ANALISA KOMPONEN BIOAKTIF PANGAN FUNGSIONAL
27/06/2013
METODE ANALISIS
ANALISA KOMPONEN BIOAKTIF
PANGAN FUNGSIONAL
Kompetensi yang diharapkan :
• Mahasiswa mampu menjelaskan
metode
pengujian
komponen
bioaktif pangan fungsional
We Do
Pengembangan
Metode
So that
Tidak diperlukan pengulangan setiap
kali analisis dilakukan
Analisis sesuai
Metode
Variasi dari satu lab dengan lab yang
lain harus dihindari dan hasilnya harus
dapat diulang
Dokumentasi
Dapat
dilakukan
pengembangan
dengan perubahan sesuai kebutuhan
Kontrol Mutu secara
Statistik
Korelasi fungsi dan konstituen kimia
dikembangkan
Jaminan Mutu
Ruang
Lingkup
Micro of trace Konstituen
mikro
Tipe Analisis
Metode
Parameter
kimia
Kromatografi Sifat
dari
dan
Spektroskopi komponen
Macro
Konstituen
Major
Fisiko-kimia, Sifat kimia,
analisis
perilaku
termal
termal
Bulk
Produk
Reologi
Tekstur,
viskositas
ANALISIS MIKRO
• Langkah-langkah yang harus
dikerjakan adalah :
– Defenisi masalah
– Persiapan sampel yang mewakili
– Persiapan sampel atau ekstraksi
– Seleksi alat dan kondisi analisis
– Analisis berdasarkan metode yang
dipilih
– Kompilasi hasil
– Metode
Pengembangan metode :
Cara-cara ekstraksi :
Presipitasi
Ekstraksi Solvent
Ekstraksi fase padat
Hati-hati dalam memilih :
Pelarut yang benar
Filter yang sesuai
Memberi keuntungan bagi konsumen
1
27/06/2013
Ekstraksi Analit dari Matriks
Sistem
Cair
Metodologi
Pemisahan
Cair-cair
Padat
Ekstraksi
Soxhlet
Relefansi
Isolasi
komponen
dari matriks
FENOLIK TANAMAN
•
•
•
•
•
Asam fenolat
Flavonoid
Tanin
Stilbenes
lignan
Keterangan
Pemecahan
emulsi
dengan cara
presipitasi
atau
desalting
Jangan
ada
kebocoran
untuk
mencegah
kehilangan
KOMPONEN FENOLIK TANAMAN
• Fenoilk : komponen yang memiliki 1 atau lebih cincin
aromatik dengan 1 atau lebih gugus hidroksil.
• Terdistribusi secara luas pada hampir semua jenis tanaman
sebagai metabolit sekunder
• Saat ini lebih dari 8000 struktur fenolik yang dikenal, dari
mulai molekul yang sederhana seperti asam fenolat hingga
struktur polimer seperti tanin.
• Fenoiik tanaman biasanya terbentuk untuk melawan radiasi
matahari, patogen, parasit dan ppredator, juga
berkontribusi terhadap warna pada tanaman.
• Terdapat pada hampir semua bagian tanaman
merupakan bagian dari diet manusia
• Berkontribusi terhadap karakteristik organoleptik, misalnya
rasa pahit, astrigen (sepat) yang disebabkan interaksi
• Bereaksi dengan oksigen dan merupakan faktor kritis pada
pengawetan, pematangan dan aging dari anggur (wine)
FLAVONOID
• Struktur : inti flavon tdd 15 atom C dengan 3 cincin
(C6-C3-C6) yang disebut dengan A,B,C
• Tdd 6 sub kelompok :
1. Flavone
2. Flavonol
3. Flavanol
Tergantung pada kondisi
4. Flavanon
oksidasi cincin C pusat
5. Isovlavon
6. Antosianin
2
27/06/2013
FLAVONOID
• Quercitin adalah flavonol terdapat pada bawang,
brokoli, apel
• Katekin adalah flavanol yang terdapat pada beberapa
jenis buah
• Naringin flavanon yang terdapat pada grapefruit
(jeruk besar)
• Cyanindin-glikosida antosianin yang terdapat pada
buah2 beri seperti black currant, rasberi, blackberry
dll
• Daidzein, genistein dan glisitin isoflavon pada
kedelai
ASAM FENOLAT
• Tdd 2 kelas :
1. Turunan asam benzoat : asam galat
2. Turunan asam sinamat : asam kumarat, asam
kafeat dan asam ferulat
• Asam kafeat :
Diesterifikasi dengan asam quinat asam
klorogenat yaitu komponen fenolik pada kopi
• Asam ferulat :
Terdapat pada serealia
Diesterifikasi menjadi hemiselulosa pada dinding
sel
TANIN
• Tdd atas 2 kelompok :
1. Hydrolyzable tannin
2. Condensed tannin
• Hydrolyzable Tannin :
Komponen yang terdiri dari gugus inti glukosa atau poliol
teresterifikasi lain dengan asam galat disebut gallotannin
Jika dengan hexahydoxilpenat disebut elagitannin
• Condensed Tannin :
Oligomer atau polimer dari flavon 3-ol yang berikatan dengan ikatan
karbon interflavon
Dikenal sebagai asam proantosianin didekomposisi membentuk
antosianin melalui reaksi oksidasi yang dikatalis asam melalui
pemanasan larutan alkohol asam
Gambar. Struktur Flavonoid, Asam Fenolat dan tanin
3
27/06/2013
Gambar. Struktur Stilbenes dan Lignan
Gambar. Struktur Flavonoid, Asam Fenolat dan tanin
EKSTRAKSI FENOLIK
• Dapat diekstrak dari sampel segar, beku atau yang dikeringkan
• Perlakuan sebelum ekstraksi : Milling, grinding, homogenisasi
didahului dengan pengeringan duara atau freeze drying
• Metode ekstraski yang banyak digunakan solvent
rendemen tergantung pada :
Polaritas pelarut
Waktu ekstraksi
Suhu
Rasio sampel : pelarut
Komposisi kimia dan sifat fisik sampel
EKSTRAKSI FENOLIK (2)
• Jenis pelarut :
Metanol
Etanol
Aseton
Etil asetat
Kombinasi pelarut
Kombinasi dengan air pada berbagai proporsi
• Metanol efisien untuk komponen polifenol dengan BM
rendah
• Aseton aqueous untuk flavanol dengan BM tinggi
• Etanol baik untuk ekstrak polifenol dan aman untuk
konsumsi manusia
4
27/06/2013
EKSTRAKSI FENOLIK (3)
EKSTRAKSI FENOLIK (3)
• Ekstraksi fenolik dari tanaman yang kaya akan antosianin :
Pelarut organik yang diasamkan
Sistem pelarut akan mendenaturasi membran sel
melarutkan antosianin dan menstabilkannya
Penambahan asam harus hati-hati karena kelebihan asam
akan menghidrolisis antosianin
Asam yang digunakan : asam organik lemah : asam
formiat, asam asetat, asam sitrat, asam tartarat dan asam
posporik, atau asam kuat dengan konsentrasi rendah
misalnya asam trifluroasetat 0.5-3%, HCl 200 ml pelarut.
