AKTIVITAS SENYAWA ALKALOID SA2014 DARI SPONS LAUT CINACHYRELLA ANOMALA TERHADAP PROTEIN P53 KANKER PAYUDARA T47D MENGGUNAKAN DOCKING MOLEKULER - ITS Repository

• – SB141510 TUGAS AKHIR

  

AKTIVITAS SENYAWA ALKALOID SA2014 DARI

SPONS LAUT Cinachyrella anomala

TERHADAP PROTEIN p53 KANKER PAYUDARA

T47D MENGGUNAKAN DOCKING MOLEKULER

FITRI LIANINGSIH 1512100011 Dosen Pembimbing Dr. Awik Puji Dyah Nurhayati, M.Si JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER

  TUGAS AKHIR – SB141510

AKTIVITAS SENYAWA ALKALOID SA2014 DARI

SPONS LAUT

  Cinachyrella anomala

TERHADAP PROTEIN p53 KANKER PAYUDARA

T47D MENGGUNAKAN DOCKING MOLEKULER

FITRI LIANINGSIH 1512100011 Dosen Pembimbing Dr. Awik Puji Dyah Nurhayati, M.Si JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER SURABAYA 2016

  FINAL PROJECT – SB141510

ACTIVATED ALKALOID COMPOUND SA2014

OF MARINE SPONGE Cinachyrella anomala

AGAINST p53 PROTEIN T47D BREAST

CANCER USING MOLEKULAR DOCKING FITRI LIANINGSIH 1512100011 Advisor Lecturer Dr. Awik Puji Dyah Nurhayati, M.Si BIOLOGY DEPARTMENT Faculty of Mathematic and Natural Sciences Institute Technology Sepuluh Nopember Surabaya 2016

KATA PENGANTAR

  Alhamdulillah, rasa syukur dipanjatkan kehadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan laporan Tugas Akhir dengan judul Aktivitas Senyawa Alkaloid SA2014 Dari Spons

  

Laut Cinachyrella anomala Terhadap Protein p53 Kanker

Payudara T47D Menggunakan Docking Molekuler . Penelitian

  ini dilakukan pada bulan Februari - April 2016. Penyusunan laporan Tugas Akhir ini merupakan persyaratan untuk memperoleh gelar kesarjanaan strata 1 (S1) pada Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya.

  Penyusunan laporan Tugas Akhir ini tidak lepas dari bimbingan berbagai pihak. Penulis mengucapkan terima kasih kepada para pihak yang membantu terselesaikannya laporan Tugas Akhir ini, yaitu Ibu Dr. Awik Puji Dyah Nurhayati, M.Si selaku pembimbing serta tim penguji Dr.rer.nat. Edwin Setiawan, M.Sc, dan Aunurohim, DEA. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada orangtua, saudara, dan teman-teman seperjuangan angkatan 2012 yang telah memberikan dukungan baik moril maupun materil.

  Penulis menyadari bahwa penulisan laporan Tugas Akhir ini masih memiliki banyak kekurangan. Namun, besar harapan penulis agar laporan ini dapat bermanfaat.

  Surabaya, 7 Juni 2016 Fitri Lianingsih

  

DAFTAR ISI

  12 2.4 Respon Protein p53 ................................................

  36 BAB III METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ..................................

  33 2.9 Docking PLANTS ....................................................

  30 2.8 Docking molekuler ...................................................

  28 2.7 Simbiosis Spons dan Mikroba ..................................

  24 2.6 Spons Cinachyrella anomala ...................................

  21 2.5 Kemoterapi dan Efek Sampingnya .........................

  21 2.4.3 Perbaikan DNA dan Apoptosis ...........................

  18 2.4.2 Induksi Terhadap Ketahanan Siklus Sel .............

  18 2.4.1 Aktivasi Protein p53 ...........................................

  9 2.3 p53 (Tumor Protein 53) ...........................................

  Halaman HALAMAN JUDUL ..................................................... i HALAMAN PENGESAHAN ....................................... ii ABSTRAK .................................................................... iii

  7 2.2 Kanker Payudara ......................................................

  5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Kanker .....................................................................

  5 1.5 Manfaat ...................................................................

  5 1.4 Tujuan .....................................................................

  5 1.3 Batasan Masalah ......................................................

  1 1.2 Rumusan Permasalahan ...........................................

  BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ........................................................

  KATA PENGANTAR ................................................... vii DAFTAR ISI ................................................................. ix DAFTAR TABEL ......................................................... xi DAFTAR GAMBAR .................................................... xiii DAFTAR LAMPIRAN ................................................. xvii

  ABSTRACT .................................................................... v

  39

  3.3 Metode yang Digunakan ..........................................

  39 3.3.1 Pengambilan Data ..............................................

  39 3.3.2 Docking Molekuler ...........................................

  40 3.3.2.1 Preparasi Database Protein ........................

  40 3.3.2.2 Preparasi Database Ligan ..........................

  41 3.3.2.3 Input File Konfigurasi ................................

  41 3.3.2.4 Simulasi Program Docking PLANTS .........

  41 3.3.2.5 Evaluasi dan Interpretasi Hasil ...................

  41 3.3.3 Visualisasi Hasil Docking .................................

  43

  3.3.3.1 Visualisasi Asam Amino menggunakan YASARA ..................................................

  43

  3.3.3.2 Visualisasi Jarak Ikatan Ligan dan Protein menggunakan VMD……................ 43

  3.3.4 Rancangan Penelitian dan Analisa Data

  44 ……….

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Struktur Protein Target .................................................

  47 4.2 Hasil Docking Ligan dan Protein Target.......................

  48 4.3 Validasi Hasil Docking Ligan dan Protein Target .........

