Analisis Keragaman Bakteri Asam Laktat dari Saluran Pencernaan Ayam Cemani Berdasarkan Gen 16S rRNA dan Potensi Penggunaannya sebagai Probiotik
ANALISIS KERAGAMAN BAKTERI ASAM LAKTAT DARI
SALURAN PENCERNAAN AYAM CEMANI BERDASARKAN
GEN 16S rRNA DAN POTENSI PENGGUNAANNYA
SEBAGAI PROBIOTIK
SITI NUR JANNAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Analisis Keragaman Bakteri
Asam Laktat dari Saluran Pencernaan Ayam Cemani Berdasarkan Gen 16S rRNA
dan Potensi Penggunaannya Sebagai Probiotik adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2014
Siti Nur Jannah
NIM G361090011
RINGKASAN
SITI NUR JANNAH. Analisis Keragaman Bakteri Asam Laktat Dari Saluran
Pencernaan Ayam Cemani Berdasarkan Gen 16S rRNA dan Potensi
Penggunaannya sebagai Probiotik.
Dibimbing oleh IMAN RUSMANA,
ACHMAD DINOTO dan KOMANG G. WIRYAWAN.
Di Indonesia terdapat 31 rumpun ayam lokal dengan karakteristik yang
berbeda antara satu jenis dengan jenis lainnya. Salah satu jenisnya adalah ayam
Cemani, yang mempunyai karakteristik unik dengan warna hitam diseluruh
tubuhnya dan ketahanannya terhadap penyakit. Tujuan penelitian ini adalah untuk
mendapatkan informasi awal tentang komunitas bakteri asam laktat sebagai
penyusun dari mikrobiota saluran pencernaan ayam Cemani dan mendapatkan
isolat bakteri asam laktat sebagai probiotik pada ayam.
Analisa keragaman bakteri dengan menggunakan metode T-RFLP
dilakukan dengan isolasi DNA genom langsung dari sampel lumen saluran
pencernaan ayam (tembolok, ventrikulus, ileum dan sekum), primer yang
digunakan adalah primer forward 27F dilabel dengan 6-carboxyfluorescein dan
primer reverse spesifik untuk bakteri asam laktat SG-Lab-0677, enzim restriksi
yang digunakan HaeIII dan MspI. Selanjutnya ditentukan jumlah filotipe,
kelimpahannya (indeks Shannon Wiener) dan indeks kesamaan komunitas (indeks
Sorensen). Analisa plate counts dilakukan untuk memperoleh nilai total bakteri
asam laktat dan juga untuk memperoleh isolat kandidat probiotik, dengan cara
ditumbuhkan pada cawan petri yang berisi media padat MRS dan GYP yang
ditambahkan dengan 0.5% CaCO3, diinkubasi secara anaerobik selama 48 jam
pada suhu 37°C. Isolat kandidat probiotik diuji aktivitasnya meliputi uji aktivitas
antimikroba terhadap bakteri indikator, uji toleransi terhadap pH dan garam
empedu, uji hidrofobisitas pada permukaan sel, uji koagregasi, uji aktivitas
enzimatik dan uji sensitivitas terhadap antibiotik. Identifikasi secara molekuler
dan fisologis dengan fermentasi gula. Galur probiotik (L. Salivarius) yang
diperoleh dienkapsulasi denngan 5% susu skim dan dilakukan pengawetan dengan
metode kering beku.
Selanjutnya dilakukan aplikasi L. salivarius sebagai
probiotik dalam ransum terhadap penampilan dan kesehatan ayam serta
komunitas mikrobiota ayam broiler.
Hasil analisa T-RFLP menunjukkan perbedaan dan dinamika populasi antara
mikroba pada tembolok, ventrikulus, ileum dan sekum. Tidak semua filotipe BAL
dapat diidentifikasi, beberapa filotipe BAL (41 %) tidak dapat diidentifikasi
(unidentified) dan 17% diidentifikasi sebagai bakteri yang belum dapat
dikulturkan (unculturable), hal ini mengacu pada database yang tersedia di
MiCA3. Jumlah filotipe (S) BAL di ileum (9.5) lebih tinggi daripada di komunitas
lain dan jumlah terendahnya adalah di sekum (6.5), indeks keragaman ShannonWienner menunjukkan indeks keragaman bervariasi dengan nilai tertinggi di
ileum (2.13), sedangkan yang terendah di sekum (1.08), indeks kesamaan
komunitas tertinggi (0.70) adalah antara komunitas ventrikulus dan ileum. Dengan
menggunakan metode tradisional pengkulturan, populasi bakteri asam laktat dari
saluran pencernaan ayam diketahui antara 7.12 sampai 9.07 log CFU g - 1 dan
jumlah tertingginya ditemukan di bagian tembolok. Dari uji kandidat probiotik
didapatkan isolat CSP004, CCM011 dan CVM002 mempunyai aktivitas
antimikroba terhadap bakteri patogen, tahan terhadap pH2 dan 0.1% garam
empedu, mempunyai hidrofobisitas yang kuat pada permukaan sel dan mucus,
mempunyai enzim phytase dan protease, tetapi tidak mempunyai enzim amilase
dan lipase, mempunyai koagregasi dengan bakteri asam laktat lainnya tetapi
lemah koagregasinya dengan bakteri patogen, dan kesemua isolat tidak ada yang
resisten terhadap antibiotik. Ketiga isolat probiotik teridentifikasi sebagai
Lactobacillus salivarius, tetapi dengan menggunakan kit API 50CHL, ketiganya
memperlihatkan perbedaan pola dalam fermentasi gula. Penambahan probiotik
belum memperbaiki penampilan ayam broiler yang meliputi bobot badan akhir,
konsumsi pakan, FCR, persentase karkas, profil darah dan persentase organ
limpatik, akan tetapi dengan penambahan probiotik dengan galur tunggal maupun
campuran dapat meningkatkan pertambahan bobot badan ayam pada minggu
pertama kehidupan ayam. Dari analisa T-RFLP penambahan probiotik galur
tunggal terbukti dapat memperbaiki mikrobiota saluran pencernaan broiler pada
akhir minggu.
Kata kunci : ayam Cemani, bakteri asam laktat, probiotik, T-RFLP.
SUMMARY
SITI NUR JANNAH. Diversity Analysis of Lactic Acid Bacteria from
Gastrointestinal Tract of Cemani Chicken Based on 16S rRNA gene and Their
Potential Use as Probiotics. Supervised by IMAN RUSMANA, ACHMAD
DINOTO dan KOMANG G. WIRYAWAN.
There are thirty one of native chickens in Indonesia with various genotipic
and phenotipic characteristics. Cemani chicken is one of Indonesian native
chicken showing unique morphological appearances with black colour concerns
the whole body and their resistance to disease. The aims of this study were to
obtain preliminary information about the microbial community of lactic acid
bacteria (LAB) in the gastrointestinal tract of Cemani chicken and to get candidate
probiotics for chickens.
LAB diversity analysis using T-RFLP method performed by isolation of
genomic DNA from lumen samples (crop, ventriculus, ileum and cecum) directly.
Primers used were 27F forward primer that labeled with 6-carboxyfluorescein and
a specific reverse primer for lactic acid bacteria, SG-Lab-0677. PCR products
were cutted with HaeIII and MspI restriction enzyme. The lengths of the T-RFs
were determined by comparison with size standards using the Peak Scanner TM
software. Biodiversity value is determined based on the number of phylotypes,
their abundance (Shannon Wiener index) and pairwise similarity index
(Sorensen’s index). Analysis of plate counts in petri dishes containing MRS and
GYP media conducted to obtain the total number of LAB and probiotic
candidates. The probiotic candidates were screened for their probiotic properties.
Probiotic strains encapsulated with 5% skim milk by freeze-drying preservation
method. Furthermore, the application of probiotics strain (L. salivarius) in the
diet on performance, healthy of chickens and microbiota community were
conducted.
The results showed the differences between population dynamics of LAB
in crop, ventriculus, ileum and cecum. Not all phylotypes can be identified using
MiCA3 database, some filotipe (41% unidentified) and 17% identified as
unculturable bacteria. The number of LAB phylotypes in the ileum (9.5) is higher
than in other communities and the lowest number is in the cecum (6.5), ShannonWienner diversity index showed the highest diversity index in the ileum (2.13),
while the lowest in the cecum (1:08), the ventriculus and ileum community have
the highest similarity index (0.70). By culturing method, the population of LAB
were 7.12 to 9.07 log CFU/g. Three selected isolates, i.e. CCM011, CSP004, and
CVM002 showed the highest inhibition activity, high cell surface hidrophobicity,
showing phytase and protease activity (but no amylase and lipase activity), weak
coagregation with pathogen, and no resistance to the examined antibiotics. The
isolates were identified as Lactobacillus salivarius, however, each isolate had
different profiles of sugar fermentation. The probiotics supplemented feed have
no improve the appearance of broiler chickens which includes final body weight,
feed intake, FCR, carcass percentage, profile of the blood and lymphatic organs
percentage, but in the first week experiment indicated that chickens fed with
probiotics supplemented feed (single or mix cultures of LAB) have higher body
weight gain than the control or antibiotic dietary treatments. The supplemented
feed with the single-strain probiotic can improved gastrointestinal tract microbiota
in the last week treatment.
Keywords: Cemani chicken, lactic acid bacteria, probiotics, T-RFLP.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ANALISIS KERAGAMAN BAKTERI ASAM LAKTAT DARI
SALURAN PENCERNAAN AYAM CEMANI BERDASARKAN
GEN 16S rRNA DAN POTENSI PENGGUNAANNYA
SEBAGAI PROBIOTIK
SITI NUR JANNAH
Disertasi ini
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada
Program Studi Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji pada Ujian Tertutup : Prof Dr Ir Lilis Nuraida, MSc
Dr Ir Rita Mutia, MAgr
Penguji pada Ujian Terbuka : Dr Ir Yantyati Widyastuti
Dr Ir Sumiati, MSc
Judul Disertasi
Nama
NIM
: Analisis Keragaman Bakteri Asam Laktat dari
Saluran Pencernaan Ayam Cemani Berdasarkan Gen
16S rRNA dan Potensi Penggunaannya sebagai
Probiotik
: Siti Nur Jannah
: G361090011
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua
Dr Achmad Dinoto, MSc
Anggota
Prof Dr Ir Komang G. Wiryawan
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Mikrobiologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr Anja Meryandini, MS
Dr Ir Dahrul Syah, MSc Agr
Tanggal Ujian: 16 Juli 2014
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Bismillaahirrahmaanirrahiim
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah Subhanahu wa Ta’ala
atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil
diselesaikan. Disertasi ini ditulis berdasarkan hasil penelitian yang berjudul
Analisis Keragaman Bakteri Asam Laktat dari Saluran Pencernaan Ayam Cemani
Berdasarkan Gen 16S rRNA dan Potensi Penggunaannya sebagai Probiotik yang
dilaksanakan sejak bulan September 2011 hingga Nopember 2013.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr
Ir Iman Rusmana, MSi, Dr Achmad Dinoto, MSc dan Prof Dr Ir Komang G.
Wiryawan selaku komisi pembimbing yang selalu memberi masukan, motivasi
dan semangat kepada penulis sehingga karya ilmiah ini bisa diselesaikan. Ucapan
terima kasih juga penulis sampaikan kepada ibu Prof Dr Ir Lilis Nuraida, MSc dan
ibu Dr Ir Rita Mutia, MAgr sebagai penguji luar komisi pada ujian tertutup dan
kepada Ibu Dr Ir Yantyati Widyastuti dan ibu Dr Ir Sumiati, MSc pada ujian
terbuka yang telah memberi masukan dan saran untuk penulisan disertasi ini lebih
baik.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan berturut-turut kepada Direktorat
Pendidikan Tinggi yang telah memberikan dana pendidikan, Rektor Universitas
Diponegoro yang telah mengijinkan penulis untuk tugas belajar, Ketua Program
Studi dan para dosen Pascasarjana Program Studi Mikrobiologi IPB, seluruh staf
peneliti dan teknisi bidang di Lab Mikrobiologi Terapan, Lab Genetika Mikroba,
dan Lab Biokimia Mikroba, bidang Mikrobiologi, Puslit Biologi LIPI, dan Teknisi
di Lab ilmu nutrisi unggas (ibu Lanjarsih dan pak Arif Darmawan) dan para
pekerja di Kandang C yang telah banyak membantu dalam penelitian ini.
