14 kemudian didinginkan di atas es. Larutan RNA dipindahkan ke dalam tabung
berisi kit sintesis cDNA, dan ditambahkan 1 µg primer dT3’RACE-VECT 5’-GTAATACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGTT
TTTTTTTTTTTTTTTTT-’. Larutan dihomogenkan, dan diinkubasi pada suhu 37
o
3.4.3 PCR dan Kuantifikasi Ekspresi Gen IGF-I
C selama 1 jam. cDNA yang terbentuk ditambahkan 30 µL SDW steril, dan disimpan dalam refrigerator hingga akan digunakan.
Ekspresi gen IGF-I dideteksi dengan menggunakan teknik RT-PCR menggunakan primer F 5’-TTCAAGAGTGTCATGTGCTGTA-3’
dan R 5’-CATAGCCTGTTGGTTTACTGAA-3’ Irmawati, komunikasi pribadi.
Kontrol int
ernal menggunakan gen β-aktin. Gen β-aktin dilacak dengan
menggunakan metode RT-PCR dengan primer F 5’-AACCATGGATGATGAA ATCGCCGCA-3’ dan R 5’-TGATGCCTGGGGCGA-CCGACGATGG-3’
Irmawati, komunikasi pribadi. PCR gen IGF-I dilakukan dengan program: 94
o
C selama 1 menit; 94
o
C selama 30 detik; 57
o
C selama 30 detik; 72
o
C selama 30 detik sebanyak 35 siklus; 72
o
C selama 1 menit; dan 4
o
C tak hingga. PCR gen β-aktin dilakukan dengan program: 94
o
C selama 1 menit; 94
o
C selama 30 detik; 59
o
C selama 30 detik; 72
o
C selama 30 detik sebanyak 30 siklus; 72
o
C selama 1 menit; dan 4
o
3.5 Analisis Kadar Hormon Kortisol
C tak hingga. Pengecekan hasil amplifikasi PCR dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose 1. Pengukuran level ekspresi
gen IGF-I dilakukan dengan mengukur ketebalan pita DNA hasil elektroforesis menggunakan program UN-SCAN-IT gel 6.1. Hasil pengukuran level ekspresi
gen IGF-I dibandingkan dengan gen beta aktin yang berfungsi sebagai kontrol loading RNA dalam sintesis cDNA.
Sampel ikan dikumpulkan 1 menit setelah peredaman HPr, dilanjutkan pada jam ke-0, 3, 6, 9, 12, 24, dan 36. Sebagai kontrol, ikan dikumpulkan
sebelum, dan sesaat setelah diberi kejutan salinitas. Benih ikan gurami sebanyak 2 g diambil, digerus menjadi halus, lalu ditambahkan 10 mL dietil eter, dan
diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang. Ke dalam tabung ditambahkan PBS 0,5 mL, dihomogenasi dengan vorteks selama 30 detik, dan selanjutnya
15 disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk
dipindahkan ke dalam tabung baru, dan disimpan pada suhu -20
o
C hingga akan digunakan. Pengukuran RIA radioimmunoassay dilakukan untuk mengetahui
kadar hormon kortisol menggunakan Ria Kit Kortisol [
125
3.6 Analisis Data
I] Institute of Isotopes Ltd, Budapest dengan prosedur sesuai manual.
Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan sidik ragam pada tingkat kepercayaan 95, dan dilanjutkan dengan uji Duncan untuk melihat
pengaruh antar perlakuan terhadap masing-masing parameter yang diuji. Analisis data menggunakan piranti lunak SPSS ver. 17.00.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Ekspresi dan Analisis Protein Hormon Pertumbuhan Rekombinan
Berdasarkan hasil analisis SDS-PAGE Gambar 1, terdapat pita yang muncul pada posisi sekitar 21 kDa yang merupakan protein hormon pertumbuhan
rekombinan. Panjang fragmen DNA gen HP dalam konstruksi adalah 563 bp. Di bagian depan sekuen gen HP terdapat fragmen 65 bp, total sekuen DNA yang
menyandikan asam amino adalah menjadi 633 bp, sehingga ukuran protein yang dihasilkan adalah sekitar 21 kDA. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa
protein HPr telah berhasil diproduksi.
Gambar 1 Analisis SDS-PAGE protein HPr; M= marker, 1= protein dari
bakteri Escherichia coli BL21 yang membawa plasmid C-mOgGH; 2= protein dari bakteri Escherichia coli BL21 yang membawa
plasmid C-mCcGH tanda panah menunjukkan protein HPr; angka di sebelah kiri menunjukkan ukuran marker M.
30
25 kDA
M 2
1
HPr
