Prinsip Kerja Pembekuan Embrio
PRlNSlP KERJA PEMBEKUAN
SULAXONO HAD1
B 19.1338
FAKULT'AS KEDOKTERAN HEWAN
1NSTlf Uf PERTANIAN BOGOR
1 9 8 8
SULAXONO HADI.
P r i n s i p K e r j a Pembekuan Embrio (Dibawah
bimbingan Soebadi P a r t o d i h a r d j o dan Iman S u p r i a t n a ) .
Berbagai usaha dilakukan manusia untuk mendapatkan
mutu g e n e t i k t e r n a k yang dikehendaki s e k a l i g u s melipatgandakan dan menyebarkannya dengan mudah s e r t a e f i s i e n .
Sa-
l a h s a t u t e k n o l o g i yang mempunyai p o t e n s i untuk i n i a d a l a h
t r a n s f e r embrio.
Melalui berbagai p e n e l i t i a n , t e k n i k i n i
t e l a h mengalami penyempurnaan-penyempurnaan.
Untuk dapat m e l e s t a r i k a n kehidupan embrio d i l u a r
tubuh induk, mudah dibawanya d a r i satu tempat ke tempat
l a i n dengan aman dan dapat d i t r a n s f e r ke r e s i p i e n s e t i a p
saat maka diperlukan t e k n i k penyimpanannya yang r e v e r s i - .
bel.
2ada saat i n i yang t e r b a i k y a i t u pembekuan.
Ada beberapa ha1 yang p e r l u mendapat p e r h a t i a n ka-
r e n a biasanya merupakan kendala dalam melakukan t e k n i k
i n i y a i t u k r i o p r o t e k t a n yang digunakan dalam medium, emb r i o yang dibekukan dan prosedur pembekuannya.
Medium
yang umum digunakan a d a l a h garam b u f f e r f o s f a t Dulbecco
yang t e l a h diperkaya, sedangkan untuk krioprotektannya
a d a l a h g l i s e r o l dan DMSO.
Embrio yang t e r b a i k untuk di-
bekukan a d a l a h a d a l a h tahap morula hingga b l a s t o s i s dan
memilikl k l a s i f i k a s i k w a l i t a s yang t e r b a i k .
Embrio da-
p a t d i e q u i l i b r a s i k a n dalam medium k r i o p r o t e k t a n pada temp e r a t u r t e r t e n t u (suhu tubuh, suhu ruang, suhu pendingin
pada l e m a r i e s ataupun O'C) s e s u a i dengan metoda yang d i pakai.
Penambahan medium k r i o p r o t e k t a n d a p a t d i l a k u k a n
l a n g s u n g ( d i r e c t ) maupun t i d a k l a n g s u n g ( i n d i r e c t ) y a i t u
s e c a r a b e r t a h a p untuk menghindarkan kerusakan pada embrio
yang disebabkan perbedaan tekanan osmotik yang besar.
K o n s e n t r a s i k r i o p r o t e k t a n yang b a i k dan ekonomis a d a l a h
1 , O M untuk g l i s e r o l dan
1 , 5 M untuk DMSO.
Prosedur pembekuan dengan p r o s e s l l c e p a t l lmemungkinkan p e n c a i r a n (thawing) embrio yang t e l a h dibekukan d a p a t
d i l a k u k a n menggunakan a i r bersuhu 25-37'~.
Exosmose Isrio-
p r o t e k t a n d a r i h a s i l p e n c a i r a n embrio beku i n i d a p a t d i l a kukan menggunakan sukrosa.
Sukrosa d a p a t dimasukkan ke da-
l a m s t r a w pengemas ernbrio.
Dengan demikian p e n c a i r a n em-
b r i o beku dan exosmose k r i o p r o t e k t a n d a p a t dilakukan sekal i g u s s a t u t a h a p (one s t e p method) dalam straw.
Hasil-ha-
s i l p e n e l i t i a n i n i memungkinkan t r a n s f e r embrio dapat d i l a kukan s e p e r t i c a r a yang digunakan dalam t e k n i k i n s e m i n a s i
b u a t a n menggunakan semen beku.
PRINSIP KERJA PEMBMUAN EMBRIO
Oleh
SULAXONO BAD1
Sarjana Kedokteran Bewan (1987)
Menyetujui
prof. 6 h . SOEBADI PARTODIHARDJO, M. Sc
--
-
Pembimbing Utama
DR. IMAN SUPRIATNA
Pembimbing Pembantu
,JC agustus 1988
., Ph.D.
PRINSLP KERJA PEMBEKUAN EMBRIO
SKRIPSI
Sebagai s a l a h s a t u s y a r a t untuk memperoleh gelar
Dokt e r Hewan
pada
F a k u l t a s Kedokteran Hewan
I n s t i t u t P e r t a n i a n Bogor
Oleh
SULAXONO BAD1
B19.1338
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWBN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1988
KATA PENGANTAR
P u j i dan syukur p e n u l i s p a n j a t k a n k e h a d i r a t Tuhan
Yang Maha Pengasih dan Penyayang yang t e l a h melimpahkan
rahmat-Nya hingga p e n u l i s d a p a t n e n y e l e s a i k a n s k r i p s i i n i .
