi
keragaman atau keseragaman genetik suatu populasi, mendeteksi variasi
somaklonal (terutama pada tananaman hasil kultur jaringan), sertifikasi tanaman
tetua, identitas benih murni, dapat melakukan studi tentang genetik yang tahan
hama dan atau penyakit, pemetaan genetik yang memberi informasi letak gen
pada kromosom-kromosom yang mengatur sifat-sifat tertentu, sehingga dapat di
introduksi atau di solasi untuk perbaikan mahluk hidup.

2

Teknik analisis yang banyak dikembangkan sekarang adala h berdasarkan
markapenanda isozim dan markapenanda DNA.

Pendugaan variasi genetik

dengan teknik isozim merupakan teknik yang paling awal dikembangkan dan di
aplikasikan pada tanaman. Masing- masingBerbagai teknik yang dikembangkann,
masing- masing mempunyai kelemahan dan kelebihannya, hal ini disesuaikanjika
dikaikan dengan tujuan dan biaya yang tersedia. MarkaPenanda DNA merupakan
dasar untuk melihat adanya suatu perubahan sifat dengan mendeteksi perubahan
urutan basa dan basa nukleotida DNA khas untuk setiap jenis protein atau enzim.
MarkaPenanda DNA yang di maksud dapat berupaadalah markapenanda dominan
dan ko-dominan. MarkaPenanda dominan adalah penanda berdasarkan ada atau
tidaknya pita DNA yang muncul setelah elektroforesis, yang termasuk ke dalam
markapenanda ini adalah RAPD (random amplified polymorphic DNAdna) dan
RFLP (restriction fragment length polymorphism). Sedangkan markapenanda
kodominan adalah penanda yang menghasilkan pita heterozigot dan homozigot.
MarkaPenanda yang termasuk co-dominan adalah Mikrosatelit dan IsozimAFLP
(amplified fragment length polymorphism). .
Menurut

Finkeldey

(2003),

sumber

DNA

yang

diteliti

dengan

markapenanda genetik ini sebagian besar terdapat dalam nukleus (99,9%). Sisanya
yang 0,1% terdapat dalam organel tertentu. Organel yang mengandung DNA ialah
terdapat pada plastida yang terdiri dari mitokondria dan kloroplas.

Material

genetik yang di analisis dari plastida biasanya hanya berasal dari sifat satu
tetuanya, kalau tidak dari tetua jantannya saja atau hanya dari betinanya,
sedangkan dengan material genetik yang diambil dari inti, analisis genetiknya bisa
menunjukan dua tetuanya. Pada DNA kloroplas material genetik diturunkan dari
tetua betina, tetapi bisa mendeteksi tetua genetik jantannya.
Melihat kondisi di atas dalam usaha melengkapi data mengenai keragaman
genetik Meranti maka perlu dilakukan suatu penelitian yang dapat memberikan
infomasi mengenai hal tersebut.

Penulis memilih DNA kloroplas (cpDNA)

sebagai bahan untuk analisis keragaman genetik Meranti dan teknik PCR–RFLP
sebagai markapenanda genetik. Teknik ini sangat sederhana, cepat dan ekonomis,
memiliki kisaran 50-3000 bp yang dapat dibedakan dan lebih sesuai bagi individu
yang ditangani dalam jumlah banyak (Hillis et al, 1996).

3

Permasalahan
Kerusakan hutan dipterokarpa yang diakibatkan oleh deforestrasi seperti
pembalakan hutan secara liar, kebakaran dan lainnya dapat berdampak pada
penurunan populasi S. leprosula. Penurunan populasi ini menyebabkan terjadi
penurunan sumberdaya genetik dari S. leprosula, oleh karena itu perlu segera
dilakukan program konservasi genetik jenis ini. Penelitian tentang keragaman
genetik S. leprosula sangat diperlukan untuk memberikan landasan ilmiah dalam
penggunaan stategi konservasi genetik.

Tujuan
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk :
1. Mengetahui variasi keragaman cpDNA S. leprosula, yaitu jumlah
haplotiype berdasarkan PCR-RLFP, yaitu titik potong (restriction site)
pada DNA fragmen hasil PCR dengan menggunakan enzim restriksi
2. Mengetahui variasi cpDNA di dalam dan antar populasi S. leprosula
Hipotesis
Hipotesis yang diuji adalah bahwa cpDNA S. leprosula di Indonesia
memiliki variasi yang rendah, dimana pola yang dijumpai dapat digunakan untuk
melacak atau membedakan populasi antar pulau.karena diwariskan secara
maternal.
Manfaat
1. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tetang variasi
genetik S. leprosula yang ada di Indonesia untuk kepentingan suatu program
konservasi genetik yang berkesinambungan, dan pada akhirnya dapat
digunakan untuk mendukungsuatu program pemuliaan dari jenis ini
2. Variasi cpDNA S. leprosula dapat digunakan untuk menentukan asal usul,
serta aliran gen berupa migrasi benih dari jenis ini

4

TINJAUAN PUSTAKA
Shorea leprosula Miq.
Aspek Botanis
Shorea leprosula termasuk ke dalam famili Dipterocarpaceae, Kelas
Dicotyledone, dan sub-divisi angiospermae. Pohon jenis ini mempunyai tinggi
total mencapai 60 m, dan tinggi bebas cabang 45 m, diameter batang umumnya
mencapai 2 m dengan banir mencapai 5 m (Heyne, 1987). Samingan (1973)
menambahkan, pohon jenis ini memiliki batang yang lurus, besar, bersih dan
berbanir. Kulitnya mempunyai garis-garis halus dan lurus. Sering terlihat ada
damar yang keluar dari kulitnya, warnanya coklat sampai kuning.

