Waktu dan Tempat Penelitian Analisis Data

28 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian 2, Laboratorium Farmakologi, Laboratorium Kimia Obat, Laboratorium Biokimia, Laboratorium Riset, serta Animal House Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Penelitian berlangsung dari bulan Februari 2015 sampai dengan Juni 2015.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: tissue, pot, gelas ukur, kaca arloji, timbangan analitik AND GH-202, kandang hewan, tempat makan dan minum tikus, timbangan hewan ohauss, sonde, wadah pembiusan, beaker glass, lumpang dan alu, tabung reaksi, spatula, kaca objek, kaca penutup, seperangkat alat bedah, Hemositometer improved neubeur NESCO, mikro pipet Eppendorf research plus, miskroskop motic B1 series, miskroskop optik motic BA310, stirrer homogenizer, dan ELISA reader.

3.2.2 Bahan Penelitian

Bahan uji yang digunakan adalah jus dari bawang putih local Allium sativum L. varietas Lumbu Kuning yang diperoleh dari Kecamatan Tawangmangu, Kabupaten Karang Anyar, Provinsi Jawa Tengah. Bahan uji juga telah dideterminasi di “Herbarium Bogoriense” Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI, Bogor. Bahan kimia yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah pakan tikus pellet, aquadest, suspending agent untuk mensuspensi ekstrak natrium karboksi metil selulosa BLANOSE® 7M1F, analisis kaspase Kit ELISA Casp-3 SUNLONG®, terminasi tikus eter, dan diluen Phosphat Buffer Saline. Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih Rattus norvegicus jantan galur Sprague Dawley berumur 7-8 minggu dengan berat 29 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta badan 250-350 gram yang diperoleh dari peternakan Institut Pertanian Bogor IPB, Bogor.

3.3 Rancangan Penelitian

3.3.1 Besar Sampel

Penelitian ini merupakan eksperimen murni dengan rancangan acak lengkap RAL dengan beberapa kondisi perlakuan. Perlakuan dikelompokkan menjadi 4 bagian dengan 5 ekor tikus putih jantan galur Sprague Dawley dalam setiap kelompok WHO, 2000. Empat kelompok tersebut terdiri dari satu kelompok kontrol dan tiga kelompok yang diberikan serbuk kering bawang putih Allium sativum L. dengan tiga dosis berbeda.

3.3.2 Dosis dan Cara Perlakuan

Dosis pemberian mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Dixit dan Joshi 1982 yaitu 50, 100, dan 150 mgkgBB per hari perhitungan dosis terlampir. Suspensi ekstrak diberikan secara oral menggunakan sonde, pada kelompok kontrol diberikan suspensi Na CMC tanpa kandungan ekstrak. Setiap kali akan diberikan perlakuan, tikus ditimbang terlebih dahulu kemudian dibuat perhitungan dosis sesuai dengan berat badan tikus. Lamanya waktu perlakuan berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Hammami, et al,. 2009, yaitu selama 30 hari.

3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Penyiapan Serbuk

Penyiapan serbuk dilakukan dilakukan di Laboratorium Penelitian II. Sebanayk 1 kg bulbus bawang putih dikupas kulit luarnya, kemudian dibersihkan dari pengotor-pengotornya. Kupasan bulbus bawang putih yang sudah bersih diiris tipis-tipis kemudian didehidrasi menggunakan freeze dry dengan suhu 10 F - 12,2 C dan tekanan 10 Pa. Bawang putih kering hasil freeze dry kemudian dihancurkan. Serbuk yang didapat diayak dengan mesh 30-100. Setelah itu dibuat suspensi dengan dosis yang telah ditentukan Li dan Ying, 2007. 30 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.2 Penapisan Fitokimia