S k r i p s i i n i d i t u l i s s e b a g a i s a l a h s a t u s y a r a t dalam
upaya memperoleh g e l a r Dokter Hewan d a r i F a k u l t a s Kedoktera n Rewan, I n s t i t u t P e r t a n i a n Bogor, dan d i s u s u n b e r d a s a r kan h a s i l s t u d i l i t e r a t u r .
S e c a r a khusus p e n u l i s menghaturkan t e r i m a k a s i h kepada Bapak Prof.Drh.
SOEBADI PARTODIHARDJO, M.Sc.,
Ph.D.
dan Bapak DR. IMAN SUPRIATNA yang t e l a h dengan i k h l a s meluangkan waktunya membimbing kami dalam menyelesaikan
skripsi ini.
Terimakasih pula p e n u l i s sampaikan kepada s e l u r u h
s t a f PT Dos k'i Roha, s t a f J u r u s a n Reproduksi dan Kebidanan
FYJI-IPB, s t a f perpustakaan IPB, s t a f Perpustakaan B a l a i Pen e l i t i a n Ternak Ciawi, s t a f P u s a t Perpustakaan B i o l o g i dan
P e r t a n i a n Deptan, s t a f P e r p u s t a k a a n B a l a i P e n e l i t i a n Veter i n e r a t a s s e g a l a bantuannya.
Akhirnya p e n u l i s menyadari bahwa s k r i p s i i n i masih
jauh d a r i sempurna, namun demikian p n u l i s b e r h a r a p mudahmudahan bermanfaat b a g i para pembaca.
Bogor, Maret 1988
Penulis
DAFTAR I S 1
RINGKASAN
........................................... iii
KATA PENGANTAR
DAFTAR TABEL
...................................... vi
........................................
viii
....................................... i x
BAB I. PENDAHULUAN ................................. 1
DAFTAR GAMBAR
BAB I1
.
TINJAUAN PUSTAKA
3
2.1.
...........................
P r i n s i p d a s a r pembekuan ..............
3
2.2.
Peranan k r i o p r o t e k t a n selama pembekuan
2.3.
.................................
6
V a r i a b e l yang mempengaruhi v i a b i l i t a s
s e l selama pembekuan
................. 8
............. 13
2.4.
Penyediaan k r i o p r o t e k t a n
2.5.
K l a s i f i k a s i embrio yang akan dibeku-
.................................. 15
P r o s e d u r pembekuan ................... 24
kan
2.6.
BAB I11
.
PD4BAHASAN
................................ 30
................................. 35
DAFTAR PUSTAKA ...................................... 36
BAB I V
.
KESIMPULAN
Nomor
Halaman
Teks
-
1.
2.
3.
4.
........ 1 4
K e s e t a r a a n a n t a r a b e r a t den volume k r i o p r o t e k t a n ...................................... 1 4
Tahap perkembangan embrio d i k a i t k a n dengan
waktu s e t e l a h o v u l a s i ....................... 1 6
H a r i pengkoleksian, t i n g k a t kebuntingan dan
k w a l i t a s embrio .............................
P e n g u j i a n u l a n g embrio s a p i s e t e l a h dibelrukan ......................................... 23
K a r a k t e r i s t i k beberapa k r i o p r o t e k t a n
21
5.
6.
P r o s e s rllambat'f dalam pembekuan embrio
...... 29
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Nomor
Teks
...............................
1.
Embrio s a p i
2.
Perbandingan a n t a r a t i n & a t k e b u n t i n g a n dan
d i s t r i b u s i frekviensi tahapan embrio
.......
3.
Embrio s a p i dengan zona p e l l u c i d a u t u h yamg
dikoleksi 7 hari setelah estrus
4.
B l a s t o s i s sapi 8 h a r i s e t e l a h inseminasi
5.
Embrio dalam s t r a w d i s e r t a i s u k r o s a s e b a g a i
medium k r i o p r o t e k t a n
6.
Hasil perekaman suhu contoh medium yang di-
...........
..
......................
bekukan dalam bak pembekuan dengan k e c e p a t -
............................
an 0 , 5 ~ ~ / m e n i t
7.
P r o s e s "cepat" dalam pembekuan embrio
.....
18
31
yang berbeda jika krioprotektan yang digunakan berlainan.
DMSO merupakan krioprotektan yang mempunyai daya pelin dung yang 1ebih baik dibanding glisero1 (Whittingham et
al., 1972), tetapi Bilton et al. (1976, 1977, 1979) dapat
membuktikan bahwa gliserol 1,0 M merupakan krioprotektan
yang 1ebih baik dibanding DMSO 1,5 M.
Kasai et a1. (1981)
memperkuat hasil penelitian ahli terakhir tersebut dan meｮｵｪｾ｡＠
bahwa glisero1 maupun eti1en gliko1 merupakan
krioprotektan yang terbaik dibanding DMSO, dimeti1formamida, sukrosa maupun eritritol.
Terdapat suatu hubungan an tara kecepatan pembekuan
dengan konsentrasi krioprotektan yang digunakan.
