e. Lama pengiriman dan suhu saat pengiriman bahan coba ekstrak kulit buah
manggis ke laboratorium
3.5 Defenisi Operasional
Variabel Bebas No
Variabel Defenisi Operasional
Cara ukur Skala Ukur
Alat Ukur 1.
Ekstrak kulit buah manggis
dengan konsentrasi
100 Ekstrak yang didapat
dengan melarutkan 1 gram ekstrak kental
kulit buah manggis dalam 1 ml MHB
Sesuai SOP dari Laboratorium
Pusat Penyakit Tropis UNAIR
Rasio Electronic
Balance, gelas ukur
2. Ekstrak kulit
buah manggis dengan
konsentrasi 50
Ekstrak yang didapat dengan mengambil ½
dari konsentrasi ekstrak kulit
buah manggis 100 dan dilarutkan
dalam 1 ml MHB Sesuai SOP dari
Laboratorium Pusat Penyakit
Tropis UNAIR Rasio
Mikropipet
3. Ekstrak kulit
buah manggis dengan
konsentrasi 25
Ekstrak yang didapat dengan mengambil ½
dari konsentrasi ekstrak kulit buah manggis 50
dan dilarutkan dalam 1 ml MHB
Sesuai SOP dari Laboratorium
Pusat Penyakit Tropis UNAIR
Rasio Mikropipet
4. Ekstrak kulit
buah manggis dengan
konsentrasi 12,5
Ekstrak yang didapat dengan mengambil ½
dari konsentrasi ekstrak kulit buah manggis 25
dan dilarutkan dalam 1 ml MHB
Sesuai SOP dari Laboratorium
Pusat Penyakit Tropis UNAIR
Rasio Mikropipet
5. Ekstrak kulit
buah manggis dengan
konsentrasi 6,25
Ekstrak yang didapat dengan mengambil ½
dari konsentrasi ekstrak kulit buah manggis
12,5 dan dilarutkan dalam 1 ml MHB
Sesuai SOP dari Laboratorium
Pusat Penyakit Tropis UNAIR
Rasio Mikropipet
6. Ekstrak kulit
buah manggis dengan
konsentrasi 3,125
Ekstrak yang didapat dengan mengambil ½
dari konsentrasi ekstrak kulit buah manggis
6,25 dan dilarutkan dalam 1 ml MHB
Sesuai SOP dari Laboratorium
Pusat Penyakit Tropis UNAIR
Rasio Mikropipet
7. Ekstrak kulit
buah manggis dengan
konsentrasi 1,5625
Ekstrak yang didapat dengan mengambil ½
dari konsentrasi ekstrak kulit buah manggis
3,125 dan dilarutkan dalam 1 ml MHB
Sesuai SOP dari Laboratorium
Pusat Penyakit Tropis UNAIR
Rasio Mikropipet
3.6 Bahan dan Alat Penelitian
3.6.1 Bahan Penelitian
a. Buah manggis sebanyak 1000 gram
b. Pelarut Etanol 70 sebanyak 5 liter Kimia Farma,Indonesia
Variabel Tergantung No. Variabel
Defenisi Operasional Hasil Ukur
Skala Ukur Alat Ukur
1. KHM
Kadar Hambat
Minimum konsentrasi minimal
bahan coba yang mampu menghambat
pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 37°C dan tidak
tumbuh koloni bakteri pada media
perbenihan dengan menggunakan metode
dilusi pengenceran ganda
dalam satuan CFUml
colony forming
unitsuspensi Rasio
Spektofotometer
2 KBM
Kadar Bunuh
Minimum konsentrasi minimal
bahan coba yang dapat membunuh
99,9 atau 100 bakteri setelah
dilakukan uji dilusi selama 24 jam,
dengan cara menghitung jumlah
koloni bakteri pada media padat
menggunakan metode Drop Plate Mills
Mesra. dalam satuan
CFUml colony
forming unitsuspensi
Rasio Kaca pembesar
c. Suspensi F.nucleatum ATCC 25586 UNAIR, Indonesia
d. Media Mueller Hinton Agar Difco, USA
e. NaCl 0,9 1 liter Kimia Farma, Indonesia
3.6.2 Alat Penelitian
a. Lemari pengering
b. Kertas perkamen
c. Aluminium foil 1 gulungan
d. Blender Panasonic, Japan
e. Perkolator
f. Kapas Bio Panca, Indonesia
g. Kertas saring Whatman no.42, England
h. Vaccum Rotary Evaporator Heidolph VV 2000, Germany
i. Erlenmeyer Pyrex, USA
j. Destilator
k. Lemari penyimpan petri
l. Piring petri Pyrex, Japan
m. Inkubator CO
2
Sanyo, Japan n.
Autoklaf Tomy, Japan o.
Electronic Balance Ohyo JP2 6000, Japan p.
Vortexwhirli mixer Iwaki model TM 100, Japan q.
Pipet mikro dan tipsGilson, France r.
Kaca Pembesar Ootsuka ENV-CL, Japan s.
Ose dan spiritus
3.7 Proses Pengambilan dan Pengumpulan Data
3.7.1 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis
Buah manggis diperoleh dengan cara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan sumber lain. Buah manggis diperoleh dari Pasar Buah Brastagi, Medan,
Sumatera Utara dimana asal tumbuh Sibolangit dengan berat 1000 gram. Buah
manggis dikeluarkan dan dibersihkan dari kotoran sehingga yang tersisa kulit buah manggis. Bahan baku berupa kulit buah manggis sebanyak 895 gram dibersihkan dari
kotoran, dicuci bersih, lalu dipotong kira-kira setebal 0,3 mm dan dikeringkan di lemari pengering.
