3.5.3.2 Pengenceran Bahan Coba
Ekstrak daun Afrika Vernonia amygdalina dalam pelarut etanol ditimbang dengan menggunakan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan
dengan cara dilarutkan dengan media Trypricase Soy Broth TSB. Disediakan 6 buah tabung, pada masing-masing tabung diisi 1 ml TSB. Pada tabung pertama diisi 1 gram ekstrak kental daun Afrika
kemudian divorteks sehingga diperoleh ekstrak daun Afrika dengan konsentrasi 100. Kemudian dilakukan pengenceran dengan cara pengambilan ½ dari ekstrak daun Afrika konsentrasi 100
menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung ke-2 untuk mendapatkan ekstrak daun Afrika konsentrasi 50 pengenceran ganda. Demikian seterusnya sampai tabung ke-6 sehingga
dihasilkan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, dan 3,125. Beri label pada setiap label sesuai konsentrasinya.
3.5.3.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Trypricase Soy Agar TSA, sebanyak 12 gram TSA dilarutkan dalam 250 ml akuades kemudian dituangkan ke dalam petri lalu
media disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121
o
C, kemudian media dimasukkan ke dalam inkubator selama 24 jam untuk melihat apakah ada kontaminasi
bakteri atau tidak. Jika steril, media sudah dapat digunakan untuk membiakkan spesimen.
3.5.3.4 Pembuatan Suspensi Bakteri
Enterococcus faecalis yang digunakan adalah spesimen stem sel Enterococcus faecalis
ATCC 29212 yang dibiakkan secara murni pada media TSA dalam suasana anaerob hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil beberapa
koloni bakteri dengan ose steril lalu diencerkan dengan larutan NaCl 0,9 hingga konsentrasi 10
8
CFUml atau setara dengan 0.5 Mc Farland Standard.
3.5.3.5 Penentuan KHM Bahan Coba
Konsentrasi ekstrak etanol daun Afrika Vernonia amygdalina yang diuji dalam penelitian ini adalah 100, 50, 25, 12,5, 6,25, dan 3,125. Dari masing-masing konsentrasi ekstrak
etanoldaun Afrika Vernonia amygdalina dari pengenceran yang telah dilakukan tersebut, diambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan
menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba tersebut kemudian dicampur
Universitas Sumatera Utara
dengan vorteks, lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam pada inkubator CO
2
. Kemudian amati perubahan kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tersebut, lalu
dibandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol Mc Farland untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap
kelompok perlakuan merupakan konsentrasi minimal ekstrak yang mampu menghambat pertumbuhan Enterococcus faecalis dalam media pembenihan setelah diinkubasi 24 jam dan
diamati secara visual.
3.5.3.6 Penentuan KBM Bahan Coba
Kategori