Pada pem-
bekuan 1ambat konsentrasi DMSO yang efektif berkisar antara
1,0-1,5 M (Whittingham et a1., 1972), sedang untuk pembekuan cepat berkisar antara 1,5-2,0 M (Kasai et a1., 1980).
Whittingham (1975) membuktikan bahwa untuk pembekuan lambat
maka konsentrasi DMSO yang paling efektif adalah 1,5 M, sedangkan menurut Vfuittingham et a1. (1976) da1am DMSO 1,5 M
kecepatan pembekuan yang efektif berkisar O,18-0,30 oe/menit.
Da1am penggunaannya, krioprotektan bisa ditambahkan
ke da1am medium pada suhu oOe atau 1ebih (Whittingham, 1974).
SUhUi penambahan krioprotektan ini dapat mempengaruhi viabilitas embrio (Supriatna, 1987).
Sesuai dengan krioprotektan_
yang digunakan, embrio akan ter1indung dengan baik dari pengaruh pembekuan yang merugikan jika berada dalam krioprotektan untuk beberapa saat 1amanya sete1ah penambahan, dan
PRlNSlP KERJA PEMBEKUAN
SULAXONO HAD1
B 19.1338
FAKULT'AS KEDOKTERAN HEWAN
1NSTlf Uf PERTANIAN BOGOR
1 9 8 8
SULAXONO HADI.
P r i n s i p K e r j a Pembekuan Embrio (Dibawah
bimbingan Soebadi P a r t o d i h a r d j o dan Iman S u p r i a t n a ) .
Berbagai usaha dilakukan manusia untuk mendapatkan
mutu g e n e t i k t e r n a k yang dikehendaki s e k a l i g u s melipatgandakan dan menyebarkannya dengan mudah s e r t a e f i s i e n .
Sa-
l a h s a t u t e k n o l o g i yang mempunyai p o t e n s i untuk i n i a d a l a h
t r a n s f e r embrio.
Melalui berbagai p e n e l i t i a n , t e k n i k i n i
t e l a h mengalami penyempurnaan-penyempurnaan.
Untuk dapat m e l e s t a r i k a n kehidupan embrio d i l u a r
tubuh induk, mudah dibawanya d a r i satu tempat ke tempat
l a i n dengan aman dan dapat d i t r a n s f e r ke r e s i p i e n s e t i a p
saat maka diperlukan t e k n i k penyimpanannya yang r e v e r s i - .
bel.
2ada saat i n i yang t e r b a i k y a i t u pembekuan.
Ada beberapa ha1 yang p e r l u mendapat p e r h a t i a n ka-
r e n a biasanya merupakan kendala dalam melakukan t e k n i k
i n i y a i t u k r i o p r o t e k t a n yang digunakan dalam medium, emb r i o yang dibekukan dan prosedur pembekuannya.
Medium
yang umum digunakan a d a l a h garam b u f f e r f o s f a t Dulbecco
yang t e l a h diperkaya, sedangkan untuk krioprotektannya
a d a l a h g l i s e r o l dan DMSO.
Embrio yang t e r b a i k untuk di-
bekukan a d a l a h a d a l a h tahap morula hingga b l a s t o s i s dan
memilikl k l a s i f i k a s i k w a l i t a s yang t e r b a i k .
Embrio da-
p a t d i e q u i l i b r a s i k a n dalam medium k r i o p r o t e k t a n pada temp e r a t u r t e r t e n t u (suhu tubuh, suhu ruang, suhu pendingin
pada l e m a r i e s ataupun O'C) s e s u a i dengan metoda yang d i pakai.
Penambahan medium k r i o p r o t e k t a n d a p a t d i l a k u k a n
l a n g s u n g ( d i r e c t ) maupun t i d a k l a n g s u n g ( i n d i r e c t ) y a i t u
s e c a r a b e r t a h a p untuk menghindarkan kerusakan pada embrio
yang disebabkan perbedaan tekanan osmotik yang besar.
K o n s e n t r a s i k r i o p r o t e k t a n yang b a i k dan ekonomis a d a l a h
1 , O M untuk g l i s e r o l dan
1 , 5 M untuk DMSO.
Prosedur pembekuan dengan p r o s e s l l c e p a t l lmemungkinkan p e n c a i r a n (thawing) embrio yang t e l a h dibekukan d a p a t
d i l a k u k a n menggunakan a i r bersuhu 25-37'~.
Exosmose Isrio-
p r o t e k t a n d a r i h a s i l p e n c a i r a n embrio beku i n i d a p a t d i l a kukan menggunakan sukrosa.
Sukrosa d a p a t dimasukkan ke da-
l a m s t r a w pengemas ernbrio.
Dengan demikian p e n c a i r a n em-
b r i o beku dan exosmose k r i o p r o t e k t a n d a p a t dilakukan sekal i g u s s a t u t a h a p (one s t e p method) dalam straw.
Hasil-ha-
s i l p e n e l i t i a n i n i memungkinkan t r a n s f e r embrio dapat d i l a kukan s e p e r t i c a r a yang digunakan dalam t e k n i k i n s e m i n a s i
b u a t a n menggunakan semen beku.