Akhirnya sujud sungkem terima kasih penulis haturkan kepada suami
tercinta Ir Teguh Suroso, MSi atas doa dan ijinnya dan terima kasih atas doa yang
ikhlas dan pendidikan yang diberikan dari Ibunda Asfariyah Faqih dan Ayahanda
Drs Moh. Thoha (Alm) dan terima kasih atas doa dari ananda tersayang (Hilmi,
Syauqi dan Faruq). Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2014
Siti Nur Jannah
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................................vi
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... viii
PENDAHULUAN ................................................................................................... 1
Latar Belakang.................................................................................................. 1
Tujuan Penelitian .............................................................................................. 3
Manfaat Penelitian ............................................................................................ 3
Kerangka Pemikiran ......................................................................................... 3
Kebaruan ........................................................................................................... 4
Hipotesis Penelitian .......................................................................................... 4
Kerangka Penelitian .......................................................................................... 5
TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................................ 11
Ayam Cemani ................................................................................................ 11
Ayam Broiler .................................................................................................. 11
Saluran Pencernaan Ayam ............................................................................. 12
Mikrobiota Saluran Pencernaan Ayam ........................................................... 13
Fingerprinting Komunitas ............................................................................. 14
Probiotik untuk Ayam .................................................................................... 16
Bakteri Asam Laktat ...................................................................................... 17
METODE ............................................................................................................... 19
Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................................ 19
Tahapan Penelitian ......................................................................................... 19
Tahap I: Analisis Keragaman Bakteri Asam Laktat (BAL) pada Saluran
Pencernaan Ayam Cemani dengan Menggunakan Metode Terminal
Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) ................................ 19
Tahap II : Isolasi dan Seleksi BAL yang Berpotensi sebagai Probiotik ....... 22
Tahap III. Enkapsulasi Bakteri L. Salivarius Sebagai Probiotik
dengan Teknik Kering Beku .......................................................................... 26
Tahap IV. Efikasi L. salivarius sebagai Probiotik dalam Pakan
terhadap Penampilan dan Kesehatan Ayam serta Komunitas
Mikrobiota Ras Pedaging/ Broiler ................................................................. 27
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................... 33
Tahap I : Analisis Keragaman BAL dari Saluran Pencernaan Ayam
Cemani dengan Menggunakan Metode T-RFLP ........................................... 33
Tahap II : Populasi BAL yang dapat Dikulturkan dari Saluran
Pencernaan Ayam Cemani dan Uji Potensi Probiotik.................................... 42
Tahap III : Enkapsulasi Bakteri L. salivarius sebagai Probiotik
dengan Teknik Kering Beku / Freeze-drying ................................................ 54
Tahap IV : Aplikasi L. salivarius sebagai Probiotik terhadap
Penampilan, kesehatan dan Mikrobiota Saluran Pencernaan Ayam
Broiler ........................................................................................................... 56
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ........................................................................................................ 73
Saran .............................................................................................................. 74
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 75
LAMPIRAN .......................................................................................................... 83
DAFTAR RIWAYAT HIDUP .............................................................................. 88
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Susunan pakan perlakuan dalam penelitian pada ayam broiler
selama pemeliharaan 5 minggu
Kandungan nutrisi pakan perlakuan
Identifikasi filotipe berdasarkan pada database MiCA3 secara
online
Indeks kesamaan pasangan Sorensen (Cs) komunitas BAL dalam
saluran pencernaan ayam Cemani
Total bakteri asam laktat yang dapat dikulturkan dan pH dari
saluran pencernaan ayam Cemani
Jumlah bakteri asam laktat yang mempunyai aktivitas
antimikroba terhadap E. coli dan S. enteritidis menggunakan uji
difusi agar
Aktivitas penghambatan supernatan bebas sel isolat BAL terpilih
terhadap E.coli and S. enteritidis
Ketahanan hidup isolat BAL terpilih dengan adanya faktor
penghambat
Aktivitas enzimatik isolat bakteri asam laktat kandidat probiotik
Diameter zona hambat kerentanan isolat BAL terpilih terhadap
berbagai jenis antibiotik (Rerata ± SE) dan status kerentanannya
Hasil identifikasi isolat menggunakan API 50 CHL dan sekuen
16S rDNA dari isolat CCM011, CSP004 dan CVM002
Pola fermentasi gula isolat bakteri asam laktat (LAB)
menggunakan Kit API 50 CHL
Waktu generasi dan laju pertumbuhan spesifik isolat bakteri asam
laktat yang ditumbuhkam pada medium MRS cair pada suhu
36OC selama 36 jam
Viabilitas Lactobacillus salivarius sebelum dan setelah proses
freeze-drying
Pengaruh pemberian pakan probiotik terhadap performa ayam
broiler selama 35 hari pemeliharaan (n=50)
Profil darah ayam yang diberi perlakuan probiotik (n=5)
Persentase bobot bursa fabrisius dan timus ayam broiler umur
5 minggu (n=5)
Kadar kolesterol serum darah ayam yang diberi perlakuan (n= 5)
Energi metabolis semu pakan perlakuan (n=5)
Indeks keragaman Shannon Wiener (H’) dari komunitas bakteri
dalam saluran pencernaan ayam broiler
28
29
35
41
43
44
45
46
47
50
51
53
54
55
56
60
63
63
65
71
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Struktur saluran pencernaan ayam
Produk amplifikasi gen 16S rRNA dari saluran pencernaan ayam
Cemani menggunakan primer 27F-FAM dan S-G-Lab 0677R
Profil T-RF BAL dalam saluran pencernaan ayam Cemani yang
teridentifikasi berdasar database MiCA3 dan isolat kandidat
probiotik L. salivarius CSP004
Distribusi kelimpahan relatif masing-masing filotipe BAL yang
terdapat pada setiap relung saluran pencernaaan ayam Cemani.
Persentase kelimpahan relatif T-RF yang signifikan dari filotipe
BAL dalam sekum ayam Cemani.
Jumlah filotipe/ spesies dan indeks keragaman Shannon
Wiener komunitas BAL pada saluran pencernaan ayam Cemani.
Jumlah total T-RF yang mewakili filotipe BAL dalam
saluran pencernaan secara individual dan komposit dari
7 ayam Cemani
Morfologi sel isolat probiotik CCM011, CSP004, dan CVM002
dengan menggunakan mikroskop cahaya
Kemampuan koagregasi antar isolat BAL terpilih (n=3).
Kemampuan koagregasi isolat BAL (n=3) dan bakteri indikator
(E. coli and S.enteritidis)
Gell agarosa yang menunjukkan pita potongan dari gen penyandi
16S rRNA hasil amplifikasi PCR
Pohon filogeni yang dihasilkan dari analisa fulllength sekuen 16S
rDNA isolat BAL dengan menunjukkan posisi L. salivarius
CCM011, CSP004 dan CVM002 diantara sejumlah lactobacilli
Kurva Pertumbuhan L. salivarius CSP004, CCM011 dan
CVM002 dalam media MRS cair selama 36 jam.
Pertambahan bobot badan mingguan broiler yang diberi
perlakuan pakan berbeda
Perbedaan pertambahan bobot badan ayam pada minggu pertama
dengan minggu ke lima.
Pengaruh pakan probiotik terhadap populasi koliform dan
bakteri asam laktat dalam ileum
Pengaruh pakan probiotik terhadap populasi koliform dan
bakteri asam laktat dalam sekum
Profil komunitas bakteri asam laktat yang didapatkan dari
sekum ayam broiler yang diberi perlakuan penambahan
13
34
36
38
39
40
42
45
48
49
51
52
55
57
58
66
67
19
probiotik (n=5)
Profil komunitas mikrobiota sekum ayam broiler yang diberi
perlakuan penambahan probiotik (n=5)
69
70
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
Dinamika jumlah dan kelimpahan relatif BAL pada saluran
pencernaan ayam Cemani (dengan menggunakan enzim
restriksi Hae III
Dinamika jumlah dan kelimpahan relatif BAL pada saluran
pencernaan ayam Cemani (dengan menggunakan enzim
restriksi MspI
Karakterisasi isolat BAL dari saluran pencernaan ayam Cemani
dengan pada media MRSA dan GYPA.
Rerata suhu dan kelembaban udara mingguan di lingkungan
kandang ayam
83
84
85
87
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Produk peternakan unggas, terutama ayam ras pedaging / broiler sangat
populer di masyarakat. Broiler dan produknya selain merupakan pangan yang
bergizi tinggi, juga harganya lebih murah dibandingkan produk daging lainnya.
Produksi broiler di Indonesia mengalami peningkatan tiap tahun seiring dengan
peningkatan jumlah penduduk. Pada tahun 2008 produksi broiler di Indonesia
sebesar 902 052 000 ekor, dan meningkat 50% pada tahun 2013 menjadi 1 355
288 000 ekor (Ditjennak, 2013). Broiler menyumbang produk peternakan terbesar,
sekitar 73.11% dari seluruh populasi ternak unggas (1 853 762 000 ekor) di
Indonesia pada tahun 2013. Meningkatnya produk peternakan tersebut
menyebabkan peningkatan penggunaan obat-obatan, terutama antibiotik untuk
pencegahan terhadap penyakit pada ayam.
Penggunaan antibiotik sebagai faktor pertumbuhan atau Antibiotic Growth
Promoters (AGPs), diberikan melalui pakan dalam jumlah sedikit atau tingkat
sub-terapeutik dan dalam jangka yang lama. Namun penggunaan AGPs dapat
mengganggu kesehatan manusia sebagai konsumennya, karena adanya residu
antibiotik dalam bahan pangan dan munculnya galur bakteri zoonotik yang
resisten terhadap antibiotik. Hal ini bersifat merugikan karena menurunkan
efektivitas terapi antibiotik yang digunakan dalam pengobatan berbagai infeksi
pada manusia sebagai konsumennya (Dahiya et al. 2006). Sejak 1 Januari 2006
Uni Eropa melarang penggunaan antibiotik sebagai faktor pertumbuhan pada
produk peternakan. Konsekuensi utama pelarangan penggunaan AGPs antara lain
meningkatnya biaya pakan sekitar 3% dalam produksi ayam sebagai akibat dari
konversi pakan yang kurang menguntungkan dan meningkatnya penyakit
necrotic enteritis pada unggas.
Untuk meningkatkan produksi ayam dan tetap menyediakan produk
peternakan yang aman untuk dikonsumsi, perlu diusahakan alternatif penggunaan
antibiotik atau obat-obatan dalam industri peternakan. Salah satu cara dengan
penggunaan imbuhan pakan berupa probiotik yang berperan menjaga
keseimbangan mikrobiota usus, meningkatkan mekanisme pertahanan alami inang
sehingga berpengaruh baik terhadap performa dan kesehatan ayam. Probiotik
merupakan mikoorganisme hidup yang diberikan dalam jumlah yang cukup yang
memberikan efek menguntungkan terhadap kesehatan inang (FAO/WHO 2002).
Efek menguntungkan itu antara lain menjaga homeostasis mikrobiota usus,
menstabilkan fungsi penghalang saluran gastrointestinal (Salminen et al. 1996),
ekspresi bakteriosin, aktivitas enzimatik yang menginduksi absorpsi dan nutrisi
(Hooper 2000), efek imunomodulasi, penghambatan enzim prokarsinogenik dan
mencegah kemampuan patogen untuk mengkolonisasi pada mukosa (Gill 2003).
Mikroba yang sering digunakan sebagai probiotik pada ayam berasal dari
kelompok bakteri asam laktat (BAL) (Patterson dan Burkholder 2003; Mojgani et
al. 2007; Torshizi et al. 2008; Vargas-Rodriguez et al. 2013). BAL telah lama
2
secara luas digunakan sebagai kultur starter dalam fermentasi makanan, produk
susu dan pakan. Selain itu, BAL telah dikenal berperan penting bagi kesehatan
manusia dan hewan. BAL digunakan sebagai probiotik untuk meningkatkan
mikrobiota normal usus inangnya karena kemampuannya menghasilkan berbagai
zat antimikroba termasuk asam laktat, alkohol, karbondioksida, diasetil, hidrogen
peroksida, bakteriosin dan metabolit lainnya ( Gaggia et al. 2010) .
Probiotik komersial telah banyak terdapat di pasaran, akan tetapi
potensinya di Indonesia yang beriklim panas belum banyak dikembangkan.
Probiotik dengan memanfaatkan isolat lokal yang diisolasi dalam saluran
pencernaan ayam lokal berpotensi sebagai probiotik di Indonesia. Di Indonesia,
terdapat 31 jenis ayam lokal dengan karakteristik genotipik dan fenotipik yang
berbeda antara satu jenis dengan jenis lainnya. Salah satu diantaranya adalah
ayam Cemani. Ayam Cemani merupakan salah satu ayam asli (native chicken)
Indonesia yang berasal dari Kedu, Kabupaten Temanggung, Provinsi Jawa
Tengah. Ayam ini menunjukkan penampilan morfologi unik dengan warna hitam
di seluruh tubuh (Ismoyowati et al. 2012). Umumnya, ayam Cemani di Indonesia
digunakan untuk produksi telur dan daging ke pasar lokal. Kadang-kadang juga
digunakan dalam upacara ritual dan sebagai obat (Nugroho 2013), selain itu ayam
ini memiliki ketahanan tinggi terhadap penyakit, terutama terhadap virus dan
patogen usus (Sulandari et al. 2009a; Nataamijaya 2010). Kemampuan resistensi
terhadap penyakit dan beradaptasi terhadap kondisi lingkungan dapat dipengaruhi
oleh keseimbangan mikrobiota usus didalamnya (Lan et al. 2004, Gaggia et al.
2010).
Penelitian tentang sifat telur dan daging ayam Cemani secara intensif telah
dipelajari (Lukasiewicz et al. 2009; Wahyuni et al. 2011; Kusumasari et al. 2013),
tetapi penelitian keanekaragaman BAL dari saluran pencernaan ayam Cemani di
Indonesia belum dilaporkan. Studi tentang fingerprinting suatu komunitas akan
membantu memberi pemahaman hubungan antara keragaman mikroba dalam
komunitas tersebut dan karakter spesifik yang dihasilkan. Sehingga sangat penting
untuk mempelajari keanekaragaman BAL pada ayam Cemani berdasarkan metode
culture-independent agar dapat memahami mekanisme modulasi kesehatan inang
oleh adanya mikrobiota saluran pencernaan. Analisis ini dapat menjadi dasar
pembuatan probiotik yang efektif pada saluran pencernaan ayam.