  49 4.4 Visualisasi Hasil Docking Menggunakan YASARA .....

  51 4.4.1 Visualisasi Hasil Docking SA2014 dan Protein ..........

  51

  4.4.2 Visualisasi Hasil Docking Doxorubicin dan Protein p53 .......................................................................................

  53 4.5 Analisa Visualisasi Asam Amino pada p53 ...................

  57 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan ...................................................................

  63 5.2 Saran..............................................................................

  63 DAFTAR PUSTAKA .........................................................

  65 LAMPIRAN .......................................................................

  83

  

DAFTAR TABEL

  Halaman

Tabel 1.1 Contoh beberapa gen penekan tumor lokasi, fungsi, jenis

  mutasi dan gejala yang terlibat dalam kanker 15 manusia……………………..

Tabel 1.2 Nilai dari skor docking

  44 ……………………………….

  docking

Tabel 1.3 Hasil seleksi

  45 ……………………………….

Tabel 1.4 Hasil dari skor docking ligan dan protein p53

  49 ……………………………….

Tabel 1.5 Hasil seleksi docking Ligan dan Protein p53

  49 ……………………………….

Tabel 1.6 Jenis Asam Amino pada

  Interaksi p53 dan senyawa alkaloid SA2014 57 ……………………………….

  DAFTAR GAMBAR

  Halaman

Gambar 2.1 Sifat kanker ………………………………

  8 Gambar 2.2 Domain fungsional pada gen p53 terdiri atas domain N ‐terminal, domain central core dan domain c terminal

  …………………………....................

  12 Gambar 2.3 Representasi skematik molekul p53 ………………….........................

  13 Gambar 2.4 Struktur tiga dimensi p53 tumor supresor kompleks dengan DNA …………………………………..

  15 Gambar 2.5 Jalur pada p53 dihubungkan dengan Mdm2 ketika terjadi kerusakan DNA

  17 …………………………………

  Gambar 2.6

  Model mekanisme protein p53 pada

  18 tumor …………….. …….…………...

Gambar 2.7 Berbagai jalur dalam regulasi AMPK yang dapat memodulasi proliferasi sel

  .....................................

  20 …………………

  Gambar 2.8 Mekanisme apoptosis…………………. 24

Gambar 2.9 Struktur doxorubicin…………………. 26Gambar 2.10 Karakteristik spons laut Cinachyrella

  28 sp. …………………………………….

Gambar 2.11 Struktur kimia senyawa dari spons laut

  25 Gambar 2.12 Model produksi metabolit sekunder melalui simbiosis spons dengan mikroba………..……………………… 32 Gambar 2.13 Filosofi docking …...………………….

  C.anomala ……………………………..

  29 Gambar 2.14

  36 Penambatan molekul………………….

Gambar 3.1 Hasil docking yang benar dan salah

  42 …..

Gambar 3.2 Contoh hasil visualisasi docking ……..

  45 Gambar 4.1 Struktur tiga dimensi MDM2 berikatan dengan domain transaktivasi pada p53..

  47 Gambar 4.2a Hasil RMSD senyawa hasil docking dengan referensinya…………………..

  50 Gambar 4.2b Perbesaran hasil RMSD senyawa hasil

  50

  docking dengan nilai 1.0300A ………. Gambar 4.3A Visualisasi hasil docking SA2014 dan protein p53 menggunakan YASARA tampak depan

  51 …………………………. Gambar 4.3B Visualisasi hasil docking SA2014 dan protein p53 menggunakan YASARA tampak samping………………………

  51 Gambar 4.3C Visualisasi hasil docking SA2014 dan protein p53 menggunakan YASARA 52 tampak belakang………………………

  Gambar 4.3D Visualisasi asam amino pada SA2014 dan protein p53 menggunakan YASARA ……………………………..

  52 Gambar 4.3E Visualisasi asam amino pada SA2014 dan Protein p53 menggunakan YASARA jika diperbesar

  53 ……………. Gambar 4.3F Visualisasi struktur ligan SA2014 menggunakan Marvin

  Space…………………………………..

  53 Gambar 4.4A Visualisasi hasil docking doxorubicin dan protein p53 menggunakan YASARA tampak depan

  54 …………….. Gambar 4.4B Visualisasi hasil docking doxorubicin dan protein p53 menggunakan

  YASARA tampak samping……………

  54 Gambar 4.4C Visualisasi hasil docking doxorubicin dan protein p53 menggunakan YASARA tampak belakang………….

  55 Gambar 4.4D Visualisasi asam amino pada doxorubicin dan protein p53 menggunakan YASARA …………….

  55 Gambar 4.4E Visualisasi asam amino pada doxorubicin dan Protein p53 menggunakan YASARA jika diperbesar

  …………………………….

  56 Gambar 4.4F Visualisasi struktur ligan doxorubicin menggunakan Marvin Space…………………………………. 56

Gambar 4.5 Hasil visualisasi jarak asam amino disekitar ligan menggunakan VMD

  …

  58 Gambar 4.6 Struktur fenilalanin……………………

  59 Gambar 4.7 Struktur leusin………………………...

  61 Gambar 4.8 Struktur senyawa alkaloid SA2014…...

  61

DAFTAR LAMPIRAN

  Halaman Lampiran 1 Prosedur docking menggunakan

  PLANTS

  83 ……………………… Lampiran 2 Biodata penulis..........................

