14
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ini menyebabkan penyakit sistemik progresif pada penderita yang lemah atau kekebalannya tertekan. Candida dapat
menimbulkan invasi dalam aliran darah, tromboflebitis, endokarditis, atau infeksi pada mata dan organ-organ lain
Jawetz et al., 1995.
2.4.3 Metode Pengujian Aktivitas Antimikroba
Pengujian mikrobiologi
memanfaatkan mikroorganisme
sebagai penentu konsentrasi komponen tertentu pada campuran kompleks kimia, untuk mendiagnosis penyakit tertentu, serta untuk
menguji bahan kimia guna menentukan potensi mutagenik atau karsinogenik suatu bahan.
Pada uji ini diukur pertumbuhan mikroorganisme terhadap agen antimikroba. Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu
sistem pengobatan yang efektif dan efisien. Adapun metoda uji antimikroba antara lain sebagai berikut :
1. Metode difusi
a. Metode disc diffusion metode Kirby Bauer untuk menentukan
aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami
mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan
mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar Pratiwi, 2008.
b. Metode E-test digunakan untuk mengestimasi MIC Minimum
Inhibitory Concentration
atau KHM
Kadar Hambat
Minimum, yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Pada
metode ini digunakan strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan diletakkan
pada permukaan
media agar
yang telah
ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang
ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba
15
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar Pratiwi, 2008.
c. Ditch plate technique. Pada metode ini sampel uji berupa agen
antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah
secara membujur dan mikroba uji maksimum 6 macam digoreskan ke arah parit yang berisi agen antimikroba Pratiwi,
2008. d.
Cup-plate technique. Metode ini serupa dengan metode dics diffusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang telah
ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang diuji Pratiwi, 2008.
e. Gradient-plate technique. Pada metode ini konsentrasi agen
antimikroba pada media agar secara teoritis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji
ditambahkan. Campuran kemudian dituang ke dalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua
selanjutnya dituang diatasnya dan diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi dan
permukaan media mengering. Mikroba uji maksimal 6 macam digoreskan pada arah mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah.
Hasil diperhitungkan sebagai panjang total pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin dibandingkan
dengan panjang pertumbuhan hasil goresan. Bila :
X = panjang total pertumbuhan mikroorganisme yang mungkin Y = panjang pertumbuhan aktual
C = konsentrasi final agen antimikroba pada total volume media mgmL atau µgmL,
Maka konsentrasi hambat adalah;
. �
mgmL atau µgmL
16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Yang perlu diperhatikan adalah dari hasil perbandingan yang didapat dari lingkungan padat dan cair, faktor difusi agen
antimikroba dapat mempengaruhi keseluruhan hasil pada media padat Pratiwi, 2008.
2. Metode dilusi
Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu: a.
Metode dilusi cair broth dilution test serial dilution. Metode ini mengukur MIC Minimum Inhibitory Concentration
atau Kadar Hambat Minimum, KHM dan MBC Minimum Bactericidal Concentration atau Kadar Bunuh Minimum,
KBM. Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengeceran agen antimikroba pada medium cair yang
ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya
pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur
ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair
yang tetap terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM Pratiwi, 2008.
b. Metode dilusi padat solid dilution test.
Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat solid. Keuntungan metode ini
adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji Pratiwi, 2008.
3. Uji aktivitas antifungi
Pada uji ini kebutuhan media berbeda dengan menggunakan bakteri. Media yang umum digunakan adalah Sabouraud Dextrose
LiquidSolid, Czapex Dox, dan media khusus fungi lainnya. Uji ini serupa dengan uji untuk bakteri, dimana spora atau miselium fungi
17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dilarutkan pada larutan agen antimikroba uji, dan selanjutnya pada interval waktu tertentu disubkultur pada media yang sesuai. Setelah
diinkubasi, pertumbuhan fungi pun diamati Pratiwi, 2008. 4.
Uji Bioautografi Uji bioautografi merupakan metode spesifik untuk
mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT kromatografi lapis tipis yang memiliki aktivitas antibakteri, antifungi, dan
antivirus. Keuntungan metode ini adalah sifatnya yang efisien untuk mendeteksi adanya senyawa antimikroba karena letak bercak
dapat ditentukan walaupun berada dalam campuran yang kompleks sehingga memungkinkan untuk mengisolasi senyawa aktif tersebut.
Kerugiannya adalah metode ini tidak dapat digunakan untuk menentukan KHM dan KBM.
Ada dua macam metode bioautografi, yaitu : a.
Bioautografi langsung: dengan penyemprotan plat KLT dengan suspensi mikroorganisme atau dengan menyentuhkan plat KLT
pada permukaan media agar yang ditanami mikroorganisme. Setelah inkubasi pada waktu tertentu, letak senyawa aktif
tampak sebagai area jernih dengan latar belakang keruh. b.
Bioautografi overlay: dengan menuangkan media agar yang telah dicampur mikroorganisme diatas permukaan plat KLT,
media ditunggu hingga padat, kemudian diinkubasi. Area hambatan
dilihat dengan
penyemprotan menggunakan
tetrazolium klorida. Senyawa yang aktif sebagai antimikroba akan tampak sebagai area jernih dengan latar belakang ungu
Pratiwi, 2008.
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pharmacy Drugs Research dan Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta. Waktu penelitian dilakukan dari bulan Mei 2012 hingga Januari 2013.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini yaitu timbangan analitik Sartonius CP224S, blender , tanur Thermolyne,
oven Memmert, serangkaian alat rotary evaporator N-1000 EYELA, Spektrofotometer UV-Vis U-2910, Hitachi, gelas ukur
Pyrex, labu ukur Pyrex, beaker gelas Pyrex, cawan petri Pyrex, erlenmeyer Pyrex, cawan penguap, plat tetes, pipet tetes, batang
pengaduk, corong Iwake, botol gelap, botol timbang, spatula, pinset, tabung reaksi, rak tabung reaksi, jarum ose, bunsen, Laminar Air Flow
EACI, refrigerator Sanyo Medicool, hot plate dan magnetic stirrer Daiki KBLee 5001, pipet mikro Epphendorf, vortex Labnet,
autoklaf Tommy, tipe SS-325 dan inkubator Gallenkamp.
3.2.2 Bahan
1. Tanaman uji. Tamanan yang akan digunakan dalam penelitian ini
adalah herba kemangi Ocimum americanum L. yang diperoleh dari perkebunan daerah Grogol, Kecamatan Limo, Depok. Herba
kemangi dipanen pada umur 2 bulan, dengan kondisi tanah gembur, tanpa pestisida dan sistem pengairan menggunakan air
hujan dan air kali di dekat kebun. Tanaman dideterminasi di Herbarium Bogoriense Pusat Penelitian Botani, Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia LIPI, Bogor untuk memastikan bahan
uji yang akan digunakan.