Penelitian berbasis culture-independent difokuskan untuk mengungkapkan
pola keragaman BAL di saluran pencernaan ayam Cemani dengan menerapkan
teknik Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP). Selain itu
berdasarkan metode culture-dependent untuk mendapatkan isolat-isolat BAL yang
berpotensi sebagai probiotik pada ayam, baik untuk budidaya ayam lokal maupun
broiler dan diharapkan dapat berfungsi sebagai alternatif pengganti antibiotik.
3
Tujuan Penelitian
Secara umum penelitian ini bertujuan mendapatkan informasi tentang
komunitas dan keragaman bakteri asam laktat (BAL) sebagai penyusun
mikrobiota pada saluran pencernaan ayam Cemani dan mendapatkan isolat BAL
yang berpotensi sebagai probiotik pada pakan ayam. Untuk mencapai tujuan
tersebut maka tujuan khusus penelitian ini adalah :
1. Mendapatkan informasi populasi dan keragaman BAL yang menyusun
mikrobiota pada berbagai komunitas pada saluran pencernaan beberapa
ayam Cemani menggunakan teknik molekuler berbasis 16S rRNA yaitu
dengan metode T-RFLP (Culture-independent method).
2. Mendapatkan isolat BAL yang berpotensi sebagai probiotik dari saluran
pencernaan ayam Cemani (culture-dependent method).
3. Mengidentifikasi BAL terpilih yang dikarakterisasi secara morfologi,
fisiologis dan molekuler.
4. Mempelajari enkapsulasi kultur probiotik dengan cara kering beku.
5. Aplikasi probiotik terhadap performa dan kesehatan ayam ras/broiler.
6. Mempelajari mikrobiota ayam broiler dengan pemberian probiotik.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini memberikan informasi awal berupa database dan fingerprinting
tentang keragaman jenis dan komunitas serta peran bakteri asam laktat sebagai
penyusun mikrobiota saluran pencernaan ayam Cemani, sehingga bisa bermanfaat
dalam menyusun strategi dalam pengembangan peternakan ayam lokal. Isolat
bakteri asam laktat yang diperoleh dapat berpotensi sebagai probiotik pada ayam
baik itu ayam lokal ataupun ayam broiler yang hidup dengan kondisi yang kurang
ideal di daerah tropis, sehingga dapat menjadi salah satu alternatif penggunaan
antibiotik pada pakan ayam.
Kerangka Pemikiran
Ayam Cemani merupakan ayam asli Indonesia yang unik dan tahan
terhadap penyakit. Ketahanan terhadap penyakit kemungkinan disebabkan salah
satunya karena keseimbangan mikrobiota di dalam saluran pencernaannya. Isolat
BAL sebagai penyusun mikrobiotanya kemungkinan berpotensi sebagai probiotik
pada ayam yang hidup di daerah tropis, sehingga dapat digunakan sebagai
pengganti antibiotik pada pakan. Tetapi informasi gambaran mikrobiota di dalam
saluran pencernaan ayam Cemani belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu perlu
dilakukan studi untuk mempelajari populasi dan keragaman BAL pada saluran
pencernaan ayam Cemani dan mengisolasinya untuk mempelajari potensi dan
karakterisasinya sebagai probiotik dan mengujinya secara invivo pada ayam
broiler.
4
Kebaruan/Novelty
Berdasarkan penelusuran literatur yang telah dilakukan, hingga saat ini
belum ada laporan kajian tentang keragaman bakteri asam laktat yang berasal dari
saluran pencernaan ayam Cemani dengan menggunakan teknik Terminal
restriction fragment length polymorphism (T-RFLP). Demikian juga dalam
skrining bakteri asam laktat yang berpotensi sebagai probiotik yang berasal dari
saluran pencernaan ayam Cemani. Isolat probiotik yang diperoleh dapat
diintroduksikan ke dalam ayam broiler yang mempunyai komunitas mikroba
berbeda dengan ayam Cemani dan efikasinya memberikan efek positif dalam
menjaga keseimbangan mikrobiota saluran pencernaan ayam broiler.
Hipotesis Penelitian
a. Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bagian dari mikrobiota saluran
pencernaan (tembolok, ventrikulus, ileum dan sekum) ayam Cemani.
b. Metode culture-independent dengan menggunakan gen 16S rRNA dan
analisa T-RFLP dapat digunakan sebagai alat untuk mengungkap
keragaman BAL pada saluran pencernaan ayam Cemani.
c. Terdapat perbedaan jumlah spesies, kelimpahan dan keragaman BAL
sebagai penyusun mikrobiota tiap relung pada saluran pencernaan ayam
Cemani.
d. Dengan metode culture-dependent dapat diperoleh BAL yang beragam
yang berasal dari saluran pencernaan ayam Cemani.
e. BAL yang diisolasi dari saluran pencernaan ayam Cemani mempunyai
potensi sebagai probiotik pada ayam.
f. BAL yang diperoleh merupakan isolat indigineous saluran pencernaan
ayam.
g. Probiotik yang dihasilkan dapat diintroduksikan ke ayam produksi /
broiler, sehingga dapat menjaga keseimbangan mikrobiota saluran
pencernaan ayam broiler, memperbaiki performa dan kesehatan ayam,
yang pada akhirnya dapat menggantikan fungsi antibiotik pendukung
pertumbuhan (Antibiotic Growth Promoters).
5
Kerangka Penelitian
Ayam Cemani
Saluran pencernaan
(Tembolok, ventrikulus, ileum dan sekum)
Tahap-II: Culturedependent method
Tahap-III: Enkapsulasi dan
formulasi kandidat probiotik
Tahap-IV:Aplikasi probiotik
pada ayam broiler
Probiotik untuk ayam
Data base saluran
pencernaan ayam
Cemani
Tahap-I: Cultureindependent method
6
Tahap I:
Metode Culture-Independent
Ekstraksi DNA
Sampel isi lumen dari tembolok, ventrikulus, ileum dan
sekum
Analisis kuantitas dan kualitas DNA
(spektofotometer /DNA analyzer)
Amplifikasi
dengan primer dan kondisi PCR yang sesuai untuk
BAL
Elektroforesis
untuk visualisasi produk PCR
Purifikasi DNA
(dengan kit purifikasi)
Pemotongan DNA
dengan enzim restriksi (Hae III dan Msp I)
Analisis T-RFLP
7
Tahap II. Metode culture dependent dan isolasi bakteri asam laktat sebagai
kandidat probiotik
Isolasi dan penghitungan jumlah BAL
pada media selektif (MRSA dan GYPA), kondisi anaerob
Penentuan isolat BAL
Morfologi koloni
Pewarnaan Gram
Reaksi peroksida
Pembuatan Kultur
stok
20% (v/v) Gliserol steril
Simpan dalam -80oC
Uji kemampuan probiotik isolat BAL terpilih
Uji sifat antagonis terhadap bakteri patogen
(Escherichia coli JCM 1649 and Salmonella enteritidis
B2586)
Uji ketahanan terhadap pH rendah dan adanya bile salt
Uji penempelan pada hidrokarbon
Uji koagregasi dengan bakteri patogen
Uji koagregasi antar BAL
Uji resistensi terhadap antibiotika
Identifikasi isolat BAL terpilih
Berdasar sekuen 16S rDNA
Pola fermentasi gula dengan kit API
50 CHL
8
Tahap III: Enkapsulasi dan Formulasi probiotik
Preparasi
Bakteri L. Salivarius sebagai probiotik
Pengukuran kinetika pertumbuhan
Penggandaan skala
pada media MRS cair
Enkapsulasi
pelet bakteri pada susu skim
Proses Kering beku
Viabilitas probiotik
Formulasi probiotik
Probiotik
9
Tahap IV:
Efikasi probiotik L. salivarius terhadap penampilan, kesehatan dan komunitas
mikrobiota saluran pencernaan ayam Broiler
Pengujian probiotik
pada ayam Broiler secara in vivo
PB/kontrol
PB + Antibiotik
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
Penampilan
ayam pedaging
Bobot badan akhir
Pertambahan bobot
badan
Konsumsi pakan
Konversi pakan
Mortalitas
Prosentase karkas
Pakan
PB + probiotik 1
(isolat tunggal BAL)
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
Kesehatan
ayam pedaging
Kolesterol daging
Lemak daging
Kolesterol darah
Profil darah
Prosentase
bursa
fabrisius
Prosentase thymus
PB + probiotik 2
(campuran isolat BAL)
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
Komunitas
mikrobiota
Jumlah koliform
Jumlah BAL
Deteksi
keberadaan
probiotik
Analisis
komunitas
mikrobiota
saluran
pencernaan
10
TINJAUAN PUSTAKA
Ayam Cemani
Perkembangan ayam lokal dimulai sejak proses domestikasi, sehingga
dikenal sebagai ayam asli atau native chicken. Berdasarkan referensi pembagian
clade domestikasi, ayam lokal Indonesia sangat berbeda dengan ayam lokal dari
negara Asia lainnya, dan Indonesia merupakan salah satu pusat domestikasi ayam
di dunia (Sulandari et al. 2009b). Banyak potensi genetik tertentu pada ayam lokal
yang belum dikenal, seperti daya tahan terhadap penyakit dan kemampuan
bertahan terhadap iklim tropis yang lebih panas, sehingga mudah dalam
pemeliharaannya. Budidaya ayam lokal di daerah berkembang atas dasar
kesenangan dan kepercayaan masyarakat tradisional. Menurut Nataamijaya (2010)
terdapat 31 rumpun ayam lokal Indonesia yang mempunyai ciri khas yang
berbeda, diantaranya ayam Pelung, ayam Kedu, ayam Nunukan, ayam Merawang,
ayam Merawas, ayam Sedayu, ayam Sentul, ayam Gaok, ayam Cemani dan
lainnya.
Ayam Cemani yang berasal dari daerah Kedu, merupakan plasma nutfah
dari Jawa Tengah, mempunyai ciri spesifik yaitu bulu, kulit, ceker, jengger, pial,
paruh, lidah, tenggorokan, telak (langit-langit mulut), dan dubur berwarna hitam.
Daging dan tulang berwarna kehitam-hitaman. Kata cemani berasal dari bahasa
Jawa yang artinya hitam legam. Ayam Cemani adalah ayam Kedu hitam yang
diseleksi ke arah pemurnian warna hitam, berasal dari kecamatan Kedu,
kabupaten Temanggung, Jawa Tengah. Potensi pemanfaatan ayam ini selain
digunakan dalam acara ritual adat, juga sebagai ayam hias yang eksotis,
dagingnya dipercaya sebagai obat dan produksi telur yang tinggi. Sistem
pemeliharaan dengan pola ransum dan nutrisi pada pemeliharaan ayam Cemani
dilakukan oleh peternak secara sederhana dan turun temurun. Umumnya
pemeliharaannya masih dilakukan secara tradisional atau umbaran sehingga
produktivitasnya tetap bahkan cenderung menurun. Untuk menjaga kualitas dan
keaslian ayam Cemani, peternak mengawinkan sesama ayam Cemani secara alami
dengan perbandingan maksimal satu ayam jantan dengan empat ayam betina
(Nugroho 2013).
Ayam Broiler
Ayam broiler adalah galur ayam hasil budidaya teknologi yang memiliki
karakteristik ekonomis dengan ciri khas yaitu warna bulu putih, pertumbuhan
yang cepat, konversi pakan yang baik, dan dapat dipotong pada usia yang relatif
muda sehingga sirkulasi pemeliharaannya lebih cepat dan efisien serta
menghasilkan daging yang berkualitas baik. Ayam broiler dipasarkan pada bobot
hidup antara 1.4-2.1 kg per ekor ayam yang dilakukan pada umur 4-5 minggu
(Leeson & Summer, 2001). Ayam broiler termasuk ke dalam ordo Galliformes,
famili Phasianidae, genus Gallus, dan spesies Gallus domesticus. Ayam broiler
dihasilkan dari bangsa ayam tipe Cornish. Bangsa ayam ini berbulu putih dan
12
seleksi diteruskan hingga dihasilkan ayam broiler seperti sekarang ini Jenis ayam
broiler antara lain Cobb, Ross, dan Arbor Arches (Amrullah, 2004).
Karakteristik broiler CP 707 yang dihasilkan PT. Charoen Phokphand
antara lain : berat badan umur 5 minggu 2.05 kg, konversi ransum 1.6,
pertumbuhan berat badan 83 g/hari/ekor, konsumsi pakan komulatif sebesar 3
297 g, warna kulit kuning dan warna bulu putih. Bila pertumbuhan 7 hari pertama
mencapai 175 g/ekor, secara umum akan menghasilkan berat badan yang baik
pada masa akhir panen. Kemampuan ayam broiler mengubah ransum menjadi
bobot hidup jauh lebih cepat dibandingkan dengan ayam kampung (Charoen
Pokphand Indonesia 2006).
Kendala usaha peternakan ayam broiler komersial di daerah tropis,
khususnya di Indonesia adalah temperatur harian relatif tinggi, terutama pada
musim kemarau, dan temperatur tahunan rata-rata adalah 26.5oC. Stres karena
panas dapat memicu neurohormonal sehingga ayam mudah terserang penyakit
(Fadilah, 2004).
Saluran Pencernaan Ayam
Saluran pencernaan ayam atau dikenal sebagai saluran gastrointestinal
merupakan saluran yang memanjang dari mulut sampai kloaka dengan beberapa
organ penting diantara keduanya, berfungsi dalam mengubah dan mencerna
makanan menjadi nutrisi yang dapat diabsorbsi dan digunakan oleh tubuh/inang.