  97

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

  Siklus sel merupakan proses penting dalam kehidupan setiap organisme karena berperan pada pembelahan sel. Secara normal, siklus sel terdiri atas dua proses utama yaitu mitosis/M (pembelahan satu sel menjadi dua sel) dan interfase, yang terdiri atas fase gap 1 (G1), sintesis DNA (S) dan gap 2 (G2) (Alberts, et

  

al., 2008). Siklus sel dikontrol oleh sejumlah gen dan apabila

  salah satu gen tersebut mengalami perubahan fungsi maka akan berpengaruh pada seluruh sistem. Akibatnya, sel normal membutuhkan sejumlah mekanisme intrinsik yang melibatkan “gatekeeper” molekuler untuk menghindarkan diri dari pembelahan yang tidak terkontrol. Pembentukan dan perkembangan tumor terjadi jika protein khusus yang mengatur pembelahan sel mengalami perubahan fungsi, ekspresi gen atau hilang kedua-duanya. Salah satu protein yang berhubungan erat dengan pengendalian siklus sel adalah p53 (Syaifuddin, 2010). p53 merupakan faktor transkripsi (protein regulator) yang mempunyai berat molekul 53 kilodalton (kD) dan pertama kali ditemukan pada tahun 1979 (Lane & Crawford, 1979 dalam Syaifuddin, 2010). p53 yang berfungsi normal akan mengontrol siklus sel dan induksi apoptosis (Agarwal, et al., 1995). Kehilangan fungsi p53 akan mengakibatkan proliferasi tidak terkendali dan menimbulkan kanker. Mutasi p53 merupakan perubahan genetik dengan frekuensi lebih dari 50% pada kanker manusia (Bai & Wei, 2006). Pasien dengan mutasi p53 memiliki ketahanan yang buruk dibandingkan dengan pasien yang tidak memiliki mutasi p53 (Olivier, et al., 2006; Sjogren, et al., 1996). Mutasi pada p53 terlibat pada proses pembentukan kanker payudara (Hanahan, et al., 2011; Solomon, et al., 2011 dalam Walerych, et al., 2012).

  Kanker payudara merupakan penyakit kompleks yang tidak terkontrol pada bagian duktus terminal dan lobular pada payudara (Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast

  Cancer,

  1996). Menurut World Health Organization (WHO), kanker merupakan salah satu penyebab kematian didunia dengan setiap tahun jumlah penderita kanker di dunia bertambah 7,9 juta orang pada tahun 2007 dan jumlah ini akan bertambah 80 juta setiap tahunnya (Maxwell, 2000). Kanker payudara merupakan penyebab maligna pada wanita yang melibatkan satu juta pasien setiap tahunnya mencakup sekitar 10% dari semua kanker dan 23% kanker wanita di negara berkembang (Coley, 2008). Pada tahun 2014, Berdasarkan Sistem Informasi RS (SIRS), jumlah pasien rawat jalan maupun rawat inap pada kanker payudara terbanyak yaitu 12.014 orang (28,7%) dan kanker serviks 5.349

  1

  orang (12,8%) (Anonim , 2014). Hal tersebut menunjukkan bahwa kanker payudara tergolong jenis kanker yang membahayakan.

  Pengobatan kanker umumnya menggunakan kemoterapi, yaitu membunuh sel-sel kanker, mengontrol pertumbuhan sel kanker, menghentikan pertumbuhannya agar tidak menyebar dan mengurangi gejala-gejala yang disebabkan oleh kanker. Kemoterapi terkadang merupakan pilihan pertama untuk menangani kanker namun menimbulkan efek samping antara lain terjadinya penurunan jumlah sel-sel darah, infeksi, anemia, pendarahan seperti mimisan, rambut rontok, kadang muncul keluhan seperti kulit gatal dan kering, mual dan muntah, dehidrasi dan tekanan darah rendah, sembelit/konstipasi, diare dan gangguan sistem syaraf (Siswandono, 2000). Tingginya efek samping dari kemoterapi disebabkan obat yang dipergunakan masih belum mempunyai mekanisme yang spesifik terhadap sel kanker saja, tetapi obat tersebut juga menyerang sel-sel normal. Obat kanker umumnya berfungsi menghambat proliferasi sel tanpa mematikan sel kanker dan bersifat multidrug resistance (MDR) atau tahan terhadap berbagai obat kanker (William & Andersen, 2006). Riset untuk mendapatkan kandidat potensial permasalahan tersebut. Obat antikanker yang sedikit menimbulkan efek samping dan memiliki target bioaktif spesifik umumnya diperoleh dari alam (Iwamaru, et al., 2007). Salah satunya adalah spons laut.

  Spons sebagai salah satu organisme bentik yang telah diketahui memiliki kandungan senyawa bioaktif yang paling luas dan paling banyak mendapat perhatian para peneliti dibandingkan invertebrata laut lainnya yang telah diteliti. Menurut Jha dan Zi- Rong (2004), spons merupakan kontributor terbesar senyawa bioaktif dari laut jika dibandingkan dengan biota laut lainnya yaitu 37%, disusul coelenterata (21%), mikroorganisme (18%), alga (9%), echinodermata dan tunikata masing-masing (6%), moluska (2%) dan bryozoa (1%). Spons merupakan biota sesil, sehingga tidak dapat menghindari serangan predator dengan berpindah tempat sehingga spons mempunyai mekanisme pertahanan secara kimiawi. Mekanisme pertahanan kimiawi dilakukan dengan cara menghasilkan senyawa bioaktif (Joseph & Sujatha, 2011). Senyawa bioaktif tersebut antara lain alkaloid, steroid, dan terpene (Sjogren, 2006). Senyawa bioaktif tersebut diisolasi dan dimurnikan kemudian secara terpisah dilakukan sintesis secara kimia sehingga organisme bentik penghasil senyawa bioaktif tidak dieksploitasi secara berlebihan (Sukandar, 2014). Beberapa senyawa bioaktif ini bersifat antivirus, antijamur, antimikroba, antiinflamasi, antitumor, dan sitotoksik (Joseph & Sujatha, 2011). Spons juga memiliki potensi farmakologis (Faulkner, 2001).