PRINSIP KERJA PEMBMUAN EMBRIO
Oleh
SULAXONO BAD1
Sarjana Kedokteran Bewan (1987)
Menyetujui
prof. 6 h . SOEBADI PARTODIHARDJO, M. Sc
--
-
Pembimbing Utama
DR. IMAN SUPRIATNA
Pembimbing Pembantu
,JC agustus 1988
., Ph.D.
PRINSLP KERJA PEMBEKUAN EMBRIO
SKRIPSI
Sebagai s a l a h s a t u s y a r a t untuk memperoleh gelar
Dokt e r Hewan
pada
F a k u l t a s Kedokteran Hewan
I n s t i t u t P e r t a n i a n Bogor
Oleh
SULAXONO BAD1
B19.1338
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWBN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1988
KATA PENGANTAR
P u j i dan syukur p e n u l i s p a n j a t k a n k e h a d i r a t Tuhan
Yang Maha Pengasih dan Penyayang yang t e l a h melimpahkan
rahmat-Nya hingga p e n u l i s d a p a t n e n y e l e s a i k a n s k r i p s i i n i .
S k r i p s i i n i d i t u l i s s e b a g a i s a l a h s a t u s y a r a t dalam
upaya memperoleh g e l a r Dokter Hewan d a r i F a k u l t a s Kedoktera n Rewan, I n s t i t u t P e r t a n i a n Bogor, dan d i s u s u n b e r d a s a r kan h a s i l s t u d i l i t e r a t u r .
S e c a r a khusus p e n u l i s menghaturkan t e r i m a k a s i h kepada Bapak Prof.Drh.
SOEBADI PARTODIHARDJO, M.Sc.,
Ph.D.
dan Bapak DR. IMAN SUPRIATNA yang t e l a h dengan i k h l a s meluangkan waktunya membimbing kami dalam menyelesaikan
skripsi ini.
Terimakasih pula p e n u l i s sampaikan kepada s e l u r u h
s t a f PT Dos k'i Roha, s t a f J u r u s a n Reproduksi dan Kebidanan
FYJI-IPB, s t a f perpustakaan IPB, s t a f Perpustakaan B a l a i Pen e l i t i a n Ternak Ciawi, s t a f P u s a t Perpustakaan B i o l o g i dan
P e r t a n i a n Deptan, s t a f P e r p u s t a k a a n B a l a i P e n e l i t i a n Veter i n e r a t a s s e g a l a bantuannya.
Akhirnya p e n u l i s menyadari bahwa s k r i p s i i n i masih
jauh d a r i sempurna, namun demikian p n u l i s b e r h a r a p mudahmudahan bermanfaat b a g i para pembaca.
Bogor, Maret 1988
Penulis
DAFTAR I S 1
RINGKASAN
........................................... iii
KATA PENGANTAR
DAFTAR TABEL
...................................... vi
........................................
viii
....................................... i x
BAB I. PENDAHULUAN ................................. 1
DAFTAR GAMBAR
BAB I1
.
TINJAUAN PUSTAKA
3
2.1.
...........................
P r i n s i p d a s a r pembekuan ..............
3
2.2.
Peranan k r i o p r o t e k t a n selama pembekuan
2.3.
.................................
6
V a r i a b e l yang mempengaruhi v i a b i l i t a s
s e l selama pembekuan
................. 8
............. 13
2.4.
Penyediaan k r i o p r o t e k t a n
2.5.
K l a s i f i k a s i embrio yang akan dibeku-
.................................. 15
P r o s e d u r pembekuan ................... 24
kan
2.6.
BAB I11
.
PD4BAHASAN
................................ 30
................................. 35
DAFTAR PUSTAKA ...................................... 36
BAB I V
.
KESIMPULAN
Nomor
Halaman
Teks
-
1.
2.
3.
4.
........ 1 4
K e s e t a r a a n a n t a r a b e r a t den volume k r i o p r o t e k t a n ...................................... 1 4
Tahap perkembangan embrio d i k a i t k a n dengan
waktu s e t e l a h o v u l a s i ....................... 1 6
H a r i pengkoleksian, t i n g k a t kebuntingan dan
k w a l i t a s embrio .............................
P e n g u j i a n u l a n g embrio s a p i s e t e l a h dibelrukan ......................................... 23
K a r a k t e r i s t i k beberapa k r i o p r o t e k t a n
21
5.
6.
P r o s e s rllambat'f dalam pembekuan embrio
...... 29
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Nomor
Teks
...............................
1.
Embrio s a p i
2.
Perbandingan a n t a r a t i n & a t k e b u n t i n g a n dan
d i s t r i b u s i frekviensi tahapan embrio
.......
3.
Embrio s a p i dengan zona p e l l u c i d a u t u h yamg
dikoleksi 7 hari setelah estrus
4.
B l a s t o s i s sapi 8 h a r i s e t e l a h inseminasi
5.
Embrio dalam s t r a w d i s e r t a i s u k r o s a s e b a g a i
medium k r i o p r o t e k t a n
6.
Hasil perekaman suhu contoh medium yang di-
...........
..
......................
bekukan dalam bak pembekuan dengan k e c e p a t -
............................
an 0 , 5 ~ ~ / m e n i t
7.