Seluruh proses penapisan fitokimia dilakukan di Labortorium Kimia Obat.  Identifikasi Alkaloid Potong-potong 2-4 gr material tumbuhan yang telah bersih masukkan ke dalam mortar, tambahkan kloroform dan pasir bersih secukupnya, kemudian gerus. Tambahkan 10 mL kloroform amoniakal dan diaduk rata. Campuran dipindahkan ke dalam tabung reaksi dengan cara menyaringnya menggunakan kasa. Selanjutnya tambahkan 0,5 ml 1M asam sulfat dan kocok baik-baik, diamkan beberapa saat. Pipet lapisan jernih yang terbentuk ke dalam 2 tabung reaksi kecil. Satu tabung ditambahkan pereaksi Dragendorff dan tabung lainnya perekasi Mayer 2-3 tetes. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan jingga dengan pereaksi Dragendorff dan endapan putih dengan pereaksi Mayer, sebagai berikut: + : sedikit keruh ++ : sangat keruh +++ : terjadi endapan. Chairul, 2003  Identifikasi Saponin Frothing test Pengujian dilakukan dengan memasukkan 0,5 ml filtrate ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan dengan 5 ml aquades. Kocok selama 30 detik. Adanya busabuih yang menetap mengindikasikan adanya saponin Evans, 1996  Identifikasi Steroid Pada uji dengan menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard, steroid menunjukkan warna biru kehijauan sedangkan triterpenoid menunjukkan warna merah, merah muda, atau ungu. Namun pada saat pengujian dilapangan baik secara langsung pada simplisia maupun pada ekstrak terdapat variasi warna yang dihasilkan, tergantung pada cara bagaimana pengujian tersebut dilakukan Farnsworth, 1966. 31 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta  Identifikasi Flavonoid Ekstrak lebih kurang 10 g material dengan etanol 80, saring dan keringkan di atas penangas air. Kemudian lemaknya dihilangkan dengan pencucian heksan beberapa kali sehingga warna pigmen hilang atau larutan heksan tidak berwarna lagi. Panaskan residu bebas lemak untuk memindahkan sisa heksana. Tambahkan residu dengan 20 ml etanol dan pindahkan masing-masing 10 ml ke dalam 2 tabung reaksi. Setiap tabung reaksi ditambahkan 0,5 ml asam klorida pekat dan dilakukan uji dengan pereaksi Wilstater Chairul, 2003. Salah satu tabung reaksi yang telah berisi asam klorida pekat ditambahkan 3-4 butir logam magnesium Mg. amati perubahan warna yang terjadi dalam 10 menit. Apabila terbentuk warna, diencerkan dengan air secukupnya dan tambahkan 1 ml oktil alcohol.kocok kuat- kuat kemudian diamkan. Amati perubahan warna pada masing0masing pelarut. Apabila terjadi pembentukan atau perubahan warna menunjukkan reaksi positif terhadap flavonoid Chairul, 2003.  Identifikasi Tannin Timbang 2 mg serbuk bawang putih, tambahkan aquades 10 ml, kemudian saring. Masukkan 2 ml filtrate ke dalam tabung reaksi, tambahkan 1 ml FeCl 3 . Adanya endapan biru kehijauan mengindikasikan adanya tannin Evans, 1996.  Identifikasi Minyak Atsiri Identifikasi minyak atsiri dilakukan secara kualitatif dengan mencium bau dari serbuk. Adanya bau khas aromatic bawang putih menandakan adanya minyak atsiri Evans, 1996. 32 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.4.3 Parameter Spesifik dan Non-spesifik 3.4.3.1 Parameter Spesifik  Identitas ekstrak: nama ekstrak generic, dagang, paten, nama latin tumbuhan sistematika botani, bagian tumbuhan yang digunakan, dan nama Indonesia tumbuhan. Depkes RI, 2000  Organoleptik: bentuk padat, serbuk kering, kental, cair, warna kuning, coklat, dll., bau aromatik, tidak berbau, dll., dan rasa pahit, manis, kelat, dll. Depkes RI, 2000

