Analisis Gen 16S rRNA Bakteri Asam Laktat Isolat 18A Hasil Isolasi Kolon Sapi Bali.

ANALISIS GEN 16S rRNA BAKTERI ASAM LAKTAT ISOLAT 18A HASIL ISOLASI KOLON SAPI BALI

SKRIPSI

Diajukan untuk Melengkapi Tugas-tugas dan Memenuhi Persyaratan untuk Mencapai Gelar Sarjana Kedokteran Hewan

Oleh

Annisa Putri Cahyani NIM. 1109005064

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS UDAYANA

ANALISIS GEN 16S rRNA BAKTERI ASAM LAKTAT ISOLAT 18A HASIL ISOLASI KOLON SAPI BALI

SKRIPSI

Diajukan untuk Melengkapi Tugas-tugas dan Memenuhi Persyaratan untuk Mencapai Gelar Sarjana Kedokteran Hewan

Oleh

Annisa Putri Cahyani NIM. 1109005064

Menyetujui/Mengesahkan:

Pembimbing I, Pembimbing II,

Dr. drh. I Wayan Suardana, M.Si. dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes. NIP. 19700122 199512 1 001 NIP. 19670112 199601 1 001

DEKAN FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS UDAYANA

Dr. drh. Nyoman Adi Suratma, MP. NIP. 19600305 198703 1 001

Setelah mempelajari dan menguji dengan sungguh-sungguh kami berpendapat bahwa tulisan ini baik ruang lingkup maupun kualitasnya dapat diajukan sebagai skripsi untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan.

Ditetapkan di Denpasar tanggal ………

Panitia Penguji :

Dr. drh. I Wayan Suardana, M.Si. Ketua

dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes. Dr. drh. I Nengah Kerta Besung, M.Si

Sekretaris Anggota

Prof. Ir. Nyoman Semadi Antara, MP., Ph.D Luh Ade Wilan Krisna, S.Si., M.Ked

i

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kulon progo pada tanggal 22 Januari 1994, merupakan anak sulung dari pasangan Bapak Cahyanto dan Ibu Suryani. Menamatkan pendidikan di MIN Sindutan 2005, SMP Negeri 3 Wates pada tahun 2008 dan SMA Negeri 1 Temon Kabupaten Kulon progo Yogyakarta pada tahun 2011. Pada tahun 2011 penulis diterima di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN).

Dalam rangka menyelesaikan skripsi dan untuk mencapai gelar Sarjana Kedokteran Hewan (S.KH.), penulis melakukan penelitian dengan judul“Analisis Gen 16S rRNA Bakteri Asam Laktat Isolat 18A Hasil Isolasi Kolon Sapi Bali”_.

ABSTRAK

Bakteri asam laktat (BAL) merupakan kelompok bakteri yang memiliki kemampuan memproduksi asam laktat. BAL juga merupakan flora normal dalam saluran pencernaan baik pada manusia maupun hewan. BAL digunakan sebagai probiotik. Sapi bali mempunyai daya adaptasi yang tinggi terhadap mutu pakan yang rendah sehingga memungkinkan untuk dapat ditemukan jenis BAL yang spesifik. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi BAL isolat 18A hasil isolasi kolon sapi bali sebagai probiotik serta untuk mengetahui analisis susunan nukleotida dari gen 16S rRNA serta gambaran phylogenetic tree isolat 18A. Identifikasi genotipik BAL isolat 18A diawali dengan reculture menggunakan media man rogosa sharpe broth (MRSB) kemudian dilakukan pewarnaan Gram dan uji katalase, uji antimikroba terhadap bakteri patogen (E. coli KL 48 (2) dan S. aureus) kemudian dilanjutkan dengan isolasi DNA genom, amplifikasi gen 16S rRNA dengan metode Polymerase Chain Reaction(PCR), selanjutnya hasil PCR dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose, hasil elektroforesis kemudian disekuensing. Hasil sekuensing kemudian dianalisis dengan membandingkan urutan nukleotida gen 16S rRNA isolat 18A dengan isolat referensi dari GenBank. Hasil penelitian menunjukkan bakteri asam laktat isolat 18A teridentifikasi Enterococcus durans dengan similaritas 99% dan nilai bootstrap sebesar 100 serta memiliki efektivitas penghambatan terhadap patogen saluran pencernaan sepertiEscherichia colipatogen KL 48 (2) sebesar 18,8% dan Staphylococcus aureussebesar 28,06%.