Bunganya

berwarna merah, kuning atau agak putih. Buah keras dengan sayap berjumlah
lima yang terdiri dari 3 sayap panjang dan 2 sayap pendek, serta bentuk buahnya
berbentuk bulat. Pada umumnya meranti menduduki strata tajuk lapisan paling
atas (strata A) atau lapisan ke-2 (strata B). Pada umumnya meranti termasuk jenis
semitoleran.
Berdasarkan keadaan dan sifat kayunya S. leprosula termasuk ke dalam
kelompok meranti merah.

Jenis meranti merah terdiri dari pohon besar dan

berbanir besar, batang merah atau bersisik, pada umumnya berdamar, kulit luar
dan kulit dalam tebal, berurat- urat, warnanya merah atau kemerah- merahan,
gubalnya kuning pucat, serta isi kayu berwarna merah (Al Rasyid, et al., 1991).
Penyebaran dan Tempat Tumbuh
Shorea leprosula secara alami menyebar mulai dari Semenanjung
Thailand dan Malaysia, Sumatera dan Kalimantan Utara, biasanya ditemukan di
hutan dipterokarpa di bawah 700 m menempati ruang terbuka di hutan yang
mengalami gangguan.

Tumbuh pada berbagai jenis tanah tetapi tidak toleran

terhadap genangan. Curah hujan 1500-3500 mm pertahun, dan musim kemarau
pendek perlu untuk pertumbuhan dan regenerasi. Jarang ditemukan di punggung
bukit. S. leprosula merupakan meranti merah yang pertumbuhannya paling cepat
jika dibandingkan dengan meranti jenis yang lain, namun kondisi ini hanya
sampai umur 20 tahun, selanjutnya akan terkejar oleh meranti lain. Jenis ini
mengalami penurunan populasi yang disebabkan oleh adanya penebangan liar,
dan menurut daftar IUCN S. leprosula tergolong langka.

5

Pembungaan
Pembungaan S. leprosula terjadi setiap 3 hingga 5 tahun sekali. Pada saat
mengalami pembungaan, hampir semua pohon berbunga lebat dan serempak,
bunga tersebut akan merekah pada malam hari. Jika terjadi kekeringan selama
periode ini, gugur buah tertunda dan buah tidak berkembang sempurna. Pada
sebaran alami, pengumpulan benih dilakukan pada bula Maret-Juli, terutama pada
bulan setelah musim kemarau.

Pemanenan Buah
Untuk mengurangi kerusakan oleh serangga, sebaiknya buah dipetik di
atas pohon. Pengumpulan hendaknya dilakukan ketika periode utama gugur buah,
sebab sebelum ini biasanya belum masak dan terserang serangga.

Kegunaan
Kayunya ringan, merupakan kayu berharga dan sangat baik untuk
(joinery), (meubel), panel, lantai, langit- langit dan juga untuk kayu lapis.
Menghasilkan resin yang dikenal dengan damar daging, yang dapat digunakan
obat. Kulitnya digunakan untuk produksi tannin.

Keragaman Genetik
Keragaman genetik suatu spesies adalah hasil dari perkembangbiakan
secara seksual. Pada proses perkembangbiakan seksual, terjadi peristiwa meiosis
yang mereduksi jumlah kromosom diploid (2n) dalam sel tetua menjadi haploid
(n) dalam gamet, mengikuti hukum segregasi bebas seperti diungkapkan oleh
Mendel (Hukum Mendel 1). Selanjutnya diperjelas lagi pada Hukum Mendel 2
meiosis kromosom homolog juga akan mengalami pindah silang dan kadangkadang terjadi perubahan susunan genetik karena mutasi yang akan menambah
keturunan (Crowder, 1986). Selain perkawinan dan mutasi, ditambahkan oleh
Finkeldey (2003) bahwa migrasi, aliran ge netik, penyimpangan genetik, dan
proses seleksi. Keragaman genetik adalah suatu besaran yang mengukur variasi

6

fenotipe yang disebabkan oleh faktor- faktor genetik. Fenotipe salah satu tanaman
akan berbeda dengan tanaman yang lainnya dalam satu atau beberapa hal.
Keragaman genetik merupakan landasan bagi pemulia untuk memulai
suatu kegiatan perbaikan tanaman. Besarnya keragaman genetik dapat menjadi
dasar untuk menduga keberhasilan perbaikan genetik di dalam program pemuliaan
(Comstock dan Moll, 1963 dalam Rachmadi 1999).