P r o s e s "cepat" dalam pembekuan embrio
.....
18
SULAXONO HAD1
B 19.1338
FAKULT'AS KEDOKTERAN HEWAN
1NSTlf Uf PERTANIAN BOGOR
1 9 8 8
SULAXONO HADI.
P r i n s i p K e r j a Pembekuan Embrio (Dibawah
bimbingan Soebadi P a r t o d i h a r d j o dan Iman S u p r i a t n a ) .
Berbagai usaha dilakukan manusia untuk mendapatkan
mutu g e n e t i k t e r n a k yang dikehendaki s e k a l i g u s melipatgandakan dan menyebarkannya dengan mudah s e r t a e f i s i e n .
Sa-
l a h s a t u t e k n o l o g i yang mempunyai p o t e n s i untuk i n i a d a l a h
t r a n s f e r embrio.
Melalui berbagai p e n e l i t i a n , t e k n i k i n i
t e l a h mengalami penyempurnaan-penyempurnaan.
Untuk dapat m e l e s t a r i k a n kehidupan embrio d i l u a r
tubuh induk, mudah dibawanya d a r i satu tempat ke tempat
l a i n dengan aman dan dapat d i t r a n s f e r ke r e s i p i e n s e t i a p
saat maka diperlukan t e k n i k penyimpanannya yang r e v e r s i - .
bel.
2ada saat i n i yang t e r b a i k y a i t u pembekuan.
Ada beberapa ha1 yang p e r l u mendapat p e r h a t i a n ka-
r e n a biasanya merupakan kendala dalam melakukan t e k n i k
i n i y a i t u k r i o p r o t e k t a n yang digunakan dalam medium, emb r i o yang dibekukan dan prosedur pembekuannya.
Medium
yang umum digunakan a d a l a h garam b u f f e r f o s f a t Dulbecco
yang t e l a h diperkaya, sedangkan untuk krioprotektannya
a d a l a h g l i s e r o l dan DMSO.
Embrio yang t e r b a i k untuk di-
bekukan a d a l a h a d a l a h tahap morula hingga b l a s t o s i s dan
memilikl k l a s i f i k a s i k w a l i t a s yang t e r b a i k .
Embrio da-
p a t d i e q u i l i b r a s i k a n dalam medium k r i o p r o t e k t a n pada temp e r a t u r t e r t e n t u (suhu tubuh, suhu ruang, suhu pendingin
pada l e m a r i e s ataupun O'C) s e s u a i dengan metoda yang d i pakai.
Penambahan medium k r i o p r o t e k t a n d a p a t d i l a k u k a n
l a n g s u n g ( d i r e c t ) maupun t i d a k l a n g s u n g ( i n d i r e c t ) y a i t u
s e c a r a b e r t a h a p untuk menghindarkan kerusakan pada embrio
yang disebabkan perbedaan tekanan osmotik yang besar.
K o n s e n t r a s i k r i o p r o t e k t a n yang b a i k dan ekonomis a d a l a h
1 , O M untuk g l i s e r o l dan
1 , 5 M untuk DMSO.
Prosedur pembekuan dengan p r o s e s l l c e p a t l lmemungkinkan p e n c a i r a n (thawing) embrio yang t e l a h dibekukan d a p a t
d i l a k u k a n menggunakan a i r bersuhu 25-37'~.
Exosmose Isrio-
p r o t e k t a n d a r i h a s i l p e n c a i r a n embrio beku i n i d a p a t d i l a kukan menggunakan sukrosa.
Sukrosa d a p a t dimasukkan ke da-
l a m s t r a w pengemas ernbrio.
Dengan demikian p e n c a i r a n em-
b r i o beku dan exosmose k r i o p r o t e k t a n d a p a t dilakukan sekal i g u s s a t u t a h a p (one s t e p method) dalam straw.
Hasil-ha-
s i l p e n e l i t i a n i n i memungkinkan t r a n s f e r embrio dapat d i l a kukan s e p e r t i c a r a yang digunakan dalam t e k n i k i n s e m i n a s i
b u a t a n menggunakan semen beku.
PRINSIP KERJA PEMBMUAN EMBRIO
Oleh
SULAXONO BAD1
Sarjana Kedokteran Bewan (1987)
Menyetujui
prof. 6 h . SOEBADI PARTODIHARDJO, M. Sc
--
-
Pembimbing Utama
DR. IMAN SUPRIATNA
Pembimbing Pembantu
,JC agustus 1988
., Ph.D.
PRINSLP KERJA PEMBEKUAN EMBRIO
SKRIPSI
Sebagai s a l a h s a t u s y a r a t untuk memperoleh gelar
Dokt e r Hewan
pada
F a k u l t a s Kedokteran Hewan
I n s t i t u t P e r t a n i a n Bogor
Oleh
SULAXONO BAD1
B19.1338
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWBN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1988
KATA PENGANTAR
P u j i dan syukur p e n u l i s p a n j a t k a n k e h a d i r a t Tuhan
Yang Maha Pengasih dan Penyayang yang t e l a h melimpahkan
rahmat-Nya hingga p e n u l i s d a p a t n e n y e l e s a i k a n s k r i p s i i n i .