   Cinachyrella anomala merupakan spons laut yang tergolong

  kelas Demospongiae, ordo Tetractinellida, dan familia Tetillidae (Cardenas, 2015). C. anomala merupakan spons laut yang melimpah ditemukan di perairan Indonesia. Organisme bentik ini memiliki kadar metabolit sekunder lebih tinggi dibanding zat metabolit sekunder pada tanaman. Tingginya zat metabolit sekunder tersebut dapat digunakan sebagai alternatif pengobatan kanker.

  Beberapa penelitian yang pernah dilakukan antara lain Shimogawa, et al. (2006) berhasil mengisolasi senyawa

  Cinachyramine

  dari spons genus Cinachyrella sp. dari perairan Okinawa, Jepang. Penelitian yang telah dilakukan Machida, et al. (2014) berhasil mengidentifikasi senyawa Cinanthrenol A dari spons Cinachyrella sp. dan diketahui pula aktivitas biologinya. Komponen alkaloid dari Cinachyrella sp.telah diisolasi dan diidentifikasi dari kelompok derivat cinachyramine dengan

  triaza

  formula molekular dan nama struktur 4,9

  

tricyclo [7,3,1,0]trideca-3,5(13),10-trien-8-ol (SA2014)

  (Nurhayati, et al., 2014). Uji sitotoksik dan antiproliferasi spons laut Cinachyrella sp. dapat menghambat proliferasi sel T47D lebih baik dibandingkan pada sel Hela, Widr dan Vero (Nurhayati, et al., 2014). Komponen1,4,9- triazatricyclo[7,3,1,0]trideca-3,5(13),10-trien-8-ol (SA2014) yang telah diisolasi dari spons laut C.anomala memiliki mekanisme seluler melawan sel T47D (Nurhayati, et al., 2015).

  Senyawa bioaktif spons C. anomala berpotensi sebagai obat kanker. Obat yang ditargetkan diharapkan merupakan

  treatment

  yang lebih baik melalui interaksi protein-ligan yang penting untuk mendesign obat. Biologi komputasi dan bioinformatika memiliki potensi untuk mempermudah proses penemuan obat serta membantu mengidentifikasi metode yang bervariasi untuk identifikasi komponen obat. Salah satu metode yang digunakan adalah docking molekul obat dengan reseptor (target). Studi interaksi protein-ligan melalui metode komputasi membantu mengetahui struktur berdasarkan desain obat (Lyskov,

  

et al., 2008). Penelitian docking molekuler antara senyawa

  alkaloid SA2014 dari C. anomala terhadap p53 kanker payudara T47D belum pernah dilakukan.

  Metode docking molekuler membantu mengetahui ikatan molekul yang stabil dengan energi minimum pada target protein p53 dan senyawa alkaloid SA2014 dari spons laut C. anomala. Penelitian ini penting dilakukan sebagai salah satu metode untuk T47D akibat mutasi p53 dan berpotensi menambah informasi dari manfaat bahan alam laut, khususnya spons C. anomala di Indonesia.

  1.2 Rumusan Masalah

  Rumusan masalah pada penelitian ini adalah sebagai berikut: a.

  Bagaimana skor docking senyawa alkaloid SA2014 dari spons laut C.anomala terhadap protein p53.

  b.

  Bagaimana peran asam amino pada interaksi senyawa alkaloid SA2014 dari spons laut C.anomala terhadap protein p53 kanker payudara T47D.

  1.3 Batasan Masalah

  Batasan masalah pada penelitian ini adalah sebagai berikut: a.

  Skor docking senyawa alkaloid SA2014 dari spons laut

  C.anomala docking

  dibandingkan dengan skor doxorubicin terhadap protein p53 menggunakan software PLANTS.

  b. Jarak ikatan asam amino pada interaksi senyawa alkaloid SA 2014 terhadap protein p53 menggunakan software VMD.

  1.4 Tujuan

  Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui skor docking senyawa SA2014 terhadap protein p53 dan asam amino yang berperan pada ikatannya.

  1.5 Manfaat

  Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai potensi bahan alam laut di Indonesia untuk desain obat yang efektif mengobati kanker payudara.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kanke r

  Kanker merupakan suatu penyakit yang disebabkan oleh kehilangan fungsi kontrol regulasi siklus sel dan homeostatis. Akibatnya, sel akan berproliferasi dengan pertumbuhan jaringan abnormal (Ullah & Aatif, 2009). Sel-sel kanker akan berkembang dengan cepat, tidak terkendali, dan akan terus membelah diri, selanjutnya menyusup ke jaringan sekitarnya (invasive) dan terus menyebar melalui jaringan ikat, darah dan menyerang organ- organ penting serta syaraf tulang belakang. Sel hanya akan membelah diri untuk mengganti sel-sel yang telah mati dan rusak dalam keadaan normal, sebaliknya sel kanker mengalami pembelahan secara terus menerus meskipun tubuh tidak memerlukannya sehingga terjadi penumpukan sel baru yang disebut tumor ganas. Penumpukan sel akan mendesak dan merusak jaringan normal sehingga mengganggu organ yang ditempatinya. Kanker dapat terjadi di berbagai jaringan dalam berbagai organ di setiap tubuh, mulai dari kaki sampai kepala. Kanker yang terjadi di permukaan tubuh mudah diketahui dan diobati sedangkan ketika kanker terjadi didalam tubuh, kanker sulit diketahui dan kadang-kadang tidak memiliki gejala. Jika timbul gejala biasanya sudah stadium lanjut sehingga sulit diobati

  2 (Anonim , 2006).