Allard (1961)

mengungkapkan bahwa, keragaman genetik yang luas merupakan syarat
berlangsungnya proses seleksi yang efektif karena memberikan keleluasaan dalam
proses pemilihan suatu genotipe. Selain itu populasi dengan keragaman genetik
yang lebih luas akan memberikan peluang yang lebih besar diperolehnya karakterkarakter yang diinginkan (Simonds, 1979).
Soerjanegara dan Djamhuri (1979) mempertegas bahwa dalam satu jenis
pohon dapat dijumpai keragaman geografis (antar provenan), keragaman lokal
(antar tempat tumbuh), dan keragaman dalam pohon serta keragaman antar pohon.
Ada dua sebab yang menimbulkan keragaman, yaitu perbedaan lingkungan dan
perbedaaan susunan genetik.

Keragaman lingkungan biasanya disebabkan oleh

keadaan perbedaan tempat tumbuh, sifat tanah, atau jarak tanam. Namun adapula
keragaman yang tidak dapat diterangkan dengan perbedaan tempat tumbuh,
misalnya perbedaan bentuk batang, tebang batang, tebal cabang, dan berat jenis
kayu dari pohon-pohon dalam suatu tegakan.

Dalam hal ini keragaman

dipengaruhi oleh perbedaaan genetik yang diturunkan tetua kepada keturunannya
(keragaman genetik). Adanya keragaman dalam suatu jenis perlu diketahui lebih
dahulu sebelum memulai dengan pemuliaan pohon, karenakeragaman genetik
merupakan syarat mutlak dalam pemuliaan, yaitu untuk memungkinkan seleksi
dan untuk mencegah dihasilkannya tanman yang tidak bermutu.
DNA Kloroplas
Yatim (2003) mengungkapkan bahwa unit fungsional materi genetik ialah
gen, berasal dari kata genos, artinya asal- usul. Sedangkan unit struktural atau unit
kimiawi gen ialah DNA (deoxyribo-nucleic acid, asam deoksiribo- nukleat). Gen
atau DNA itu berderet secara linier pada kromatin atau kromosom. Satu benang
kromatin dibina atas nukleoprotein, yaitu gabungan asam nukleat (DNA) dan
protein. DNA-nya, membentuk super- lilitan sepanjang kromatin, sedangkan
7

protein bertindak sebagai tempat melilit, protein yang jadi tempat melilit DNA
disebut histon. Protein lain dalam kromatin ada yang bertindak sebagai penyekat,
penyalut, unsur regulator, atau sebagai enzim bagi aktivitas DNA, mereka disebut
protein nonhiston. Gen menumbuhkan dan memelihara aktivitas seharian berbagai
karakter dalam tubuh. Jumlah karakter dalam satu individu ada ribuan macam.
Contoh karakter: Batang (tebal, gepeng/pipih), daun (bulat, lonjong, jarum), buah
(bulat/kriput).
Di antara gen yang banyak itu, ada karakter yang pengatur utamanya satu
gen, disebut karakter monogenik. Ada pula karakter yang diatur oleh banyak gen,
disebut karakter poligenik. Satu gen dibina atas satu molekul DNA. Antara gen
bersebelahan dalam satu kromosom ada urutan DNA seling (intervening
sequences), tidak berperan dalam menumbuhkan suatu karakter.
DNA semacam bahan organik yang memiliki BM (berat molekul) yang
terbesar dalam sel, yaitu dalam ukuran juta. Monomer DNA ialah nukleotida.
Satu gen dibina atas satu molekul DNA, dan satu molekul DNA dibina atas ribuan
sampai puluhan ribu nukleotida. Satu nukleotida terdiri dari tiga gugus senyawa:
1) gula deoksiribosa; 2) fosfat; 3) basa-N. Gula yang membina DNA tergolong
gula pentosa, yaitu gula yang atom karbonnya lima. Glukosa yang membina
sebagian besar gula dalam tubuh kita dan yang menjadi sumber utama energi,
tergolong gula heksosa, artinya gula yang atom karbonnya enam, gugus fosfat
ialah -PO4-3. Basa-N terdiri dari dua kelompok dan tiap kelompok dibina atas dua
macam basa: 1) purin; adenin (A) dan guanim (G); 2) pirimidin: timin (T) dan
citosin (C). Satu molekul DNA terdiri untaian linear nukleotida, sehingga disebut
juga satu utas. Agar sifat kimianya stabil maka DNA itu bersusun berpasangan,
disebut utas double. Kedua utas DNA yang berpasangan (double) itu berpilin
sejajar (helix) sesama, tapi arahnya berlawanan (anti-paralel). Maksudnya bagian
kepala satu utas berpasangan dengan bagian ekor utas pasangan.
Tegasnya DNA dalam inti sel disebut dalam susunan double helix antiparalel. Kedua utas diikat oleh ikatan hidrogen antar basa masing- masing.
Perikatan antara basa itu tertentu dan tetap, yaitu antara A dari satu utas berikatan
dengan T utas pasangan, dan antara G dari satu utas berikatan dengan C utas
pasangan, disingkat A-T, G-C. Dengan demikian urutan nukleotida yang membina

