Penapisan Awal Komponen Bioaktif dari Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) sebagai Senyawa Antioksidan.

PENAPISAN AWAL KOMPONEN BIOAKTIF

DARI KIJING TAIWAN (Anodonta woodiana Lea.)

SEBAGAI SENYAWA ANTIOKSIDAN

Oleh:

Eka Ayuningrat C34104040

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2009

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul Penapisan Awal Komponen Bioaktif dari Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) sebagai Senyawa Antioksidan adalah hasil karya saya sendiri dan belum pernah diajukan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi.

Bogor, Januari 2009 Eka Ayuningrat

RINGKASAN

EKA AYUNINGRAT. C34104040. Penapisan Awal Komponen Bioaktif dari Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) sebagai Senyawa Antioksidan. Dibawah bimbingan ELLA SALAMAH dan SRI PURWANINGSIH.

Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea) merupakan kerang-kerangan yang hidup di danau atau sungai. Tingkat reproduksinya yang tinggi menjadikan kijing Taiwan sangat potensial jika dibudidayakan. Kijing Taiwan sebenarnya telah lama dimanfaatkan oleh bangsa Cina sebagai obat untuk berbagai macam penyakit, membersihkan racun dalam tubuh, memperlancar sirkulasi darah, menambah energi, dan memperkuat daya tahan tubuh. Berbagai khasiat yang terdapat pada kijing Taiwan mendorong penelitian tentang kandungan bioaktif sebagai antioksidan yang terdapat di dalamnya.

Penelitian dibagi menjadi dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan utama. Penelitian pendahuluan dilakukan untuk menentukan jenis pelarut yang efektif untuk dapat mengekstrak senyawa antioksidan dari kijing Taiwan. Metode ekstraksi yang dilakukan adalah ekstraksi bertingkat untuk memisahkan ekstrak berdasarkan sifat kepolarannya. Pengujian antioksidan dilakukan dengan metode 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH). Penelitian utama dilakukan untuk menentukan waktu maserasi paling optimal untuk mendapatkan ekstrak dengan sifat antioksidan paling tinggi. Pengujian ini dilanjutkan dengan penghitungan bilangan peroksida emulsi minyak dan uji fitokimia.

Jenis pelarut terbaik berdasarkan penelitian pendahuluan adalah metanol karena mempunyai nilai IC50 sebesar 201,52 ppm. Nilai tersebut menunjukkan bahwa pada konsentrasi sebesar 201,52 ppm, ekstrak kijing Taiwan mampu mereduksi radikal bebas (DPPH) sebanyak 50%, artinya ekstrak tersebut bersifat antioksidan. Hasil uji ekstrak dari maserasi dengan pelarut n-heksan dan etil asetat menunjukkan tidak bersifat sebagai antioksidan. Tahap penelitian utama dilakukan maserasi dengan pelarut metanol selama 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Hasil uji efek antioksidan paling tinggi diperoleh dari maserasi selama 72 jam dengan nilai IC50 sebesar 166,64 ppm. Pengujian penghitungan bilangan peroksida dilakukan menggunakan ekstrak dari hasil terbaik, yaitu maserasi kijing Taiwan dengan metanol selama 72 jam.

Bilangan peroksida dihitung dari emulsi minyak dengan tambahan ekstrak yang telah disimpan di inkubator suhu 36,9oC selama tujuh hari. Ekstrak yang ditambahkan pada emulsi minyak adalah sebesar 0 ppm, 2000 ppm, 3000 ppm, dan 4000 ppm. Hasil terbaik yang diperoleh adalah dari penambahan ekstrak

sebanyak 4000 ppm. Bilangan peroksida yang dihasilkan adalah sebesar 2,38 Meq/kg bahan. Bilangan peroksida yang terbentuk masih di bawah ambang

batas ketengikan minyak, yaitu 3 Meq/kg bahan. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak mampu menghambat oksidasi minyak (efektif antioksidan). Uji fitokimia terhadap ekstrak kijing Taiwan menunjukkan hasil positif pada uji alkaloid dan flavonoid, tetapi negatif pada uji steroid. Hasil uji ini menunjukkkan bahwa senyawa antioksidan berupa alkaloid dan flavonoid dari ekstrak kijing Taiwan bersifat polar karena terekstrak dari pelarut metanol.

PENAPISAN AWAL KOMPONEN BIOAKTIF

DARI KIJING TAIWAN (Anodonta woodiana Lea.)

SEBAGAI SENYAWA ANTIOKSIDAN

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

Institut Pertanian Bogor

Oleh:

Eka Ayuningrat C34104040

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2009

Judul Skripsi : PENAPISAN AWAL KOMPONEN BIOAKTIF DARI KIJING TAIWAN (Anodonta woodiana Lea.) SEBAGAI SENYAWA ANTIOKSIDAN

Nama : Eka Ayuningrat NRP : C34104040

Menyetujui, Komisi Pembimbing

Pembimbing I Pembimbing II

Dra. Ella Salamah, M.Si Dr. Ir. Sri Purwaningsih, M.Si

NIP. 131 788 597 NIP. 131 878 935

Mengetahui,

Dekan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

Prof. Dr. Ir. Indra Jaya, M.Sc NIP. 131 578 799

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya sehingga penelitian dengan judul Penapisan Awal Komponen Bioaktif dari Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea) sebagai Senyawa Antioksidan ini dapat diselesaikan oleh penulis. Adapun tujuan dari penyusunan skripsi ini adalah sebagai syarat kelulusan pada program sarjana Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

Penulis menyadari banyak kekurangsempurnaan dalam penulisan, karena itu segala bentuk kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan guna tercapainya hasil yang lebih baik. Semoga bermanfaat.

Bogor, Januari 2009

UCAPAN TERIMA KASIH

Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis mampu menyelesaikan pendidikan di Institut Pertanian Bogor ini dengan baik. Penulis mengucapkan terima kasih kepada seluruh pihak yang telah membantu penyelesaian skripsi ini, diantaranya kepada: 1. Ibu Dra. Ella Salamah, M.Si dan Ibu Dr. Ir. Sri Purwaningsih, M.Si sebagai

komisi pembimbing atas segala masukan, kritik, arahan, motivasi, dan bimbingan yang telah diberikan.

2. Bapak Dr. Ir. Bustami Ibrahim, M.Sc dan Ibu Ir. Anna C. Erungan, MS sebagai penguji atas semua kritik, saran, dan masukan yang telah diberikan. 3. Bapak Ir. Djoko Poernomo, B.Sc selaku pembimbing akademik atas semua

bantuan dan dorongan semangat.

4. Ibu dan Bapak yang telah memberikan semuanya, semoga selalu berada dalam lindungan Allah SWT dan selalu sehat wal’afiat.

5. Adik-adikku (Ichwan, Husein, dan Ghofur), juga kepada Shifa dan Afi atas segala keceriaan dalam hidup.

6. Mbah Putri, Mbah Kakung, Mbak Anik, Mas Ipul, Bulik Puk, dan semua anggota keluarga besar di Blitar, Bogor, Pondok Gede, dan Surabaya atas doa dan dukungannya.