• Suhu dan tekanan tinggi meningkatkan kelarutan analit dan
kinetika desporpsi dari matriks.
Microwave Assited Extraction (MAE)
• Ekstraksi dengan menggunakan energi gelombang mikro
untuk memudahkan pemisahan analit dari matriks sampel ke
dalam pelarut.
• Keuntungan : mengurangi waktu ekstraksi dan volume
pelarut jika dibandingkan metode ekstraksi konvensional.
• Digunakan untuk ekstraski fenolik : asam galatm elagat,
quersitin, isoflavon dan trans-resveratrol menggunakan
mikrowave pada suhu 100 °C selama 20 menit.
• Komponen fenolik yang dihasilkan memiliki susbtituen
hydroksil dengan jumlah tinggi (misal tanin) dan sensitif
terhadap kenaikan suhu antosianin tidak dapat diekstraksi
dengan MAE
Subcritical Water Extraction (SWE)
• Sama dengan PLE tapi pelarut yang digunakan adalah air
• Air dipanaskan hingga suhu200°C dan terjadi perubahan
konstanta dielektrik air sehingga air bersifat sebagaimana
pelarut organik.
• Contoh konstanta dielektrik air pada suhu 200°C = 36 yang
mendekati konstanta dielektrik metanol.
• PLE (80–100°C) menggunakan air yang diasamkan asam
efektifnya dengan metanol 60% yang diasamkan untuk
mengekstraksi antosianin dari kulit anggur.
• Komponen fenolik lebih mudah teroksidasi pada suhu tinggi,
sehingga perlu dicegah degradasi pada kondisi PLE.
• PLE efektif digunakan untuk ekstraksi komponen fenolok pada
biji anggur, apel, bayam, terung dan tepung barley.
Extraction of phlorotannins
Bubuk Algal (0.5 g)
Pengadukan dengan shaker menggunakan methanol (2 ml) pada suhu ruang selama 2 jam
Penambahan CHCl3 (4 ml) pengadukan dengan tangan selama 5 menit
Filtratrasi
Filtratrasi menggunakan kapas bebas lemak
Penambahan air bebas ion 1.5 ml dan pengadukan dengan tangan selama 5 menit
Pemisahan campuran antara bagian atas dan bagian bawah, lapisan atas merupakan fraksi non
lemak dikumpulkan
Diekstraksi 2 kali menggunakan ehyl ether (3 ml) dan ambil lapisan atas (2 kali)
Fraksi ethyl ether dievaporasi menggunakan blower nitrogen
Phlorotannins kasar
6
27/06/2013
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Pemurnian phlorotannins
• Analisa secara quantitatif menggunakan
• Dilakukan dengan kombinasi beberapa teknik
kromatografi yaitu TLC (Thin Layer
Chromaography) dan kromatografi kolom
(Column Chromaography).
HPLC
• Sistem HPLC tdd Waters 600 pump,
detektor UV dan kolom and C 18.
• Laju aliran 1.0 mL/m
mL/menit
enit
• Gradien linier 3030-100% methanol
• Detektor UV diatur pada 290 nm
25
KROMATOGRAFI KOLOM
• Terdiri dari fase stasioner (fase diam) dan fase mobil (fase
bergerak).
• Fase diam berupa adsorben berbentuk bubuk yang dimasukkan ke
dalam kolom gelas vertikal. Sampel yang akan dianalisa dimasukkan
di bagian atas dari kolom ini.
• Fase bergerak adalah pelarut yang dialirkan dari atas ke kolom
sehingga komponen dari bahan akan terdistribusi di antara
adsorben dan pelarut dan terjadi pemisahan komponen, sedangkan
pelarut akan mengalir ke bagian bawah kolom.
• Pada pemisahan ini ada komponen yang lebih cepat terelusi dan
ada yang lebih lambat.
• Prinsip dasar kromatografi adalah komponen yang berbeda akan
mempunyai kelaurtan dan adsorpsi yang berbeda di antara 2 fase
sehingga dapat dipisahkan. Fase mobil kemudian dipaksa melalui
sebuah fase sasioner yang tidak bergerak dan tidak dapat bersatu.
KROMATOGRAFI KOLOM
• Pemilihan fase didasarkan pada kelarutan komponen pada
tiap fase.
• Komponen yang sangat mudah larut di dalam fase stasioner
akan membutuhkan waktu lebih lama untuk melewatkannya
daripada komponen yang sangat tidak larut pada fase
stasioner tapi larut pada fase mobil komponen sampel akan
terpisah satu sama lain ketika lewat pada fase stasioner.
7
27/06/2013
THIN LAYER CHROMATIGRAPHY (TLC)
• Teknik pemisahan padat-cairan dimana fase stasioner berupa
bahan padat sedangkan fase bergeraknya adalah cair.
• Bahan padat yang biasa digunakan dalam kromatografi adalah
silika gel (SiO2xH2O) dan alumina (AL2O3xH2O). Kedua
adsorben ini merupakan adsorben yang bersifat polar, tetapi
alumina lebih polar dibandingkan silika gel.
• Silika bersifat asam, sedangkan alumina terdapa dalam bentuk
netral, basa atau asam.
• TLC merupakan teknik kromatografi yang sensitif, cepat,
sederhana, murah, membutuhkan sampel dalam jumlah kecil
(1-20 mg/ml), dan dengan visualisasi kimia yaitu mengekspos
plate agar terjadi reaksi kimia dengan komponen akan
terbentuk warna yang dapat dilihat dengan sinar ultraviole
pada panjang gelombang tertentu.
Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Kedele dan Tempe
• Bahan-Bahan :
bubuk kedele kering, tempe
pelarut (hexan, etanol)
pelarut/eluen untuk kromatografi kolom (hexan, etil
asetat, metanol)
eluen untuk TLC (hexan, eil asetat, dikloromettan,
metanol)
silika gel
Reagen untuk visualisasi (larutan sulfur atau
pospomolibdat dalam etanol)
TLC
THIN LAYER CHROMATIGRAPHY (TLC)
• Digunakan untuk menentukan :
banyaknya komponen di dalam campuran
idenifikasi dua substansi/komponen
memonitor terjadinya reaksi
Efektivitas proses pemurnian
Kondisi yang sesuai untuk pemisahan dengan kolom
kromatografi
Memonitor kromatografi kolom
Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Kedele dan
Tempe
• Alat-alat :
Vacuum filter funnel
Kromatografi kolom
Lampu UV (254, 365 nm)
Botol
Sprayer
Hotplate/oven
Rotary evaporator
8
27/06/2013
Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Kedele dan Tempe
• Cara kerja :
Sampel dalam bentuk bubuk diekstraksi/maserasi dengan
hexan dan etanol sebanyak 3 kali.