Kata kunci: Bakteri asam laktat, probiotik, gen 16S rRNA, phylogenetic tree, polymerase chain reaction,elektroforesis, sekuensing.

iii ABSTRACT

Lactic acid bacteria (LAB) are a group of bacteria that have the ability to produce lactic acid. LAB are also the flora normal in the digestive tract in humans and animals. LAB used as probiotics. Bali cattle have high adaptability to low quality feed, it possible to be found specific types of LAB. This study aims to determine the potential of LAB isolates 18A the results of the isolation of the colon bali cattle as probiotics and to determine the analysis of the arrangement of nucleotides genes 16S rRNA and phylogenetic tree of isolates 18A. Identification of LAB isolates 18A begins with reculture using media Man Rogosa Sharpe Broth (MRSB) then Gram staining and catalase test, Antimicrobial test were done against pathogenic bacteria (E. coliKL 48 (2) andS. aureus) followed by genomic DNA isolation, amplification 16S rRNA gene using Polymerase Chain Reaction (PCR), the results of PCR performed using agarose gel electrophoresis and sequenced to determine of the arrangement of nucleotides. Sequencing results were analyzed by comparing the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene 18A isolates with isolates from GenBank reference. The results showed LAB isolates 18A identified as Enterococcus durans by the similarity of 99% and a value of 100 bootstrapping and then have inhibitory efficacy against gastrointestinal pathogens such asEscherichia colipathogens KL 48 (2) by 18,8% and 28,06% of Staphylococcus aureus.

Keywords: Lactic acid bacteria, probiotic, 16S rRNA gene, phylogenetic tree, polymerase chain reaction, electrophoresis, sequencing.

UCAPAN TERIMAKASIH

Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Allah SWT Yang Maha Pengasih dan Maha Berkehendak karena berkat izin-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “_{Analisis Gen 16S rRNA Bakteri Asam Laktat Isolat} 18A Hasil Isolasi Kolon Sapi Bali”_{. Tak lupa penulis hantarkan shalawat dan} salam kepada Nabi Besar Muhammad SAW. Melalui tulisan ini, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada seluruh pihak yang telah membantu penulisan skripsi ini:

1. Bapak Dr. drh. Nyoman Adi Suratma, MP. selaku Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana.

2. Bapak Dr. drh. I Wayan Suardana, M.Si. selaku pembimbing pertama, atas keikutsertaan saya dalam penelitian Hibah Bersaing yang didanai oleh Dana Hibah Desentralisasi BOPTN 2014.

3. Bapak dr. Komang Januartha Putra Pinatih, M.Kes. selaku pembimbing kedua, atas bimbingan, masukan dan waktu yang telah diberikan selama penulisan skripsi sampai selesai.

4. Para penguji skripsi Dr. drh. I Nengah Kerta Besung, M.Si., Prof. Ir. Nyoman Semadi Antara, MP., Ph.D. dan Luh Ade Wilan Krisna, S.Si., M.Ked. yang telah memberikan masukan, kritik, saran dan penilaian. 5. Bapak Prof. Dr. drh. I Made Damriyasa, MS. selaku Pembimbing

v

6. Kedua orang tua yang sangat saya cintai dan hormati yang tak henti-hentinya memberikan dukungan, doa, nasehat, dan motivasi hingga sampai saat ini penulis tetap kuat dan bersemangat dalam menyelesaikan studi. 7. Saudara-saudara di rumah, Bima Al Qari Mari Bari, Bagus, Bella, Hani,

Lala, Mirza, Ardhie, dan Melani yang secara tidak langsung telah memberikan semangat untuk terselesaikannya skripsi ini.

8. Untuk Rian KA Praja, S.KH terimakasih dorongannya selama ini, sudah menjadi pendengar yang baik untuk semua keluh kesah penulis selama proses penyelesaian skripsi ini.

9. Kepada seluruh teman-teman FKH Unud 2011B terimakasih sudah menjadi saudara yang baik selama di perantauan.

10. Teman-teman satu tim penelitian Dewa Wid, Nuni, Yana, Mita, Rizki, dan Sukoco terimakasih untuk kekompakan dan kerjasamanya.

Hanya kata terima kasih yang dapat penulis ucapkan kepada seluruh pihak yang belum penulis sebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih sangat jauh dari sempurna, oleh karena itu segala kritik dan saran yang sifatnya membangun sangat penulis harapkan untuk kesempurnaan karya tulis ini. Besar harapan penulis, semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan dapat bernilai positif bagi semua pihak yang membutuhkan.