8

sepasang utas DNA yang double helix membentuk semacam tangga spiral. Induk
tangganya yang sejajar tapi berpilin ialah untaian G-P. Jadi B dari satu utas
berikatan dengan B dari utas pasangan B-B. Urutan nukleotida yang membina
satu molekul DNA membentuk semacam tangga spiral. Induk tangganya ialah
ikatan S-P dari kedua utas, sedangkan anak tangganya ialah ikatan B-B, tangga itu
berbentuk spiral, maka pegangannya kiri-kanan ialah untaian S-P, sedangkan anak
tangga yang diinjak ialah pasangan B-B.
Suatu gen diberi simbol dalam buku atau majalah menurut urutan
pasangan basa nukleotiodanya: A-T, G-C. Alasannya ia lah: 1) P (fosfat) semua
nukleotida tetap; 2) S (sugar, gula) semua nukleotida tetap, yaitu deoksiribosa; 3)
variasi antara nukleotida hanya pada basa yang empat macam; 4) mutasi yang
terjadi pada suatu gen sehingga menyebabkan kelainan atau penyakit, sela lu
terjadi pada basa nukleotida saja. Susunan DNA disajikan seperti pada Gambar 1.

Gambar 1. Rantai DNA (Hattemer et al., 1993 dalam Finkeldey, 2003)

Finkeldey (2003) menambahkan, sampai saat ini masih diyakini bahwa
genetik merupakan hal yang mampu mengenali dan memberikan informasi suatu
organisme, hal ini di karenakan dalam gen terdapat suatu material yang berbeda
9

dengan material yang la in yaitu DNA (deoxyribonucleic acid). Materi genetik gen
ialah DNA-nya. Asam ini disebut juga asam nukleat, berasal dari kata asam yang
terdapat dalam nukleus, karena sebagian besar (99,9 persen) asam ini terdapat
dalam inti, sisanya yang 0,1 persen terdapat dalam organel tertentu. Organel yang
mengandung DNA ialah plastida yang terdiri dari mitokondria dan kloroplas.
Material genetik yang di analisis dari plastida biasanya hanya berasal dari sifat
satu tetuanya, kalau tidak dari tetua jantannya saja atau hanya dari betinanya saja,
lain halnya dengan material genetik yang diambil dari inti analisis genetiknya,
bias menunjukan dua tetuanya. Pada DNA kloroplas material genetik diturunkan
dari induk betina nya saja.

Sumber :www.micro.magnet.fsu.edu

Gambar 2. Letak cpDNA pada sel

PCR (Polymerase Chain Reaction)
Polimerase chain reaction (PCR) merupakan teknik yang mulai
berkembang pesat sekitar tahun 1987. Pada dasarnya PCR mampu mengenali
dan memperbanyak (amplifikasi) segmen DNA sasaran walupun dalam
konsentrasi

yang

sangat

rendah

menggunakan

satu

pasang

primer
10

oligonukleotida. Reaksi amplifikasi sangat tergantung dari keberadaan enzim
polimerase sebagai katalisator, terutama yang tahan pana s. Enzim yang paling
terkenal dan banyak digunakan adalah polimerase DNA Taq yang diisolasi dari
bakteri yang tahan panas Thermus aquaticus. Bahan utama lain yang diperlukan
adalah deoxynukleotide triphospates (dNTPa).
PCR adalah suatu metode untuk menggandakan atau mengamplifikasi
DNA yang diisolasi pada sebuah tabung reaksi kecil dengan melalui replikasi
berulang (Gambar 3). Titik awal dari reaksi (primers) adalah oligonukleotida,
yakni potongan kecil DNA yang dihasilkan secara buatan (biasanya terdiri
antara 10-25 nukleotida). Sekuensi basa dari primer dapat dipilih secara bebas.
DNA teramplifikasi dalam reaksi campuran mengunakan enzim thermostabil
(enzim tahan panas) yakni DNA polimerase dari titik awal seperti ditunjukkan
oleh sekuensi pada primer. Reaksi dikendalikan oleh perubahan suhu pada
thermocycler. PCR memungkinkan penggandaan potongan pendek. DNA dari
semua organisme (lebih dari 2000 hingga 3000bps). Dari satu tabung reaksi
tunggal dapat dihasilkan jutaan tiruan potongan DNA identik seperti pada
Gambar 3 (Newbury dan Fordllyoyd, 1993 dalam Finkeldey, 2003).
PCR

merupakan

salah

satu

tahapan

proses

dalam

penentuan

keanekaragaman genetik, PCR ini berfungsi untuk mendapatkan sekuensisekuensi DNA dari genom DNA.

Akan tetapi menurut Gupta et al. (2002)

penanda genetik ini tidak hanya PCR, penandaan lain yang biasa digunakan
adalah; (i) hibridisasi berdasarkan penanda, (ii) penanda molekuler berdasarkan
PCR yang dilanjutkan dengan hibridisasi, (iii) sekuensing dan chip DNA
berdasarkan penanda
Seiring dengan kemajuan dalam teknologi DNA, analisis PCR-RFLP dapat
dilakukan tanpa menggunakan pelacak DNA dan proses hibridisasi DNA.
Penemuan program PCR (polymerase chain reaction) dapat membantu
mendapatkan sekuensi-sekuensi DNA tertentu dari genom DNA, kemudian
dilakukan pemotongan dengan enzim restriksi, atau dengan kata lain analisis
PCR-RFLP dapat dilakukan terhadap sekuensi-sekuensi DNA spesifik yang telah
diisolasi dengan menggunakan primer spesifik dalam program PCR