7. Ika, Nia, Dilla, Sereli. Jaga persahabatan kita karena persahabatan itu abadi. 8. Sahabat-sahabatku di THP 41: Anang, An’im, Amelia, Estrid, Yanti, Tyas,

Enif, Ulfah, Nuzul, Windhyka, Glory, Gilang, Yudha, Rijan, Masikah, Wisnu, Erlangga, Yugha, Dede, Santi, Luh Putu Ari, Vika, Vera, Ima, Indah, Andi, Andika, Alim, Yudha, Rijal, dan teman-teman lain yang tidak bisa disebutkan satu persatu. Juga kepada rekan-rekan THP 39, 40, 42, dan 43 yang pernah mengisi hari-hari yang telah lewat.

9. Teman-teman di Blitar (Lailatul, Rahma, Irma, Tika, Lia, Diah, Sofwan, Bayu, Radith, Iqbal, dan semuanya) yang mengajari tentang arti hidup yang lebih baik dan cara mendewasakan diri.

10. Para penghuni Kawah Kelud dan Pondok An-Nur, untuk semua kenangan manis yang pernah tercipta.

11. Bu Ema, Mbak Icha, Om Zacky, Mas Ipul, Umi atas semua bantuan dan suntikan semangat selama berjuang di THP.

12. Pak Nurwanto di PAU, Mbak Ina, Mbak Nunuk, Mbak Titis, Endi di Biofarmaka atas bantuan dan saran yang sangat membantu selesainya skripsi ini.

13. Basuki Sulistyana atas dukungan, perhatian, dan semua hal yang pernah terkorbankan.

14. Semua pihak yang telah membantu penulis dari awal sampai sekarang yang tidak bisa disebutkan satu per satu.

Kesempurnaan skripsi ini tidak terlepas dari segala kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penulis dan semua yang memerlukannya.

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Blitar, 13 Juni 1986 dari ayah M. Ghufron dan ibu Sri Eko Martiningsih. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara. Tahun 2004 penulis menyelesaikan pendidikan di SMA Negeri I Blitar dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB pada Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan.

Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif dalam organisasi HIMASILKAN sebagai staff Hubungan Luar dan Komunikasi (Hublukom) pada tahun 2005/2006, staff Pengabdian Mahasiswa dan Masyarakat (PMM) pada tahun 2006/2007, dan bendahara pada tahun 2007/2008. Penulis juga menjadi koordinator asisten mata kuliah Teknologi Pengolahan Tradisional Hasil Perikanan tahun ajaran 2007/2008 dan mata kuliah Biotoksikologi Hasil Perairan tahun ajaran 2008/2009. Pada tahun 2008 penulis menjuarai Kompetisi Pemikiran Kritis Mahasiswa (KPKM) tingkat nasional bidang perekonomian sebagai juara II, dengan judul karya tulis Tantangan dalam Meningkatkan Standar Kualitas Udang Ekspor Indonesia melalui Traceability System.

Penulis menyelesaikan studi di Institut Pertanian Bogor dengan menyusun skripsi yang berjudul Penapisan Awal Komponen Bioaktif dari Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) sebagai Senyawa Antioksidan.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... xi

DAFTAR GAMBAR ... xii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiii

1. PENDAHULUAN ... 1

1.1. Latar Belakang ... 1

1.2. Tujuan ... 2

2. TINJAUAN PUSTAKA ... 3

2.1. Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea) ... 3

2.2. Penapisan Komponen Bioaktif ... 5

2.3. Radikal Bebas ... 9

2.4. Antioksidan ... 10

3. METODOLOGI ... 14

3.1. Waktu dan Tempat ... 14

3.2. Alat dan Bahan ... 14

3.3. Tahapan Penelitian ... 14

3.3.1. Penelitian Pendahuluan ... 15

3.3.1.1. Ekstraksi Senyawa Bioaktif ... 15

3.3.1.2. Uji Antioksidan (DPPH) ... 17

3.3.2. Penelitian Utama ... 17

3.3.2.1. Uji Antioksidan (DPPH) ... 17

3.3.2.2. Evaluasi Aktivitas Antioksidan (Penentuan Bilangan Peroksida) ... 18

3.3.3. Fitokimia ... 19

3.3.3.1. Uji Alkaloid ... 19

3.3.3.2. Uji Triterpenoid/steroid ... 19

3.3.3.3. Uji Flavonoid ... 20

3.3.4. Rancangan Percobaan dan Analisis Data ... 20

4. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 22

4.1. Penelitian Pendahuluan ... 22

4.1.1. Ekstraksi Senyawa Bioaktif ... 22

4.1.2. Penentuan Jenis Pelarut dengan Uji Antioksidan Metode DPPH ... 22

PENAPISAN AWAL KOMPONEN BIOAKTIF

DARI KIJING TAIWAN (Anodonta woodiana Lea.)

SEBAGAI SENYAWA ANTIOKSIDAN

Oleh:

Eka Ayuningrat C34104040

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2009

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul Penapisan Awal Komponen Bioaktif dari Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) sebagai Senyawa Antioksidan adalah hasil karya saya sendiri dan belum pernah diajukan kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi.

Bogor, Januari 2009 Eka Ayuningrat

RINGKASAN

EKA AYUNINGRAT. C34104040. Penapisan Awal Komponen Bioaktif dari Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) sebagai Senyawa Antioksidan. Dibawah bimbingan ELLA SALAMAH dan SRI PURWANINGSIH.

Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea) merupakan kerang-kerangan yang hidup di danau atau sungai. Tingkat reproduksinya yang tinggi menjadikan kijing Taiwan sangat potensial jika dibudidayakan. Kijing Taiwan sebenarnya telah lama dimanfaatkan oleh bangsa Cina sebagai obat untuk berbagai macam penyakit, membersihkan racun dalam tubuh, memperlancar sirkulasi darah, menambah energi, dan memperkuat daya tahan tubuh. Berbagai khasiat yang terdapat pada kijing Taiwan mendorong penelitian tentang kandungan bioaktif sebagai antioksidan yang terdapat di dalamnya.

Penelitian dibagi menjadi dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan utama. Penelitian pendahuluan dilakukan untuk menentukan jenis pelarut yang efektif untuk dapat mengekstrak senyawa antioksidan dari kijing Taiwan. Metode ekstraksi yang dilakukan adalah ekstraksi bertingkat untuk memisahkan ekstrak berdasarkan sifat kepolarannya. Pengujian antioksidan dilakukan dengan metode 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH). Penelitian utama dilakukan untuk menentukan waktu maserasi paling optimal untuk mendapatkan ekstrak dengan sifat antioksidan paling tinggi. Pengujian ini dilanjutkan dengan penghitungan bilangan peroksida emulsi minyak dan uji fitokimia.

Jenis pelarut terbaik berdasarkan penelitian pendahuluan adalah metanol karena mempunyai nilai IC50 sebesar 201,52 ppm. Nilai tersebut menunjukkan bahwa pada konsentrasi sebesar 201,52 ppm, ekstrak kijing Taiwan mampu mereduksi radikal bebas (DPPH) sebanyak 50%, artinya ekstrak tersebut bersifat antioksidan. Hasil uji ekstrak dari maserasi dengan pelarut n-heksan dan etil asetat menunjukkan tidak bersifat sebagai antioksidan. Tahap penelitian utama dilakukan maserasi dengan pelarut metanol selama 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Hasil uji efek antioksidan paling tinggi diperoleh dari maserasi selama 72 jam dengan nilai IC50 sebesar 166,64 ppm. Pengujian penghitungan bilangan peroksida dilakukan menggunakan ekstrak dari hasil terbaik, yaitu maserasi kijing Taiwan dengan metanol selama 72 jam.