  Sel kanker memiliki karakteristik yang unik, antara lain sel kanker mampu melakukan proliferasi sendiri, dapat melawan suppresor growth, mampu menembus jaringan yang lain, tidak ada kematian sel (immortal), replikasi immortal, dan induksi angiogenesis (pembentukan pembuluh darah baru) (Hanahan, et al., 2011).

  Kanker memiliki gen-gen yang berperan yaitu onkogen dan protoonkogen. Onkogen adalah bentuk mutan dari proto- onkogen (disebut juga gen-gen untuk pertumbuhan atau growth

  promoting genes merespon sinyal dari sel-sel lain dan membawanya ke inti sel, untuk menstimulasi pertumbuhan. Proto-onkogen berfungsi dalam pertumbuhan dan pembelahan sel-sel normal (Hunt, 1998). Apabila proto-onkogen mengalami mutasi menjadi onkogen (berasal dari ba hasa Yunani “Oncos”yang berarti tumor) yang bersifat karsinogen, akibatnya sel-sel mengalami multiplikasi (penggandaan) secara berlebihan, karena gen-gen mutan ini tidak bereaksi terhadap sinyal pengatur pertumbuhan (Does, et

  al.

  ,2007).

Gambar 2.1 Sifat kanker (Hanahan, et al., 2011)

  Kanker secara garis besar dibagi menjadi dua kelompok, yaitu kanker jinak dan kanker ganas. Kanker jinak (benign) memiliki kecenderungan untuk tumbuh lebih lambat dari kanker ganas dan tidak menyebar ke organ lain. Kanker ganas (malign) memiliki pertumbuhan sel yang sangat cepat, dapat menginvasi serta menghancurkan jaringan disekitarnya dan pada tahap selanjutnya akan menyebar ke organ-organ lain (Lumongga, 2008). Kanker juga dapat diklasifikasikan berdasarkan jaringan dan tipe sel tempat mereka tumbuh. Kanker yang tumbuh dari sel jaringan penghubung (connective) atau sel otot disebut sarcoma

  ( Alberts, et al., 1994).

  Mekanisme kanker adalah mulanya, sel normal terdiri atas ukuran yang sama, yang terorganisir dan semua lapisan sel berada diatas membran basement. Membran tersebut membagi sel berdasarkan tipe selnya untuk membentuk organ yang berbeda. Sel normal yang mengalami mutasi akan tumbuh lebih cepat daripada sel disekitarnya. Sel termutasi yang tumbuh lebih cepat disebut dengan hyperproliferative cell. Akumulasi dari

hyperproliferative cells akan membentuk tumor benign kecil.

Tumor tersebut dikenal dengan adenoma. Jika adenoma diangkat, penderita akan sembuh dan kanker tidak akan menyebar lebih ganas. Jika adenoma belum terangkat seluruhnya dapat mengakibatkan adenocarcinoma. Sel adenocarcinoma akan terlepas dari membrane basement dan menyebar melalui pembuluh darah dan mengalami metastasis. Sel kanker yang telah mengalami metastasis disebut malign (Hunt,1998).

2.2 Kanker payudara

  Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang mempunyai prevalensi yang paling sering ditemukan di Indonesia setelah kanker leher rahim. Data Badan Registrasi Kanker Ikatan Ahli patologi Indonesia (BRK-IAPI) tahun 1994 menunjukkan bahwa kanker payudara tetap menduduki peringkat ke-2 tertinggi setelah keganasan pada wanita kanker leher rahim dengan angka kejadian 17,1% dari keseluruhan kanker pada wanita. Namun, baru- baru ini data melaporkan bahwa kanker payudara menempati posisi pertama penyebab kematian terbesar di Indonesia. Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT) tahun 2004 jumlah kasus kanker payudara yang dilaporkan oleh rumah sakit di Jawa Tengah adalah lebih tinggi dibanding kanker leher rahim, jumlah kasus kanker payudara 3.593 (43,91%) dibanding kanker

  3 leher rahim sebanyak 2.780 kasus (33,98%) (Anonim , 2004).

  Data Sistem Informasi Rumah Sakit (2010) menunjukkan bahwa leher rahim 5.349 kasus (12,8%). Pada tahun 2014, Berdasarkan Sistem Informasi RS (SIRS), jumlah pasien rawat jalan maupun rawat inap pada kanker payudara terbanyak yaitu 12.014 orang

  1

  (28,7%) dan kanker serviks 5.349 orang (12,8%) (Anonim , 2014). Hal tersebut menunjukkan bahwa kanker payudara tergolong jenis kanker yang membahayakan.

  Kanker Payudara adalah tumor ganas yang menyerang jaringan payudara yang berasal dari kelenjar, saluran kelenjar dan jaringan penunjang payudara. Kanker payudara terjadi karena adanya kerusakan gen yang mengatur pertumbuhan dan diferensiasi sehingga sel ini tumbuh dan berproliferasi tanpa dapat dikendalikan (Mardiana, 2004). Pada umumnya tumor pada payudara bermula dari sel epitelial, sehingga kebanyakan kanker payudara dikelompokkan sebagai karsinoma (keganasan tumor epitelial) (Hondermarck, 2003).

  Kanker payudara pada umumnya berupa ductal yang invasif dengan pertumbuhan tidak terlalu cepat (Tambunan, 2003). Kanker payudara sebagian besar (sekitar 70%) ditandai dengan adanya gumpalan yang biasanya terasa sakit pada payudara, juga adanya tanda lain yang lebih jarang yang berupa sakit pada bagian payudara, erosi, retraksi, pembesaran dan rasa gatal pada bagian puting, juga secara keseluruhan timbul kemerahan, pembesaran dan kemungkinan penyusutan payudara (Bosman, 1999).