11

DNA
Primer
Nukleotida

Taq Polymerase

Tabung reaksi yang berisi
larutan penyangga
Proses dengan thermocycler

Untuk genotif 1

Untuk genotif 2

Elektroforesis pada
agarose gel

Gambar 3. Prinsip reaksi RCR (Rabouam et al, 1999 dalam finkeldey, 2005)
.
Dalam analisis PCR, digunakan primer spesifik yang mampu mengklon
sekuensi DNA tertentu yang dapat digunakan sebagai pengganti pelacak DNA
dalam analisis PCR-RFLP. Sekuensi DNA yang sudah diisolasi dipotong dengan
berbagai enzim restriksi, guna melihat keragaman melalui keberadaan
recognition site yang memberikan ukuran potongan DNA yang berbeda-beda.
Potonga n DNA dengan ukuran berbeda-beda ini merupakan gambaran adanya

12

keragaman genetik berdasarkan sekuen DNA yang diisolasi pada berbagai jenis
tanaman yang dianalisis.
Pada saat media contoh dipanaskan hingga suhu 94o C, atau pH media
dibuat alkalis, maka DNA tersebut menjadi asam, sehingga pHnya dibawah 7, jika
ditambahkan basa (NaoH) maka media itu menjadi alkalis dan DNA mengalami
denaturasi. Pada saat suhu diturunkan hingga ke 50 o C atau pH diturunkan
menjadi asam, maka kedua utas DNA kembali berpasangan. Peristiwa ini disebut
renaturasi (re = kembali). Jika dalam media terdapat DNA lain atau RNA, dan
urutan basa mereka komplemen, maka akan terjadi perpasangan atau hibrid.
Adapun proses amplifikasi PCR adalah seperti pada Gambar 4.

PCR: polymerase chain reaction
Step 1 : denaturation

Step 2 : annealing

Step 3 : extension

Gambar 4. Proses amplifikasi PCR
(www.users.ugent.be/~avierst/principle/seq.htm)
(Gailing et al., 2003 )

13

PCR-RFLP
(Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphisms)
PCR-RFLP adalah penanda dominan yang merestriksi DNA secara
spesifik pada lokasi tertentu yang dikenalnya dengan enzim restriksi
endonuklease (Park dan Moran, 1995). Enzim Restriksi ini akan mengenali
sekuen tertentu dan memutus DNA jika bertemu dengan situs yang dikenalnya
dan menghasilkan sejumlah fragmen DNA.
Polimorfisme PCR-RFLP muncul karena adanya basa yang mengalami
substitusi, penambahan, pengurangan dan perpindahan (translokasi) pada genom
DNA.

Perubahan tersebut menyebabkan perbedaan ukuran dari fragmen

restriksi yang dicerna oleh enzim restriksi tertentu. Fragmen yang dihasilkan
oleh enzim restriksi dapat dipilah-pilah dengan elektroforesis.
DNA genom yang dipotong oleh enzim restriksi, akan menghasilkan
beratus-ratus atau beribu-ribu potongan DNA. Untuk mempelajari pola
pemotongan DNA yang berasal dari lokus tertentu dalam kromosom, maka
ratusan atau ribuan potongan tersebut harus :
(a) Dipisahkan berdasarkan ukuran dengan elektroforesis gel agarose
(b) Potongan DNA tertentu yang diinginkan harus dapat dibedakan dari
populasi potongan DNA dengan ukuran yang sama dengan melakukan
hibridisasi menggunakan pelacak DNA (DNA probe).
Pelaksanaan analisis PCR-RFLP memerlukan penggunaan bahan
radioaktif atau bahan non-radioaktif tertentu untuk memberi label pada pelacak
DNA. Bahan ini harganya masih relatif mahal. Selain itu, bahan radioaktif juga
merupakan polutan yang berbahaya bagi lingkungan. Sebaliknya, bahan nonradioaktif walaupun tidak berbahaya, tetapi kemampua n dan sensitifitasnya
untuk mendeteksi sekuensi DNA kopi tunggal masih belum efisien. Pemberian
label pada pelacak DNA dilakukan dengan teknik nick translation atau dengan
teknik random priming DNA labelling. Dengan teknik nick translation, salah
satu untaian dari DNA yang akan dilabel diputus diberbagai titik dengan
menggunakan enzim DNaseI. Untaian DNA yang baru, akan disintesis kembali
oleh enzim polimerase I dari titik tempat terjadinya pemutusan tersebut. Ketika
14

proses sintesis DNA yang baru terjadi, nukleotida yang telah diberi label ikut
bergabung dalam untaian DNA baru yang disintesis.
Pelacak DNA yang dipakai dalam penelitian PCR-RFLP dapat berupa
DNA yang berasal dari sekerabat dengan spesies tanaman yang diteliti (pelacak
homolog), atau berasal dari tanaman yang tidak sekerabat (pelacak heterolog).
pelacak heterolog biasanya lebih sulit dalam pemakaiannya karena biasanya ada
homologi sekuensi pelacak DNA dengan DNA tanaman relatif kecil. Akibatnya,
penggunaan pelacak DNA heterolog akan memberikan komplementasi yang
kurang stabil antara DNA tanaman dan pelacak DNA. Pelacak heterologous dari
DNA yang bersifat sangat konservatif (selalu sama untuk berbagai spesies
tanaman) misalnya bagian gen small sub unit dari RUBISCO (Ribulosa Bifosfat
Karboksilasi), gen major klorofil a/b binding protein atau gen RNA ribosomal.