Hasil ekstraksi dievaporasi sehingga diperoleh ekstrak kasar
Siapkan TLC yang dilengkapi dengan indikator fluorescense
yang akan bervisualisasi dengan lampu ulraviolet pada
panjang gelombang 254 nm, dengan dua atau lebih pelarut
untuk menentukan pelarut yang terbaik.
Teteskan hasil ekstraksi/maserasi pada TLC
Ambil 3 ml pelarut (MeOH, etil asetat, hexan dan lain-lain)
Masukkan ke dalam beaker glass
Letakkan TLC di dalamnya, tutup dan tunggu. Jika pelarut
sudah sampai 0.5 cm di bagian atas TLC, angkat TLC.
Beri anda dengan pensil, kemudian dikering anginkan.
Lihat di bawah lampu UV
Metode Analisa Antioksidan
• Pengujian kapasitas antioksidan suatu senyawa dilakukan
secara bertahap sebagai berikut :bertahap sebagai berikut :
1. Uji in vitro menggunakan reaksi kimia misalnya metillinoleat, DPPH (1,1-diphenyl -2- pycrylhydrazyl)
2. Uji in vitro menggunakan materi biologis, misalnya
mengukur viabilitas sel (teknik kultur sel), pembentukan
dien terkonjugasi dan kadar TBARS dari isolat LDL, dll
3. Uji in vivo pada model hewan percobaan, misalnya
aktifitas enzim antioksidan, kadar TBARS
4. Uji in vivo pada manusia
Solvent
Depan
Solvent
Depan
Origin
Origin
Hexan:EtOAc
1:1
Hexan:DOM
1:2
Gambar. Penentuan pelarut terbaik
Metode Analisa Antioksidan (2)
Pengujian in vitro menggunakan reaksi DPPH atau ABTS
• DPPH dan ABTS merupakan senyawa radikal yang
relatif stabil.
• DPPH berwarna ungu, namun apabila DPPH tereduksi
oleh suatu antioksidan akan mengakibatkan penurunan
intensitas warna ungu (memudar).
• Semakin besar selisih absorbansi dibandingkan kontrol
(tanpa penambahan antioksidan) menunjukkan semakin
tingginya aktivitas antioksidan senyawa uji.aktivitas
9
27/06/2013
Metode Analisa Antioksidan (3)
Metode Analisa Antioksidan (4)
Pengujian in vitro menggunakan reaksi kimia
Pengujian in vitro menggunakan materi biologis
Dien Terkonjugasi
Teknik Kultur Sel
Oksidasi asam lemak tidak jenuh mengubah ikatan rangkap menjadi
konfigurasi dien terkonjugasi atau konfigurasi trien terkonjugasi.
Konfigurasi-konfigurasi ini dapat diukur dengan spektrofotometer UV
langsung atau melalui kompleks turunan dengan spektra absorpsi.
Untuk pengujian antioksidan suatu senyawa uji, senyawa tersebut
diinkubasi bersama-sama dengan asam linoleat, kemudian dioksidasi
oleh CuSO4. Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap
interval waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga
membentuk kurva oksidasi. Semakin besar aktivitas antioksidan
ditunjukkan oleh semakin panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi.
Metode Analisa Antioksidan (5)
Pengujian in vitro menggunakan materi biologis
LDL Teroksidasi
Model ini menggunakan LDL yang diisolasi dari hewan atau manusia.
Senyawa uji diinkubasi bersama-sama dengan LDL, kemudian
dioksidasi oleh CuSO4. Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm
setiap interval waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga
membentuk kurva LDL teroksidasi.
Semakin besar aktivitas antioksidan ditunjukkan oleh semakin
panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi.
Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun tanpa
penambahan senyawa uji
Senyawa uji dikultur bersama sel limfosit yang diisolasi dari hewan atau
manusia, kemudian diukur tingkat proliferasi sel hewan atau manusia,
tersebut setelah masa inkubasi tertentu.
Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun diberi stres
oksidatif menggunakan senyawa oksidator (misalnya H2O2), dan
sebagai kontrol adalah model tanpa penambahan senyawa uji.
Agar dapat menerima respon/sinyal untuk berpoliferasi, sel harus
memiliki membran utuh. Adanya oksidasi pada lipid penyusun struktur
membran sel, mengakibatkan sel tidak dapat merespon sinyal sehingga
tingkat proliferasi sel menurun.
Dengan kultur sel dapat juga diukur TBARS sebagai indikator
peroksidasi lipid
Metode Analisa Antioksidan (6)
Pengujian in vivo (menggunakan hewan percobaan atau manusia)
Mula--mula senyawa uji diberikan kepada subyek, kemudian diukur
keberadaan beberapa komponen yang terlibat dalam sistem
antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, sistem antioksidan
tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, aktivitas enzim antioksidan dan
lainnya)
Indikator lainnya yaitu dari pernafasan (hidrokarbon volatil, H2O2), dari
urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah, dari urin (TBARS,
eikosanoids) dan dari darah (TBARS, LDL teroksidasi, H (TBARS, LDL
teroksidasi, H2O2), glutation dan lainnya.
Apabila menggunakan hewan percobaan dapat dibandingkan dengan
model yang diberi stres oksidatif dengan model yang diberi stres
oksidatif.
10
27/06/2013
Metode Analisa Antioksidan (7)
Pengujian in vivo (menggunakan hewan percobaan atau manusia)
Mula--mula senyawa uji diberikan kepada subyek, kemudian diukur
keberadaan beberapa komponen yang terlibat dalam sistem
antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, sistem antioksidan
tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, aktivitas enzim antioksidan dan
lainnya)
Indikator lainnya yaitu dari pernafasan (hidrokarbon volatil, H2O2), dari
urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah, dari urin (TBARS,
eikosanoids) dan dari darah (TBARS, LDL teroksidasi, H (TBARS, LDL
teroksidasi, H2O2), glutation dan lainnya.
Apabila menggunakan hewan percobaan dapat dibandingkan dengan
model yang diberi stres oksidatif dengan model yang diberi stres
oksidatif.
CONTOH
Metode Uji Aktivitas Antimikroba
Metode Dilusi cair atau dilusi padat
• Pada prinsipnya, antibiotik diencerkan hingga
diperoleh beberapa konsentrasi. Pada dilusi cair,
masing-masing konsentrasi senyawa bioaktif
ditambah suspensi kuman dalam media. Pada dilusi
padat, tiap konsentrasi senyawa bioaktif dicampur
dengan media agar, lalu ditanami kuman.