DAFTAR ISI

Halaman

RIWAYAT HIDUP... i

ABSTRAK…….…….... ii

ABSTRACT……….... iii

UCAPAN TERIMAKASIH... iv

DAFTAR ISI ... vi

DAFTAR TABEL ... viii

DAFTAR GAMBAR ... ix

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Rumusan Masalah ... 3

1.3 Tujuan Penelitian... 4

1.4 Manfaat Penelitian... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Bakteri Asam Laktat ... 5

2.2 Aktifitas Antimikroba BAL... 6

2.3 Sapi Bali ... 7

2.4 Analisis Molekuler ... 8

2.4.1 Identifikasi Molekuler dengan Menggunakan 16S rRNA . 8 2.4.2 Polymerase Chain Reaction(PCR) ... 9

2.4.3 Elektroforesis Gel Agarosa ... 12

2.4.4 Sekuensing DNA... 13

2.3.5 Program BLAST ... 16

2.5 Kerangka Konsep ... 17

BAB III MATERI DAN METODE 3.1 Materi Penelitian ... 18

3.1.1 Objek ... 18

3.1.2 Alat... 18

3.1.3 Bahan ... 18

3.2 Prosedur Penelitian ... 19

3.2.1RecultureSampel ... 19

3.2.2 Pewarnaan Gram ... 19

3.2.3 Uji Katalase ... 20

3.2.4 Uji Antimikroba terhadap Bakteri Patogen... 20

3.2.5 Isolasi DNA Genom ... 21

3.2.6 Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan Metode PCR ... 23

3.2.7 Elektroforesis Hasil PCR Gen 16S rRNA ... 23

3.2.8 Sekuensing ... 24

3.2.9 Analisis Hasil Sekuensing ... 24

vii BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil…... 26 4.1.1 Kultivasi Isolat BAL 18A Hasil Isolasi Kolon Sapi Bali... 26 4.1.2 Uji Potensi Antimikroba ... 27 4.1.3 Analisis Molekuler Gen 16S rRNA BAL isolat 18A... 27 4.2 Pembahasan ... 32 BAB V SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan... 37 5.2 Saran ... 37 DAFTAR PUSTAKA... 38

DAFTAR TABEL

Tabel ... Halaman

1. Uji daya Hambat BAL isolat 18A hasil isolasi kolon sapi bali terhadap

bakteri patogen..………27 2. Paiwise distanceBAL isolat 18A hasil isolasi kolon sapi bali

ix

DAFTAR GAMBAR

Gambar ... Halaman

1. Siklus PCR, yang terdiri dari denaturasi, penempelan primer (annealing) dan polimerisasinya... 12 2. Skema Kerangka Konsep ... .17 3. Hasil pewarnaan Gram BAL isolat18A... 26 4. Daya hambat BAL isolat 18A hasil isolasi kolon sapi bali terhadap

E. coli O157:H7danS. aureus... ...27 5. Amplifikasi Gen 16S rRNA BAL isolat 18A hasil isolasi kolon sapi bali

dengan primer B27F dan U1492R pada Agarose 1%. M: marker 1kb DNA leader, 1: Isolat 18A... 28 6. filogenetik berdasarkan sekuens penyandi 16S rRNA BAL isolat

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri asam laktat (BAL) merupakan kelompok bakteri yang memiliki kemampuan memproduksi asam laktat sebagai produk utama melalui homofermentasi dan heterofermentasi. Proses pengasaman dan enzimatik dalam pertumbuhan BAL mempengaruhi cita rasa, tekstur dan ketahanan pada berbagai makanan fermentasi (Klasenhammer et al., 2002). Bakteri asam laktat dapat ditemukan pada asinan buah dan sayur (Kusumawatyet al.,2003), minuman buah (Plessiset al.,2004), sosis (Ammoret al., 2005), cairan rumen sapi bali (Suardana et al., 2007), susu (Sujaya et al., 2008), gandum, beras, singkong (Reddy et al., 2008), dan limbah kedelai (Maliket al.,2008).

Beberapa jenis BAL menjadi flora normal dalam saluran pencernaan baik pada manusia maupun hewan (Surono, 2004). Sapi bali mempunyai daya adaptasi yang tinggi terhadap mutu pakan yang rendah (Batan, 2006). Karakteristik ini memungkinkan untuk dapat ditemukan jenis BAL yang spesifik didasarkan atas prinsip bahwa jenis BAL sebagai flora normal di dalam saluran pencernaan yang bergantung dari beberapa faktor yang salah satunya adalah faktor pakan (Suardana, 2007).

Disamping peran utama BAL dalam fermentasi makanan, ada fungsi lain yang tidak kalah penting bagi kesehatan manusia. Bukti-bukti riset para peneliti

2

saluran pencernaan memberikan kontribusi positif bagi kesehatan, melalui aktivitas metabolismenya dan dikenal sebagai probiotik. Salah satu persyaratan dalam menseleksi strain probiotik yaitu harus memberikan efek antagonis terhadap bakteri patogen, Selain itu, strain probiotik yang diperoleh harus mempunyai kejelasan taksonominya, mulai dari genus sampai spesies bahkan sampai tingkatan sub spesies(Surono, 2004).

Identifikasi bakteri asam laktat dapat dilakukan berdasarkan sifat fenotipik dan genotipik. Identifikasi fenotipik didasarkan pada uji morfologi sel, pewarnaan Gram, uji motilasi, uji katalase, uji produksi gas dari glukosa, produksi asam dan uji pertumbuhan pada suhu, pH dan kadar garam yang berbeda (Sudiarta, 2011). Metode identifikasi fenotipik ini memiliki kemungkinan bakteri lain yang mempunyai fenotip yang sama teridentifikasi menjadi spesies yang sama, padahal secara genetik belum tentu sama. Sehingga untuk mengidentifikasi bakteri pada tingkat spesies perlu diidentifikasi menggunakan analisis secara molekuler (Gonzaleset al.,2001).