Struktur saluran pencernaan terdiri dari mulut, esofagus, tembolok,
proventrikulus, gizzard/ventrikulus, usus halus (duodenum, jejunum & ileum),
dan usus besar (sekum, usus besar dan rektum) (Gambar 1). Masing-masing
bagian memiliki struktur histologi dan anatomi yang dirancang sesuai fungsi
masing-masing dalam proses pencernaan. Masing-masing bagian juga mempunyai
pH lingkungan yang berbeda, tembolok dengan pH 5.5, proventrikulus 2.5-3.5,
gizzard/ventrikulus 2.5-3.5, duodenum 5-6, jejenum 6.5-7, ileum 7.0-7.5, sekum
6-7, dan kolon 7-8 (Salanitro et al. 1974 ).
Makanan yang masuk ke dalam mulut tidak dikunyah karena ayam tidak
mempunyai gigi, dan secara utuh masuk ke dalam tembolok, yang merupakan
perpanjangan dari esofagus. Bagian dalam tembolok dilapisi dengan epitelium
skuamosa non-secretory stratified, makanan berada di tembolok selama 6 jam
sehingga makanan mengalami fermentasi oleh kelompok Lactobacillus. Dari
tembolok masuk ke bagian yang terdiri dari 2 bagian yang terpisah, yaitu
proventrikulus (disebut sebagai true stomach, bagian glandula) dan ventrikulus
(mechanical stomach, bagian muscular). Bagian proventrikulus menghasilkan
asam (HCl) sehingga pada proventrikulus dan ventrikulus memiliki pH yang
rendah. Ventrikulus memiliki otot yang tebal dan kuat yang bekerja secara
mekanis memotong dan menggiling makanan. Pada ayam umbaran sering
ditemukan kerikil yang berfungsi untuk membantu menghancurkan makanan.
Setelah itu makanan memasuki usus halus, di duodenum terdapat enzim–enzim
pencernaan (proteinase, amilase dan lipase), bikarbonat dari pankreas dan empedu
dari hati/liver melalui gall blader. Di usus halus juga disekresikan mucus, serta
13
adanya vili dan mikrovili yang membantu penyerapan nutrisi makanan. Setelah itu
sisa makanan masuk ke usus besar, yang di bagian ini terdapat sepasang sekum.
Di sini terjadi reabsorbsi air yang berlebihan dari fekal dan terjadi fermentasi dari
sisa makanan yang menghasilkan asam lemak, dan dihasilkan vitamin B seperti
Tiamin, riboflavin, niasin, asam pantotenat, piridoksin, biotin, asam folat dan
vitamin B12. Usus besar dikenal sebagai kolon, di sini sangat kecil terjadi
penyerapan dan pencernaan, pelet fekal dan asam urat dikeluarkan melalui kloaka
(Daghir, 1995; Jacob et al. 2011).
Gambar 1 Struktur saluran pencernaan ayam ( sumber : www.Geauga4h.org/
poultry/chicken_digestion.htm
Mikrobiota Saluran Pencernaan Ayam
Sepanjang saluran pencernaan terdapat komunitas mikroorganisme yang
terdiri dari bakteri, khamir, arkaea, protozoa, kapang anaerobik dan bakteriofag,
yang hal ini sering disebut sebagai mikrobiota saluran pencernaan. Komposisi
mikrobiota saluran pencernaan sangat dinamis dan ada pergantian dalam populasi
tiap relungnya karena adanya perubahan kondisi lingkungan masing masing
relung. Mikrobiota saluran pencernaan didominasi oleh bakteri, dari penelitian
berbasis pengkulturan (culture-dependent), terdapat sekitar 1010-1012 sel/gram
sampel fekal dari isi kolon dan terdapat sekitar 500 spesies bakteri yang berbeda
(Salanitro 1974). Penelitian berbasis culture-independent mendapatkan bahwa
terdapat 1000 spesies dalam suatu relung dalam saluran pencernaan manusia, dan
50-90% merupakan bakteri yang belum dapat dikulturkan dan bakteri yang belum
dapat dikarakterisasi/dikenali (Zoetendal et al. 2004). Mikrobiota saluran
pencernaan ayam berbeda dengan manusia karena perbedaan fisiologi saluran
pencernaan dan asupan makanannya. Kelimpahan dan keragaman
mikrobiota bervariasi sepanjang saluran pencernaan dan akan berkurang pada
relung yang memiliki kondisi kurang kondusif untuk pertumbuhan bakteri dan
14
pada tempat dengan waktu retensi yang cepat. Mikrobiota ayam berasal dari
lingkungan saat menetas, pakan dan pekerja yang menangani saat penetasan
(Stanley et al. 2013).
Dari metode berbasis pengkulturan, populasi bakteri yang melimpah di
tembolok adalah lactobacilli yang melekat pada epitel melalui komponen
karbohidrat pada dinding sel bakteri.
Bakteri penghuni tembolok ini
memfermentasi makanan yang masuk dan menghasilkan asam laktat yang
menyebabkan pH lingkungan tembolok turun menjadi pH 5. Kondisi lingkungan
dalam proventrikulus sangat asam sehingga merupakan lingkungan yang kurang
menyenangkan bagi sebagian besar bakteri. Ventrikulus/gizzard memiliki pH
rendah yang dipengaruhi oleh pH proventrikulus, sehingga lingkungan ini
didominasi oleh populasi lactobacilli, meskipun masih dibawah 108 cfu/g, selain
itu terdapat Enterococcus dan Escherichia coli. Usus halus memiliki daya
peristaltik yang tinggi sehingga kurang menguntungkan bagi bakteri untuk berada
di lumen. Namun, terdapat lactobacilli dalam jumlah tinggi dan populasi yang
stabil setelah usia sekitar dua minggu (Barnes et al. 1972). Lumen usus halus
menunjukkan bahwa mayoritas bakteri berupa bakteri fakultatif anaerob, dengan
Lactobacillus sp., Enterococcus sp. dan E. coli ( sekitar 60-90 %) dan juga
beberapa bakteri anaerob obligat seperti eubacteria, clostridia, propionibacteria
dan fusobacteria. Awalnya sekum didominasi oleh lactobacilli, coliform dan
enterococci, namun karena rendahnya tingkat aliran peristaltik, mikrobiota sekum
lebih stabil dan kompleks dan dalam usia empat minggu ditemukan anggota
bacteroides, eubacteria, bifidobacteria, lactobacilli dan clostridia (Salanitro et al.
1978).
Dari studi molekuler berbasis tanpa pengkulturan, memungkinkan wawasan
yang lebih besar tentang mikrobiota usus baik dari karakter maupun
kompleksitasnya. Dari berbagai studi dijelaskan bahwa mayoritas bakteri saluran
pencernaan ayam dan mamalia tetap uncharacterised, dan menunjukkan hanya 10
% dari spesies mikrobiota yang yang dikenal, 35 % tidak diketahui spesiesnya
tetapi dapat dikenal genusnya dan sisanya 55 % adalah bakteri yang benar-benar
tidak diketahui. Studi molekuler telah menegaskan bahwa dalam ileum 70 % dari
populasi bakteri didominasi lactobacilli dan sisanya 30 % terutama terdiri dari
clostridia, streptococci dan enterococci (Bjerrum et al. 2006).
Fingerprinting Komunitas
Untuk memahami peran dan kontribusi mikrobiota saluran pencernaan
terhadap kesehatan usus diperlukan pengetahuan tentang keberadaan spesies yang
mendiami saluran pencernaan dan perubahannya. Metode tradisional berbasis
pengkulturan hanya mengkarakterisasi bakteri dari saluran pencernaan, tetapi
pendekatan metode ini tidak menunjukkan tentang keragaman, terlebih lagi hanya
10-50% bakteri yang bisa dikulturkan (Zoetendal et al. 2004). Bakteri anaerob
yang diisolasi dari saluran pencernaan tumbuh lambat dan dapat memakan waktu
hingga dua minggu untuk tumbuh dalam kultur di laboratorium, sebagai
15
konsekuensinya, tidak sepenuhnya dapat dibuat profil komunitas berbasis
pengkulturan. Selain itu, penggunaan media selektif hanya memberi kesempatan
tumbuh kelompok bakteri tertentu yang sudah dikenal, sehingga akan memberikan
hasil profil komunitas yang bias dan tidak realistis.
Metode culture-independent yang mulai muncul tahun 1980-an
memungkinkan ahli mikrobiologi untuk memperoleh pandangan yang lebih
akurat tentang mikrobiota saluran pencernaan tanpa perlu pengkulturan terlebih
dahulu. Ada banyak teknik yang memanfaatkan teknologi molekuler sebagai
sarana untuk memantau populasi mikroba, antara lain microarray DNA,
fluorescent in situ hybridisation (FISH), kloning dan sekuencing gen 16S rRNA,
quantitative PCR, terminal fragment restriction length polymorphism (T-RFLP),
temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) dan lainnya. Teknik culture-independent umumnya
melibatkan teknik PCR sehingga penting untuk memperhatikan gen yang menjadi
target, dasar analisa serta metode ekstraksi DNAnya. Keterbatasan teknik cultureindependent sangat dipengaruhi oleh kemampuan metode ekstraksi DNA yang
digunakan. Dalam ekstraksi DNA dari lumen, adanya nuklease maupun inhibitor
PCR dapat terekstraksi dari isi lumen sehingga sangat mempengaruhi kualitas
DNA hasil ekstraksi (Dunbar et al. 2001, Moeseneder et al. 1999).
T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism) merupakan
metode yang efektif untuk membedakan komunitas bakteri pada berbagai
lingkungan. Metode ini merupakan metode yang cepat untuk menemukan
perbedaan antara komunitas saluran pencernaan manusia dengan menggunakan
sampel berupa feses dari orang yang mempunyai gaya hidup berbeda (Dicksved et
al. 2007), komunitas mikroba pada paru-paru orang yang sakit cystic fibrosis
(Roger et al. 2010), mengkarakterisasi komunitas bakterioplankton di laut
(Moeseneder et al. 1999). T-RFLP dapat digunakan untuk melihat secara
kuantitatif perubahan pada komunitas mikroba karena kelimpahan relatif suatu
populasi dalam komunitas dapat dibandingkan antar sampel dengan perlakuan
yang berbeda atau diambil pada waktu yang berlainan. Masing-masing T-RF
mewakili minimal satu spesies bakteri, terlihat sebagai satu puncak (peak),
sementara luas daerah di bawah puncak tersebut menunjukkan kelimpahan
relatifnya.
Keunggulan metode ini reproducible (berulang kali dipakai dengan hasil
yang sama) prosedur yang relatif cepat, high-throughput dan relatif tidak mahal.
Kekurangan metode ini kurang dapat mendeteksi lingkungan yang sangat
beragam dan kurang akurasi analisanya dalam menghitung keragaman spesies
dalam komunitas yang kompleks karena hanya spesies dominan dengan
kelimpahan lebih dari 1% yang terdeteksi (Li et al. 2007), sehingga spesies yang
rendah kelimpahannya/langka tidak akan dapat terdeteksi, padahal spesies langka
banyak memberikan besarnya keragaman. Selain itu adanya T-RF yang sama
dapat dihasilkan dari beberapa taksa yang berbeda kekerabatannya (Blackwood et
al. 2003). Dengan demikian Dunbar et al. (2000) menyatakan bahwa teknik
16
pengkulturan dan penghitungan sel secara langsung tetap dibutuhkan karena dapat
saling melengkapi kekurangan masing-masing teknik yang dibutuhkan.
Probiotik untuk Ayam
Penyakit pada saluran pencernaan menjadi perhatian dalam industri unggas
karena dapat menurunkan produktivitas, menaikkan mortalitas, berpengaruh
terhadap kesehatan unggas dan pada manusia sebagai konsumennya. Pada empat
dekade sebelumnya, antibiotik disuplementasikan pada pakan unggas untuk
menaikkan performa dan efisiensi pakan serta melindungi unggas dari berbagai
pengaruh mikroba usus yang patogen dan non patogen. Penggunaan antibiotik
sebagai pemacu pertumbuhan kadarnya sangat kecil, bertujuan untuk melawan
infeksi dan diberikan dalam jangka waktu yang lama (beberapa minggu sampai
bulan). Pemberian dalam jangka waktu yang lama dan dosis rendah menjadikan
mikrobiota terseleksi dan menjadi resisten. Akan tetapi, pelarangan antibiotic
growth promoters (AGPs) dalam pakan ternak merupakan faktor penting yang
menyebabkan perubahan ekologi mikrobiota dalam saluran pencernaan ayam
broiler, sehingga banyak terjadi wabah radang usus nekrotik (necrotic enteristis).
Istilah mikroba yang diberikan secara langsung /direct-fed microbial
(DFM) atau probiotik didefinisikan sebagai suplemen pakan yang berupa mikroba
hidup yang memberi efek menguntungkan bagi inang dengan meningkatkan
keseimbangan mikrobiota usus (Fuller 1999). Probiotik digunakan pada ayam
terutama untuk membantu memelihara status kesehatan dengan menjaga
keseimbangan mikrobiota saluran pencernaan, mengurangi potensi bakteri
patogen dan
memiliki efek meningkatkan kinerja dan produktivitas
(pertumbuhan, produksi telur, dan konversi pakan). Gangguan pencernaan pada
ayam menjadi perhatian serius oleh adanya sindrom diare yang terpicu pada saat
periode sensitif pertumbuhan (hari-hari pertama kehidupan setelah menetas ) atau
stres karena faktor makanan (ketidakseimbangan nutrisi), dan adanya bakteri dan
kapang dalam jumlah yang tinggi. Probiotik pada ayam untuk mencegah dan
melawan gangguan pencernaan melalui competitive exclusion (mengganggu
kemampuan pelekatan dan kolonisasi) bakteri patogen (Salmonella enteritidis,
Escherichia coli, Clostridium perfringens), menjaga homeostasis da
SALURAN PENCERNAAN AYAM CEMANI BERDASARKAN
GEN 16S rRNA DAN POTENSI PENGGUNAANNYA
SEBAGAI PROBIOTIK
SITI NUR JANNAH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Analisis Keragaman Bakteri
Asam Laktat dari Saluran Pencernaan Ayam Cemani Berdasarkan Gen 16S rRNA
dan Potensi Penggunaannya Sebagai Probiotik adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2014
Siti Nur Jannah
NIM G361090011
RINGKASAN
SITI NUR JANNAH. Analisis Keragaman Bakteri Asam Laktat Dari Saluran
Pencernaan Ayam Cemani Berdasarkan Gen 16S rRNA dan Potensi
Penggunaannya sebagai Probiotik.