Metode Difusi
• Cara Kirby Bauer
• Cara Sumuran (Cup Plate)
• Cara Pour Plate
Metode Dilusi Cair
•Skema penyiapan suspensi bakteri
1
Diambil 1 koloni bakteri dari stok bakteri
(Staphylococcus aureus atau Escherichia coli)
Dimasukkan dalam BHI 1 ml
Diinkubasi 18-24 jam pada suhu 37ºC
Diambil 100 µl, dimasukkan dalam 1 ml BHI
Diinkubasi 4-8 jam pada suhu 37ºC
Diencerkan dengan NaCl 0,9% sampai konsentrasi bakteri 108 CFU/ml
(Kekeruhan disamakan dengan Standar Mc Farland)
Diencerkan sampai 106 CFU/ml dengan BHI DS
(diperoleh suspensi bakteri dg konsentrasi 106 CFU/ml)
2
3
4
Tabung uji
+ suspensi bakteri 106 CFU/ml
K1
K2
K3
K4
Tabung kontrol
K1 : Kontrol media
K2 : Kontrol pelarut
K3 : Kontrol sampel
K4 : Kontrol suspensi bakteri
Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C
Diamati kejernihan dalam tabung uji (Menentukan KHM)
Digores ke media padat
Agar darah (Staphylococcus aureus) atau Agar Mc.Conkey ( Escherichia coli)
Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C
Diamati tumbuh tidaknya koloni bakteri di atas media agar (Menentukan KBM)
11
27/06/2013
Contoh Hasil Uji Aktivitas
No
Tabung
Perlakuan
% b/v
(kadar akhir)
HASIL
PENGAMATAN
Kejernihan Koloni
1.
0,6125%
K
+
1,25%
J
2.
3.
2,5%
J
4.
5%
J
5.
K
Keterangan
:
6.Kekeruhan
K bakteri KK =
+ = Ada koloni
J =
7.Jernih
K.I- = Tidak ada
J koloni bakteri
K =
8.Keruh
K.II
J
9.
K.III
K
Kadar akhir = kadar ekstrak awal dibagi 2
10.
K.IV
K
+
Jadi, KHM = 1,25% b/v
KBM = 1,25% b/v
KHM
1
2
3
KBM
4
Determination of MIC
2
1
8
4
2
1
0
Tetracycline (μg/ml)
4
Kontrol (data dan gambar belum ditampilkan)
K.I
(Kontrol media)
K.II (Kontrol pelarut)
K.III (Kontrol sampel)
K.IV (Kontrol bakteri)
3
MIC = 2 μg/ml
Metode Dilusi Padat
1
2
3
+ media
padat
4
+ media
padat
K1
K2
K3
K4
Petri
kontrol
Petri uji
106
suspensi bakteri
CFU/ml
Dg cara spread plate
K1 : Kontrol media
K2 : Kontrol pelarut
K3 : Kontrol sampel
K4
Kontrol suspensi
:
bakteri
METODE
DIFUSI
a. KirbyKirbyBauer
Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C
Diamati tumbuh tidaknya koloni bakteri di atas media agar
(Menentukan KHM/KBM)
12
27/06/2013
Kirby--Bauer
Kirby
Disk Diffusion Test
Str
Susceptible
Not susceptible
Tet
Ery
Bacterial
lawn
Chl
No
growth
Amp
Growth
Antibiotic disk
Disk Diffusion
Size of zone of inhibition depends on
sensitivity, solubility, rate of diffusion. Compare
results to MIC tables generated using
standards.
Zone Diameter Standards for Disk Diffusion
Tests
Antimicrobial Agent
(amt.per disk) and organism
Zone Diameter (mm)
R
I
MS
Approx.MIC
(g/L) for
S
R
S
Ampisilin (10 g/disk)
Enterobacteriaciae
16
>19
> 16
126 mg/dl
Masing-masing kelompok diberi ransum standard, tetapi pada kelompok
perlakuan diberi tambahan makanan berupa perlakuan yang ingin diuji.
Tikus dipuasakan selama 16 jam, dan kadar gula darah diukur
17
27/06/2013
Uji Aktivitas Antidiabetes Secara In Vitro
Dengan Uji aktivitas -Glukosidase
Pembuatan Kurva Standar 4-nitrofenol
Menggunakan 6 deret standar (15,30,45,60,75 dan 90 M), dengan
cara melarutkan 4-nitrofenol dalam larutan buffer fosfat pH 7.
Blanko = buffer fosfat pH 7. Diukur absorbansinya pada 400 nm
Uji inhibisi -Glukosidase
Menggunakan substrat p-nitrofenil--Dglukopiranosida (p-NPG) dan
enzim -Glukosidase.
Larutan enzim dibuat dengan melarutkan 1.0 mg enzim Glukosidase dalam larutan buffer fosfat (pH 7) yang mengandung
serum bovin albumin, kemudian diencerkan 25 kali dengan puffer
fosfat pH 7.
Ekstrak sampel dilarutkan dalam DMSO.
Penghentian reaksi enzim substrat dilakukan dengan penambahan
Na2CO3 200 mM. Larutan diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 400 nm.
Uji Aktivitas Antikanker
Preparasi kultur sel mieloma mencit
• Sel mieloma mencit di thawing setelah dibekukan pada suhu 80°C. Hasil thawing diinisiasi pada inkubator 5% CO2 pada
suhu 37 °C dan pH 7,4 -7,7 di dalam media RPMI 1640 dan FBS
10%, 100µg/ml streptomisin, 100 unit/ml penisilin. Bila
kepadatan sel hasil inisiasi telah mencapai 105 – 2.106 maka
suspensi sel tersebut dapat digunakan lebih lanjut untuk uji
antikanker dan induksi apoptosis.
Uji Aktivitas Antikanker (2)
Pengamatan aktivitas antikanker dengan metode viabilitas sel dengan
pewarnaan tripan biru.
• Sebanyak 0,2 mL dari masing -masing larutan baku kerja dengan
konsentrasi 1 25, 250, 500, 750, 1000 µg/mL, kontrol positif dan kontrol
negatif dimasukkan ke dalam sumuran microplate. Tiap konsentrasi
dilakukan 3 pengulangan (3 lubang sumuran).
• Setelah itu, ke dalam masing -masing lubang sumuran di tambahkan
suspensi sel mieloma seb anyak 0,8 ml sehingga didapatkan konsentrasi
larutan uji 25, 50,100, 150 , 200 dan 300 µg/ml serta kontrol positif
etoposida sebesar 10 µg/ml. Bersama-sama kemudian diinkubasi pada
inkubator 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 37 °C dan pH 7,4 -7,7.
dilakukan panen sel dan diamati persentase viabilitasnya menggunakan
pewarnaan laru tan tripan biru 0,4% dengan perbandingan susp ensi sel :
tripan biru = 1:1 dihitung dengan menggunakan hemositometer, di mana
sel mati akan terwarnai biru sedangkan sel hidup akan berwarna jernih.