Identifikasi secara genotipik berdasarkan analisis molekuler menggunakan 16S rRNA bakteri dengan metode Polymerase Chain Reactions (PCR) -sekuensing (Sunaryanto, 2012). Teknik ini sedang populer untuk menganalisis suatu bakteri yaitu dengan teknologi analisis sekuen gen. Gen yang sering digunakan adalah gen 16S rRNA (Gonzales and Saiz, 2005). RNA ribosomal paling banyak digunakan sebagai penanda molekuler. Pada prokaryota terdapat tiga jenis RNA ribosomal, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Di antara ketiganya, 16S rRNA yang paling sering digunakan. Molekul 5S rRNA memiliki urutan

3

basa terlalu pendek, sehingga tidak ideal dari segi analisis statistika, sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang sehingga menyulitkan analisis. Molekul 16S rRNA memiliki beberapa daerah yang memiliki urutan basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah urutan basanya variatif. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies. Biasanya jika derajat kesamaan urutan basa gen penyandi 16S rRNA kurang dari 97% dapat dianggap sebagai spesies baru (Pangastuti, 2006).

Dari penelitian sebelumnya, telah dilakukan identifikasi fenotipik terhadap isolat 18A yang berasal dari kolon sapi bali positif sebagai BAL dan berpotensi mempunyai potensi antimikroba terhadap bakteri indikator E. coli dan S. aureus bersama-sama dengan 17 isolat lainnya yang ditunjukkan dengan adanya killing zone, namun kekuatan potensi antimikroba dari isolat 18A serta analisis genetiknya belum pernah dilakukan. Oleh karena itu untuk mengetahui potensi antimikroba dan karakteristik genotipik dari BAL isolat 18A, maka penelitian dengan judul “Analisis Gen 16S rRNA Bakteri Asam Laktat Isolat 18A Hasil Isolasi Kolon Sapi Bali” menarik untuk dilakukan.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang diatas, dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut:

1. Apakah bakteri asam laktat (BAL) isolat 18A yang diisolasi dari kolon sapi bali mempunyai potensi antimikroba?

4

2. Bagaimana sekuen gen 16S rRNA dari BAL isolat 18A hasil isolasi kolon sapi bali?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Untuk mengetahui potensi antimikroba bakteri asam laktat (BAL) isolat 18A hasil isolasi kolon sapi bali.

2. Untuk mengetahui analisis susunan nukleotida dari gen 16S rRNA serta gambaranphylogenetic treeisolat 18A.

1.4 Manfaat Penelitian

1. Diharapkan dapat dijadikan sebagai sumber informasi mengenai potensi antimikroba bakteri asam laktat (BAL) isolat 18A Hasil isolasi kolon sapi bali yang dapat dikembangkan menjadi calon probiotik unggul.

2. Dapat diketahui susunan gen 16S rRNA dari isolat 18A yang lebih akurat secara molekuler

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat terdiri dari 13 genera bakteri gram positif meliputi Carnobacterium, Enterococcus, Lactoccoccus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Paralactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus, Weissella dan Vagococcus (Jay, 2005). Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, dan Streptococcus merupakan genus BAL yang sudah umum diketahui berperan dalam fermentasi susu. Genus Oenococcus dan Tetragenococcus diketahui berperan dalam fermentasi pangan (Widodo, 2003).

Semua BAL umumnya mempunyai kesamaan sifat gram positif non-sporeforming kokus, kokus, batang pendek, katalase negatif yang dapat memproduksi asam laktat dengan cara memfermentasi karbohidrat. Komposisi basa DNA kurang dari 53mol% G+C (Todar, 2008). BAL yang menghasilkan dua molekul asam laktat dari fermentasi glukosa disebut bakteri asam laktat homofermentatif, sedangkan BAL yang menghasilkan satu molekul asam laktat dan satu molekul etanol serta satu molekul karbon dioksida disebut bakteri asam laktatheterofermentatif(Reddyet al., 2008).

Meskipun BAL secara umum bersifat anaerobic, namun berbagai jenis strain reaksinya berbeda terhadap molekul oksigen. Beberapa strain obligat homofermentatif seperti Lactobacillus delbrueckii subs. bulgarius

6

strain bahkan menggunakan molekul oksigen untuk menghasilkan NAD+ dan mendapatkan ATP dari konversi asetil phosfat ke asetat. Secara umum, keberadaan oksigen sangat menekan perkembangan BAL selaku bakteri anaerobic yang aerotoleran. Suhu optimum bagi pertumbuhan BAL juga beragam pada setiap strain. Ada yang bersifat psikotropik (mampu tumbuh pada suhu 5oC atau dibawahnya) seperti genus Leuconostoc dan beberapa spesies Lactobacillus fakultatif heterofermentatif, khususnya Lactobacillus sake. Beberapa strain BAL yang bersifat thermoduric (tahan pada suhu tinggi) seperti Enterococcus sp.Dan Streptococcus thermophilesdapat tumbuh pada suhu hingga 50oC (Surono, 2003).