S k r i p s i i n i d i t u l i s s e b a g a i s a l a h s a t u s y a r a t dalam
upaya memperoleh g e l a r Dokter Hewan d a r i F a k u l t a s Kedoktera n Rewan, I n s t i t u t P e r t a n i a n Bogor, dan d i s u s u n b e r d a s a r kan h a s i l s t u d i l i t e r a t u r .
S e c a r a khusus p e n u l i s menghaturkan t e r i m a k a s i h kepada Bapak Prof.Drh.
SOEBADI PARTODIHARDJO, M.Sc.,
Ph.D.
dan Bapak DR. IMAN SUPRIATNA yang t e l a h dengan i k h l a s meluangkan waktunya membimbing kami dalam menyelesaikan
skripsi ini.
Terimakasih pula p e n u l i s sampaikan kepada s e l u r u h
s t a f PT Dos k'i Roha, s t a f J u r u s a n Reproduksi dan Kebidanan
FYJI-IPB, s t a f perpustakaan IPB, s t a f Perpustakaan B a l a i Pen e l i t i a n Ternak Ciawi, s t a f P u s a t Perpustakaan B i o l o g i dan
P e r t a n i a n Deptan, s t a f P e r p u s t a k a a n B a l a i P e n e l i t i a n Veter i n e r a t a s s e g a l a bantuannya.
Akhirnya p e n u l i s menyadari bahwa s k r i p s i i n i masih
jauh d a r i sempurna, namun demikian p n u l i s b e r h a r a p mudahmudahan bermanfaat b a g i para pembaca.
Bogor, Maret 1988
Penulis
DAFTAR I S 1
RINGKASAN
........................................... iii
KATA PENGANTAR
DAFTAR TABEL
...................................... vi
........................................
viii
....................................... i x
BAB I. PENDAHULUAN ................................. 1
DAFTAR GAMBAR
BAB I1
.
TINJAUAN PUSTAKA
3
2.1.
...........................
P r i n s i p d a s a r pembekuan ..............
3
2.2.
Peranan k r i o p r o t e k t a n selama pembekuan
2.3.
.................................
6
V a r i a b e l yang mempengaruhi v i a b i l i t a s
s e l selama pembekuan
................. 8
............. 13
2.4.
Penyediaan k r i o p r o t e k t a n
2.5.
K l a s i f i k a s i embrio yang akan dibeku-
.................................. 15
P r o s e d u r pembekuan ................... 24
kan
2.6.
BAB I11
.
PD4BAHASAN
................................ 30
................................. 35
DAFTAR PUSTAKA ...................................... 36
BAB I V
.
KESIMPULAN
Nomor
Halaman
Teks
-
1.
2.
3.
4.
........ 1 4
K e s e t a r a a n a n t a r a b e r a t den volume k r i o p r o t e k t a n ...................................... 1 4
Tahap perkembangan embrio d i k a i t k a n dengan
waktu s e t e l a h o v u l a s i ....................... 1 6
H a r i pengkoleksian, t i n g k a t kebuntingan dan
k w a l i t a s embrio .............................
P e n g u j i a n u l a n g embrio s a p i s e t e l a h dibelrukan ......................................... 23
K a r a k t e r i s t i k beberapa k r i o p r o t e k t a n
21
5.
6.
P r o s e s rllambat'f dalam pembekuan embrio
...... 29
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Nomor
Teks
...............................
1.
Embrio s a p i
2.
Perbandingan a n t a r a t i n & a t k e b u n t i n g a n dan
d i s t r i b u s i frekviensi tahapan embrio
.......
3.
Embrio s a p i dengan zona p e l l u c i d a u t u h yamg
dikoleksi 7 hari setelah estrus
4.
B l a s t o s i s sapi 8 h a r i s e t e l a h inseminasi
5.
Embrio dalam s t r a w d i s e r t a i s u k r o s a s e b a g a i
medium k r i o p r o t e k t a n
6.
Hasil perekaman suhu contoh medium yang di-
...........
..
......................
bekukan dalam bak pembekuan dengan k e c e p a t -
............................
an 0 , 5 ~ ~ / m e n i t
7.
P r o s e s "cepat" dalam pembekuan embrio
.....
18
31
yang berbeda jika krioprotektan yang digunakan berlainan.
DMSO merupakan krioprotektan yang mempunyai daya pelin dung yang 1ebih baik dibanding glisero1 (Whittingham et
al., 1972), tetapi Bilton et al. (1976, 1977, 1979) dapat
membuktikan bahwa gliserol 1,0 M merupakan krioprotektan
yang 1ebih baik dibanding DMSO 1,5 M.
Kasai et a1. (1981)
memperkuat hasil penelitian ahli terakhir tersebut dan meｮｵｪｾ｡＠
bahwa glisero1 maupun eti1en gliko1 merupakan
krioprotektan yang terbaik dibanding DMSO, dimeti1formamida, sukrosa maupun eritritol.
Terdapat suatu hubungan an tara kecepatan pembekuan
dengan konsentrasi krioprotektan yang digunakan.