Dibimbing oleh IMAN RUSMANA,
ACHMAD DINOTO dan KOMANG G. WIRYAWAN.
Di Indonesia terdapat 31 rumpun ayam lokal dengan karakteristik yang
berbeda antara satu jenis dengan jenis lainnya. Salah satu jenisnya adalah ayam
Cemani, yang mempunyai karakteristik unik dengan warna hitam diseluruh
tubuhnya dan ketahanannya terhadap penyakit. Tujuan penelitian ini adalah untuk
mendapatkan informasi awal tentang komunitas bakteri asam laktat sebagai
penyusun dari mikrobiota saluran pencernaan ayam Cemani dan mendapatkan
isolat bakteri asam laktat sebagai probiotik pada ayam.
Analisa keragaman bakteri dengan menggunakan metode T-RFLP
dilakukan dengan isolasi DNA genom langsung dari sampel lumen saluran
pencernaan ayam (tembolok, ventrikulus, ileum dan sekum), primer yang
digunakan adalah primer forward 27F dilabel dengan 6-carboxyfluorescein dan
primer reverse spesifik untuk bakteri asam laktat SG-Lab-0677, enzim restriksi
yang digunakan HaeIII dan MspI. Selanjutnya ditentukan jumlah filotipe,
kelimpahannya (indeks Shannon Wiener) dan indeks kesamaan komunitas (indeks
Sorensen). Analisa plate counts dilakukan untuk memperoleh nilai total bakteri
asam laktat dan juga untuk memperoleh isolat kandidat probiotik, dengan cara
ditumbuhkan pada cawan petri yang berisi media padat MRS dan GYP yang
ditambahkan dengan 0.5% CaCO3, diinkubasi secara anaerobik selama 48 jam
pada suhu 37°C. Isolat kandidat probiotik diuji aktivitasnya meliputi uji aktivitas
antimikroba terhadap bakteri indikator, uji toleransi terhadap pH dan garam
empedu, uji hidrofobisitas pada permukaan sel, uji koagregasi, uji aktivitas
enzimatik dan uji sensitivitas terhadap antibiotik. Identifikasi secara molekuler
dan fisologis dengan fermentasi gula. Galur probiotik (L. Salivarius) yang
diperoleh dienkapsulasi denngan 5% susu skim dan dilakukan pengawetan dengan
metode kering beku.
Selanjutnya dilakukan aplikasi L. salivarius sebagai
probiotik dalam ransum terhadap penampilan dan kesehatan ayam serta
komunitas mikrobiota ayam broiler.
Hasil analisa T-RFLP menunjukkan perbedaan dan dinamika populasi antara
mikroba pada tembolok, ventrikulus, ileum dan sekum. Tidak semua filotipe BAL
dapat diidentifikasi, beberapa filotipe BAL (41 %) tidak dapat diidentifikasi
(unidentified) dan 17% diidentifikasi sebagai bakteri yang belum dapat
dikulturkan (unculturable), hal ini mengacu pada database yang tersedia di
MiCA3. Jumlah filotipe (S) BAL di ileum (9.5) lebih tinggi daripada di komunitas
lain dan jumlah terendahnya adalah di sekum (6.5), indeks keragaman ShannonWienner menunjukkan indeks keragaman bervariasi dengan nilai tertinggi di
ileum (2.13), sedangkan yang terendah di sekum (1.08), indeks kesamaan
komunitas tertinggi (0.70) adalah antara komunitas ventrikulus dan ileum. Dengan
menggunakan metode tradisional pengkulturan, populasi bakteri asam laktat dari
saluran pencernaan ayam diketahui antara 7.12 sampai 9.07 log CFU g - 1 dan
jumlah tertingginya ditemukan di bagian tembolok. Dari uji kandidat probiotik
didapatkan isolat CSP004, CCM011 dan CVM002 mempunyai aktivitas
antimikroba terhadap bakteri patogen, tahan terhadap pH2 dan 0.1% garam
empedu, mempunyai hidrofobisitas yang kuat pada permukaan sel dan mucus,
mempunyai enzim phytase dan protease, tetapi tidak mempunyai enzim amilase
dan lipase, mempunyai koagregasi dengan bakteri asam laktat lainnya tetapi
lemah koagregasinya dengan bakteri patogen, dan kesemua isolat tidak ada yang
resisten terhadap antibiotik. Ketiga isolat probiotik teridentifikasi sebagai
Lactobacillus salivarius, tetapi dengan menggunakan kit API 50CHL, ketiganya
memperlihatkan perbedaan pola dalam fermentasi gula. Penambahan probiotik
belum memperbaiki penampilan ayam broiler yang meliputi bobot badan akhir,
konsumsi pakan, FCR, persentase karkas, profil darah dan persentase organ
limpatik, akan tetapi dengan penambahan probiotik dengan galur tunggal maupun
campuran dapat meningkatkan pertambahan bobot badan ayam pada minggu
pertama kehidupan ayam. Dari analisa T-RFLP penambahan probiotik galur
tunggal terbukti dapat memperbaiki mikrobiota saluran pencernaan broiler pada
akhir minggu.
Kata kunci : ayam Cemani, bakteri asam laktat, probiotik, T-RFLP.
SUMMARY
SITI NUR JANNAH. Diversity Analysis of Lactic Acid Bacteria from
Gastrointestinal Tract of Cemani Chicken Based on 16S rRNA gene and Their
Potential Use as Probiotics. Supervised by IMAN RUSMANA, ACHMAD
DINOTO dan KOMANG G. WIRYAWAN.
There are thirty one of native chickens in Indonesia with various genotipic
and phenotipic characteristics. Cemani chicken is one of Indonesian native
chicken showing unique morphological appearances with black colour concerns
the whole body and their resistance to disease. The aims of this study were to
obtain preliminary information about the microbial community of lactic acid
bacteria (LAB) in the gastrointestinal tract of Cemani chicken and to get candidate
probiotics for chickens.
LAB diversity analysis using T-RFLP method performed by isolation of
genomic DNA from lumen samples (crop, ventriculus, ileum and cecum) directly.
Primers used were 27F forward primer that labeled with 6-carboxyfluorescein and
a specific reverse primer for lactic acid bacteria, SG-Lab-0677. PCR products
were cutted with HaeIII and MspI restriction enzyme. The lengths of the T-RFs
were determined by comparison with size standards using the Peak Scanner TM
software. Biodiversity value is determined based on the number of phylotypes,
their abundance (Shannon Wiener index) and pairwise similarity index
(Sorensen’s index). Analysis of plate counts in petri dishes containing MRS and
GYP media conducted to obtain the total number of LAB and probiotic
candidates. The probiotic candidates were screened for their probiotic properties.
Probiotic strains encapsulated with 5% skim milk by freeze-drying preservation
method. Furthermore, the application of probiotics strain (L. salivarius) in the
diet on performance, healthy of chickens and microbiota community were
conducted.
The results showed the differences between population dynamics of LAB
in crop, ventriculus, ileum and cecum. Not all phylotypes can be identified using
MiCA3 database, some filotipe (41% unidentified) and 17% identified as
unculturable bacteria. The number of LAB phylotypes in the ileum (9.5) is higher
than in other communities and the lowest number is in the cecum (6.5), ShannonWienner diversity index showed the highest diversity index in the ileum (2.13),
while the lowest in the cecum (1:08), the ventriculus and ileum community have
the highest similarity index (0.70). By culturing method, the population of LAB
were 7.12 to 9.07 log CFU/g. Three selected isolates, i.e. CCM011, CSP004, and
CVM002 showed the highest inhibition activity, high cell surface hidrophobicity,
showing phytase and protease activity (but no amylase and lipase activity), weak
coagregation with pathogen, and no resistance to the examined antibiotics. The
isolates were identified as Lactobacillus salivarius, however, each isolate had
different profiles of sugar fermentation. The probiotics supplemented feed have
no improve the appearance of broiler chickens which includes final body weight,
feed intake, FCR, carcass percentage, profile of the blood and lymphatic organs
percentage, but in the first week experiment indicated that chickens fed with
probiotics supplemented feed (single or mix cultures of LAB) have higher body
weight gain than the control or antibiotic dietary treatments. The supplemented
feed with the single-strain probiotic can improved gastrointestinal tract microbiota
in the last week treatment.
Keywords: Cemani chicken, lactic acid bacteria, probiotics, T-RFLP.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ANALISIS KERAGAMAN BAKTERI ASAM LAKTAT DARI
SALURAN PENCERNAAN AYAM CEMANI BERDASARKAN
GEN 16S rRNA DAN POTENSI PENGGUNAANNYA
SEBAGAI PROBIOTIK
SITI NUR JANNAH
Disertasi ini
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada
Program Studi Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji pada Ujian Tertutup : Prof Dr Ir Lilis Nuraida, MSc
Dr Ir Rita Mutia, MAgr
Penguji pada Ujian Terbuka : Dr Ir Yantyati Widyastuti
Dr Ir Sumiati, MSc
Judul Disertasi
Nama
NIM
: Analisis Keragaman Bakteri Asam Laktat dari
Saluran Pencernaan Ayam Cemani Berdasarkan Gen
16S rRNA dan Potensi Penggunaannya sebagai
Probiotik
: Siti Nur Jannah
: G361090011
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua
Dr Achmad Dinoto, MSc
Anggota
Prof Dr Ir Komang G. Wiryawan
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Mikrobiologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr Anja Meryandini, MS
Dr Ir Dahrul Syah, MSc Agr
Tanggal Ujian: 16 Juli 2014
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Bismillaahirrahmaanirrahiim
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah Subhanahu wa Ta’ala
atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil
diselesaikan. Disertasi ini ditulis berdasarkan hasil penelitian yang berjudul
Analisis Keragaman Bakteri Asam Laktat dari Saluran Pencernaan Ayam Cemani
Berdasarkan Gen 16S rRNA dan Potensi Penggunaannya sebagai Probiotik yang
dilaksanakan sejak bulan September 2011 hingga Nopember 2013.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr
Ir Iman Rusmana, MSi, Dr Achmad Dinoto, MSc dan Prof Dr Ir Komang G.
Wiryawan selaku komisi pembimbing yang selalu memberi masukan, motivasi
dan semangat kepada penulis sehingga karya ilmiah ini bisa diselesaikan. Ucapan
terima kasih juga penulis sampaikan kepada ibu Prof Dr Ir Lilis Nuraida, MSc dan
ibu Dr Ir Rita Mutia, MAgr sebagai penguji luar komisi pada ujian tertutup dan
kepada Ibu Dr Ir Yantyati Widyastuti dan ibu Dr Ir Sumiati, MSc pada ujian
terbuka yang telah memberi masukan dan saran untuk penulisan disertasi ini lebih
baik.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan berturut-turut kepada Direktorat
Pendidikan Tinggi yang telah memberikan dana pendidikan, Rektor Universitas
Diponegoro yang telah mengijinkan penulis untuk tugas belajar, Ketua Program
Studi dan para dosen Pascasarjana Program Studi Mikrobiologi IPB, seluruh staf
peneliti dan teknisi bidang di Lab Mikrobiologi Terapan, Lab Genetika Mikroba,
dan Lab Biokimia Mikroba, bidang Mikrobiologi, Puslit Biologi LIPI, dan Teknisi
di Lab ilmu nutrisi unggas (ibu Lanjarsih dan pak Arif Darmawan) dan para
pekerja di Kandang C yang telah banyak membantu dalam penelitian ini.