Pada dasarnya BAL merupakan kelompok organisme dengan kemampuan metabolik yang beragam. Keragaman ini membuat BAL sangat mudah beradaptasi dengan berbagai kondisi. Lactobacillus acidophilus , L. bulgaricus , L. plantarum, L. sisipan, L. pentoaceticus, L brevis dan L. thermophilus adalah contoh penghasil asam laktat bakteri yang terlibat dalam fermentasi makanan. Asam laktat yang dihasilkan BAL efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri lain yang dapat membusuk atau merusak makanan (Battcock and Azam-Ali, 1998).

2.2 Aktifitas Antibakteri Bakteri Asam Laktat

Senyawa antimikroba merupakan senyawa biologis atau kimia yang dapat menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba (Sudiarta, 2011). Senyawa antimikroba dapat bersifat bakterisidal, bakterstatik, fungisidal dan fungistatik. Senyawa antimikroba dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroba dengan merusak dinding sel yang sedang tumbuh, mengubah permeabilitas

7

sitoplasma yang menyebabkan terganggunya transport nutrient, denaturasi protein sel, menghambat kerja enzim didalam sel sehingga merusak sistem metabolism didalam sel (Fardiaz, 1992).

Asam laktat, asetat dan asam propionate yang dihasilkan BAL mampu menghasilkan lingkungan asam yang tidak menguntungkan bagi pertumbuhan bakteri patogen. Lingkungan yang asam dapat merusak membrane sel, menghambat transport aktif bakteri patogen. BAL yang menghasilkan asam propionat yang digunakan dalam berbagai produk biopreservatif memiliki kemampuan antimikroba terhadap berbagai jenis bakteri patogen hingga jamur (Rattanachaikunsopon dan Phumkhachorn, 2010).

2.3 Sapi Bali

Sapi Bali yang merupakan hasil domestikasi banteng (Bos (Bibos) banteng) adalah jenis sapi yang unik, berukuran sedang, dadanya dalam, tidak berpunuk dan kaki-kakinya ramping. Sapi bali mempunyai sifat-sifat subur, cepat beranak, mudah beradaptasi dengan lingkungannya, dapat hidup di lahan kritis, dan mempunyai daya cerna yang baik terhadap pakan (Batan, 2002).

Komponen bakteri pada saluran pencernaan bergantung pada nutrisi (diet) kesehatan, dan kondisi lingkungan. Pola makan (diet) merupakan salah satu faktor penentu komposisi bakteri saluran pencernaan (Surono, 2004). Saluran pencernaan sapi bali khususnya cairan rumen sapi bali dapat diisolasi bakteri asam laktat (BAL) dengan kemampuan antimikroba yang cukup luas, baik terhadap bakteri Gram positif maupun Gram negatif (Suardanaet al., 2007)

8

2.4 Analisis Molekuler

2.4.1 Identifikasi Molekuler Menggunakan 16S rRNA

Salah satu bentuk pendekatan analisis molekuler adalah menggunakan pembanding sekuen RNA khususnya ribosom termasuk dengan menggunakan komponen gen 16S (Maliket al., 2007). Pada prokaryota terdapat tiga jenis RNA ribosomal, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Diantara ketiganya 16S paling banyak digunakan sebagai penanda molekuler. Molekul 5S rRNA memiliki struktur urutan basa terlalu pendek, sehingga tidak ideal dari segi analisis statistika, sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang sehingga menyulitkan analisis. 16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler yang dikenal dengan sebutan ribotyping atau riboprinting. Identifikasi tersebut didasarkan pada tingkat kesamaan dalam sekuens DNA ribosomal 16S sebagai sidik jari genetik bakteri atau disebut sebagai sekuens sidik jari (Madigan et al., 2000). Molekul 16S rRNA ini bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme. Molekul ini juga dapat berubah sesuai jarak evolusinya, sehingga dapat digunakan sebagai kronometer evolusi yang baik. Molekul 16S rRNA memiliki beberapa daerah yang urutan basanya konservatif dan beberapa urutan basanya variatif (Pangastuti, 2006). Hal ini salah satunya didukung oleh telah tersedianya database dari 16S rRNA yang dapat dipakai sebagai pembanding sekuen 16S rRNA bakteri lain untuk melihat hubungan kekerabatan genetik. Teknik ini berkembang setelah diciptakannya mesin DNA sequencer. Secara teknis metode ini melibatkan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk amplifikasi sekuen rRNA dari strain bakteri.

9

Hasil amplifikasi ini kemudian disekuensing untuk mendapatkan informasi sekuen basa nitrogen. Sekuen basa nitrogen kemudian dibandingkan dengan sekuen bakteri lain (Vaughanet al.,1999).