Gambar 6. Buah manggis dikeluarkan dan dibersihkan dari kotoran
Gambar 7. Kulit buah manggis diiris tipis
Gambar 8. Kulit buah manggis yang telah diiris tipis dimasukkan ke lemari pengering
Sampel yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk simplisia dan diambil sebanyak 300 g yang diperkirakan cukup untuk membuat
ekstrak kulit manggis pada pengujian efektivitas antibakteri. Serbuk simplisia kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut
etanol 70. Diaduk sesekali dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Setelah 3 jam, simplisia diperkolasi dengan menggunakan perkolator yang ditutup dengan
aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam. Pada bagian ujung alat perkolator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring.
Gam
bar 9. Kulit buah manggis yang sudah kering dihaluskan
Gambar 10. Simplisia dimaserasi dalam etanol 70 selama 3 jam
Setelah 24 jam, bagian ujung perkolator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetesmenit.
Sampel pada tabung perkolator tetap dijaga dalam kondisi terendam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai
perkolat yang dihasilkan berwarna jernih.
Gambar 11. Penampungan perkolat
Semua perkolat digabung lalu diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan 1 ATM dengan temperatur
≤ 50°C. Prosedur berikutnya dilakukan waterbath untuk memperoleh hasil akhir berupa ekstrak kental kulit buah
manggis.
Gambar 12. Penguapan perkolat dengan menggunakan Vaccum
Rotary Evaporator
Gambar 13. Ekstrak kental kulit
buah manggis
3.7.2 Pengenceran Bahan Coba
Ekstrak kulit manggis ditimbang dengan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan
media Mueller Hinton Broth MHB. Disediakan 7 buah tabung, pada masing-masing tabung diisi 1 ml MHB. Pada tabung pertama diisi 1 gram ekstrak kental kulit
manggis kemudian dicampur dengan menggunakan vorteks sehingga diperoleh ekstrak kulit buah manggis dengan konsentrasi 100. Kemudian dilakukan
pengenceran dengan cara mengambil ½ dari ekstrak kulit buah manggis konsentrasi 100 menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung ke-2 untuk mendapatkan
ekstrak kulit buah manggis 50 pengenceran ganda. Demikian seterusnya sampai tabung-7 sehingga dihasilkan konsentrasi 25, 12,5, 6,25, 3,125, dan 1,5625.
Tabung-tabung tersebut kemudian diberi label sesuai konsentrasinya.
3.7.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media MHA sebanyak 12 gram dilarutkan ke dalam 240 ml aquadest untuk 40 petri 20 mlpetri, lalu dipanaskan di
atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak, disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu
121°C. Setelah disterilkan, media disimpan di dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke
dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
3.7.4 Pembiakan Spesimen
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
. Fusobacterium nucleatum yang digunakan adalah specimen stem cell Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 yang telah dibiakkan secara murni pada
media MHA yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh
dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mac Farland atau sebanding dengan jumlah
bakteri 1 x 10
8
CFUml.
3.7.5 Penentuan KHM bahan coba
Bahan coba ekstrak kulit buah manggis yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 dan 1,5625. Dari masing-masing
konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya diambil 1 ml suspensi
bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label
kemudian divorteks. Lalu tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam pada inkubator CO
2
dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan bantuan spektrofotometer dan membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk
menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu
konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat
pertumbuhan Fusobacterium nucleatum dalam media perbenihan setelah diikubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut.
3.7.6 Penentuan KBM bahan coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah
koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 dan 1,5625 dengan metode Drop Plate Mills Mesra. Setelah itu, bahan coba dengan
konsentrasi tersebut masing- masing divorteks dan diambil 50 μl untuk tiap
konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat Mueller Hinton Agar, direplikasi sebanyak 5 petri, didiamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi
dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37 C selama 24 jam dan media padat akan tumbuh
menjadi 1 koloni bakteri. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan nilai KBM dengan bantuan kaca pembesar. Perhitungannya adalah bila
bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU Colony
Forming Unit ml cairan suspensi. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian
dibuat jumlah rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah
koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri
pada media padat sebanyak 50 μl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml.
3.8 Analisis Data
Data hasil pengujian antibakteri dianalisis dengan memakai uji statistik sebagai berikut :
1. Uji analisis varian satu arah ANOVA, untuk melihat perbedaan efek
antibakteri esktrak etanol kulit buah manggis terhadap pertumbuhan F.nucleatum. 2.
Uji Least Significant Difference LSD, untuk melihat perbedaan efek antibakteri antar masing-masing kelompok perlakuan.
BAB 4 HASIL PENELITIAN
4.1 Ekstraksi Kulit Buah Manggis Garcinia mangostana L
Ekstrak kulit buah manggis berasal dari 300 gram serbuk simplisia yang dilarutkan dengan pelarut etanol 70 kemudian diuapkan dengan vaccum rotary
evaporator dan prosedur water bath sehingga diperoleh ekstrak kental berwarna kuning kecoklatan sebanyak 50 gram. Ekstrak kental dimasukkan ke dalam botol kaca
tertutup dan disimpan dalam lemari pendingin.
Gambar 14. Ekstrak kulit buah manggis
4.2 Uji Efektivitas Antibakteri
Pengujian efektivitas antibakteri bahan coba dilakukan dengan mengamati perubahan kekeruhan pada tiap konsentrasi bahan coba 100, 50, 25, 12,5,
6,25, 3,125, dan 1,5625. Penetapan konsentrasi dilakukan berdasarkan standar Laboratorium Tropical Disease, UNAIR dengan metode dilusi pengenceran ganda.
Pada penentuan KHM yang dilihat adalah tabung perlakuan yang mulai tampak jernih bila dibandingkan dengan kontrol Mac Farland. Dari hasil pengujian
antibakteri ekstrak kulit buah manggis terhadap Fusobacterium nucleatum setelah
Kategori