Bilangan peroksida dihitung dari emulsi minyak dengan tambahan ekstrak yang telah disimpan di inkubator suhu 36,9oC selama tujuh hari. Ekstrak yang ditambahkan pada emulsi minyak adalah sebesar 0 ppm, 2000 ppm, 3000 ppm, dan 4000 ppm. Hasil terbaik yang diperoleh adalah dari penambahan ekstrak

sebanyak 4000 ppm. Bilangan peroksida yang dihasilkan adalah sebesar 2,38 Meq/kg bahan. Bilangan peroksida yang terbentuk masih di bawah ambang

batas ketengikan minyak, yaitu 3 Meq/kg bahan. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak mampu menghambat oksidasi minyak (efektif antioksidan). Uji fitokimia terhadap ekstrak kijing Taiwan menunjukkan hasil positif pada uji alkaloid dan flavonoid, tetapi negatif pada uji steroid. Hasil uji ini menunjukkkan bahwa senyawa antioksidan berupa alkaloid dan flavonoid dari ekstrak kijing Taiwan bersifat polar karena terekstrak dari pelarut metanol.

PENAPISAN AWAL KOMPONEN BIOAKTIF

DARI KIJING TAIWAN (Anodonta woodiana Lea.)

SEBAGAI SENYAWA ANTIOKSIDAN

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

Institut Pertanian Bogor

Oleh:

Eka Ayuningrat C34104040

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2009

Judul Skripsi : PENAPISAN AWAL KOMPONEN BIOAKTIF DARI KIJING TAIWAN (Anodonta woodiana Lea.) SEBAGAI SENYAWA ANTIOKSIDAN

Nama : Eka Ayuningrat NRP : C34104040

Menyetujui, Komisi Pembimbing

Pembimbing I Pembimbing II

Dra. Ella Salamah, M.Si Dr. Ir. Sri Purwaningsih, M.Si

NIP. 131 788 597 NIP. 131 878 935

Mengetahui,

Dekan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

Prof. Dr. Ir. Indra Jaya, M.Sc NIP. 131 578 799

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya sehingga penelitian dengan judul Penapisan Awal Komponen Bioaktif dari Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea) sebagai Senyawa Antioksidan ini dapat diselesaikan oleh penulis. Adapun tujuan dari penyusunan skripsi ini adalah sebagai syarat kelulusan pada program sarjana Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

Penulis menyadari banyak kekurangsempurnaan dalam penulisan, karena itu segala bentuk kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan guna tercapainya hasil yang lebih baik. Semoga bermanfaat.

Bogor, Januari 2009

UCAPAN TERIMA KASIH

Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis mampu menyelesaikan pendidikan di Institut Pertanian Bogor ini dengan baik. Penulis mengucapkan terima kasih kepada seluruh pihak yang telah membantu penyelesaian skripsi ini, diantaranya kepada: 1. Ibu Dra. Ella Salamah, M.Si dan Ibu Dr. Ir. Sri Purwaningsih, M.Si sebagai

komisi pembimbing atas segala masukan, kritik, arahan, motivasi, dan bimbingan yang telah diberikan.

2. Bapak Dr. Ir. Bustami Ibrahim, M.Sc dan Ibu Ir. Anna C. Erungan, MS sebagai penguji atas semua kritik, saran, dan masukan yang telah diberikan. 3. Bapak Ir. Djoko Poernomo, B.Sc selaku pembimbing akademik atas semua

bantuan dan dorongan semangat.

4. Ibu dan Bapak yang telah memberikan semuanya, semoga selalu berada dalam lindungan Allah SWT dan selalu sehat wal’afiat.

5. Adik-adikku (Ichwan, Husein, dan Ghofur), juga kepada Shifa dan Afi atas segala keceriaan dalam hidup.

6. Mbah Putri, Mbah Kakung, Mbak Anik, Mas Ipul, Bulik Puk, dan semua anggota keluarga besar di Blitar, Bogor, Pondok Gede, dan Surabaya atas doa dan dukungannya.

7. Ika, Nia, Dilla, Sereli. Jaga persahabatan kita karena persahabatan itu abadi. 8. Sahabat-sahabatku di THP 41: Anang, An’im, Amelia, Estrid, Yanti, Tyas,

Enif, Ulfah, Nuzul, Windhyka, Glory, Gilang, Yudha, Rijan, Masikah, Wisnu, Erlangga, Yugha, Dede, Santi, Luh Putu Ari, Vika, Vera, Ima, Indah, Andi, Andika, Alim, Yudha, Rijal, dan teman-teman lain yang tidak bisa disebutkan satu persatu. Juga kepada rekan-rekan THP 39, 40, 42, dan 43 yang pernah mengisi hari-hari yang telah lewat.

9. Teman-teman di Blitar (Lailatul, Rahma, Irma, Tika, Lia, Diah, Sofwan, Bayu, Radith, Iqbal, dan semuanya) yang mengajari tentang arti hidup yang lebih baik dan cara mendewasakan diri.

10. Para penghuni Kawah Kelud dan Pondok An-Nur, untuk semua kenangan manis yang pernah tercipta.

11. Bu Ema, Mbak Icha, Om Zacky, Mas Ipul, Umi atas semua bantuan dan suntikan semangat selama berjuang di THP.

12. Pak Nurwanto di PAU, Mbak Ina, Mbak Nunuk, Mbak Titis, Endi di Biofarmaka atas bantuan dan saran yang sangat membantu selesainya skripsi ini.

13. Basuki Sulistyana atas dukungan, perhatian, dan semua hal yang pernah terkorbankan.

14. Semua pihak yang telah membantu penulis dari awal sampai sekarang yang tidak bisa disebutkan satu per satu.

Kesempurnaan skripsi ini tidak terlepas dari segala kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penulis dan semua yang memerlukannya.

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Blitar, 13 Juni 1986 dari ayah M. Ghufron dan ibu Sri Eko Martiningsih. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara. Tahun 2004 penulis menyelesaikan pendidikan di SMA Negeri I Blitar dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB pada Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan.

Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif dalam organisasi HIMASILKAN sebagai staff Hubungan Luar dan Komunikasi (Hublukom) pada tahun 2005/2006, staff Pengabdian Mahasiswa dan Masyarakat (PMM) pada tahun 2006/2007, dan bendahara pada tahun 2007/2008. Penulis juga menjadi koordinator asisten mata kuliah Teknologi Pengolahan Tradisional Hasil Perikanan tahun ajaran 2007/2008 dan mata kuliah Biotoksikologi Hasil Perairan tahun ajaran 2008/2009. Pada tahun 2008 penulis menjuarai Kompetisi Pemikiran Kritis Mahasiswa (KPKM) tingkat nasional bidang perekonomian sebagai juara II, dengan judul karya tulis Tantangan dalam Meningkatkan Standar Kualitas Udang Ekspor Indonesia melalui Traceability System.