Sekuensing DNA ribosomal 16S dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu sekuensing secara langsung dan sekuensing dengan bantuan Polymerase Chain Reaction (PCR). Metode yang lebih baru, yaitu dengan teknik PCR, merupakan metode terpilih karena teknik PCR membutuhkan lebih sedikit bahan, lebih cepat, dan lebih praktis dilakukan untuk penelitian daripada sekuensing DNA ribosomal secara langsung. Teknik PCR digunakan untuk mengamplifikasi DNA ribosomal 16S menggunakan primer komplemen yang diproduksi secara sintetik. Kemudian DNA hasil amplifikasi dengan PCR tersebut disekuensing dengan bantuan mesin sequencer dan pita yang terbentuk dideteksi oleh detektor dan dianalisis langsung oleh komputer (Madiganet al., 2000).

Telah banyak peneliti yang melakukan identifikasi BAL dengan menggunakan metode amplifikasi sekuen 16S rRNA dengan PCR. Chagnaud et al. (2001) melakukan amplifikasi sekuen 16S rRNA menggunakan forward primersyang didesain dari wilayah VI dari 16S rRNA, sedangkanreverse primers didesain dari wilayah lain dari 16S rRNA yang umum dimiliki oleh anggota genus BAL.

2.4.2Polymerase Chain Reaction(PCR)

Reaksi rantai polimerase (“polymerase chain reaction“/PCR), yang ditemukan oleh Kary Mullis pada pertengahan 1980-an, merupakan salah satu

10

tonggak revolusi dalam genetika molekuler. PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatenya. PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (template) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA template, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida template. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA template. PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan,

11

yaitu pemisahan (denaturation) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polymerase (Gaffar, 2007).

PCR memerlukan siklus berulang yang terdiri dari tiga tahap, yaitu denaturasi, perlekatan (annealing), dan perpanjangan (extension) sebagai berikut:

1. Tahap pertama adalah proses denaturasi DNA target sehingga DNA yang berutas ganda akan terpisah menjadi DNA berutas tunggal. Proses ini dilakukan dengan cara memanaskan sampel DNA pada temperatur 90oC -95oC selama 1 - 2 menit.

2. Tahap kedua adalah proses perlekatan (annealing). Pada tahap ini primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA target pada daerah yang komplementer dengan sekuens primer. Primer dapat melekat pada sekuens komplementernya dengan cara menurunkan temperatur antara 40 - 60oC. 3. Tahap ketiga adalah tahap pemanjangan atau extension. Tahap ini

dilakukan dengan cara menaikkan temperatur antara 70 - 75oC. Lamanya reaksi bergantung pada DNA polimerase yang digunakan dan panjangnya fragmen DNA yang akan diamplifikasi (Yuwono, 2006; Gaffar, 2007).

12

Gambar 1. Siklus PCR, yang terdiri dari denaturasi, penempelan primer (annealing) dan polimerisasinya (Sumber: Gaffar, 2007).

2.4.3 Elektroforesis Gel Agarosa

Metode ini didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutub negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam

13

medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar (Madigan, 2000; Gaffar, 2007).

2.4.4 Sekuensing DNA

Sekuensing DNA merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui urutan nukleotida atau basa dalam suatu fragmen DNA. DNA menyimpan informasi genetik dalam bentuk urutan nukleotida. Dengan mengetahui urutan nukleotida suatu gen, maka dapat ditentukan urutan asam amino protein yang dikodenya. Sebaliknya, urutan asam amino protein tidak dapat memberikan informasi lengkap tentang urutan nukleotida gen yang mengkodenya. Karena alasan tersebut, selain karena mahalnya sekuensing protein, maka sekuensing DNA jauh lebih banyak digunakan (Gaffar, 2007).

Terdapat dua metode yang digunakan dalam sekuensing yakni dengan prosedur kimia yang ditemukan oleh A. Maxam dan W. Gilbert dan prosedur enzimatik yang dikembangkan oleh F. Sanger (Sudjadi, 2008).

14

Metode Maxam-Gilbert melibatkan bahan radioaktif seperti fosfat, sejumlah senyawa kimia, fragmen DNA dan autoradigrafi. Fragmen DNA dilabel radioaktif pada salah satu ujung 5’-nya melalui penempelan enzimatik radioaktif fosfat dipecah secara parsial dalam lima reaksi terpisah yang masing-masing spesifik untuk basa tertentu. Tahap pertama yaitu basa-basa spesifik yang mengalami modifikasi secara kimia. Tahap kedua yaitu basa yang termodifikasi dipisahkan dari gugus gulanya dan pemutusan ikatan 5’ dan 3’ fosfodiester dengan basa termodifikasi (Sambrooket al,1989).