15

METODE PENELITIAN
Tempat dan waktu penelitian
Pengambilan contoh daun dilakukan pada populasi S. leprosula di 13
lokasi di Indonesia (Tabel 1). Penelitian elektroforesis dan analisis DNA
dilakukan di Laboratorium Silvikultur Fakultas Kehutanan Institut Pertanian
Bogor. Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret-Juni 2005 untuk pengambilan
data primer selanjutnya bulan Juli-September 2005 untuk studi pustaka dan
analisis data.
Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang digunakan untuk penelitian ini berupa daun S. leprosula yang
telah kering. Selain itu juga digunakan silika gel, nitrogen cair, bahan-bahan kimia
untuk membuat buffer untuk proses ekstraksi DNA, PCR, dan pemotongan DNA,
agaros, serta ethidium bromida (EtBr).
Alat-alat yang digunakan untuk pengambilan contoh di lapangan meliputi:
tally sheet, label, alat tulis, plastik klip, gunting. Alat-alat yang digunakan untuk
elektroforesis dan analisis DNA di laboratorium meliputi: mortar dan pestel,
sarung tangan, pipet, pipet mikro, sentrifugasi, vortex, spatula, gelas piala, gelas
ukur, koleksi tabung, cetakan gel, bak elektroforesis, tray, microwave, power
supply, pH meter, gelas piala, gelas ukur, timbangan analitik, pengaduk magnet,
lemari pendingin, water bath, mesin PCR, ultraviolet transiluminator, kamera
digital.
Prosedur Penelitian
Optimasi metode
Tahapan optimasi metode dilakukan untuk menjamin munculnya pita
dengan resolusi yang tinggi. Tahapan optimasi metode ini meliputi 3 proses
utama, yaitu ekstraksi DNA, amplifikasi PCR dan pemotongan cpDNA. Optimasi
ekstraksi DNA dari daun dimulai dari penentuan ukuran daun yang diekstrak,
komposisi bahan ekstraksi, suhu dan kepekatan gel agaros pada proses
elektroforesis, termasuk pengenceran DNA hasil ekstraksi. Optimasi pada proses
amplifikasi PCR adalah mencari komposisi bahan yang digunakan untuk PCR

16

cpDNA serta primer yang akan digunakan, pengaturan suhu pada thermocycler
sesuai dengan primer yang digunakan, suhu dan kepekatan gel agaros pada proses
elektroforesis. Optimasi pada proses pemotongan DNA yang dilakukan adalah
mencari komposisi bahan yang digunakan untuk pemotongan DNA serta mencari
jenis enzim restriksi yang akan digunakan, kondisi arus, tegangan dan persentase
agaros pada elektroforesis. Skema prosedur penelitian menggunakann penanda
PCR-RFLP dapat dilihat pada Gambar 5.

Ekstraksi DNA

Ya

Tidak

PCR

Ya

Tidak

RFLP

Gambar 5. Bagan alur penelitian di laboratorium
Pengambilan Contoh
Pengambilan contoh dilakukan di 13 populasi S. leprosula (Tabel 1),
dimana pada masing- masing populasi diambil 5 contoh (Gambar 6). Pengambilan
contoh daun dilakukan dengan mengambil daun ke 2 atau ke 3 dari pucuk dengan
jumlah sekitar 5 daun yang berada di lokasi dan dimasukkan ke dalam plastik klip,
kemudian dalam plastik tersebut dimasukkan silika gel dengan perbandingan berat
daun contoh dan silika gel sebesar 1 : 5. Silika gel yang sudah berubah warna
diganti dengan silika gel yang baru sampai contoh daun menjadi kering. Pada
plastik klip diberi label yang meliputi: nomor pohon diameter, tinggi pohon dan

17

lokasi.

Selain itu juga dilakukan pengambilan daun yang digunakan untuk

herbarium untuk keperluan identifikasi jenis.
Tabel 1. Lokasi pengambilam contoh S. leprosula
Perkiraan Lokasi

No

Lokasi

Provinsi

Batch

Garis Bujur

Garis Lintang

1

Haurbentes, Bogor

Jawa Barat

106041’ - 107042’ BT

6054’-7054’ LU

2

Tering

Kalimantan Timur

115022’ – 116038’ BT

000 – 00010’ LS

3

Asialog, Jambi

Sumatra

103015’ – 103033’ BT

2002’ – 2022’ LU

4

Pasir Mayang, Jambi

Sumatra

101019’ – 103020’ BT

0008’ – 0309’ LU

5
6
7

TNBT, Riau
Nanjak Makmur, Jambi
Sari Bumi Kusuma

Sumatra
Sumatra
Kalimantan Selatan

102013’ – 103014’ BT
101040’ BT
111018’ - 114042’ BT

0105’ - 0206’ LU
10022’ LU
01059’ - 00036’ LU

8
9

PT ITCI Kartika Utama
Kebun Percobaan Darmaga,
Bogor
Bukit Bangkirai, Balikpapan
Sumalindo, Samarinda
Carita I
Carita II