18
27/06/2013
Pendekatan terbaru studi pencernaan
• Secara In vivo :
Uji pernafasan
Scintigraf
USG
MRI (Magnetic Resonance Imaging)
• Secara in vitro :
Gastrointestinal model (GIM) static dan
dinamyc
Human Gastrointestinal Simulator (HGS) UC
Davis
19
METODE ANALISIS
ANALISA KOMPONEN BIOAKTIF
PANGAN FUNGSIONAL
Kompetensi yang diharapkan :
• Mahasiswa mampu menjelaskan
metode
pengujian
komponen
bioaktif pangan fungsional
We Do
Pengembangan
Metode
So that
Tidak diperlukan pengulangan setiap
kali analisis dilakukan
Analisis sesuai
Metode
Variasi dari satu lab dengan lab yang
lain harus dihindari dan hasilnya harus
dapat diulang
Dokumentasi
Dapat
dilakukan
pengembangan
dengan perubahan sesuai kebutuhan
Kontrol Mutu secara
Statistik
Korelasi fungsi dan konstituen kimia
dikembangkan
Jaminan Mutu
Ruang
Lingkup
Micro of trace Konstituen
mikro
Tipe Analisis
Metode
Parameter
kimia
Kromatografi Sifat
dari
dan
Spektroskopi komponen
Macro
Konstituen
Major
Fisiko-kimia, Sifat kimia,
analisis
perilaku
termal
termal
Bulk
Produk
Reologi
Tekstur,
viskositas
ANALISIS MIKRO
• Langkah-langkah yang harus
dikerjakan adalah :
– Defenisi masalah
– Persiapan sampel yang mewakili
– Persiapan sampel atau ekstraksi
– Seleksi alat dan kondisi analisis
– Analisis berdasarkan metode yang
dipilih
– Kompilasi hasil
– Metode
Pengembangan metode :
Cara-cara ekstraksi :
Presipitasi
Ekstraksi Solvent
Ekstraksi fase padat
Hati-hati dalam memilih :
Pelarut yang benar
Filter yang sesuai
Memberi keuntungan bagi konsumen
1
27/06/2013
Ekstraksi Analit dari Matriks
Sistem
Cair
Metodologi
Pemisahan
Cair-cair
Padat
Ekstraksi
Soxhlet
Relefansi
Isolasi
komponen
dari matriks
FENOLIK TANAMAN
•
•
•
•
•
Asam fenolat
Flavonoid
Tanin
Stilbenes
lignan
Keterangan
Pemecahan
emulsi
dengan cara
presipitasi
atau
desalting
Jangan
ada
kebocoran
untuk
mencegah
kehilangan
KOMPONEN FENOLIK TANAMAN
• Fenoilk : komponen yang memiliki 1 atau lebih cincin
aromatik dengan 1 atau lebih gugus hidroksil.
• Terdistribusi secara luas pada hampir semua jenis tanaman
sebagai metabolit sekunder
• Saat ini lebih dari 8000 struktur fenolik yang dikenal, dari
mulai molekul yang sederhana seperti asam fenolat hingga
struktur polimer seperti tanin.
• Fenoiik tanaman biasanya terbentuk untuk melawan radiasi
matahari, patogen, parasit dan ppredator, juga
berkontribusi terhadap warna pada tanaman.
• Terdapat pada hampir semua bagian tanaman
merupakan bagian dari diet manusia
• Berkontribusi terhadap karakteristik organoleptik, misalnya
rasa pahit, astrigen (sepat) yang disebabkan interaksi
• Bereaksi dengan oksigen dan merupakan faktor kritis pada
pengawetan, pematangan dan aging dari anggur (wine)
FLAVONOID
• Struktur : inti flavon tdd 15 atom C dengan 3 cincin
(C6-C3-C6) yang disebut dengan A,B,C
• Tdd 6 sub kelompok :
1. Flavone
2. Flavonol
3. Flavanol
Tergantung pada kondisi
4. Flavanon
oksidasi cincin C pusat
5. Isovlavon
6. Antosianin
2
27/06/2013
FLAVONOID
• Quercitin adalah flavonol terdapat pada bawang,
brokoli, apel
• Katekin adalah flavanol yang terdapat pada beberapa
jenis buah
• Naringin flavanon yang terdapat pada grapefruit
(jeruk besar)
• Cyanindin-glikosida antosianin yang terdapat pada
buah2 beri seperti black currant, rasberi, blackberry
dll
• Daidzein, genistein dan glisitin isoflavon pada
kedelai
ASAM FENOLAT
• Tdd 2 kelas :
1. Turunan asam benzoat : asam galat
2. Turunan asam sinamat : asam kumarat, asam
kafeat dan asam ferulat
• Asam kafeat :
Diesterifikasi dengan asam quinat asam
klorogenat yaitu komponen fenolik pada kopi
• Asam ferulat :
Terdapat pada serealia
Diesterifikasi menjadi hemiselulosa pada dinding
sel
TANIN
• Tdd atas 2 kelompok :
1. Hydrolyzable tannin
2. Condensed tannin
• Hydrolyzable Tannin :
Komponen yang terdiri dari gugus inti glukosa atau poliol
teresterifikasi lain dengan asam galat disebut gallotannin
Jika dengan hexahydoxilpenat disebut elagitannin
• Condensed Tannin :
Oligomer atau polimer dari flavon 3-ol yang berikatan dengan ikatan
karbon interflavon
Dikenal sebagai asam proantosianin didekomposisi membentuk
antosianin melalui reaksi oksidasi yang dikatalis asam melalui
pemanasan larutan alkohol asam
Gambar. Struktur Flavonoid, Asam Fenolat dan tanin
3
27/06/2013
Gambar. Struktur Stilbenes dan Lignan
Gambar. Struktur Flavonoid, Asam Fenolat dan tanin
EKSTRAKSI FENOLIK
• Dapat diekstrak dari sampel segar, beku atau yang dikeringkan
• Perlakuan sebelum ekstraksi : Milling, grinding, homogenisasi
didahului dengan pengeringan duara atau freeze drying
• Metode ekstraski yang banyak digunakan solvent
rendemen tergantung pada :
Polaritas pelarut
Waktu ekstraksi
Suhu
Rasio sampel : pelarut
Komposisi kimia dan sifat fisik sampel
EKSTRAKSI FENOLIK (2)
• Jenis pelarut :
Metanol
Etanol
Aseton
Etil asetat
Kombinasi pelarut
Kombinasi dengan air pada berbagai proporsi
• Metanol efisien untuk komponen polifenol dengan BM
rendah
• Aseton aqueous untuk flavanol dengan BM tinggi
• Etanol baik untuk ekstrak polifenol dan aman untuk
konsumsi manusia
4
27/06/2013
EKSTRAKSI FENOLIK (3)
EKSTRAKSI FENOLIK (3)
• Ekstraksi fenolik dari tanaman yang kaya akan antosianin :
Pelarut organik yang diasamkan
Sistem pelarut akan mendenaturasi membran sel
melarutkan antosianin dan menstabilkannya
Penambahan asam harus hati-hati karena kelebihan asam
akan menghidrolisis antosianin
Asam yang digunakan : asam organik lemah : asam
formiat, asam asetat, asam sitrat, asam tartarat dan asam
posporik, atau asam kuat dengan konsentrasi rendah
misalnya asam trifluroasetat 0.5-3%, HCl 200 ml pelarut.