Metode lain yang lebih popular digunakan dalam sekuensing adaah metode Sanger atau yang disebut The Sanger Chain-Termination Sequencing Method. Metode terpilih ini disebut juga metode dideoxynucleotide atau metode enzimatis. Prinsip kerja metode Sanger yaitu terminasi sintesis DNA oleh dideoksinukleotida yang ditempatkan pada empat tabung yang berbeda sehingga menghentikan sintesis urutan basa sesudah basa termodifikasi tersebut. Setiap tabung memiliki satu jenis ddNTP. ddNTP tidak memiliki gugs –OH pada ujung 3’, hal tersebut berguna untuk menghentikan sintesis primer pada sekuen yang tidak memiliki gugus –OH. Terminasi sintesis DNA akan menghasilkan chain terminating dideoxynucleotide sehingga terbentuk fragmen-fragmen tersebut kemudian dilakukan melalui elektroforesis dengan mengidentifikasi jenis dideoksinukleotida yang digunakan untuk terminasi (Cooper, 1997: Fairbanks and Andersen, 1999).

Metode asli dilakukan secara manual, tetapi sekarang semua telah dilakukan secara otomatis dengan batuan mesin automated DNA sequencing.

15

Metode tersebut merupakan modifikasi dari metode Sanger. Persamaan metode automated DNA sequencing dengan metode Sanger yaitu menggunakan prinsip terminasi replikasi, tetapi komponen reaksi yang digunakan ditempatkan dalam satu tabung yang sama (Wolfe, 1993). Metode automated DNA sequencing menggunakan pewarna berfluoresens yang berbeda untuk memberikan label pada ddNTP. Pewarna berflouresens menggantikan peran radioaktif fosfat. Setiap jenis dideoksiribonukleotida yang terbaca akan teridentifikasi berdasarkn pewarna fluoresens yang muncul setelah dipaparkan pada sinar laser. Masing-masing pewarna fluoresens mewakili basa-basa tertentu dan data terdeteksi menggunakan detector yang terhubung dengan computer sehingga data dapat langsung dianalisis (Winfrey et al, 1997).

Sekuensing dengan metode automated DNA sekuensing dilakukan dalam proses yang disebut cycle sequencing terhadap hasil PCR. Proses cycle sequencing menggunakan prinsip yang serupa dengan proses PCR, yaitu ekstensi fragmen DNA dengan menggunakan prinsip yang serupa dengan thermal cycler. Proses cycle sequencing juga terbagi atas tahap denaturasi, perlekatan primer, dan ekstensi berulang. Cycle sequencing hanya menggunakan satu jenis primer dan mengikutserakan dideoksinukleotida (ddNTP), selain deoksinukleotida (dNTP) sebagai basa komplementer (Weaver and Hedrick, 1999).

16

2.4.5 Program BLAST

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) adalah suatu program komputer atau algoritma untuk membandingkan informasi sekuens biologi, seperti sekuens asam amino atau sekuens nukleotida DNA, dengan sekuens yang terdapat pada basis data. BLAST dapat diakses secara terbuka melalui website (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Program BLAST terdiri dari beberapa macam yang penggunaannya disesuaikan dengan kebutuhan, yaitu blastp (protein-protein BLAST), blastn (nucleotide-nucleotide BLAST), PSI-BLAST (Position-Specific Iterative BLAST), blastx (nucleotide 6-frame translation-nucleotide 6-frame translation), tbalstn (protein-nucleotide 6-frame translation), dan megablast (large number of query sequences) (NCBI, 2003).

17

2.5 Kerangka Konsep

Gambar 2. Skema kerangka konsep. Isolat Bakteri Asam Laktat

(BAL) 18A

Reculturepada MRS Broth

Uji Katalase dan Pewarnaan Gram

Uji Potensi Antimikroba terhadap bakteri patogenE. coliKL 48 (2) danS. aureus

Analisis molekuler dengan membandingkan urutan nukleotida gen16S rRNA Isolat 18A

dengan Isolat referensi dariGenBank Amplifikasi Gen 16S rRNA

Isolasi DNA

Elektroforesis

Sekuensing

Gambar 1. Siklus PCR, yang terdiri dari denaturasi, penempelan primer (annealing) dan polimerisasinya (Sumber: Gaffar, 2007).

2.4.3 Elektroforesis Gel Agarosa

Metode ini didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutub negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam

medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar (Madigan, 2000; Gaffar, 2007).

2.4.4 Sekuensing DNA

Sekuensing DNA merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui urutan nukleotida atau basa dalam suatu fragmen DNA. DNA menyimpan informasi genetik dalam bentuk urutan nukleotida. Dengan mengetahui urutan nukleotida suatu gen, maka dapat ditentukan urutan asam amino protein yang dikodenya. Sebaliknya, urutan asam amino protein tidak dapat memberikan informasi lengkap tentang urutan nukleotida gen yang mengkodenya. Karena alasan tersebut, selain karena mahalnya sekuensing protein, maka sekuensing DNA jauh lebih banyak digunakan (Gaffar, 2007).