Kalimantan Timur
Jawa Barat

116017’ - 11706’ BT
106050’ – 1070 50’ BT

00020’ - 01018’ LU
6036’ – 7040’ LU

Kalimantan Timur
Kalimantan Timur
Banten
Banten

117032’ – 118035’ BT
115018’ – 116036’ BT
105°15' – 106011’ BT
105°15' – 106011’ BT

00014’ – 01015’ LU
00055’ – 00056’ LS
6°21' - 7°10' LU
6°21' - 7°10' LU

10
11
12
13

11

5
4
6

4

2
7

3

8

10

1
12
9

Gambar 6. Peta pengambilan contoh S. leprosula

18

Ekstraksi DNA
Metode yang digunakan untuk ekstraksi DNA mengikuti prosedur yang
dikeluarkan oleh QIAGEN dengan menggunakan DNeasy Plant Mini Kit untuk
isolasi jaringan tanaman. Ekstraksi DNA ini meliputi tiga tahapan, yaitu tahapan
prespitasi, pencucian dan elusi (Lampiran 1).
Tahap pertama yaitu tahapan prespitasi dimulai dengan menggerus contoh
daun meranti berukuran 2 x 1 cm yang ditambahkan nitrogen cair dengan
menggunakan mortar dan pestel untuk mendapatkan serbuk. Serbuk kemudian
dipindahkan ke dalam tabung yang berkuran 2 ml. Tambahkan 400 µl buffer AP1
dan 4 µl RNAse A (100 mg/ml) yang berfungsi untuk menghilangkan RNA dalam
Larutan tersebut kemudian di kocok dengan menggunakan vortex.

larutan.

Larutan diinkubasi di dalam water bath selama 10 menit dengan suhu 65o C,
kemudian dikocok 2 - 3 kali selama inkubasi dengan membalikkan tabung.
Ditambahkan 130 µl buffer AP2, vortex, kemudian diinkubasikan ke dalam es
selama 5 menit, kemudian di sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan penuh.
dimasukkan cairan ke dalam QIAShedder spin column yang terdapat pada koleksi
tabung 2 ml dan dilakukan sentrifugasi selama 2 menit denga n kecepatan
maksimum. Larutan yang mengalir lewat fraksi dari dipindahkan ke tabung yang
baru (tanpa penambahan). 1,5 volume buffer AP3/E (buffer sebelumnya
ditambahkan dengan etanol) pada larutan bersih ditambahkan dan dicampur
dengan pemipetan. dimasukkan 650 µl larutan ke DNeasy mini spin column yang
di letakkan di koleksi tabung 2 ml, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 8000
rpm kemudian cairan yang melewati fraksi dibuang.
Tahapan kedua yaitu tahapan pencucian (washing) dimulai dengan
menempatkan DNeasy column pada tabung koleksi 2 ml yang baru , kemudian
ditambahkan 500 µl buffer AW pada DNeasy column dan sentrifugasi selama 1
menit pada kecepatan 8000 rpm. Cairan yang melewati fraksi dibuang, kegiatan
ini dilakukan dua kali, kemudian disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan
maksimal.

19

Tahapan ketiga yaitu tahapan elution dilakukan dengan menyimpan
DNeasy column pada 1,5 atau 2 ml tabung sentrifugasi dan pipet 100 µl buffer AE
hangat (65o C) ke dalam membran Dneasy dan dilakukan inkubasikan selama 5
menit pada suhu ruangan, kemudian disentrifugasi selama 1 menit dengan
kecepatan 8000 rpm, tahapan ini dilakukan dua kali, sehingga akan dihasilkan
DNA hasil ekstraksi sebanyak 200 µl.
DNA

hasil

ekstraksi

kemudian

dilakukan

uji

kualitas

dengan

menggunakan teknik elektroforesis agaros 1%. Gel ini dibuat dengan melarutkan
agaros sebanyak 2,5 µl ke dalam 250 µl larutan TAE (tris acetate with EDTA).
Kemudian larutan dipanaskan di dalam microwave sampai mendidih. Larutan gel
dibiarkan sampai hangat (± 50o C) kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel
dengan ketebalan 5 mm. Cetakan gel tersebut telah dipasang sisir/comb yang
berfungsi untuk membuat cetakan sumur gel/well elektroforesis. Gel didinginkan
sampai membeku. Kemudian sisir/comb dicabut dan gel beserta cetakannya
dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi buffer elektroforesis yaitu
buffer TAE sebanyak 2300 ml. DNA hasil ekstraksi sebanyak 15 µl ditambah
3,75 µl bahan pewarna (blue juice) dimasukkan ke dalam sumur-sumur
elektroforesis. Setelah itu bak elektroforesis ditutup dan dialiri listrik dengan
tegangan 25 volt selama 3 jam.
Gel

yang

sudah

dielektroforesis

dilakukan

pewarnaan

dengan

merendamkan gel di dalam larutan ethidium bromida (EtBr) 25 µl dan aquadest
500 ml selama 1 jam.