Akhirnya sujud sungkem terima kasih penulis haturkan kepada suami
tercinta Ir Teguh Suroso, MSi atas doa dan ijinnya dan terima kasih atas doa yang
ikhlas dan pendidikan yang diberikan dari Ibunda Asfariyah Faqih dan Ayahanda
Drs Moh. Thoha (Alm) dan terima kasih atas doa dari ananda tersayang (Hilmi,
Syauqi dan Faruq). Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2014
Siti Nur Jannah
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................................vi
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... viii
PENDAHULUAN ................................................................................................... 1
Latar Belakang.................................................................................................. 1
Tujuan Penelitian .............................................................................................. 3
Manfaat Penelitian ............................................................................................ 3
Kerangka Pemikiran ......................................................................................... 3
Kebaruan ........................................................................................................... 4
Hipotesis Penelitian .......................................................................................... 4
Kerangka Penelitian .......................................................................................... 5
TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................................ 11
Ayam Cemani ................................................................................................ 11
Ayam Broiler .................................................................................................. 11
Saluran Pencernaan Ayam ............................................................................. 12
Mikrobiota Saluran Pencernaan Ayam ........................................................... 13
Fingerprinting Komunitas ............................................................................. 14
Probiotik untuk Ayam .................................................................................... 16
Bakteri Asam Laktat ...................................................................................... 17
METODE ............................................................................................................... 19
Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................................ 19
Tahapan Penelitian ......................................................................................... 19
Tahap I: Analisis Keragaman Bakteri Asam Laktat (BAL) pada Saluran
Pencernaan Ayam Cemani dengan Menggunakan Metode Terminal
Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) ................................ 19
Tahap II : Isolasi dan Seleksi BAL yang Berpotensi sebagai Probiotik ....... 22
Tahap III. Enkapsulasi Bakteri L. Salivarius Sebagai Probiotik
dengan Teknik Kering Beku .......................................................................... 26
Tahap IV. Efikasi L. salivarius sebagai Probiotik dalam Pakan
terhadap Penampilan dan Kesehatan Ayam serta Komunitas
Mikrobiota Ras Pedaging/ Broiler ................................................................. 27
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................... 33
Tahap I : Analisis Keragaman BAL dari Saluran Pencernaan Ayam
Cemani dengan Menggunakan Metode T-RFLP ........................................... 33
Tahap II : Populasi BAL yang dapat Dikulturkan dari Saluran
Pencernaan Ayam Cemani dan Uji Potensi Probiotik.................................... 42
Tahap III : Enkapsulasi Bakteri L. salivarius sebagai Probiotik
dengan Teknik Kering Beku / Freeze-drying ................................................ 54
Tahap IV : Aplikasi L. salivarius sebagai Probiotik terhadap
Penampilan, kesehatan dan Mikrobiota Saluran Pencernaan Ayam
Broiler ........................................................................................................... 56
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ........................................................................................................ 73
Saran .............................................................................................................. 74
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 75
LAMPIRAN .......................................................................................................... 83
DAFTAR RIWAYAT HIDUP .............................................................................. 88
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Susunan pakan perlakuan dalam penelitian pada ayam broiler
selama pemeliharaan 5 minggu
Kandungan nutrisi pakan perlakuan
Identifikasi filotipe berdasarkan pada database MiCA3 secara
online
Indeks kesamaan pasangan Sorensen (Cs) komunitas BAL dalam
saluran pencernaan ayam Cemani
Total bakteri asam laktat yang dapat dikulturkan dan pH dari
saluran pencernaan ayam Cemani
Jumlah bakteri asam laktat yang mempunyai aktivitas
antimikroba terhadap E. coli dan S. enteritidis menggunakan uji
difusi agar
Aktivitas penghambatan supernatan bebas sel isolat BAL terpilih
terhadap E.coli and S. enteritidis
Ketahanan hidup isolat BAL terpilih dengan adanya faktor
penghambat
Aktivitas enzimatik isolat bakteri asam laktat kandidat probiotik
Diameter zona hambat kerentanan isolat BAL terpilih terhadap
berbagai jenis antibiotik (Rerata ± SE) dan status kerentanannya
Hasil identifikasi isolat menggunakan API 50 CHL dan sekuen
16S rDNA dari isolat CCM011, CSP004 dan CVM002
Pola fermentasi gula isolat bakteri asam laktat (LAB)
menggunakan Kit API 50 CHL
Waktu generasi dan laju pertumbuhan spesifik isolat bakteri asam
laktat yang ditumbuhkam pada medium MRS cair pada suhu
36OC selama 36 jam
Viabilitas Lactobacillus salivarius sebelum dan setelah proses
freeze-drying
Pengaruh pemberian pakan probiotik terhadap performa ayam
broiler selama 35 hari pemeliharaan (n=50)
Profil darah ayam yang diberi perlakuan probiotik (n=5)
Persentase bobot bursa fabrisius dan timus ayam broiler umur
5 minggu (n=5)
Kadar kolesterol serum darah ayam yang diberi perlakuan (n= 5)
Energi metabolis semu pakan perlakuan (n=5)
Indeks keragaman Shannon Wiener (H’) dari komunitas bakteri
dalam saluran pencernaan ayam broiler
28
29
35
41
43
44
45
46
47
50
51
53
54
55
56
60
63
63
65
71
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Struktur saluran pencernaan ayam
Produk amplifikasi gen 16S rRNA dari saluran pencernaan ayam
Cemani menggunakan primer 27F-FAM dan S-G-Lab 0677R
Profil T-RF BAL dalam saluran pencernaan ayam Cemani yang
teridentifikasi berdasar database MiCA3 dan isolat kandidat
probiotik L. salivarius CSP004
Distribusi kelimpahan relatif masing-masing filotipe BAL yang
terdapat pada setiap relung saluran pencernaaan ayam Cemani.
Persentase kelimpahan relatif T-RF yang signifikan dari filotipe
BAL dalam sekum ayam Cemani.
Jumlah filotipe/ spesies dan indeks keragaman Shannon
Wiener komunitas BAL pada saluran pencernaan ayam Cemani.
Jumlah total T-RF yang mewakili filotipe BAL dalam
saluran pencernaan secara individual dan komposit dari
7 ayam Cemani
Morfologi sel isolat probiotik CCM011, CSP004, dan CVM002
dengan menggunakan mikroskop cahaya
Kemampuan koagregasi antar isolat BAL terpilih (n=3).
Kemampuan koagregasi isolat BAL (n=3) dan bakteri indikator
(E. coli and S.enteritidis)
Gell agarosa yang menunjukkan pita potongan dari gen penyandi
16S rRNA hasil amplifikasi PCR
Pohon filogeni yang dihasilkan dari analisa fulllength sekuen 16S
rDNA isolat BAL dengan menunjukkan posisi L. salivarius
CCM011, CSP004 dan CVM002 diantara sejumlah lactobacilli
Kurva Pertumbuhan L. salivarius CSP004, CCM011 dan
CVM002 dalam media MRS cair selama 36 jam.
Pertambahan bobot badan mingguan broiler yang diberi
perlakuan pakan berbeda
Perbedaan pertambahan bobot badan ayam pada minggu pertama
dengan minggu ke lima.
Pengaruh pakan probiotik terhadap populasi koliform dan
bakteri asam laktat dalam ileum
Pengaruh pakan probiotik terhadap populasi koliform dan
bakteri asam laktat dalam sekum
Profil komunitas bakteri asam laktat yang didapatkan dari
sekum ayam broiler yang diberi perlakuan penambahan
13
34
36
38
39
40
42
45
48
49
51
52
55
57
58
66
67
19
probiotik (n=5)
Profil komunitas mikrobiota sekum ayam broiler yang diberi
perlakuan penambahan probiotik (n=5)
69
70
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
Dinamika jumlah dan kelimpahan relatif BAL pada saluran
pencernaan ayam Cemani (dengan menggunakan enzim
restriksi Hae III
Dinamika jumlah dan kelimpahan relatif BAL pada saluran
pencernaan ayam Cemani (dengan menggunakan enzim
restriksi MspI
Karakterisasi isolat BAL dari saluran pencernaan ayam Cemani
dengan pada media MRSA dan GYPA.
Rerata suhu dan kelembaban udara mingguan di lingkungan
kandang ayam
83
84
85
87
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Produk peternakan unggas, terutama ayam ras pedaging / broiler sangat
populer di masyarakat. Broiler dan produknya selain merupakan pangan yang
bergizi tinggi, juga harganya lebih murah dibandingkan produk daging lainnya.
Produksi broiler di Indonesia mengalami peningkatan tiap tahun seiring dengan
peningkatan jumlah penduduk. Pada tahun 2008 produksi broiler di Indonesia
sebesar 902 052 000 ekor, dan meningkat 50% pada tahun 2013 menjadi 1 355
288 000 ekor (Ditjennak, 2013). Broiler menyumbang produk peternakan terbesar,
sekitar 73.11% dari seluruh populasi ternak unggas (1 853 762 000 ekor) di
Indonesia pada tahun 2013. Meningkatnya produk peternakan tersebut
menyebabkan peningkatan penggunaan obat-obatan, terutama antibiotik untuk
pencegahan terhadap penyakit pada ayam.
Penggunaan antibiotik sebagai faktor pertumbuhan atau Antibiotic Growth
Promoters (AGPs), diberikan melalui pakan dalam jumlah sedikit atau tingkat
sub-terapeutik dan dalam jangka yang lama. Namun penggunaan AGPs dapat
mengganggu kesehatan manusia sebagai konsumennya, karena adanya residu
antibiotik dalam bahan pangan dan munculnya galur bakteri zoonotik yang
resisten terhadap antibiotik. Hal ini bersifat merugikan karena menurunkan
efektivitas terapi antibiotik yang digunakan dalam pengobatan berbagai infeksi
pada manusia sebagai konsumennya (Dahiya et al. 2006). Sejak 1 Januari 2006
Uni Eropa melarang penggunaan antibiotik sebagai faktor pertumbuhan pada
produk peternakan. Konsekuensi utama pelarangan penggunaan AGPs antara lain
meningkatnya biaya pakan sekitar 3% dalam produksi ayam sebagai akibat dari
konversi pakan yang kurang menguntungkan dan meningkatnya penyakit
necrotic enteritis pada unggas.
Untuk meningkatkan produksi ayam dan tetap menyediakan produk
peternakan yang aman untuk dikonsumsi, perlu diusahakan alternatif penggunaan
antibiotik atau obat-obatan dalam industri peternakan. Salah satu cara dengan
penggunaan imbuhan pakan berupa probiotik yang berperan menjaga
keseimbangan mikrobiota usus, meningkatkan mekanisme pertahanan alami inang
sehingga berpengaruh baik terhadap performa dan kesehatan ayam. Probiotik
merupakan mikoorganisme hidup yang diberikan dalam jumlah yang cukup yang
memberikan efek menguntungkan terhadap kesehatan inang (FAO/WHO 2002).
Efek menguntungkan itu antara lain menjaga homeostasis mikrobiota usus,
menstabilkan fungsi penghalang saluran gastrointestinal (Salminen et al. 1996),
ekspresi bakteriosin, aktivitas enzimatik yang menginduksi absorpsi dan nutrisi
(Hooper 2000), efek imunomodulasi, penghambatan enzim prokarsinogenik dan
mencegah kemampuan patogen untuk mengkolonisasi pada mukosa (Gill 2003).
Mikroba yang sering digunakan sebagai probiotik pada ayam berasal dari
kelompok bakteri asam laktat (BAL) (Patterson dan Burkholder 2003; Mojgani et
al. 2007; Torshizi et al. 2008; Vargas-Rodriguez et al. 2013). BAL telah lama
2
secara luas digunakan sebagai kultur starter dalam fermentasi makanan, produk
susu dan pakan. Selain itu, BAL telah dikenal berperan penting bagi kesehatan
manusia dan hewan. BAL digunakan sebagai probiotik untuk meningkatkan
mikrobiota normal usus inangnya karena kemampuannya menghasilkan berbagai
zat antimikroba termasuk asam laktat, alkohol, karbondioksida, diasetil, hidrogen
peroksida, bakteriosin dan metabolit lainnya ( Gaggia et al. 2010) .
Probiotik komersial telah banyak terdapat di pasaran, akan tetapi
potensinya di Indonesia yang beriklim panas belum banyak dikembangkan.
Probiotik dengan memanfaatkan isolat lokal yang diisolasi dalam saluran
pencernaan ayam lokal berpotensi sebagai probiotik di Indonesia. Di Indonesia,
terdapat 31 jenis ayam lokal dengan karakteristik genotipik dan fenotipik yang
berbeda antara satu jenis dengan jenis lainnya. Salah satu diantaranya adalah
ayam Cemani. Ayam Cemani merupakan salah satu ayam asli (native chicken)
Indonesia yang berasal dari Kedu, Kabupaten Temanggung, Provinsi Jawa
Tengah. Ayam ini menunjukkan penampilan morfologi unik dengan warna hitam
di seluruh tubuh (Ismoyowati et al. 2012). Umumnya, ayam Cemani di Indonesia
digunakan untuk produksi telur dan daging ke pasar lokal. Kadang-kadang juga
digunakan dalam upacara ritual dan sebagai obat (Nugroho 2013), selain itu ayam
ini memiliki ketahanan tinggi terhadap penyakit, terutama terhadap virus dan
patogen usus (Sulandari et al. 2009a; Nataamijaya 2010). Kemampuan resistensi
terhadap penyakit dan beradaptasi terhadap kondisi lingkungan dapat dipengaruhi
oleh keseimbangan mikrobiota usus didalamnya (Lan et al. 2004, Gaggia et al.
2010).
Penelitian tentang sifat telur dan daging ayam Cemani secara intensif telah
dipelajari (Lukasiewicz et al. 2009; Wahyuni et al. 2011; Kusumasari et al. 2013),
tetapi penelitian keanekaragaman BAL dari saluran pencernaan ayam Cemani di
Indonesia belum dilaporkan. Studi tentang fingerprinting suatu komunitas akan
membantu memberi pemahaman hubungan antara keragaman mikroba dalam
komunitas tersebut dan karakter spesifik yang dihasilkan. Sehingga sangat penting
untuk mempelajari keanekaragaman BAL pada ayam Cemani berdasarkan metode
culture-independent agar dapat memahami mekanisme modulasi kesehatan inang
oleh adanya mikrobiota saluran pencernaan. Analisis ini dapat menjadi dasar
pembuatan probiotik yang efektif pada saluran pencernaan ayam.
Penelitian berbasis culture-independent difokuskan untuk mengungkapkan
pola keragaman BAL di saluran pencernaan ayam Cemani dengan menerapkan
teknik Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP). Selain itu
berdasarkan metode culture-dependent untuk mendapatkan isolat-isolat BAL yang
berpotensi sebagai probiotik pada ayam, baik untuk budidaya ayam lokal maupun
broiler dan diharapkan dapat berfungsi sebagai alternatif pengganti antibiotik.