Terdapat dua metode yang digunakan dalam sekuensing yakni dengan prosedur kimia yang ditemukan oleh A. Maxam dan W. Gilbert dan prosedur enzimatik yang dikembangkan oleh F. Sanger (Sudjadi, 2008).

Metode Maxam-Gilbert melibatkan bahan radioaktif seperti fosfat, sejumlah senyawa kimia, fragmen DNA dan autoradigrafi. Fragmen DNA dilabel radioaktif pada salah satu ujung 5’-nya melalui penempelan enzimatik radioaktif fosfat dipecah secara parsial dalam lima reaksi terpisah yang masing-masing spesifik untuk basa tertentu. Tahap pertama yaitu basa-basa spesifik yang mengalami modifikasi secara kimia. Tahap kedua yaitu basa yang termodifikasi dipisahkan dari gugus gulanya dan pemutusan ikatan 5’ dan 3’ fosfodiester dengan basa termodifikasi (Sambrooket al,1989).

Metode lain yang lebih popular digunakan dalam sekuensing adaah metode Sanger atau yang disebut The Sanger Chain-Termination Sequencing Method. Metode terpilih ini disebut juga metode dideoxynucleotide atau metode enzimatis. Prinsip kerja metode Sanger yaitu terminasi sintesis DNA oleh dideoksinukleotida yang ditempatkan pada empat tabung yang berbeda sehingga menghentikan sintesis urutan basa sesudah basa termodifikasi tersebut. Setiap tabung memiliki satu jenis ddNTP. ddNTP tidak memiliki gugs –OH pada ujung 3’, hal tersebut berguna untuk menghentikan sintesis primer pada sekuen yang tidak memiliki gugus –OH. Terminasi sintesis DNA akan menghasilkan chain terminating dideoxynucleotide sehingga terbentuk fragmen-fragmen tersebut kemudian dilakukan melalui elektroforesis dengan mengidentifikasi jenis dideoksinukleotida yang digunakan untuk terminasi (Cooper, 1997: Fairbanks and Andersen, 1999).

Metode asli dilakukan secara manual, tetapi sekarang semua telah dilakukan secara otomatis dengan batuan mesin automated DNA sequencing.

Metode tersebut merupakan modifikasi dari metode Sanger. Persamaan metode automated DNA sequencing dengan metode Sanger yaitu menggunakan prinsip terminasi replikasi, tetapi komponen reaksi yang digunakan ditempatkan dalam satu tabung yang sama (Wolfe, 1993). Metode automated DNA sequencing menggunakan pewarna berfluoresens yang berbeda untuk memberikan label pada ddNTP. Pewarna berflouresens menggantikan peran radioaktif fosfat. Setiap jenis dideoksiribonukleotida yang terbaca akan teridentifikasi berdasarkn pewarna fluoresens yang muncul setelah dipaparkan pada sinar laser. Masing-masing pewarna fluoresens mewakili basa-basa tertentu dan data terdeteksi menggunakan detector yang terhubung dengan computer sehingga data dapat langsung dianalisis (Winfrey et al, 1997).

Sekuensing dengan metode automated DNA sekuensing dilakukan dalam proses yang disebut cycle sequencing terhadap hasil PCR. Proses cycle sequencing menggunakan prinsip yang serupa dengan proses PCR, yaitu ekstensi fragmen DNA dengan menggunakan prinsip yang serupa dengan thermal cycler. Proses cycle sequencing juga terbagi atas tahap denaturasi, perlekatan primer, dan ekstensi berulang. Cycle sequencing hanya menggunakan satu jenis primer dan mengikutserakan dideoksinukleotida (ddNTP), selain deoksinukleotida (dNTP) sebagai basa komplementer (Weaver and Hedrick, 1999).

2.4.5 Program BLAST

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) adalah suatu program komputer atau algoritma untuk membandingkan informasi sekuens biologi, seperti sekuens asam amino atau sekuens nukleotida DNA, dengan sekuens yang terdapat pada basis data. BLAST dapat diakses secara terbuka melalui website (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Program BLAST terdiri dari beberapa macam yang penggunaannya disesuaikan dengan kebutuhan, yaitu blastp (protein-protein BLAST), blastn (nucleotide-nucleotide BLAST), PSI-BLAST (Position-Specific Iterative BLAST), blastx (nucleotide 6-frame translation-nucleotide frame translation), tbalstn (protein-nucleotide 6-frame translation), dan megablast (large number of query sequences) (NCBI, 2003).

2.5 Kerangka Konsep

Gambar 2. Skema kerangka konsep. Isolat Bakteri Asam Laktat

(BAL) 18A

Reculturepada MRS Broth

Uji Katalase dan Pewarnaan Gram

Uji Potensi Antimikroba terhadap bakteri patogenE. coliKL 48 (2) danS. aureus

Analisis molekuler dengan membandingkan urutan nukleotida gen16S rRNA Isolat 18A

dengan Isolat referensi dariGenBank Amplifikasi Gen 16S rRNA

Isolasi DNA

Elektroforesis

Sekuensing