3.4.3.2 Parameter Non-spesifik

 Susut Pengeringan Ekstrak ditimbang secara seksama sebanyak 1 g sampai 2 g dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105 C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang, ekstrak diratakan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm. Jika ekstrak yang diuji berupa ekstrak kental, ratakan dengan batang pengaduk. Kemudian dimasukkan kedalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105 C hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam desikator hingga suhu kamar. Jika ekstrak sulit kering dan mencair pada pemanasan, ditambahkan 1g silica pengering yang telah ditimbang secara seksama, setelah dikeringkan dan disimpan dalam desikator pada suhu kamar. Campurkan silica tersebut secara rata dengan ekstrak pada saat panas, kemudian keringkan kembali pada suhu penetapan hingga bobot tetap. Depkes RI, 2000  Kadar Air Penentuann kadar air dari ekstrak yang mengandung senyawa menguap menggunakan metode destilasi azeotrop. Ppelarut yang digunakan adalah pelarut immiscible, dalam penelitian ini digunakan toluene 200 ml. Siapkan rangkaian alat destilasi, masukkan toluene 33 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta serta 2 ml aquadest ke dalam labu didih, lalu tambahkan beberapa batu didih di dalamnya. Setelah aquades dan sebagian toluene berpindah ke tabung pengumpul, masukkan 10 mg serbuk bawang putih yang telah ditimbang secara seksama. Setelah tinggi air pada tabung pengumpul tidak berubah, hitung kenaikan air yang terjadi Depkes RI, 2000.  Kadar Abu Lebih kurang 2 g sampai 3 g serbuk yang telah ditimbang secara seksama dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, ratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, timbang. Jika cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas lalu saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa kertas saring dalam krus yang sama. Masukkan filtrate ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara. Depkes RI, 2000

3.4.4 Penyiapan Hewan Uji

Hewan Uji yang di gunakan adalah tikus putih jantan galur Sprague Dawley berumur 7-8 minggu dengan berat badan 200-350 gram diaklimatisasi selama dua minggu agar dapat menyesuaikan dengan lingkungannya. Selama proses adaptasi, dilakukan pengamatan kondisi umum dan penimbangan berat badan.

3.4.5 Terminasi dan Pengukuran Parameter

Seluruh kelompok sampel tikus jantan putih galur Sprague Dawley diterminasi pada hari ke-30 dengan cara dimasukkan ke dalam toples yang telah dijenuhkan dengan uap eter, kemudian dibedah untuk diambil testis kanan dan kiri dan kauda epididimis. Masing-masing testis kanan dan kiri ditimbang kemudian disimpan dalam lemari pendingin hingga saat dilakukannya pengujian.

3.4.5.1 Uji Motilitas Sperma

Pengambilan spermatozoa pada epididimis kauda dengan metode cacah dan menggunakan pengenceran dengan garam fisiologis sebesar 1 ml. Untuk 34 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pengamatan motilitas spermatozoa dapat dilakukan dengan mengamati spermatozoa yang telah ditetesi ke bilik hitung Neubauer dengan perbesaran 400 kali. Motilitas sperma ditentukan dari 100 spermatozoa dalam satu lapang pandang. Motilitas spermatozoa dinilai berdasarkan persen spermatozoa dengan motilitas baik, yaitu spermatozoa yang bergerak lurus ke depan, cepat, lincah dan aktif Kaspul, 2004.