  Salah satu model sel kanker payudara yang banyak digunakan dalam penelitian adalah sel T47D. Sel kanker payudara T47D merupakan continous cell lines yang morfologinya seperti sel epitel yang diambil dari jaringan payudara seorang wanita berumur 54 tahun yang terkena ductal

  

carcinoma . Sel ini dapat ditumbuhkan dengan media dasar

  penumbuh RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640

  4

  (Anonim , 2008) yang mengekspresikan ER- β (Zampieri, et al.,

  2002) dibuktikan dengan adanya respon peningkatan proliferasi sebagai akibat pemaparan 17β-estradiol (Verma, et al., 1998). diferensiasi karena memiliki reseptor estrogen + (Wozniak & Keely, 2005). Sel ini sensitif terhadap doxorubicin (Zampieri, et

  al.,

  2002) dan mengalami mutasi missense pada residu 194 (dalam DNA binding domain) gen p53. Mutasi missense merupakan perubahan materi genetik yang mengakibatkan penggantian satu kodon sense oleh kodon sense lainnya sehingga mengubah asam amino yang dikodekan (Stansfield, et.al., 2006).

  Jika p53 tidak dapat berikatan dengan element pada DNA, kemampuannya untuk regulasi siklus sel dapat berkurang atau hilang (Schafer, et al., 2000). Sel kanker dengan mutasi p53 diketahui terjadi pengurangan respon terhadap agen-agen yang menginduksi apoptosis (kematian sel terprogram) dan kanker tersebut kemungkinan menjadi resisten terhadap obat antikanker yang memiliki target kerusakan DNA (Crawford, 2002).

  Penyebab kanker payudara sangat beragam, tetapi ada sejumlah faktor risiko yang dihubungkan dengan perkembangan penyakit ini yaitu asap rokok, konsumsi alkohol, umur pada saat menstruasi pertama, umur saat melahirkan pertama, lemak pada makanan, dan sejarah keluarga tentang ada tidaknya anggota keluarga yang menderita penyakit ini (Macdonald & Ford,1997). Hormon juga memegang peranan penting dalam terjadinya kanker payudara. Estradiol dan atau progesteron dalam daur normal menstruasi meningkatkan resiko kanker payudara. Hal ini terjadi pada kanker payudara yang memiliki reseptor estrogen. Kasus kanker payudara dengan prevalensi 50% merupakan kanker yang tergantung estrogen (Gibbs, 2000). Kompleks estrogen dengan reseptornya juga akan memacu transkripsi gen suppressor tumor, seperti p53 namun pada penderita kanker payudara (yang umumnya telah lewat masa menopause) gen-gen tersebut telah mengalami perubahan akibat dari hiperproliferasi sel-sel payudara selama perkembangannya, sehingga tidak berperan sebagaimana mestinya (Adelmann, et al., 2000; Clarke, 2000). Gen p53 secara normal menyandi protein dengan berat molekul 53 kDa yang terlibat dalam kontrol pertumbuhan sel. Mutasi yang terjadi pada gen ini dapat menyebabkan pertumbuhan sel menjadi tidak terkontrol (Gondhowiarjo, 2004).

  2.3 p53 (Tumor Protein 53)

  p53 yang merupakan faktor transkripsi berada pada kromosom manusia 17p13.1, terdiri dari 393 asam amino, 11 exon, dan mempunyai panjang 20 kilobasa. Gen penekan tumor diperlukan untuk mempertahankan pembelahan sel tetap terkontrol. Gen penekan tumor yang berfungsi normal akan mengontrol siklus sel dan replikasi DNA, jika gen tersebut tidak berfungsi dengan baik maka proliferasi sel tidak dapat terkendali dan menimbulkan kanker. Gen penekan tumor tidak saja diyakini sebagai protein yang diperlukan sebagai alat deteksi kerusakan DNA, tetapi memiliki fungsi yang lebih luas setelah terjadinya penekanan selular seperti aktivasi onkogen (Vousden, 2000). Gen penekan tumor telah menjadi topik utama penelitian kanker karena umumnya termutasi pada kanker manusia.

Gambar 2.2. Domain Fungsional pada Gen p53 terdiri atas domain

  N ‐terminal, domain Central core dan domain C terminal (Bai & Wei, 2006).

Gambar 2.3 Representasi Skematik Molekul p53 (Syaifudin, 2010).

  _Menu

  rut Bai & Wei (2006), p53 disebut juga TP53 (tumor protein 53) merupakan protein yang memiliki 393 ‐residu polipeptida. p53 memiliki tiga domain fungsional, yaitu:

  1. Domain N ‐terminal (residu 1‐94) terdiri atas domain transaktivasi (1-42) dan domain kaya Prolin (residu 61

  ‐94), domain yang berperan dalam stabilitas p53 dengan ikatan MDM2.

  2. Domain central core, paling besar (residu 102 ‐292) melibatkan ikatan DNA dan lokasi hampir semua mutasi p53 onkogenik.