• Suhu dan tekanan tinggi meningkatkan kelarutan analit dan
kinetika desporpsi dari matriks.
Microwave Assited Extraction (MAE)
• Ekstraksi dengan menggunakan energi gelombang mikro
untuk memudahkan pemisahan analit dari matriks sampel ke
dalam pelarut.
• Keuntungan : mengurangi waktu ekstraksi dan volume
pelarut jika dibandingkan metode ekstraksi konvensional.
• Digunakan untuk ekstraski fenolik : asam galatm elagat,
quersitin, isoflavon dan trans-resveratrol menggunakan
mikrowave pada suhu 100 °C selama 20 menit.
• Komponen fenolik yang dihasilkan memiliki susbtituen
hydroksil dengan jumlah tinggi (misal tanin) dan sensitif
terhadap kenaikan suhu antosianin tidak dapat diekstraksi
dengan MAE
Subcritical Water Extraction (SWE)
• Sama dengan PLE tapi pelarut yang digunakan adalah air
• Air dipanaskan hingga suhu200°C dan terjadi perubahan
konstanta dielektrik air sehingga air bersifat sebagaimana
pelarut organik.
• Contoh konstanta dielektrik air pada suhu 200°C = 36 yang
mendekati konstanta dielektrik metanol.
• PLE (80–100°C) menggunakan air yang diasamkan asam
efektifnya dengan metanol 60% yang diasamkan untuk
mengekstraksi antosianin dari kulit anggur.
• Komponen fenolik lebih mudah teroksidasi pada suhu tinggi,
sehingga perlu dicegah degradasi pada kondisi PLE.
• PLE efektif digunakan untuk ekstraksi komponen fenolok pada
biji anggur, apel, bayam, terung dan tepung barley.
Extraction of phlorotannins
Bubuk Algal (0.5 g)
Pengadukan dengan shaker menggunakan methanol (2 ml) pada suhu ruang selama 2 jam
Penambahan CHCl3 (4 ml) pengadukan dengan tangan selama 5 menit
Filtratrasi
Filtratrasi menggunakan kapas bebas lemak
Penambahan air bebas ion 1.5 ml dan pengadukan dengan tangan selama 5 menit
Pemisahan campuran antara bagian atas dan bagian bawah, lapisan atas merupakan fraksi non
lemak dikumpulkan
Diekstraksi 2 kali menggunakan ehyl ether (3 ml) dan ambil lapisan atas (2 kali)
Fraksi ethyl ether dievaporasi menggunakan blower nitrogen
Phlorotannins kasar
6
27/06/2013
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN
Pemurnian phlorotannins
• Analisa secara quantitatif menggunakan
• Dilakukan dengan kombinasi beberapa teknik
kromatografi yaitu TLC (Thin Layer
Chromaography) dan kromatografi kolom
(Column Chromaography).
HPLC
• Sistem HPLC tdd Waters 600 pump,
detektor UV dan kolom and C 18.
• Laju aliran 1.0 mL/m
mL/menit
enit
• Gradien linier 3030-100% methanol
• Detektor UV diatur pada 290 nm
25
KROMATOGRAFI KOLOM
• Terdiri dari fase stasioner (fase diam) dan fase mobil (fase
bergerak).
• Fase diam berupa adsorben berbentuk bubuk yang dimasukkan ke
dalam kolom gelas vertikal. Sampel yang akan dianalisa dimasukkan
di bagian atas dari kolom ini.
• Fase bergerak adalah pelarut yang dialirkan dari atas ke kolom
sehingga komponen dari bahan akan terdistribusi di antara
adsorben dan pelarut dan terjadi pemisahan komponen, sedangkan
pelarut akan mengalir ke bagian bawah kolom.
• Pada pemisahan ini ada komponen yang lebih cepat terelusi dan
ada yang lebih lambat.
• Prinsip dasar kromatografi adalah komponen yang berbeda akan
mempunyai kelaurtan dan adsorpsi yang berbeda di antara 2 fase
sehingga dapat dipisahkan. Fase mobil kemudian dipaksa melalui
sebuah fase sasioner yang tidak bergerak dan tidak dapat bersatu.
KROMATOGRAFI KOLOM
• Pemilihan fase didasarkan pada kelarutan komponen pada
tiap fase.
• Komponen yang sangat mudah larut di dalam fase stasioner
akan membutuhkan waktu lebih lama untuk melewatkannya
daripada komponen yang sangat tidak larut pada fase
stasioner tapi larut pada fase mobil komponen sampel akan
terpisah satu sama lain ketika lewat pada fase stasioner.
7
27/06/2013
THIN LAYER CHROMATIGRAPHY (TLC)
• Teknik pemisahan padat-cairan dimana fase stasioner berupa
bahan padat sedangkan fase bergeraknya adalah cair.
• Bahan padat yang biasa digunakan dalam kromatografi adalah
silika gel (SiO2xH2O) dan alumina (AL2O3xH2O). Kedua
adsorben ini merupakan adsorben yang bersifat polar, tetapi
alumina lebih polar dibandingkan silika gel.
• Silika bersifat asam, sedangkan alumina terdapa dalam bentuk
netral, basa atau asam.
• TLC merupakan teknik kromatografi yang sensitif, cepat,
sederhana, murah, membutuhkan sampel dalam jumlah kecil
(1-20 mg/ml), dan dengan visualisasi kimia yaitu mengekspos
plate agar terjadi reaksi kimia dengan komponen akan
terbentuk warna yang dapat dilihat dengan sinar ultraviole
pada panjang gelombang tertentu.
Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Kedele dan Tempe
• Bahan-Bahan :
bubuk kedele kering, tempe
pelarut (hexan, etanol)
pelarut/eluen untuk kromatografi kolom (hexan, etil
asetat, metanol)
eluen untuk TLC (hexan, eil asetat, dikloromettan,
metanol)
silika gel
Reagen untuk visualisasi (larutan sulfur atau
pospomolibdat dalam etanol)
TLC
THIN LAYER CHROMATIGRAPHY (TLC)
• Digunakan untuk menentukan :
banyaknya komponen di dalam campuran
idenifikasi dua substansi/komponen
memonitor terjadinya reaksi
Efektivitas proses pemurnian
Kondisi yang sesuai untuk pemisahan dengan kolom
kromatografi
Memonitor kromatografi kolom
Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Kedele dan
Tempe
• Alat-alat :
Vacuum filter funnel
Kromatografi kolom
Lampu UV (254, 365 nm)
Botol
Sprayer
Hotplate/oven
Rotary evaporator
8
27/06/2013
Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Kedele dan Tempe
• Cara kerja :
Sampel dalam bentuk bubuk diekstraksi/maserasi dengan
hexan dan etanol sebanyak 3 kali.