3.4.5.2 Analisis Protein Kaspase-3 dengan Kit ELISA Pembuatan Homogenat

Siapkan potongan 50 mg jaringan testis masing-masing diambil dari testis kanan dan testis kiri tikus, kemudian dimasukkan ke dalam satu tube. Tambahkan Phosphate Buffer Saline PBS dengan pH 7 sebanyak 1 mL lalu homogenasi. segera lakukan pengujian atau simpan dalam lemari pendingin pada suhu 4 C sampai siap digunakan. Pembuatan Standar Sentrifugasi vial standar pada 6000-10000 rpm selama 30 detik. Rekonstitusi standar dengan 1 mL sampel diluen, pastikan tercampur dengan baik. Pipet 250 µl sampel diluen ke dalam masing-masing tube S0-S6. Buat seri pengenceran dengan menambahkan 250 µl larutan standard yang telah direkonstitusi ke dalam tube S6 yang telah berisi diluen, homogenkan. Lakukan pengenceran dari tube S6 ke tube selanjutnya hingga tube S1. Tube S0 berisi sampel diluen tanpa standard yang bertindak sebagai blanko. Analisis Protein Kaspase-3 Siapkan reagen, sampel dan standar. Sampel homogenate yang telah dibuat dimasukkan ke dalam mikroplate sebanyak 100 µL. Inkubasi dalam oven selama 2 jam dengan suhu 37 C. Setelah inkubasi, buang cairan dalam well tanpa pencucian. Selanjutnya, tambahkan 100 µL biotin anti bodi ke dalam setiap well. Tutup well menggunakan strip perekat kemudian inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 C. Lakukan pencucian menggunakan wash buffer hingga 3x pengulangan. 35 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Pada pencucian terakhir, hilangkan semua wash buffer yang tersisa dengan dekantasi. Letakkan tube secara terbalik diatas tissue bersih. Tambahkan 100 µL HRP-avidin ke dalam setiap well. Tutup mikroplate menggunakan strip perekat baru, lalu inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 C. Lakukan pencucian seperti pada langkah sebelumnya, lakukan hingga 5x pengulangan. Setelah pencucian terakhir, tambahkan 50 µL TMB substrat ke dalam setiap well, inkubasi selama 15-30 menit dan pastikan terlindung dari cahaya. Selanjutnya, tambahkan 50 µ L Stop solution ke dalam setiap well, ketuk- ketuk tube perlahan untuk memastikan tercampur dengan baik. Tahap terakhir adalah menentukan optical density setiap well dengan menggunakan ELISA reader yang diatur pada panjang gelombang 450 nm.

3.5 Analisis Data

Hasil penelitian yang diperoleh diolah dengan menggunakan program pengolahan data statistik SPPS 20 yang meliputi uji normalitas, uji homogenitas menggunakan ANOVA karena dalam penelitian dilakukan lebih dari 2 perlakuan. Uji parametrik one way ANOVA dilakukan apabila distribusi normal dan homogen, sedangkan uji non parametrik Kruskal Wallis dilakukan apabila distribusi tidak normal atau tidak homogeny . Jika hasil dari uji ANOVA maupun Kruskal Wallis menunjukkan perbedaan yang signifikan p ˂ 0,05 maka analisis data dilanjutkan dengan menggunakan uji Multiple Comparisons tipe LSD Least Significant Difference. 36 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.1.1 Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman uji adalah benar tanaman bawang putih Allium Sativum L. suku Amaryllidaceae. Surat pernyataan hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 1.

4.1.2 Pembuatan Serbuk

Sebanyak 1 kg bawang putih Allium Sativum L. dikupas dan dibersihkan, lalu dihaluskan menggunakan blender hingga membentuk bubur halus dan kental puree. Bubur bawang putih Allium Sativum L. yang didapat kemudian di- freeze dry dengan tekanan 10 Pa dan suhu 10 F -12,2 C hingga mengering. Hasil freeze dry dihaluskan kembali menggunakan lumpang dan alu, dan didapatkan 800 gram serbuk bawang putih.

4.1.3 Penapisan Fitokimia

Hasil penapisan fitokimia terhadap serbuk bawang putih Allium Sativum L. dapat dilihat pada tabel 4.1 Tabel 4.1 Penapisan Fitokimia Serbuk Bawang Putih Allium sativum L. Golongan Senyawa Hasil Keterangan Alkaloid + Meyer: putih; Bouchard: coklat-hitam; Dragendorf: merah-jingga. Flavonoid - Tidak terbentuk warna kuning intens Saponin + Terbentuk busa yang stabil Steroid + Terbentuk warna merah Tanin - Tidak terbentuk warna hijaubiruungu Terpenoid + Terbentuk warna jingga pada interfase Minyak Atsiri + Terciumnya bau khas aromatik dari serbuk bawang putih uji kualitatif. Keterangan : + memberikan hasil positif, - memberikan hasil negatif.