  3. Domain C terminal dasar (residu 324 ‐393) regulator terdiri atas domain tetramer (324- 355) dan regulator (363- 393). p53 mengikat DNA dalam bentuk yang spesifik untuk menjalankan fungsinya sehingga memungkinkan p53 mengaktifkan transkripsi gen sasaran. Bagian tengah protein tersebut (residu asam amino 102-292) adalah deret spesifik daerah DNA-binding, umumnya mutasi p53 spontan berada pada daerah ini dan secara langsung atau tidak langsung mempengaruhi interaksi p53 dengan DNA. Residu asam amino antar-muka (interface) DNA-protein (Chen, et al.,1994). Mutasi p53 memiliki frekuensi paling banyak pada domain terkonservasi yaitu domain II, III, IV and V yang bertanggungjawab pada residu asam amino 117-142 (ekson 4-5), 171-181 (ekson 5), 234- 258 (ekson 4) dan 270- 286 (ekson 8). Region terkonservasi pada ekson 5-8 yang merupakan target dari mutasi p53 pada maligna manusia (Nigro, 1989 dalam Makwane, 2009).

  Menurut George (2011) fungsi seluler gen p53 antara lain: 1.) p53 mencegah adanya transmisi dari informasi genetik yang rusak dari generasi 1 sel ke sel berikutnya melalui ikatan faktor transkripsi yang disebut E2F. 2.) Inisiasi apoptosis jika kerusakan pada beberapa sel dan bekerja sebagai penanda kerusakan pada pembentukan kanker dengan cara membunuh sel yang berproliferasi. 3.) p53 berperan sebagai tumor suppressor: mutasi pada p53 dapat menyebabkan sel menjadi berubah secara onkogen (oncogenically transformed). 4.) p53 merupakan faktor transkripsi dan sekali diaktivasi akan menekan transkripsi pada satu set gen (beberapa untuk menstimulasi pertumbuhan sel). 5.) Fungsi p53 penting untuk pengobatan banyak kanker dengan cara membunuh sel sejak radioterapi dan kemoterapi berperan untuk memperbaiki kerusakan DNA. Keberhasilan respon terapi ini berkurang ketika p53 mengalami mutasi (mutan p53), sehingga kanker sulit diobati. a b

Gambar 2.4 Struktur Tiga Dimensi MDM2 Berikatan dengan

  Domain Transaktivasi pada Protein p53 (http://www.rcsb.org/pdb).

Tabel 1.1 Contoh beberapa Gen Penekan Tumor, Lokasi, Fungsi,

  Jenis Mutasi dan Gejala yang Terlibat dalam Kanker Manusia (Donehower, et al., 1992).

  Gen p53 merupakan pelindung siklus sel. Bila sel pada perbatasan G1/S dengan menginduksi penghambat CDK (cyclin dependent kinase) dan sistem perbaikan DNA terlebih dahulu menghilangkan luka tersebut sebelum sel memasuki fase S tanpa adanya DNA yang terluka. Program “arrest”dan apoptosis ini tergantung pada lingkungan fisiologik ataupun jenis sel. Kehilangan fungsi gen p53 ini merupakan penyebab munculnya malignansi (Parada, 1982 dalam Syaifuddin, 2010).

  Penelitian membuktikan bahwa mutan p53 memperbesar proses pembentukan tumor (Finlay et al., 1989; Lehman, et al., 1991; Lowe, et al., 1993). p53 dalam bentuk aktif atau stabil mengkode pengaktif transkripsi yang targetnya dapat meliputi gen-gen yang mengatur kestabilan genomik. Contoh gen tersebut adalah Murine double minute 2 (MDM2) (Grosovsky, et al., 1988).

  Produk gen MDM2 berikatan dengan p53 dan berlawanan dengan fungsi transaktivasi p53. Amplifikasi gen MDM2 terjadi pada beberapa jenis kanker seperti payudara dan leukemia. fungsi normal MDM2 adalah membatasi lamanya “arrest” yang diinduksi oleh p53 (Lodish, et al., 2000) .

  Aktivitas p53 secara normal dalam kadar rendah karena mudah didegradasi dan tidak stabil. Kadar p53 yang rendah tersebut dikontrol oleh MDM2. Pada proses respon kerusakan DNA dalam ketahanan G1 (pada gambar 3) dapat dijelaskan sebagai berikut: aktivitas kinase diaktifkan oleh respon kerusakan DNA akibat stress yang bervariasi (contohnya: panas, iradiasi UV). Ataxia telangiectasia (ATM) serine kinase teraktivasi kemudian menggerakkan tiga jalur yang berperan dalam ketahanan G1: (1) Chk2 difosforilasi kemudian memfosforilasi Cdc25, dan membuatnya terdegradasi dan menahan aktivasi CDK2 (enzim yang berikatan dengan siklin E berperan dalam

  

checkpoint dan siklus sel).(2) jalur kedua, fosforilasi p53 akan

  menstabilkannya sehingga p53 teraktivasi mengekspresikan gen yang mengkode protein yang menyebabakan ketahanan G1, memicu apoptosis dan perbaikan DNA. (3) jalur ketiga adalah cara lain untuk mengontrol kelimpahan p53. Protein MDM2 menghambat faktor transkripsi dan menyebabkan ubiquitinasi dan degradasi oleh proteosom. ATM memfosforilasi MDM2 untuk tidak mengaktifkannya, menyebabkan bertambahnya stabilisasi p53. Level MDM2 dikontrol oleh P14ARF yang berikatan dengan MDM2. Gen ini diinduksi oleh level yang tinggi dari sinyal mitogenik yang secara frekuensi diteliti pada sel yang membawa mutasi onkogen pada jalur sinyal faktor pertumbuhan. Gen MDM2 pada manusia secara frekuensi teramplifikasi pada sarcoma dan mengakibatkan inaktivasi p53 dan P14ARF juga ditemukan termutasi pada beberapa kanker (Lodish, et al., 2000).

Gambar 2.5 Jalur pada p53 dihubungkan dengan MDM2 Ketika Terjadi Kerusakan DNA (Lodish, et al., 2000) .