Pada pem-
bekuan 1ambat konsentrasi DMSO yang efektif berkisar antara
1,0-1,5 M (Whittingham et a1., 1972), sedang untuk pembekuan cepat berkisar antara 1,5-2,0 M (Kasai et a1., 1980).
Whittingham (1975) membuktikan bahwa untuk pembekuan lambat
maka konsentrasi DMSO yang paling efektif adalah 1,5 M, sedangkan menurut Vfuittingham et a1. (1976) da1am DMSO 1,5 M
kecepatan pembekuan yang efektif berkisar O,18-0,30 oe/menit.
Da1am penggunaannya, krioprotektan bisa ditambahkan
ke da1am medium pada suhu oOe atau 1ebih (Whittingham, 1974).
SUhUi penambahan krioprotektan ini dapat mempengaruhi viabilitas embrio (Supriatna, 1987).
Sesuai dengan krioprotektan_
yang digunakan, embrio akan ter1indung dengan baik dari pengaruh pembekuan yang merugikan jika berada dalam krioprotektan untuk beberapa saat 1amanya sete1ah penambahan, dan
PRlNSlP KERJA PEMBEKUAN
SULAXONO HAD1
B 19.1338
FAKULT'AS KEDOKTERAN HEWAN
1NSTlf Uf PERTANIAN BOGOR
1 9 8 8
SULAXONO HADI.
P r i n s i p K e r j a Pembekuan Embrio (Dibawah
bimbingan Soebadi P a r t o d i h a r d j o dan Iman S u p r i a t n a ) .
Berbagai usaha dilakukan manusia untuk mendapatkan
mutu g e n e t i k t e r n a k yang dikehendaki s e k a l i g u s melipatgandakan dan menyebarkannya dengan mudah s e r t a e f i s i e n .
Sa-
l a h s a t u t e k n o l o g i yang mempunyai p o t e n s i untuk i n i a d a l a h
t r a n s f e r embrio.
Melalui berbagai p e n e l i t i a n , t e k n i k i n i
t e l a h mengalami penyempurnaan-penyempurnaan.
Untuk dapat m e l e s t a r i k a n kehidupan embrio d i l u a r
tubuh induk, mudah dibawanya d a r i satu tempat ke tempat
l a i n dengan aman dan dapat d i t r a n s f e r ke r e s i p i e n s e t i a p
saat maka diperlukan t e k n i k penyimpanannya yang r e v e r s i - .
bel.
2ada saat i n i yang t e r b a i k y a i t u pembekuan.
Ada beberapa ha1 yang p e r l u mendapat p e r h a t i a n ka-
r e n a biasanya merupakan kendala dalam melakukan t e k n i k
i n i y a i t u k r i o p r o t e k t a n yang digunakan dalam medium, emb r i o yang dibekukan dan prosedur pembekuannya.
Medium
yang umum digunakan a d a l a h garam b u f f e r f o s f a t Dulbecco
yang t e l a h diperkaya, sedangkan untuk krioprotektannya
a d a l a h g l i s e r o l dan DMSO.
Embrio yang t e r b a i k untuk di-
bekukan a d a l a h a d a l a h tahap morula hingga b l a s t o s i s dan
memilikl k l a s i f i k a s i k w a l i t a s yang t e r b a i k .
Embrio da-
p a t d i e q u i l i b r a s i k a n dalam medium k r i o p r o t e k t a n pada temp e r a t u r t e r t e n t u (suhu tubuh, suhu ruang, suhu pendingin
pada l e m a r i e s ataupun O'C) s e s u a i dengan metoda yang d i pakai.
Penambahan medium k r i o p r o t e k t a n d a p a t d i l a k u k a n
l a n g s u n g ( d i r e c t ) maupun t i d a k l a n g s u n g ( i n d i r e c t ) y a i t u
s e c a r a b e r t a h a p untuk menghindarkan kerusakan pada embrio
yang disebabkan perbedaan tekanan osmotik yang besar.
K o n s e n t r a s i k r i o p r o t e k t a n yang b a i k dan ekonomis a d a l a h
1 , O M untuk g l i s e r o l dan
1 , 5 M untuk DMSO.
Prosedur pembekuan dengan p r o s e s l l c e p a t l lmemungkinkan p e n c a i r a n (thawing) embrio yang t e l a h dibekukan d a p a t
d i l a k u k a n menggunakan a i r bersuhu 25-37'~.
Exosmose Isrio-
p r o t e k t a n d a r i h a s i l p e n c a i r a n embrio beku i n i d a p a t d i l a kukan menggunakan sukrosa.
Sukrosa d a p a t dimasukkan ke da-
l a m s t r a w pengemas ernbrio.
Dengan demikian p e n c a i r a n em-
b r i o beku dan exosmose k r i o p r o t e k t a n d a p a t dilakukan sekal i g u s s a t u t a h a p (one s t e p method) dalam straw.
Hasil-ha-
s i l p e n e l i t i a n i n i memungkinkan t r a n s f e r embrio dapat d i l a kukan s e p e r t i c a r a yang digunakan dalam t e k n i k i n s e m i n a s i
b u a t a n menggunakan semen beku.