3
Tujuan Penelitian
Secara umum penelitian ini bertujuan mendapatkan informasi tentang
komunitas dan keragaman bakteri asam laktat (BAL) sebagai penyusun
mikrobiota pada saluran pencernaan ayam Cemani dan mendapatkan isolat BAL
yang berpotensi sebagai probiotik pada pakan ayam. Untuk mencapai tujuan
tersebut maka tujuan khusus penelitian ini adalah :
1. Mendapatkan informasi populasi dan keragaman BAL yang menyusun
mikrobiota pada berbagai komunitas pada saluran pencernaan beberapa
ayam Cemani menggunakan teknik molekuler berbasis 16S rRNA yaitu
dengan metode T-RFLP (Culture-independent method).
2. Mendapatkan isolat BAL yang berpotensi sebagai probiotik dari saluran
pencernaan ayam Cemani (culture-dependent method).
3. Mengidentifikasi BAL terpilih yang dikarakterisasi secara morfologi,
fisiologis dan molekuler.
4. Mempelajari enkapsulasi kultur probiotik dengan cara kering beku.
5. Aplikasi probiotik terhadap performa dan kesehatan ayam ras/broiler.
6. Mempelajari mikrobiota ayam broiler dengan pemberian probiotik.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini memberikan informasi awal berupa database dan fingerprinting
tentang keragaman jenis dan komunitas serta peran bakteri asam laktat sebagai
penyusun mikrobiota saluran pencernaan ayam Cemani, sehingga bisa bermanfaat
dalam menyusun strategi dalam pengembangan peternakan ayam lokal. Isolat
bakteri asam laktat yang diperoleh dapat berpotensi sebagai probiotik pada ayam
baik itu ayam lokal ataupun ayam broiler yang hidup dengan kondisi yang kurang
ideal di daerah tropis, sehingga dapat menjadi salah satu alternatif penggunaan
antibiotik pada pakan ayam.
Kerangka Pemikiran
Ayam Cemani merupakan ayam asli Indonesia yang unik dan tahan
terhadap penyakit. Ketahanan terhadap penyakit kemungkinan disebabkan salah
satunya karena keseimbangan mikrobiota di dalam saluran pencernaannya. Isolat
BAL sebagai penyusun mikrobiotanya kemungkinan berpotensi sebagai probiotik
pada ayam yang hidup di daerah tropis, sehingga dapat digunakan sebagai
pengganti antibiotik pada pakan. Tetapi informasi gambaran mikrobiota di dalam
saluran pencernaan ayam Cemani belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu perlu
dilakukan studi untuk mempelajari populasi dan keragaman BAL pada saluran
pencernaan ayam Cemani dan mengisolasinya untuk mempelajari potensi dan
karakterisasinya sebagai probiotik dan mengujinya secara invivo pada ayam
broiler.
4
Kebaruan/Novelty
Berdasarkan penelusuran literatur yang telah dilakukan, hingga saat ini
belum ada laporan kajian tentang keragaman bakteri asam laktat yang berasal dari
saluran pencernaan ayam Cemani dengan menggunakan teknik Terminal
restriction fragment length polymorphism (T-RFLP). Demikian juga dalam
skrining bakteri asam laktat yang berpotensi sebagai probiotik yang berasal dari
saluran pencernaan ayam Cemani. Isolat probiotik yang diperoleh dapat
diintroduksikan ke dalam ayam broiler yang mempunyai komunitas mikroba
berbeda dengan ayam Cemani dan efikasinya memberikan efek positif dalam
menjaga keseimbangan mikrobiota saluran pencernaan ayam broiler.
Hipotesis Penelitian
a. Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bagian dari mikrobiota saluran
pencernaan (tembolok, ventrikulus, ileum dan sekum) ayam Cemani.
b. Metode culture-independent dengan menggunakan gen 16S rRNA dan
analisa T-RFLP dapat digunakan sebagai alat untuk mengungkap
keragaman BAL pada saluran pencernaan ayam Cemani.
c. Terdapat perbedaan jumlah spesies, kelimpahan dan keragaman BAL
sebagai penyusun mikrobiota tiap relung pada saluran pencernaan ayam
Cemani.
d. Dengan metode culture-dependent dapat diperoleh BAL yang beragam
yang berasal dari saluran pencernaan ayam Cemani.
e. BAL yang diisolasi dari saluran pencernaan ayam Cemani mempunyai
potensi sebagai probiotik pada ayam.
f. BAL yang diperoleh merupakan isolat indigineous saluran pencernaan
ayam.
g. Probiotik yang dihasilkan dapat diintroduksikan ke ayam produksi /
broiler, sehingga dapat menjaga keseimbangan mikrobiota saluran
pencernaan ayam broiler, memperbaiki performa dan kesehatan ayam,
yang pada akhirnya dapat menggantikan fungsi antibiotik pendukung
pertumbuhan (Antibiotic Growth Promoters).
5
Kerangka Penelitian
Ayam Cemani
Saluran pencernaan
(Tembolok, ventrikulus, ileum dan sekum)
Tahap-II: Culturedependent method
Tahap-III: Enkapsulasi dan
formulasi kandidat probiotik
Tahap-IV:Aplikasi probiotik
pada ayam broiler
Probiotik untuk ayam
Data base saluran
pencernaan ayam
Cemani
Tahap-I: Cultureindependent method
6
Tahap I:
Metode Culture-Independent
Ekstraksi DNA
Sampel isi lumen dari tembolok, ventrikulus, ileum dan
sekum
Analisis kuantitas dan kualitas DNA
(spektofotometer /DNA analyzer)
Amplifikasi
dengan primer dan kondisi PCR yang sesuai untuk
BAL
Elektroforesis
untuk visualisasi produk PCR
Purifikasi DNA
(dengan kit purifikasi)
Pemotongan DNA
dengan enzim restriksi (Hae III dan Msp I)
Analisis T-RFLP
7
Tahap II. Metode culture dependent dan isolasi bakteri asam laktat sebagai
kandidat probiotik
Isolasi dan penghitungan jumlah BAL
pada media selektif (MRSA dan GYPA), kondisi anaerob
Penentuan isolat BAL
Morfologi koloni
Pewarnaan Gram
Reaksi peroksida
Pembuatan Kultur
stok
20% (v/v) Gliserol steril
Simpan dalam -80oC
Uji kemampuan probiotik isolat BAL terpilih
Uji sifat antagonis terhadap bakteri patogen
(Escherichia coli JCM 1649 and Salmonella enteritidis
B2586)
Uji ketahanan terhadap pH rendah dan adanya bile salt
Uji penempelan pada hidrokarbon
Uji koagregasi dengan bakteri patogen
Uji koagregasi antar BAL
Uji resistensi terhadap antibiotika
Identifikasi isolat BAL terpilih
Berdasar sekuen 16S rDNA
Pola fermentasi gula dengan kit API
50 CHL
8
Tahap III: Enkapsulasi dan Formulasi probiotik
Preparasi
Bakteri L. Salivarius sebagai probiotik
Pengukuran kinetika pertumbuhan
Penggandaan skala
pada media MRS cair
Enkapsulasi
pelet bakteri pada susu skim
Proses Kering beku
Viabilitas probiotik
Formulasi probiotik
Probiotik
9
Tahap IV:
Efikasi probiotik L. salivarius terhadap penampilan, kesehatan dan komunitas
mikrobiota saluran pencernaan ayam Broiler
Pengujian probiotik
pada ayam Broiler secara in vivo
PB/kontrol
PB + Antibiotik
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
Penampilan
ayam pedaging
Bobot badan akhir
Pertambahan bobot
badan
Konsumsi pakan
Konversi pakan
Mortalitas
Prosentase karkas
Pakan
PB + probiotik 1
(isolat tunggal BAL)
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
Kesehatan
ayam pedaging
Kolesterol daging
Lemak daging
Kolesterol darah
Profil darah
Prosentase
bursa
fabrisius
Prosentase thymus
PB + probiotik 2
(campuran isolat BAL)
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
10 ekor
Komunitas
mikrobiota
Jumlah koliform
Jumlah BAL
Deteksi
keberadaan
probiotik
Analisis
komunitas
mikrobiota
saluran
pencernaan
10
TINJAUAN PUSTAKA
Ayam Cemani
Perkembangan ayam lokal dimulai sejak proses domestikasi, sehingga
dikenal sebagai ayam asli atau native chicken. Berdasarkan referensi pembagian
clade domestikasi, ayam lokal Indonesia sangat berbeda dengan ayam lokal dari
negara Asia lainnya, dan Indonesia merupakan salah satu pusat domestikasi ayam
di dunia (Sulandari et al. 2009b). Banyak potensi genetik tertentu pada ayam lokal
yang belum dikenal, seperti daya tahan terhadap penyakit dan kemampuan
bertahan terhadap iklim tropis yang lebih panas, sehingga mudah dalam
pemeliharaannya. Budidaya ayam lokal di daerah berkembang atas dasar
kesenangan dan kepercayaan masyarakat tradisional. Menurut Nataamijaya (2010)
terdapat 31 rumpun ayam lokal Indonesia yang mempunyai ciri khas yang
berbeda, diantaranya ayam Pelung, ayam Kedu, ayam Nunukan, ayam Merawang,
ayam Merawas, ayam Sedayu, ayam Sentul, ayam Gaok, ayam Cemani dan
lainnya.
Ayam Cemani yang berasal dari daerah Kedu, merupakan plasma nutfah
dari Jawa Tengah, mempunyai ciri spesifik yaitu bulu, kulit, ceker, jengger, pial,
paruh, lidah, tenggorokan, telak (langit-langit mulut), dan dubur berwarna hitam.
Daging dan tulang berwarna kehitam-hitaman. Kata cemani berasal dari bahasa
Jawa yang artinya hitam legam. Ayam Cemani adalah ayam Kedu hitam yang
diseleksi ke arah pemurnian warna hitam, berasal dari kecamatan Kedu,
kabupaten Temanggung, Jawa Tengah. Potensi pemanfaatan ayam ini selain
digunakan dalam acara ritual adat, juga sebagai ayam hias yang eksotis,
dagingnya dipercaya sebagai obat dan produksi telur yang tinggi. Sistem
pemeliharaan dengan pola ransum dan nutrisi pada pemeliharaan ayam Cemani
dilakukan oleh peternak secara sederhana dan turun temurun. Umumnya
pemeliharaannya masih dilakukan secara tradisional atau umbaran sehingga
produktivitasnya tetap bahkan cenderung menurun. Untuk menjaga kualitas dan
keaslian ayam Cemani, peternak mengawinkan sesama ayam Cemani secara alami
dengan perbandingan maksimal satu ayam jantan dengan empat ayam betina
(Nugroho 2013).
Ayam Broiler
Ayam broiler adalah galur ayam hasil budidaya teknologi yang memiliki
karakteristik ekonomis dengan ciri khas yaitu warna bulu putih, pertumbuhan
yang cepat, konversi pakan yang baik, dan dapat dipotong pada usia yang relatif
muda sehingga sirkulasi pemeliharaannya lebih cepat dan efisien serta
menghasilkan daging yang berkualitas baik. Ayam broiler dipasarkan pada bobot
hidup antara 1.4-2.1 kg per ekor ayam yang dilakukan pada umur 4-5 minggu
(Leeson & Summer, 2001). Ayam broiler termasuk ke dalam ordo Galliformes,
famili Phasianidae, genus Gallus, dan spesies Gallus domesticus. Ayam broiler
dihasilkan dari bangsa ayam tipe Cornish. Bangsa ayam ini berbulu putih dan
12
seleksi diteruskan hingga dihasilkan ayam broiler seperti sekarang ini Jenis ayam
broiler antara lain Cobb, Ross, dan Arbor Arches (Amrullah, 2004).
Karakteristik broiler CP 707 yang dihasilkan PT. Charoen Phokphand
antara lain : berat badan umur 5 minggu 2.05 kg, konversi ransum 1.6,
pertumbuhan berat badan 83 g/hari/ekor, konsumsi pakan komulatif sebesar 3
297 g, warna kulit kuning dan warna bulu putih. Bila pertumbuhan 7 hari pertama
mencapai 175 g/ekor, secara umum akan menghasilkan berat badan yang baik
pada masa akhir panen. Kemampuan ayam broiler mengubah ransum menjadi
bobot hidup jauh lebih cepat dibandingkan dengan ayam kampung (Charoen
Pokphand Indonesia 2006).
Kendala usaha peternakan ayam broiler komersial di daerah tropis,
khususnya di Indonesia adalah temperatur harian relatif tinggi, terutama pada
musim kemarau, dan temperatur tahunan rata-rata adalah 26.5oC. Stres karena
panas dapat memicu neurohormonal sehingga ayam mudah terserang penyakit
(Fadilah, 2004).
Saluran Pencernaan Ayam
Saluran pencernaan ayam atau dikenal sebagai saluran gastrointestinal
merupakan saluran yang memanjang dari mulut sampai kloaka dengan beberapa
organ penting diantara keduanya, berfungsi dalam mengubah dan mencerna
makanan menjadi nutrisi yang dapat diabsorbsi dan digunakan oleh tubuh/inang.