Penulis menyelesaikan studi di Institut Pertanian Bogor dengan menyusun skripsi yang berjudul Penapisan Awal Komponen Bioaktif dari Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) sebagai Senyawa Antioksidan.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... xi

DAFTAR GAMBAR ... xii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiii

1. PENDAHULUAN ... 1

1.1. Latar Belakang ... 1

1.2. Tujuan ... 2

2. TINJAUAN PUSTAKA ... 3

2.1. Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea) ... 3

2.2. Penapisan Komponen Bioaktif ... 5

2.3. Radikal Bebas ... 9

2.4. Antioksidan ... 10

3. METODOLOGI ... 14

3.1. Waktu dan Tempat ... 14

3.2. Alat dan Bahan ... 14

3.3. Tahapan Penelitian ... 14

3.3.1. Penelitian Pendahuluan ... 15

3.3.1.1. Ekstraksi Senyawa Bioaktif ... 15

3.3.1.2. Uji Antioksidan (DPPH) ... 17

3.3.2. Penelitian Utama ... 17

3.3.2.1. Uji Antioksidan (DPPH) ... 17

3.3.2.2. Evaluasi Aktivitas Antioksidan (Penentuan Bilangan Peroksida) ... 18

3.3.3. Fitokimia ... 19

3.3.3.1. Uji Alkaloid ... 19

3.3.3.2. Uji Triterpenoid/steroid ... 19

3.3.3.3. Uji Flavonoid ... 20

3.3.4. Rancangan Percobaan dan Analisis Data ... 20

4. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 22

4.1. Penelitian Pendahuluan ... 22

4.1.1. Ekstraksi Senyawa Bioaktif ... 22

4.1.2. Penentuan Jenis Pelarut dengan Uji Antioksidan Metode DPPH ... 22

4.2. Penelitian Utama ... 25

4.2.1. Penentuan Waktu Maserasi dengan Uji Antioksidan Metode DPPH ... 25

4.2.2. Evaluasi Aktivitas Antioksidan dengan Pengukuran Bilangan Peroksida ... 28

4.3. Hasil Uji Fitokimia ... 30

5. KESIMPULAN DAN SARAN ... 33

5.1. Kesimpulan ... 33

5.2. Saran ... ... 33

DAFTAR PUSTAKA ... 34

DAFTAR TABEL

No. Teks

Halaman

1 Kandungan gizi kijing Taiwan per 100 g bahan ... 4 2 Beberapa pelarut organik dan sifat fisiknya ... 6 3 Pembagian panjang gelombang sinar tampak ... 13 4 Data rendemen ekstrak kijing Taiwan pada berbagai pelarut ... 23 5 Data rendemen ekstrak kijing Taiwan pada berbagai

waktu maserasi ... 26 6 Hasil uji fitokimia ekstrak kijing Taiwan dengan maserasi

metanol selama 72 jam ... 31

DAFTAR GAMBAR

No. Teks Halaman

1 Anatomi bivalvia secara umum ... 3 2 Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal lipid ... 11 3 Struktur awal DPPH dan DPPH tereduksi ... 12 4 Struktur umum kelompok senyawa yang mempunyai

aktivitas antioksidan ... 13 5 Tahapan proses ekstraksi ... 16 6 Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) yang digunakan

dalam penelitian ... 22 7 Grafik hasil uji antioksidan dengan metode DPPH terhadap ekstrak kijing Taiwan berdasarkan jenis pelarut ... 24 8 Grafik hasil uji antioksidan dengan metode DPPH terhadap ekstrak kijing Taiwan berdasarkan waktu maserasi ... 27 9 Bilangan peroksida pada emulsi minyak dengan penambahan

ekstrak kijing Taiwan ... 29 10 Hasil uji fitokimia (alkaloid, flavonoid, dan steroid)

terhadap ekstrak kijing Taiwan dari maserasi dengan metanol

selama 72 jam ... 31

DAFTAR LAMPIRAN

No.

Halaman 1 Urutan proses ekstraksi kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) ... 38 2 Contoh perhitungan nilai rendemen ekstrak kijing Taiwan ... 39 3 Analisis sidik ragam rendemen ekstrak kijing Taiwan

berdasarkan jenis pelarut ... 40 4 Hasil uji Duncan terhadap rendemen ekstrak kijing Taiwan

berdasarkan jenis pelarut ... 40 5 Uji aktivitas antioksidan dengan DPPH terhadap perlakuan

jenis pelarut ... 41 6 Kurva aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan

dengan pelarut n-heksan ... 43 7 Kurva aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan

dengan pelarut etil asetat ... 44 8 Kurva aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan

dengan pelarut metanol ... 45 9 Contoh perhitungan nilai IC50 ... 46 10 Analisis sidik ragam perlakuan jenis pelarut

(transformasi logaritma) ... 47 11 Hasil uji Duncan terhadap perlakuan jenis pelarut

(transformasi logaritma) ... 47 12 Analisis sidik ragam rendemen ekstrak kijing Taiwan

berdasarkan waktu maserasi ... 48 13 Uji aktivitas antioksidan dengan DPPH terhadap perlakuan

waktu maserasi ... 49 14 Kurva aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan

dengan waktu maserasi 24 jam ... 51 15 Kurva aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan

dengan waktu maserasi 48 jam ... 52 16 Kurva aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan

dengan waktu maserasi 72 jam ... 53 17 Analisis sidik ragam perlakuan waktu maserasi ... 54 18 Hasil uji Duncan terhadap perlakuan waktu maserasi ... 54 19 Contoh perhitungan bilangan peroksida emulsi minyak

20 Analisis sidik ragam terhadap bilangan peroksida sampel minyak dengan penambahan ekstrak kijing Taiwan ... 56 21 Hasil uji Duncan terhadap bilangan peroksida sampel minyak

dengan penambahan ekstrak kijing Taiwan ... 56

1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Indonesia sebagai negara kepulauan memiliki keanekaragaman sumberdaya perairan yang sangat melimpah. Wilayah perairan yang sangat luas mampu menyediakan berbagai jenis ikan, karang, rumput laut, kerang-kerangan, dan sumberdaya lain yang masih sangat potensial. Salah satu sumberdaya yang belum dimanfaatkan secara optimal adalah kerang-kerangan.

Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea) merupakan kerang-kerangan yang hidup di danau atau sungai. Kerang jenis ini mempunyai keistimewaan, yaitu dapat mengatur tingkat metabolisme O2 dengan baik sehingga masih bisa hidup pada keadaan perairan yang berkadar O2 rendah (Soeseno 1984). Kijing Taiwan juga mampu berkembang biak dengan cepat. Sekali memijah kijing Taiwan mampu menghasilkan telur sebanyak 369.227 – 458.000 butir telur. Kenyataan ini menunjukkan bahwa kijing Taiwan sangat potensial untuk dibudidayakan (Suwignyo et al 1981).

Kerang ini sebenarnya bukan kerang asli dari Indonesia, diduga bahwa kijing Taiwan masuk ke Indonesia melalui ikan nila atau ikan mola yang dibawa dari Taiwan sekitar tahun 1960 sampai 1970. Nama kijing Taiwan akhirnya diambil dari daerah asal tersebut (Hasim 2008).

Kijing Taiwan mempunyai berbagai manfaat. Kerang ini bersifat filter feeder karena hidupnya yang berada di dasar perairan tergenang atau mengalir. Makanannya berupa detritus membuatnya menjadi biofilter perairan yang efektif sehingga dapat membantu dalam usaha penjernihan air (Suwignyo et al. 1981). Menurut Liu et al (2008), Kijing Taiwan sebenarnya telah lama dimanfaatkan oleh bangsa Cina sebagai obat untuk berbagai macam penyakit, seperti lever dan diabetes. Bahkan dalam Kamus Obat-obatan Tradisional Cina (Zhong Yao Da Ci Dian), kerang Anodonta woodiana mempunyai khasiat untuk membersihkan racun dalam tubuh, memperlancar sirkulasi darah, menambah energi, dan memperkuat daya tahan tubuh.