PRINSIP KERJA PEMBMUAN EMBRIO
Oleh
SULAXONO BAD1
Sarjana Kedokteran Bewan (1987)
Menyetujui
prof. 6 h . SOEBADI PARTODIHARDJO, M. Sc
--
-
Pembimbing Utama
DR. IMAN SUPRIATNA
Pembimbing Pembantu
,JC agustus 1988
., Ph.D.
PRINSLP KERJA PEMBEKUAN EMBRIO
SKRIPSI
Sebagai s a l a h s a t u s y a r a t untuk memperoleh gelar
Dokt e r Hewan
pada
F a k u l t a s Kedokteran Hewan
I n s t i t u t P e r t a n i a n Bogor
Oleh
SULAXONO BAD1
B19.1338
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWBN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1988
KATA PENGANTAR
P u j i dan syukur p e n u l i s p a n j a t k a n k e h a d i r a t Tuhan
Yang Maha Pengasih dan Penyayang yang t e l a h melimpahkan
rahmat-Nya hingga p e n u l i s d a p a t n e n y e l e s a i k a n s k r i p s i i n i .
S k r i p s i i n i d i t u l i s s e b a g a i s a l a h s a t u s y a r a t dalam
upaya memperoleh g e l a r Dokter Hewan d a r i F a k u l t a s Kedoktera n Rewan, I n s t i t u t P e r t a n i a n Bogor, dan d i s u s u n b e r d a s a r kan h a s i l s t u d i l i t e r a t u r .
S e c a r a khusus p e n u l i s menghaturkan t e r i m a k a s i h kepada Bapak Prof.Drh.
SOEBADI PARTODIHARDJO, M.Sc.,
Ph.D.
dan Bapak DR. IMAN SUPRIATNA yang t e l a h dengan i k h l a s meluangkan waktunya membimbing kami dalam menyelesaikan
skripsi ini.
Terimakasih pula p e n u l i s sampaikan kepada s e l u r u h
s t a f PT Dos k'i Roha, s t a f J u r u s a n Reproduksi dan Kebidanan
FYJI-IPB, s t a f perpustakaan IPB, s t a f Perpustakaan B a l a i Pen e l i t i a n Ternak Ciawi, s t a f P u s a t Perpustakaan B i o l o g i dan
P e r t a n i a n Deptan, s t a f P e r p u s t a k a a n B a l a i P e n e l i t i a n Veter i n e r a t a s s e g a l a bantuannya.
Akhirnya p e n u l i s menyadari bahwa s k r i p s i i n i masih
jauh d a r i sempurna, namun demikian p n u l i s b e r h a r a p mudahmudahan bermanfaat b a g i para pembaca.
Bogor, Maret 1988
Penulis
DAFTAR I S 1
RINGKASAN
........................................... iii
KATA PENGANTAR
DAFTAR TABEL
...................................... vi
........................................
viii
....................................... i x
BAB I. PENDAHULUAN ................................. 1
DAFTAR GAMBAR
BAB I1
.
TINJAUAN PUSTAKA
3
2.1.
...........................
P r i n s i p d a s a r pembekuan ..............
3
2.2.
Peranan k r i o p r o t e k t a n selama pembekuan
2.3.
.................................
6
V a r i a b e l yang mempengaruhi v i a b i l i t a s
s e l selama pembekuan
................. 8
............. 13
2.4.
Penyediaan k r i o p r o t e k t a n
2.5.
K l a s i f i k a s i embrio yang akan dibeku-
.................................. 15
P r o s e d u r pembekuan ................... 24
kan
2.6.
BAB I11
.
PD4BAHASAN
................................ 30
................................. 35
DAFTAR PUSTAKA ...................................... 36
BAB I V
.
KESIMPULAN
Nomor
Halaman
Teks
-
1.
2.
3.
4.
........ 1 4
K e s e t a r a a n a n t a r a b e r a t den volume k r i o p r o t e k t a n ...................................... 1 4
Tahap perkembangan embrio d i k a i t k a n dengan
waktu s e t e l a h o v u l a s i ....................... 1 6
H a r i pengkoleksian, t i n g k a t kebuntingan dan
k w a l i t a s embrio .............................
P e n g u j i a n u l a n g embrio s a p i s e t e l a h dibelrukan ......................................... 23
K a r a k t e r i s t i k beberapa k r i o p r o t e k t a n
21
5.
6.
P r o s e s rllambat'f dalam pembekuan embrio
...... 29
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Nomor
Teks
...............................
1.
Embrio s a p i
2.
Perbandingan a n t a r a t i n & a t k e b u n t i n g a n dan
d i s t r i b u s i frekviensi tahapan embrio
.......
3.
Embrio s a p i dengan zona p e l l u c i d a u t u h yamg
dikoleksi 7 hari setelah estrus
4.
B l a s t o s i s sapi 8 h a r i s e t e l a h inseminasi
5.
Embrio dalam s t r a w d i s e r t a i s u k r o s a s e b a g a i
medium k r i o p r o t e k t a n
6.
Hasil perekaman suhu contoh medium yang di-
...........
..
......................
bekukan dalam bak pembekuan dengan k e c e p a t -
............................
an 0 , 5 ~ ~ / m e n i t
7.
P r o s e s "cepat" dalam pembekuan embrio
.....
18