Kemudian dideteksi dengan mengunakan ultraviolet

transiluminator.
Amplifikasi PCR
DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR MJ
Reseach PTC-100 Peltier Thermal cycler. Primer yang digunakan adalah primer
universal (hampir terdapat di semua tumbuhan) yaitu petB, psaA, psbA, rbcL dan
trnLF (Gambar 6)

20

Gambar 7. Letak petB, psaA, trnLF dan rbcL pada peta plasmid cpDNA Nicotiana
tabacum
Urutan nukleotida dari masing- masing primer adalah sebagai berikut :
petB

: 5’-TGGGGAACTACTCCTTTGAT-3’
5’-CCCGAAATACCTTGCTTACG-3’

psaA

: 5’-AAGAATGCCCATGTTGTGGC-3’
5’-TTCGTTCGCCGGAACCAGAA-3’

rbcL

: 5’-TGTCACCAAAAACAGAGACT-3’
5’-TTCCATACTTCACAAGCAGC-3’

trnLF

: 5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’
5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’

21

Primer yang akan digunakan sebelumnya dilakukan pengenceran terlebih
dahulu. Pengenceran dilakukan dengan cara mengambil primer pekat dengan
konsentrasi 50 µM sebanyak 20 µl kemudian ditambahkan H2 O sebanyak 180 µl.
Konsentrasi akhir primer akan

menjadi 5 µM. Komposisi bahan-bahan yang

digunakan dalam proses amplifikasi ini tersaji pada tabel 2.
Tabel 2. Komposisi bahan-bahan yang digunakan untuk PCR
Komponen

Volume
2,0 µl
1,8 µl
1,8 µl
1,9 µl
7,5 µl

Template DNA
Forward primer (5 pM)
Reverse primer (5 pM)
Destilled water
HotStar Taq® Master Mix Kit (Qiagen, Hilden)

Lautan PCR untuk setiap contoh merupakan campuran dari dari berbagai
komponen seperti pada Tabel 2. kemudian ditambahkan 1,9 µl destilled water
hingga volume larutan mencapai 15 µl. Larutan kemudian diaduk dengan
menggunakan vortex kemudian disentrifugasi.

Larutan tersebut kemudian di

masukan kedalam mesin PCR yang sudah di program dengan pengkondisian suhu
dan waktu. Seperti pada Tabel 3.
Tabel 3. Pengkondisian suhu dan waktu pada mesin PCR untuk primer petB,
psaA, trnLFdan rbcL
Tahapan
Suhu
Waktu
Jumlah
(o
C)
(menit)
siklus
Pemanasan Awal
95
15
1
- Denaturasi
94
1
35
- Annealing
50 & 56
1
- Extension
72
2
Pemanasan akhir
72
10
1
Penyimpanan
8
Selamanya
1
Hasil PCR kemudian di uji dengan menggunakan gel agaros dengan
kepekatan 2%, yang dibuat dengan melarutkan 0,4 mg agaros dalam 40 ml TAE.
Larutan hasil PCR sebanyak 3 µl dicampurkan dengan larutan pewarna (brom
phenol) sebanyak 3 µl dimasukkan ke dalam sumur gel.

Larutan tersebut

dielektroforesis selama 30 menit. Proses berikutnya yaitu pengecekan DNA. DNA
hasil PCR harus lebih banyak dari hasil ekstraksi. Apabila DNA hasil PCR masih
22

sedikit atau sama dengan hasil ekstraksi maka harus dilakukan PCR ulang dengan
komposisi DNA yang lebih encer. Pengenceran ini dilakukan karena sifat DNA
dari Meranti memiliki kadar fenol yang tinggi. Kadar fenol yang tinggi ini dapat
menghambat daya kerja primer.

Analisis PCR - RFLP
Analisis polimorfik dilakukan dengan teknik PCR-RFLP untuk melihat
jumlah basa antar fragmen.

DNA kloroplas hasil PCR dipotong dengan

menggunakan enzim restriksi untuk analisis keragaman genetik.

Dibawah ini

adalah jenis-jenis enzim restriksi yang digunakan dalam penelitian ini.
Tabel 4. Jenis enzim restrksi yang digunakan utuk memotong DNA
No

Nama

Sumber

1

Alu I

Anthrobacter loteus

2

Taq I

Thermus aquticus

3

Hinf I

Haemophilus influenzae

4

Rsa I

Rhodopseudomonas
sphaeroides

5

Cfo I

Clostridium formicoaceticum

6

Msp I

Moraxella sp.

7

Dra I

Deinococcus radiopilus

8

BamH I

Bacillus amyloliquefaciens H.

9

Hind III

Haemophilus influenzae

10

Pst I

Providensia stuartii

Situs
pemotongan
AG↓CT
TC↑GA
T↓CGA
AGC↑T
G↓ANTC
CTNA↑G
GT↓AC
CA↑TG
GCG↓C
C↑GCG
C↓CGG
GGC↑C
TTT↓AAA
AAA↑TTT
C↓GATC
CTAG↑G
A↓AGCT
TCGA↑G
TGCA↓G
G↑ACGT

Temperatur
Inkubasi (oC)
37
65
37
37
37
37
37
37
37
37

Larutan yang digunakan untuk p