Penyebaran kijing Taiwan di Indonesia sudah cukup luas. Usaha pembudidayaan yang menunjukkan hasil yang cukup memuaskan diantaranya

terdapat di Bogor, Cianjur, Yogyakarta, dan Jawa Tengah. Konsumsi kijing Taiwan di daerah-daerah tersebut terus meningkat walaupun pemanfaatannya masih terbatas untuk konsumsi (Suwignyo et al 1981).

Berbagai penelitian mengenai manfaat kijing Taiwan membuka wawasan yang lebih luas tentang kandungan komponen bioaktif yang terdapat di dalamnya. Kenyataan bahwa kijing Taiwan mampu memberikan efek menyehatkan bila dikonsumsi memberikan dugaan bahwa terdapat suatu komponen yang bersifat antioksidan. Antioksidan sendiri merupakan suatu zat yang dapat menangkal pengaruh radikal bebas yang bila masuk ke dalam tubuh dapat menyebabkan kerusakan. Pengaruh negatif yang diakibatkan oleh radikal bebas diantaranya penuaan dini, jantung koroner, kanker (Muchtadi 2000). Senyawa-senyawa aktif dari kijing Taiwan yang diperoleh dari hasil penelitian ini diharapkan dapat dimanfaatkan dalam bidang farmasi, pangan, industri, dan lain-lain.

1.2. Tujuan

Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk membuktikan adanya komponen antioksidan pada kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea) melalui ekstraksi bertingkat dengan pelarut polar, semi polar, dan nonpolar, sedangkan tujuan khusus yang ingin dicapai antara lain:

1) Menentukan jenis pelarut yang dapat menghasilkan ekstrak dengan aktivitas antioksidan terbaik.

2) Menentukan waktu maserasi yang paling optimal yang dapat menghasilkan ekstrak dengan aktivitas antioksidan terbaik.

3) Mengaplikasikan ekstrak terbaik pada emulsi minyak dan menentukan jumlah optimal ekstrak yang dapat menghambat pembentukan peroksida.

4) Mengetahui jenis dan sifat komponen bioaktif yang terdapat pada kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea) dari ekstrak terbaik melalui uji fitokimia.

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea)

Kerang jenis Anodonta woodiana ini berasal dari Taiwan, oleh karena itulah ia dikenal juga dengan sebutan kerang atau kijing taiwan. Kerang ini masuk ke Indonesia tanpa sengaja karena ikut terbawa saat Indonesia mengimpor ikan mola (Hypophthalmichtys molitrix) dari Taiwan sekitar akhir 1960-an hingga awal 1970-an (Hasim 2008).

Kijing Taiwan dapat hidup di beberapa ekosistem perairan tawar karena memiliki kemampuan menyedot air dan menyaring partikel dalam air 40 L per hari per ekor. Pertumbuhan kijing Taiwan cepat pada habitat air yang menggenang. Bahkan pada beberapa perairan, kijing Taiwan terjaga kontinuitasnya walaupun tidak dibudidayakan dengan sengaja (BPPT 2008). Anatomi kijing Taiwan disajikan dalam gambar bivalvia secara umum seperti yang disajikan pada Gambar 1.

Gambar 1. Anatomi bivalvia secara umum Sumber: Bunje (2001)

Berikut ini merupakan klasifikasi kijing Taiwan menurut Parker dan Haswell (1960) diacu dalam Suwignyo et al. (1981):

Kingdom : Animalia

Phylum : Mollusca

Kelas : Lamellibranchiata Ordo : Eulamellibranchiata Famili : Unionidae

Genus : Anodonta

Spesies : Anodonta woodiana Lea.

Kandungan gizi kijing Taiwan cukup tinggi. Pemanfaatannya sebagai bahan makanan dapat dijadikan sebagai alternatif sumber protein dan zat besi karena jumlahnya yang tinggi. Kandungan asam aminonya cukup lengkap, yang tertinggi adalah asam glutamat yang mencapai 1020 mg/100 g bahan. Kijing Taiwan juga mempunyai asam amino pembatas yaitu valine dengan nilai sebesar 287 mg/100 g bahan (Suwignyo et al 1981). Kandungan gizi kijing taiwan secara lengkap dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Kandungan gizi kijing Taiwan per 100 g bahan

Komposisi kimia Kadar

Air Abu Lemak Protein Karbohidrat Kalsium Fosfor Besi Vitamin A Karoten Vitamin B1 Kalori bdd

85 g 1,5 g 1,1 g 8 g 3,6 g 133 mg 170 mg 3,1 mg 300 g 898 g 0,01 g 59 kal 65 % Sumber: Poedjiadi (1994)

Kijing Taiwan mempunyai cangkang yang simetri bilateral dan terdiri dari dua buah keping pada bagian kanan dan kiri. Kedua keping cangkang kerang ini cembung berwarna hijau kebiru-biruan dan kecoklat-coklatan. Cangkang terdiri dari tiga lapis, meliputi lapisan luar yang mengandung zat tanduk, lapisan tengah

berupa kristal kalsium karbonat dan lapisan dalam sebagai lapisan mutiara yang mengandung kalsium karbonat dan dapat memantulkan cahaya. Pada bagian dorsal cangkang terdapat hinge-ligament yang merupakan tempat pertautan dari kedua cangkang dan pada bagian anterior ligament terdapat penonjolan yang disebut umbo. Sekeliling umbo terdapat garis pertumbuhan tahunan yang kelihatan nyata (BPPT 2008).

Hewan ini tergolong filter feeder yaitu jenis hewan yang mendapatkan makanan dengan jalan menyaring air yang masuk ke dalam tubuhnya. Volume air yang dapat disaring oleh kijing Taiwan adalah 2,5 liter per individu dewasa per jam. Makanan yang masuk bersama air tadi digerakkan, diperas, lalu dicerna dengan bantuan cilia (rambut getar) pada tubuhnya. Cilia mampu bergerak 2-20 kali per detik. Makanan yang masuk dapat berupa zooplankton, fitoplankton, bakteri, flagellata, protozoa, detritus, alga, dan berbagai zat yang tersuspensi dalam perairan tempat tinggalnya. Alat pencernaannya berturut-turut terdiri dari mulut yang tidak berahang atau bergigi, sepasang labial palps yang bercilia, esofagus, lambung, usus, rektum, dan anus. Dalam tubuh kerang terdapat pula hati yang menyelubungi dinding lambung, ginjal, pembuluh darah, dan pembuluh urat saraf (Hasim 2008).

Lingkungan yang cocok untuk habitat kijing Taiwan adalah dasar perairan yang berupa lumpur dengan pasir atau sedimen yang membentuk lapisan tanah yang tidak padat. Suhu perairan yang optimal harus berkisar antara 11-29°C dengan derajat keasaman (pH) antara 4,8 sampai 9,8. Umumnya kijing dapat mengatur tingkat metabolisme oksigen dengan baik sehingga masih dapat hidup pada keadaan di mana kadar oksigen dalam air sangat sedikit (BPPT 2008).