Hasil ekstraksi dievaporasi sehingga diperoleh ekstrak kasar
Siapkan TLC yang dilengkapi dengan indikator fluorescense
yang akan bervisualisasi dengan lampu ulraviolet pada
panjang gelombang 254 nm, dengan dua atau lebih pelarut
untuk menentukan pelarut yang terbaik.
Teteskan hasil ekstraksi/maserasi pada TLC
Ambil 3 ml pelarut (MeOH, etil asetat, hexan dan lain-lain)
Masukkan ke dalam beaker glass
Letakkan TLC di dalamnya, tutup dan tunggu. Jika pelarut
sudah sampai 0.5 cm di bagian atas TLC, angkat TLC.
Beri anda dengan pensil, kemudian dikering anginkan.
Lihat di bawah lampu UV
Metode Analisa Antioksidan
• Pengujian kapasitas antioksidan suatu senyawa dilakukan
secara bertahap sebagai berikut :bertahap sebagai berikut :
1. Uji in vitro menggunakan reaksi kimia misalnya metillinoleat, DPPH (1,1-diphenyl -2- pycrylhydrazyl)
2. Uji in vitro menggunakan materi biologis, misalnya
mengukur viabilitas sel (teknik kultur sel), pembentukan
dien terkonjugasi dan kadar TBARS dari isolat LDL, dll
3. Uji in vivo pada model hewan percobaan, misalnya
aktifitas enzim antioksidan, kadar TBARS
4. Uji in vivo pada manusia
Solvent
Depan
Solvent
Depan
Origin
Origin
Hexan:EtOAc
1:1
Hexan:DOM
1:2
Gambar. Penentuan pelarut terbaik
Metode Analisa Antioksidan (2)
Pengujian in vitro menggunakan reaksi DPPH atau ABTS
• DPPH dan ABTS merupakan senyawa radikal yang
relatif stabil.
• DPPH berwarna ungu, namun apabila DPPH tereduksi
oleh suatu antioksidan akan mengakibatkan penurunan
intensitas warna ungu (memudar).
• Semakin besar selisih absorbansi dibandingkan kontrol
(tanpa penambahan antioksidan) menunjukkan semakin
tingginya aktivitas antioksidan senyawa uji.aktivitas
9
27/06/2013
Metode Analisa Antioksidan (3)
Metode Analisa Antioksidan (4)
Pengujian in vitro menggunakan reaksi kimia
Pengujian in vitro menggunakan materi biologis
Dien Terkonjugasi
Teknik Kultur Sel
Oksidasi asam lemak tidak jenuh mengubah ikatan rangkap menjadi
konfigurasi dien terkonjugasi atau konfigurasi trien terkonjugasi.
Konfigurasi-konfigurasi ini dapat diukur dengan spektrofotometer UV
langsung atau melalui kompleks turunan dengan spektra absorpsi.
Untuk pengujian antioksidan suatu senyawa uji, senyawa tersebut
diinkubasi bersama-sama dengan asam linoleat, kemudian dioksidasi
oleh CuSO4. Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap
interval waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga
membentuk kurva oksidasi. Semakin besar aktivitas antioksidan
ditunjukkan oleh semakin panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi.
Metode Analisa Antioksidan (5)
Pengujian in vitro menggunakan materi biologis
LDL Teroksidasi
Model ini menggunakan LDL yang diisolasi dari hewan atau manusia.
Senyawa uji diinkubasi bersama-sama dengan LDL, kemudian
dioksidasi oleh CuSO4. Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm
setiap interval waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga
membentuk kurva LDL teroksidasi.
Semakin besar aktivitas antioksidan ditunjukkan oleh semakin
panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi.
Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun tanpa
penambahan senyawa uji
Senyawa uji dikultur bersama sel limfosit yang diisolasi dari hewan atau
manusia, kemudian diukur tingkat proliferasi sel hewan atau manusia,
tersebut setelah masa inkubasi tertentu.
Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun diberi stres
oksidatif menggunakan senyawa oksidator (misalnya H2O2), dan
sebagai kontrol adalah model tanpa penambahan senyawa uji.
Agar dapat menerima respon/sinyal untuk berpoliferasi, sel harus
memiliki membran utuh. Adanya oksidasi pada lipid penyusun struktur
membran sel, mengakibatkan sel tidak dapat merespon sinyal sehingga
tingkat proliferasi sel menurun.
Dengan kultur sel dapat juga diukur TBARS sebagai indikator
peroksidasi lipid
Metode Analisa Antioksidan (6)
Pengujian in vivo (menggunakan hewan percobaan atau manusia)
Mula--mula senyawa uji diberikan kepada subyek, kemudian diukur
keberadaan beberapa komponen yang terlibat dalam sistem
antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, sistem antioksidan
tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, aktivitas enzim antioksidan dan
lainnya)
Indikator lainnya yaitu dari pernafasan (hidrokarbon volatil, H2O2), dari
urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah, dari urin (TBARS,
eikosanoids) dan dari darah (TBARS, LDL teroksidasi, H (TBARS, LDL
teroksidasi, H2O2), glutation dan lainnya.
Apabila menggunakan hewan percobaan dapat dibandingkan dengan
model yang diberi stres oksidatif dengan model yang diberi stres
oksidatif.
10
27/06/2013
Metode Analisa Antioksidan (7)
Pengujian in vivo (menggunakan hewan percobaan atau manusia)
Mula--mula senyawa uji diberikan kepada subyek, kemudian diukur
keberadaan beberapa komponen yang terlibat dalam sistem
antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, sistem antioksidan
tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, aktivitas enzim antioksidan dan
lainnya)
Indikator lainnya yaitu dari pernafasan (hidrokarbon volatil, H2O2), dari
urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah, dari urin (TBARS,
eikosanoids) dan dari darah (TBARS, LDL teroksidasi, H (TBARS, LDL
teroksidasi, H2O2), glutation dan lainnya.
Apabila menggunakan hewan percobaan dapat dibandingkan dengan
model yang diberi stres oksidatif dengan model yang diberi stres
oksidatif.
CONTOH
Metode Uji Aktivitas Antimikroba
Metode Dilusi cair atau dilusi padat
• Pada prinsipnya, antibiotik diencerkan hingga
diperoleh beberapa konsentrasi. Pada dilusi cair,
masing-masing konsentrasi senyawa bioaktif
ditambah suspensi kuman dalam media. Pada dilusi
padat, tiap konsentrasi senyawa bioaktif dicampur
dengan media agar, lalu ditanami kuman.