Struktur saluran pencernaan terdiri dari mulut, esofagus, tembolok,
proventrikulus, gizzard/ventrikulus, usus halus (duodenum, jejunum & ileum),
dan usus besar (sekum, usus besar dan rektum) (Gambar 1). Masing-masing
bagian memiliki struktur histologi dan anatomi yang dirancang sesuai fungsi
masing-masing dalam proses pencernaan. Masing-masing bagian juga mempunyai
pH lingkungan yang berbeda, tembolok dengan pH 5.5, proventrikulus 2.5-3.5,
gizzard/ventrikulus 2.5-3.5, duodenum 5-6, jejenum 6.5-7, ileum 7.0-7.5, sekum
6-7, dan kolon 7-8 (Salanitro et al. 1974 ).
Makanan yang masuk ke dalam mulut tidak dikunyah karena ayam tidak
mempunyai gigi, dan secara utuh masuk ke dalam tembolok, yang merupakan
perpanjangan dari esofagus. Bagian dalam tembolok dilapisi dengan epitelium
skuamosa non-secretory stratified, makanan berada di tembolok selama 6 jam
sehingga makanan mengalami fermentasi oleh kelompok Lactobacillus. Dari
tembolok masuk ke bagian yang terdiri dari 2 bagian yang terpisah, yaitu
proventrikulus (disebut sebagai true stomach, bagian glandula) dan ventrikulus
(mechanical stomach, bagian muscular). Bagian proventrikulus menghasilkan
asam (HCl) sehingga pada proventrikulus dan ventrikulus memiliki pH yang
rendah. Ventrikulus memiliki otot yang tebal dan kuat yang bekerja secara
mekanis memotong dan menggiling makanan. Pada ayam umbaran sering
ditemukan kerikil yang berfungsi untuk membantu menghancurkan makanan.
Setelah itu makanan memasuki usus halus, di duodenum terdapat enzim–enzim
pencernaan (proteinase, amilase dan lipase), bikarbonat dari pankreas dan empedu
dari hati/liver melalui gall blader. Di usus halus juga disekresikan mucus, serta
13
adanya vili dan mikrovili yang membantu penyerapan nutrisi makanan. Setelah itu
sisa makanan masuk ke usus besar, yang di bagian ini terdapat sepasang sekum.
Di sini terjadi reabsorbsi air yang berlebihan dari fekal dan terjadi fermentasi dari
sisa makanan yang menghasilkan asam lemak, dan dihasilkan vitamin B seperti
Tiamin, riboflavin, niasin, asam pantotenat, piridoksin, biotin, asam folat dan
vitamin B12. Usus besar dikenal sebagai kolon, di sini sangat kecil terjadi
penyerapan dan pencernaan, pelet fekal dan asam urat dikeluarkan melalui kloaka
(Daghir, 1995; Jacob et al. 2011).
Gambar 1 Struktur saluran pencernaan ayam ( sumber : www.Geauga4h.org/
poultry/chicken_digestion.htm
Mikrobiota Saluran Pencernaan Ayam
Sepanjang saluran pencernaan terdapat komunitas mikroorganisme yang
terdiri dari bakteri, khamir, arkaea, protozoa, kapang anaerobik dan bakteriofag,
yang hal ini sering disebut sebagai mikrobiota saluran pencernaan. Komposisi
mikrobiota saluran pencernaan sangat dinamis dan ada pergantian dalam populasi
tiap relungnya karena adanya perubahan kondisi lingkungan masing masing
relung. Mikrobiota saluran pencernaan didominasi oleh bakteri, dari penelitian
berbasis pengkulturan (culture-dependent), terdapat sekitar 1010-1012 sel/gram
sampel fekal dari isi kolon dan terdapat sekitar 500 spesies bakteri yang berbeda
(Salanitro 1974). Penelitian berbasis culture-independent mendapatkan bahwa
terdapat 1000 spesies dalam suatu relung dalam saluran pencernaan manusia, dan
50-90% merupakan bakteri yang belum dapat dikulturkan dan bakteri yang belum
dapat dikarakterisasi/dikenali (Zoetendal et al. 2004). Mikrobiota saluran
pencernaan ayam berbeda dengan manusia karena perbedaan fisiologi saluran
pencernaan dan asupan makanannya. Kelimpahan dan keragaman
mikrobiota bervariasi sepanjang saluran pencernaan dan akan berkurang pada
relung yang memiliki kondisi kurang kondusif untuk pertumbuhan bakteri dan
14
pada tempat dengan waktu retensi yang cepat. Mikrobiota ayam berasal dari
lingkungan saat menetas, pakan dan pekerja yang menangani saat penetasan
(Stanley et al. 2013).
Dari metode berbasis pengkulturan, populasi bakteri yang melimpah di
tembolok adalah lactobacilli yang melekat pada epitel melalui komponen
karbohidrat pada dinding sel bakteri.
Bakteri penghuni tembolok ini
memfermentasi makanan yang masuk dan menghasilkan asam laktat yang
menyebabkan pH lingkungan tembolok turun menjadi pH 5. Kondisi lingkungan
dalam proventrikulus sangat asam sehingga merupakan lingkungan yang kurang
menyenangkan bagi sebagian besar bakteri. Ventrikulus/gizzard memiliki pH
rendah yang dipengaruhi oleh pH proventrikulus, sehingga lingkungan ini
didominasi oleh populasi lactobacilli, meskipun masih dibawah 108 cfu/g, selain
itu terdapat Enterococcus dan Escherichia coli. Usus halus memiliki daya
peristaltik yang tinggi sehingga kurang menguntungkan bagi bakteri untuk berada
di lumen. Namun, terdapat lactobacilli dalam jumlah tinggi dan populasi yang
stabil setelah usia sekitar dua minggu (Barnes et al. 1972). Lumen usus halus
menunjukkan bahwa mayoritas bakteri berupa bakteri fakultatif anaerob, dengan
Lactobacillus sp., Enterococcus sp. dan E. coli ( sekitar 60-90 %) dan juga
beberapa bakteri anaerob obligat seperti eubacteria, clostridia, propionibacteria
dan fusobacteria. Awalnya sekum didominasi oleh lactobacilli, coliform dan
enterococci, namun karena rendahnya tingkat aliran peristaltik, mikrobiota sekum
lebih stabil dan kompleks dan dalam usia empat minggu ditemukan anggota
bacteroides, eubacteria, bifidobacteria, lactobacilli dan clostridia (Salanitro et al.
1978).
Dari studi molekuler berbasis tanpa pengkulturan, memungkinkan wawasan
yang lebih besar tentang mikrobiota usus baik dari karakter maupun
kompleksitasnya. Dari berbagai studi dijelaskan bahwa mayoritas bakteri saluran
pencernaan ayam dan mamalia tetap uncharacterised, dan menunjukkan hanya 10
% dari spesies mikrobiota yang yang dikenal, 35 % tidak diketahui spesiesnya
tetapi dapat dikenal genusnya dan sisanya 55 % adalah bakteri yang benar-benar
tidak diketahui. Studi molekuler telah menegaskan bahwa dalam ileum 70 % dari
populasi bakteri didominasi lactobacilli dan sisanya 30 % terutama terdiri dari
clostridia, streptococci dan enterococci (Bjerrum et al. 2006).
Fingerprinting Komunitas
Untuk memahami peran dan kontribusi mikrobiota saluran pencernaan
terhadap kesehatan usus diperlukan pengetahuan tentang keberadaan spesies yang
mendiami saluran pencernaan dan perubahannya. Metode tradisional berbasis
pengkulturan hanya mengkarakterisasi bakteri dari saluran pencernaan, tetapi
pendekatan metode ini tidak menunjukkan tentang keragaman, terlebih lagi hanya
10-50% bakteri yang bisa dikulturkan (Zoetendal et al. 2004). Bakteri anaerob
yang diisolasi dari saluran pencernaan tumbuh lambat dan dapat memakan waktu
hingga dua minggu untuk tumbuh dalam kultur di laboratorium, sebagai
15
konsekuensinya, tidak sepenuhnya dapat dibuat profil komunitas berbasis
pengkulturan. Selain itu, penggunaan media selektif hanya memberi kesempatan
tumbuh kelompok bakteri tertentu yang sudah dikenal, sehingga akan memberikan
hasil profil komunitas yang bias dan tidak realistis.
Metode culture-independent yang mulai muncul tahun 1980-an
memungkinkan ahli mikrobiologi untuk memperoleh pandangan yang lebih
akurat tentang mikrobiota saluran pencernaan tanpa perlu pengkulturan terlebih
dahulu. Ada banyak teknik yang memanfaatkan teknologi molekuler sebagai
sarana untuk memantau populasi mikroba, antara lain microarray DNA,
fluorescent in situ hybridisation (FISH), kloning dan sekuencing gen 16S rRNA,
quantitative PCR, terminal fragment restriction length polymorphism (T-RFLP),
temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) dan lainnya. Teknik culture-independent umumnya
melibatkan teknik PCR sehingga penting untuk memperhatikan gen yang menjadi
target, dasar analisa serta metode ekstraksi DNAnya. Keterbatasan teknik cultureindependent sangat dipengaruhi oleh kemampuan metode ekstraksi DNA yang
digunakan. Dalam ekstraksi DNA dari lumen, adanya nuklease maupun inhibitor
PCR dapat terekstraksi dari isi lumen sehingga sangat mempengaruhi kualitas
DNA hasil ekstraksi (Dunbar et al. 2001, Moeseneder et al. 1999).
T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism) merupakan
metode yang efektif untuk membedakan komunitas bakteri pada berbagai
lingkungan. Metode ini merupakan metode yang cepat untuk menemukan
perbedaan antara komunitas saluran pencernaan manusia dengan menggunakan
sampel berupa feses dari orang yang mempunyai gaya hidup berbeda (Dicksved et
al. 2007), komunitas mikroba pada paru-paru orang yang sakit cystic fibrosis
(Roger et al. 2010), mengkarakterisasi komunitas bakterioplankton di laut
(Moeseneder et al. 1999). T-RFLP dapat digunakan untuk melihat secara
kuantitatif perubahan pada komunitas mikroba karena kelimpahan relatif suatu
populasi dalam komunitas dapat dibandingkan antar sampel dengan perlakuan
yang berbeda atau diambil pada waktu yang berlainan. Masing-masing T-RF
mewakili minimal satu spesies bakteri, terlihat sebagai satu puncak (peak),
sementara luas daerah di bawah puncak tersebut menunjukkan kelimpahan
relatifnya.
Keunggulan metode ini reproducible (berulang kali dipakai dengan hasil
yang sama) prosedur yang relatif cepat, high-throughput dan relatif tidak mahal.
Kekurangan metode ini kurang dapat mendeteksi lingkungan yang sangat
beragam dan kurang akurasi analisanya dalam menghitung keragaman spesies
dalam komunitas yang kompleks karena hanya spesies dominan dengan
kelimpahan lebih dari 1% yang terdeteksi (Li et al. 2007), sehingga spesies yang
rendah kelimpahannya/langka tidak akan dapat terdeteksi, padahal spesies langka
banyak memberikan besarnya keragaman. Selain itu adanya T-RF yang sama
dapat dihasilkan dari beberapa taksa yang berbeda kekerabatannya (Blackwood et
al. 2003). Dengan demikian Dunbar et al. (2000) menyatakan bahwa teknik
16
pengkulturan dan penghitungan sel secara langsung tetap dibutuhkan karena dapat
saling melengkapi kekurangan masing-masing teknik yang dibutuhkan.
Probiotik untuk Ayam
Penyakit pada saluran pencernaan menjadi perhatian dalam industri unggas
karena dapat menurunkan produktivitas, menaikkan mortalitas, berpengaruh
terhadap kesehatan unggas dan pada manusia sebagai konsumennya. Pada empat
dekade sebelumnya, antibiotik disuplementasikan pada pakan unggas untuk
menaikkan performa dan efisiensi pakan serta melindungi unggas dari berbagai
pengaruh mikroba usus yang patogen dan non patogen. Penggunaan antibiotik
sebagai pemacu pertumbuhan kadarnya sangat kecil, bertujuan untuk melawan
infeksi dan diberikan dalam jangka waktu yang lama (beberapa minggu sampai
bulan). Pemberian dalam jangka waktu yang lama dan dosis rendah menjadikan
mikrobiota terseleksi dan menjadi resisten. Akan tetapi, pelarangan antibiotic
growth promoters (AGPs) dalam pakan ternak merupakan faktor penting yang
menyebabkan perubahan ekologi mikrobiota dalam saluran pencernaan ayam
broiler, sehingga banyak terjadi wabah radang usus nekrotik (necrotic enteristis).
Istilah mikroba yang diberikan secara langsung /direct-fed microbial
(DFM) atau probiotik didefinisikan sebagai suplemen pakan yang berupa mikroba
hidup yang memberi efek menguntungkan bagi inang dengan meningkatkan
keseimbangan mikrobiota usus (Fuller 1999). Probiotik digunakan pada ayam
terutama untuk membantu memelihara status kesehatan dengan menjaga
keseimbangan mikrobiota saluran pencernaan, mengurangi potensi bakteri
patogen dan
memiliki efek meningkatkan kinerja dan produktivitas
(pertumbuhan, produksi telur, dan konversi pakan). Gangguan pencernaan pada
ayam menjadi perhatian serius oleh adanya sindrom diare yang terpicu pada saat
periode sensitif pertumbuhan (hari-hari pertama kehidupan setelah menetas ) atau
stres karena faktor makanan (ketidakseimbangan nutrisi), dan adanya bakteri dan
kapang dalam jumlah yang tinggi. Probiotik pada ayam untuk mencegah dan
melawan gangguan pencernaan melalui competitive exclusion (mengganggu
kemampuan pelekatan dan kolonisasi) bakteri patogen (Salmonella enteritidis,
Escherichia coli, Clostridium perfringens), menjaga homeostasis da