2.2. Penapisan Komponen Bioaktif

Penapisan merupakan pemisahan suatu bahan dari zat-zat pencemar atau endapan. Penapisan juga dapat diartikan sebagai proses pemisahan bahan berdasarkan perbedaan ukuran atau sifat (KBBI 1990). Proses penapisan dilakukan untuk mendapatkan ekstrak dari hewan atau tumbuhan yang selanjutnya dapat dianalisis kandungannya. Penapisan mempunyai pengertian yang sedikit berbeda dengan ekstraksi. Ekstraksi merupakan suatu proses yang secara selektif mengambil zat terlarut dari campuran dengan bantuan pelarut. Proses ekstraksi

dilakukan dengan tujuan untuk memperoleh ekstrak murni atau ekstrak yang hanya terdiri dari satu komponen tunggal, sedangkan proses penapisan dilakukan untuk mendapatkan ekstrak yang lebih kasar. Secara umum proses penapisan lebih sederhana daripada ekstraksi. Namun dalam banyak sumber, semua prosedur untuk menarik kaomponen aktif dari suatu bahan sampai diperoleh ekstrak disebut dengan ekstraksi (Achmadi 1992).

Teknik ekstraksi didasarkan pada kenyataan bahwa jika suatu zat dapat larut dalam dua fase yang tidak tercampur, maka zat itu dapat dialihkan dari fase yang satu ke fase yang lain dengan mengocoknya bersamaan. Pemilihan pelarut yang digunakan tergantung pada sifat zat yang dilarutkan, karena setiap zat memiliki kelarutan yang berbeda dalam pelarut yang berlainan (Achmadi 1992). Sifat-sifat pelarut yang dapat dijadikan acuan pemilihan pelarut dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Beberapa pelarut organik dan sifat fisiknya

Pelarut Titik didih (0C) Titik beku (0C) Konstanta dielektrik (Debye) Dietil eter Karbon disulfida Aseton Kloroform Metanol Tetrahidrofuran Di-isopropil eter N-heksan Karbon tetraklorida Etil asetat Etanol Benzena Sikloheksana Isopropanol Air Dioksan Toluena

Asam asetat glasial N,N-dimetil formamida Dietilenaglikol 35 46 56 61 65 66 68 69 76 77 78 80 81 82 100 102 111 118 154 245 -116 -111 -95 -64 -98 -65 -60 -94 -23 -84 -117 5,5 5,5 -89 0 12 -95 17 -61 -10 4,3 2,6 20,7 4,8 32,6 7,6 3,9 1,9 2,2 6,0 24,3 2,3 2,0 18,3 78,5 2,2 2,4 6,2 34,8 37,7 Sumber : Nur dan Adijuwana (1989)

Gaya yang bekerja dalam proses ekstraksi adalah akibat adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan cairan ekstraksi yang berada di luar sel. Bahan pelarut yang mengalir ke dalam ruang sel akan menyebabkan

protoplasma membengkak dan bahan kandungan sel akan terlarut sesuai kelarutannya (Voight 1994).

Metode ekstraksi berdasarkan jenis pelarutnya dapat dilakukan dengan dua cara yaitu aqueous phase dan organic phase. Cara aqueous phase dilakukan dengan menggunakan air, sedangkan cara organic phase dilakukan dengan pelarut organik. Prinsip ekstraksi menggunakan pelarut organik adalah bahan yang akan diekstrak kontak langsung dengan pelarut pada waktu tertentu, kemudian diikuti dengan pemisahan bahan yang diekstrak. Hal-hal yang harus dipertimbangkan saat memilih pelarut antara lain (Achmadi 1992) :

1) Pelarut polar akan melarutkan senyawa polar dan pelarut non polar akan melarutkan senyawa non polar.

2) Pelarut organik cenderung melarutkan senyawa organik.

3) Air cenderung melarutkan senyawa organik dan garam dari asam maupun basa organik.

4) Asam-asam organik yang larut dalam pelarut organik dapat diekstraksi dengan menggunakan basa (NaOH, Na2CO3, dan NaHCO3).

Metode ekstraksi juga dikelompokkan berdasarkan tingkat kesulitannya, yaitu ekstraksi sederhana dan ekstraksi khusus (Harborne 1987). Ekstraksi sederhana terdiri atas:

1) Maserasi, yaitu metode ekstraksi dengan cara merendam sampel dalam pelarut dengan atau tanpa pengadukan.

2) Perkolasi, yaitu metode ekstraksi secara berkesinambungan.

3) Reperkolasi, yaitu perkolasi dimana hasil perkolasi digunakan untuk melarutkan sampel di dalam perkolator sampai senyawa kimianya terlarutkan. 4) Diakolasi, yaitu perkolasi dengan penambahan tekanan udara.

Ekstraksi khusus terdiri atas:

1) Soxhletasi, yaitu metode ekstraksi secara berkesinambungan untuk melarutkan sampel kering dengan menggunakan pelarut bervariasi.

2) Arus balik, yaitu metode ekstraksi secara berkesinambungan dimana sampel dan pelarut saling bertemu melalui gerakan aliran yang berlawanan.

3) Ultrasonik, yaitu metode ekstraksi dengan alat yang menghasilkan frekuensi bunyi atau getaran antara 25 – 100 KHz.

Sifat penting yang harus diperhatikan dalam pemilihan pelarut adalah kepolaran senyawa yang dilihat dari gugus polarnya (seperti gugus OH, COOH, dan lain-lain). Derajat polaritas tergantung pada tetapan dielektrik, makin besar tetapan dielektrik semakin polar pelarut tersebut. Bahan-bahan jenis tertentu memerlukan metode ekstraksi bertingkat. Ekstraksi bertingkat dilakukan secara berturut-turut dimulai dengan pelarut nonpolar (heksan) lalu dengan pelarut yang kepolarannya menengah (etilasetat atau dietileter), kemudian dengan pelarut polar (metanol atau etanol). Dengan demikian akan diperoleh ekstrak awal (crude extract) yang berturut-turut mengandung senyawa nonpolar, kepolaran menengah, dan polar (Nur dan Adijuwana 1989).

Pelarut nonpolar merupakan salah satu pelarut yang dikenal efektif terhadap alkaloid dalam bentuk basa dan terpenoid dari bahan. Pelarut nonpolar juga dapat mengekstrak senyawa kimia seperti lilin, lemak, dan minyak yang mudah menguap. Pelarut semi polar mampu mengekstrak senyawa fenol, terpenoid, alkaloid, aglikon, dan glikosida. Pelarut yang bersifat polar, mampu mengekstrak senyawa alkaloid kuartener, komponen fenolik, karotenoid, tanin, gula, asam amino, dan glikosida (Harborne 1987). Metanol, sebagai senyawa polar, dapat disebut sebagai pelarut universal karena selain mampu mengekstrak komponen polar, dapat juga mengekstrak komponen nonpolar seperti lilin dan lemak (Houghton dan Raman 1998).