Metode Difusi
• Cara Kirby Bauer
• Cara Sumuran (Cup Plate)
• Cara Pour Plate
Metode Dilusi Cair
•Skema penyiapan suspensi bakteri
1
Diambil 1 koloni bakteri dari stok bakteri
(Staphylococcus aureus atau Escherichia coli)
Dimasukkan dalam BHI 1 ml
Diinkubasi 18-24 jam pada suhu 37ºC
Diambil 100 µl, dimasukkan dalam 1 ml BHI
Diinkubasi 4-8 jam pada suhu 37ºC
Diencerkan dengan NaCl 0,9% sampai konsentrasi bakteri 108 CFU/ml
(Kekeruhan disamakan dengan Standar Mc Farland)
Diencerkan sampai 106 CFU/ml dengan BHI DS
(diperoleh suspensi bakteri dg konsentrasi 106 CFU/ml)
2
3
4
Tabung uji
+ suspensi bakteri 106 CFU/ml
K1
K2
K3
K4
Tabung kontrol
K1 : Kontrol media
K2 : Kontrol pelarut
K3 : Kontrol sampel
K4 : Kontrol suspensi bakteri
Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C
Diamati kejernihan dalam tabung uji (Menentukan KHM)
Digores ke media padat
Agar darah (Staphylococcus aureus) atau Agar Mc.Conkey ( Escherichia coli)
Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C
Diamati tumbuh tidaknya koloni bakteri di atas media agar (Menentukan KBM)
11
27/06/2013
Contoh Hasil Uji Aktivitas
No
Tabung
Perlakuan
% b/v
(kadar akhir)
HASIL
PENGAMATAN
Kejernihan Koloni
1.
0,6125%
K
+
1,25%
J
2.
3.
2,5%
J
4.
5%
J
5.
K
Keterangan
:
6.Kekeruhan
K bakteri KK =
+ = Ada koloni
J =
7.Jernih
K.I- = Tidak ada
J koloni bakteri
K =
8.Keruh
K.II
J
9.
K.III
K
Kadar akhir = kadar ekstrak awal dibagi 2
10.
K.IV
K
+
Jadi, KHM = 1,25% b/v
KBM = 1,25% b/v
KHM
1
2
3
KBM
4
Determination of MIC
2
1
8
4
2
1
0
Tetracycline (μg/ml)
4
Kontrol (data dan gambar belum ditampilkan)
K.I
(Kontrol media)
K.II (Kontrol pelarut)
K.III (Kontrol sampel)
K.IV (Kontrol bakteri)
3
MIC = 2 μg/ml
Metode Dilusi Padat
1
2
3
+ media
padat
4
+ media
padat
K1
K2
K3
K4
Petri
kontrol
Petri uji
106
suspensi bakteri
CFU/ml
Dg cara spread plate
K1 : Kontrol media
K2 : Kontrol pelarut
K3 : Kontrol sampel
K4
Kontrol suspensi
:
bakteri
METODE
DIFUSI
a. KirbyKirbyBauer
Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C
Diamati tumbuh tidaknya koloni bakteri di atas media agar
(Menentukan KHM/KBM)
12
27/06/2013
Kirby--Bauer
Kirby
Disk Diffusion Test
Str
Susceptible
Not susceptible
Tet
Ery
Bacterial
lawn
Chl
No
growth
Amp
Growth
Antibiotic disk
Disk Diffusion
Size of zone of inhibition depends on
sensitivity, solubility, rate of diffusion. Compare
results to MIC tables generated using
standards.
Zone Diameter Standards for Disk Diffusion
Tests
Antimicrobial Agent
(amt.per disk) and organism
Zone Diameter (mm)
R
I
MS
Approx.MIC
(g/L) for
S
R
S
Ampisilin (10 g/disk)
Enterobacteriaciae
16
>19
> 16
126 mg/dl
Masing-masing kelompok diberi ransum standard, tetapi pada kelompok
perlakuan diberi tambahan makanan berupa perlakuan yang ingin diuji.
Tikus dipuasakan selama 16 jam, dan kadar gula darah diukur
17
27/06/2013
Uji Aktivitas Antidiabetes Secara In Vitro
Dengan Uji aktivitas -Glukosidase
Pembuatan Kurva Standar 4-nitrofenol
Menggunakan 6 deret standar (15,30,45,60,75 dan 90 M), dengan
cara melarutkan 4-nitrofenol dalam larutan buffer fosfat pH 7.
Blanko = buffer fosfat pH 7. Diukur absorbansinya pada 400 nm
Uji inhibisi -Glukosidase
Menggunakan substrat p-nitrofenil--Dglukopiranosida (p-NPG) dan
enzim -Glukosidase.
Larutan enzim dibuat dengan melarutkan 1.0 mg enzim Glukosidase dalam larutan buffer fosfat (pH 7) yang mengandung
serum bovin albumin, kemudian diencerkan 25 kali dengan puffer
fosfat pH 7.
Ekstrak sampel dilarutkan dalam DMSO.
Penghentian reaksi enzim substrat dilakukan dengan penambahan
Na2CO3 200 mM. Larutan diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 400 nm.
Uji Aktivitas Antikanker
Preparasi kultur sel mieloma mencit
• Sel mieloma mencit di thawing setelah dibekukan pada suhu 80°C. Hasil thawing diinisiasi pada inkubator 5% CO2 pada
suhu 37 °C dan pH 7,4 -7,7 di dalam media RPMI 1640 dan FBS
10%, 100µg/ml streptomisin, 100 unit/ml penisilin. Bila
kepadatan sel hasil inisiasi telah mencapai 105 – 2.106 maka
suspensi sel tersebut dapat digunakan lebih lanjut untuk uji
antikanker dan induksi apoptosis.
Uji Aktivitas Antikanker (2)
Pengamatan aktivitas antikanker dengan metode viabilitas sel dengan
pewarnaan tripan biru.
• Sebanyak 0,2 mL dari masing -masing larutan baku kerja dengan
konsentrasi 1 25, 250, 500, 750, 1000 µg/mL, kontrol positif dan kontrol
negatif dimasukkan ke dalam sumuran microplate. Tiap konsentrasi
dilakukan 3 pengulangan (3 lubang sumuran).
• Setelah itu, ke dalam masing -masing lubang sumuran di tambahkan
suspensi sel mieloma seb anyak 0,8 ml sehingga didapatkan konsentrasi
larutan uji 25, 50,100, 150 , 200 dan 300 µg/ml serta kontrol positif
etoposida sebesar 10 µg/ml. Bersama-sama kemudian diinkubasi pada
inkubator 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 37 °C dan pH 7,4 -7,7.
dilakukan panen sel dan diamati persentase viabilitasnya menggunakan
pewarnaan laru tan tripan biru 0,4% dengan perbandingan susp ensi sel :
tripan biru = 1:1 dihitung dengan menggunakan hemositometer, di mana
sel mati akan terwarnai biru sedangkan sel hidup akan berwarna jernih.
18
27/06/2013
Pendekatan terbaru studi pencernaan
• Secara In vivo :
Uji pernafasan
Scintigraf
USG
MRI (Magnetic Resonance Imaging)
• Secara in vitro :
Gastrointestinal model (GIM) static dan
dinamyc
Human Gastrointestinal Simulator (HGS) UC
Davis
19