  Mekanisme inaktivasi gen p53 pada kanker payudara dapat terjadi melalui 1) mutasi perubahan asam amino pada DNA

  binding domain yang mengakibatkan p53 dihalangi dari binding

  pada deret DNA spesifik dan mengaktifkan gen didekatnya. 2) menghambat MDM2 dan menahan degradasi p53 untuk tetap terkendali 3) Mis-lokasi p53 pada sitoplasma, diluar inti mengakibatkan kegagalan fungsi p53 (Smith & Fornace,1996).

2.4 Respon Protein p53

2.4.1 Aktivasi Protein p53

  Respon seluler yang ditimbulkan oleh p53 terhadap mutasi atau kerusakan DNA melalui aktivasi p53, induksi terhadap ketahanan siklus sel, perbaikan DNA dan apoptosis (Reles, 2001; Bai & Zhu, 2006). Aktivasi dari p53 bergantung induksinya (stress yang bervariasi dan kerusakan gen). Respon p53 terhadap stress yang rendah dan tinggi berbeda. Respon p53 akibat stress yang rendah, p53 berperan sebagai “pelindung” yang menghasilkan ketahanan siklus sel, menghambat pertumbuhan, perbaikan DNA dan antioksidan. Respon tersebut mampu mengembalikan sel akibat kerusakan yang diinduksi oleh stress.

Gambar 2.6 Model Mekanisme Protein p53 pada Tumor (Vousden & Prives, 2009).

  Ketika sel menerima stress yang tinggi, maka p53 berperan se bagai “pembunuh” yang menginduksi apoptosis atau penuaan, mencegah proliferasi sel berlebih. Jika p53 salah maka sel tidak dapat diperbaiki, sel tetap mengalami kerusakan dan berdampak menjadi kanker. Model mekanisme p53 pada tumor ditunjukkan pada gambar 4.6 (Vousden & Prives, 2009).

  Jalur yang berperan dalam perkembangan kanker dan berhubungan dengan p53 terdiri atas tiga jalur, yaitu jalur AMPK, PI3K dan mTOR.

1. Jalur AMPK

  Protein AMP-kinase teraktivasi (AMPK) merupakan kompleks kinase protein yang berperan dalam regulasi homeostasis energi selular, mempertahankan, energi dan viabilitas selular. AMPK diaktivasi pada keadaan stress seperti kekurangan energi dan hipoksia. Aktivasi AMPK dapat positif atau negatif terhadap pertumbuhan tumor tergantung pada konteks p53. Apabila terdapat p53, AMPK menginduksi titik periksa siklus sel metabolik yang pada proliferasi sel. Ketika tidak terdapat p53, dibutuhkan inhibitor progresi tumor lain yang mampu berperan sebagai pengganti p53 (Maddocks, 2011; Luo, et al., 2011; Gottlieb, 2010).

  Aktivasi AMPK telah dilaporkan dapat menekan proliferasi pada berbagai tipe sel. Temuan-temuan ini mengindikasikan bahwa sistem AMPK memainkan peranan penting dalam regulasi proliferasi sel (Luo, et al., 2011; Fruman, et al., 2008). AMPK dapat meregulasi berbagai variasi jalur sinyal yang berperan dalam proliferasi sel (Gambar 4.7). AMPK dapat mempengaruhi proliferasi sel, termasuk:

  Inhibisi ACC yang menyebabkan supresi sintesis asam lemak; Inhibisi reduktase HMG-CoA yang menyebabkan supresi sinstesis mevalonat dan produk jalur sintesis kolesterol lainnya.

  Inhibisi jalur mTOR sehingga menyebabkan hambatan terhadap sintesis protein; dan Inhibisi progresivitas siklus sel dengan aktivasi aksis p53-p21. Saat ini belum ada data yang menyediakan cukup informasi untuk menentukan seberapa banyak dan lama aktivasi AMPK dapat berfungsi untuk menekan sintesis protein, asam lemak dan juga DNA sehingga dibutuhkan studi lanjutan (Luo, et al., 2011; Fruman, et al., 2008; Zhou, et al., 2009).

Gambar 2.7 Berbagai Jalur dalam Regulasi AMPK yang dapat

  Memodulasi Proliferasi Sel (Luo, et al., 2010). Keterangan:

  

Aktivasi AMPK dapat meregulasi proliferasi sel, tidak hanya dengan

aktivasi aksis p53-p21 dan inhibisi sinyal mTOR, namun juga dengan

penekanan jalur sintesis asam lemak. Pada saat AMPK teraktivasi,

beberapa jalur yang diindikasikan dengan garis titik-titik mengalami

supresi.

  2. Jalur PI3K Phospatidilinositol 3 kinase (PI3K) merupakan jalur yang mengatur level phospatidil inositol terfosforilasi (PIP3) pada membran plasma. Aktivasi PI3K terkait faktor pertumbuhan menyebabkan aktivasi mammalian target of rapamycin (mTOR), yang mengkoordinasi aktivitas metabolik pendukung biosintesis selular (Sokolosky, et al., 2011).

3. Jalur mTOR

  Mamalian target of rapamycin (mTOR) merupakan jalur

  yang berperan dalam sintesis protein dengan mengatur asupan berperan dalam mTOR sehingga akan mempengaruhi laju sintesis protein. Jalur mTOR terbagi menjadi dua kompleks protein berbeda yaitu: TORC1 dan TORC2. TORC1 berperan dalam menentukan ukuran sel sedangkan TOR2 berperan dalam mengatur bentuk sel dan sitoskeleton aktin (Wullschleger, 2006; Luo, et al., 2010).

  2.4.2 Induksi Terhadap Ketahanan Siklus Sel