Proses ekstraksi terdiri dari beberapa tahap yaitu penghancuran bahan, penimbangan, perendaman dengan pelarut, penyaringan, dan pemisahan. Penghancuran bertujuan untuk mempermudah pengadukan dan kontak bahan dengan pelarutnya pada saat proses pelarutnya. Bahan ditimbang untuk mengetahui berat awal bahan sehingga dapat ditentukan rendemen yang dihasilkan. Bahan yang telah ditimbang kemudian direndam dalam pelarut yang sesuai. Proses perendaman yang dilakukan disebut maserasi. Tahap selanjutnya adalah tahap pemisahan yang terdiri dari penyaringan dan evaporasi. Penyaringan dilakukan untuk memisahkan residu bahan dan pelarut yang telah mengandung senyawa bioaktif. Pemisahkan pelarut dengan senyawa bioaktif yang terikat dilakukan evaporasi sehingga pelarut akan menguap dan diperoleh senyawa hasil ekstraksi. Hasil ekstrak yang diperoleh akan tergantung pada beberapa faktor

antara lain kondisi alamiah senyawa tersebut, metode ekstraksi yang digunakan, ukuran partikel sample, kondisi dan waktu penyimpanan, lama waktu ekstraksi, dan perbandingan jumlah pelarut terhadap jumlah sampel (Darusman et al 1995).

2.3. Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan struktur kimia yang mempunyai satu elektron yang tidak berpasangan pada orbit luarnya. Energi yang dihasilkan oleh konfigurasi yang tidak stabil dan sangat reaktif tersebut dilepaskan melalui reaksi dengan molekul didekatnya sehingga terjadi perpindahan elektron dari molekul donor ke molekul radikal untuk menjadikan radikal tersebut stabil. Radikal bebas kemudian memulai reaksi autotokatalitik dimana molekul yang bereaksi dengan radikal bebas dengan sendirinya berubah menjadi radikal bebas untuk menambah rantai kerusakan. Radikal bebas sangat berbahaya bagi makhluk hidup karena apabila reaksi ini terjadi di dalam tubuh, maka akan menimbulkan berbagai kerusakan yang menjadi penyebab penyakit (BlueFame Forums 2008).

Senyawa radikal yang terdapat dalam tubuh (prooksidan) dapat berasal dari luar tubuh (eksogen) atau terbentuk di dalam tubuh (endogen) dari hasil metabolisme zat gizi secara normal (Muchtadi 2000). Secara eksogen, senyawa radikal antara lain berasal dari polutan, makanan atau minuman, radiasi, ozon, dan pestisida (Supari 1996). Penjelasan mengenai sumber radikal bebas endogen sangat bervariasi. Sumber radikal endogen dapat melewati autoksidasi, oksidasi enzimatik, fagositosis dalam respirasi, transpor elektron di mitokondria, oksidasi ion-ion logam transisi, atau melalui ischemic. Autoksidasi adalah senyawa yang mengandung ikatan rangkap, hidrogen alilik, benzilik atau tersier yang rentan terhadap oksidasi oleh udara. Oksidasi enzimatik menghasilkan oksidan asam hipoklorit, di mana sekitar 70-90 % konsumsi O2 oleh sel fagosit diubah menjadi superoksida. Sumber eksogenus radikal bebas, berasal dari luar sistem tubuh, diantaranya sinar UV. Sinar UV B merangsang melanosit memproduksi melanin berlebihan dalam kulit, yang tidak hanya membuat kulit lebih gelap, melainkan juga berbintik hitam. Pemaparan berlebihan dari sinar ultra violet ini bahkan dapat menyebabkan kulit terbakar sampai kanker kulit. Sinar UVA dapat merusak kulit dengan menembus lapisan basal yang menimbulkan kerutan sehingga kulit menjadi kasar (BlueFame Forums 2008).

Radikal bebas juga dapat menyebabkan oksidasi DNA sehingga DNA termutasi dan menimbulkan kanker. Oksigen reaktif dapat meningkatkan kadar LDL (Low Density Lipoprotein) yang kemudian menjadi penyebab penimbunan kolesterol pada dinding pembuluh darah. Akibatnya timbullah aterosklerosis atau lebih dikenal dengan penyakit jantung koroner. Penurunan suplai darah atau ischemic karena penyumbatan pembuluh darah menurut patologi juga dikarenakan radikal bebas. Senyawa radikal juga memicu terjadinya penuaan dini akibat rusaknya sel-sel jaringan tubuh serta dapat menimbulkan penyakit autoimun. Lipid yang seharusnya menjaga kulit agar tetap segar berubah menjadi lipid peroksida karena bereaksi dengan radikal bebas sehingga mempercepat penuaan (Muchtadi 2000).

2.4. Antioksidan

Antioksidan adalah zat yang dapat melawan pengaruh bahaya dari radikal bebas atau Reactive Oxygen Species (ROS) yang terbentuk sebagai hasil dari metabolisme oksidatif yaitu hasil dari reaksi-reaksi kimia dan proses metabolik yang terjadi di dalam tubuh (Sauriasari 2006). Senyawa antioksidan dapat berfungsi sebagai penangkap radikal bebas, pembentuk kompleks dengan logam-logam prooksidan dan berfungsi sebagai senyawa pereduksi. Antioksidan dapat menangkap radikal bebas sehingga menghambat mekanisme oksidatif yang merupakan penyebab penyakit-penyakit degeneratif seperti penyakit jantung, kanker, katarak, disfungsi otak, dan artritis (Sofia 2008).

Berbagai sumber nutrisi yang mengandung antioksidan diantaranya adalah semua biji-bijian, buah-buahan dan sayuran, hati, tiram, unggas, kerang, ikan, susu dan daging. Vitamin E alami dapat ditemukan pada wheat germ (gandum), minyak sayur, sayuran berdaun hijau, kuning telur dan kacang-kacangan. Vitamin C alami dapat ditemukan pada buah sitrus, tomat, melon, kubis, jambu biji, strawberry, dan sebagainya. Beta karoten (pro-vitamin A) yang merupakan antioksidan penting dari karotenoid banyak dijumpai pada buah apricot, wortel, blewah, bit, daun singkong, daun bayam dan ubi merah. Sumber antioksidan terbaik, tentunya berasal dari makanan alami. Namun tidak ada salahnya untuk mengkonsumsi suplemen atau makanan tambahan sebagai pencegahan dan

perawatan kesehatan, karena makanan yang dimakan belum tentu mengandung komponen yang dibutuhkan secara lengkap (Sofia 2008).

Antioksidan dapat digolongkan menjadi antioksidan primer ( chain-breaking antioxidant) dan antioksidan sekunder (preventive antioxidant). Antioksidan primer dapat bereaksi dengan radikal lipid dan mengubahnya menjadi bentuk yang lebih stabil. Sebuah senyawa dapat disebut sebagai antioksidan primer bila senyawa tersebut dapat mendonorkan atom hidrogennya dengan cepat ke radikal lipid dan radikal antioksidan yang dihasilkan lebih stabil dari radikal lipid atau dapat diubah menjadi produk lain yang lebih stabil. Senyawa yang termasuk dalam kelompok antioksidan primer adalah vitamin E (tokoferol), vitamin C (asam askorbat), β-karoten, glutation, dan sistein (Sauriasari 2006). Contoh yang disajikan pada Gambar 2 di bawah ini merupakan mekanisme pengikatan radikal bebas oleh antioksidan pada oksidasi lemak.

Inisiasi : R* + AH RH + A*

Radikal lipid

Propagasi : ROO* + AH ROOH + A*

Radikal peroksida

Gambar 2. Reaksi penghambatan antioksidan primer terhadap radikal lipid Sumber: Gordon (1990)

Penambahan antioksidan (AH) primer dalam konsentrasi rendah pada lipid dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi. Proses autooksidasi lipid pada tahap inisiasi akan menghasilkan radikal lipid (R*) bila lipid kontak dengan panas, cahaya, ion metal, dan oksigen. Radikal antioksidan yang terbentuk (A*) relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi dengan molekul lipid lain membentuk radikal lipid baru. Tahap propagasi terjadi ketika radikal lipid dari tahap inisiasi kontak dengan oksigen membentuk radikal peroksida (ROO*). Tahap terakhir yaitu terminasi, dimana hidroperoksida (ROOH) yang sangat tidak stabil terpecah menjadi senyawa organik berantai pendek seperti keton, aldehid, alkohol, dan asam (Gordon 1990).

Antioksidan sekunder berfungsi sebagai antioksidan pencegah, yaitu menurunkan kecepatan inisiasi dengan berbagai mekanisme, seperti melalui pengikatan ion-ion logam, penangkapan oksigen, dan penguraian hidroperoksida

menjadi produk-produk nonradikal. Contoh antioksidan sekunder antara lain turunan-turunan asam fosfat, senyawa karoten, sterol, fosfolipid, dan produk-produk reaksi maillard. Tujuan dasar dari antioksidan sekunder adalah mencegah terjadinya radikal yang paling berbahaya yaitu radikal hidroksil (BlueFame Forums 2008).

Beberapa metode pengukuran aktivitas antioksidan yang dapat digunakan antara lain metode DPPH dan metode uji aktivitas kemampuan mereduksi. Pengujian dengan DPPH merupakan salah satu metode yang sederhana dengan menggunakan 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH) sebagai senyawa pendeteksi. DPPH merupakan senyawa radikal bebas yang bersifat stabil sehingga dapat bereaksi dengan atom hidrogen yang berasal dari suatu antioksidan. Hasil reaksi tersebut berupa DPPH tereduksi (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazin) yang tidak reaktif lagi karena telah mendapat donor hidrogen (Molyneux 2004). Struktur DPPH dan DPPH tereduksi hasil reaksi dengan antioksidan dapat dilihat pada Gambar 3.

Diphenylpicrylhydrazil Diphenylpicrylhydrazin

Gambar 3. Struktur awal DPPH dan DPPH tereduksi

Pengukuran kapasitas antioksidan dengan metode DPPH menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 517 nm. Larutan DPPH berwarna ungu gelap, ketika ditambahkan senyawa antioksidan maka warna larutan akan berubah menjadi kuning cerah. Penurunan absorbansi, yang ditunjukkan dengan berkurangnya warna ungu, menunjukkan adanya aktivitas scavenging (aktivitas antioksidan). Metode aktivitas kemampuan mereduksi digunakan untuk menentukan antioksidan total pada sampel. Aktivitas antioksidan diukur sebagai kemampuan mereduksi kalium ferri sianida. Absorbansi yang tinggi menunjukkan kemampuan mereduksi yang tinggi (Molyneux 2004). Tabel 3 di

bawah ini menampilkan pembagian warna dalam spektrum cahaya tampak berdasarkan panjang gelombangnya.

Tabel 3. Pembagian panjang gelombang sinar tampak

Panjang gelombang

(nm) Warna Warna komplementer

400 – 435 435 – 480 480 – 490 490 – 600 500 – 560 560 – 595 595 – 610 610 – 680 680 – 700

Ungu Biru

Biru kehijauan Hujau kebiruan Hijau kekuningan Hijau

Jingga Merah

Ungu kemerahan

Hijau kekuningan Kuning

Jingga Merah

Ungu kemerahan Ungu

Biru kehijauan Hijau kebiruan Hijau

Keterangan : warna komplementer merupakan warna larutan yang terlihat (warna yang diteruskan atau dipantulkan)

Sumber : Sudarmadji et al (2007)

Beberapa senyawa yang telah diketahui efektivitasnya sebagai antioksidan antara lain alkaloid, flavonoid, saponin, dan steroid. Struktur dari kelompok senyawa tersebut dapat dilihat pada Gambar 4.

Alkaloid Flavonoid

Steroid Saponin

Gambar 4. Struktur umum kelompok senyawa yang mempunyai aktivitas antioksidan. Sumber: Amrun et al (2007)

3. METODOLOGI

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian tentang penapisan awal komponen bioaktif dari kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea) sebagai senyawa antioksidan ini dilaksanakan pada bulan Agustus sampai November 2008 di Laboratorium Pananganan Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Laboratorium Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor, serta Laboratorium Basah Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor.

3.2. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan antara lain cool box, pisau, talenan, timbangan, kertas label, aluminium foil, corong kaca, labu erlenmeyer, gelas piala, tabung reaksi, buret, rak tabung reaksi, plastik tahan panas, pinggan porselin, oven, penjepit, desikator, kompor listrik, pipet tetes, sudip, bulp, kain blacu, saringan

whatman, freezer, vakum evaporator, magnetic stirrer, hot plate, spektrofotometer, botol steril, botol uji fitokimia dan lempeng tetes.

Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea). Bahan tambahan lain yang digunakan antara lain es

curai, pelarut (n-heksan, etil asetat dan metanol), radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil), H2SO4 2 M, HCl 1,57%, KI, pereaksi Mayer,

pereaksi Dragendorff, pereaksi Wagner, eter, anhidrida asetat, H2SO4 pekat, serbuk magnesium, NaOH 1 N, FeCl3 1%, aquades, minyak kelapa, asam asetat glasial, kloroform, dan natrium tiosulfat (Na2S2O3).

3.3. Tahapan Penelitian

Rangkaian kegiatan penelitian ini dibagi menjadi dua tahap. Tahap pertama merupakan penelitian pendahuluan yang meliputi ekstraksi senyawa bioaktif dan penentuan ekstrak terbaik berdasarkan jenis pelarut dengan uji antioksidan dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil). Tahap kedua merupakan penelitian utama berupa penentuan ekstrak terbaik berdasarkan waktu maserasi dengan uji antioksidan dengan metode DPPH, pembuatan minyak kelapa

dan sistem emulsinya, evaluasi aktivitas antioksidan kijing Taiwan dalam mencegah proses ketengikan pada emulsi minyak kelapa dengan mengukur bilangan peroksida serta analisis fitokimia sampel terpilih.

3.3.1. Penelitian Pendahuluan

Penelitian pendahuluan meliputi ekstraksi senyawa bioaktif dan penentuan ekstrak terbaik berdasarkan jenis pelarut dengan uji antioksidan dengan DPPH. Tujuan yang ingin dicapai adalah menentukan jenis pelarut terbaik yang menghasilkan ekstrak dengan sifat antioksidan yang paling tinggi.

3.3.1.1. Ekstraksi Senyawa Bioaktif (Darusman et al 1995.)

Proses ekstraksi kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea) meliputi penghancuran sampel, maserasi, penyaringan dan evaporasi. Kerang dipisahkan dengan cangkangnya, dicuci dan dicacah dengan pisau. Sampel kemudian ditimbang, dimasukkan dalam erlenmeyer dan dimaserasi dengan pelarut dengan perbandingan sampel : pelarut 1:2 (b/v). Pelarut yang digunakan secara berturut-turut yaitu n-heksan, etil asetat dan metanol.

Waktu perendaman yang digunakan dalam penelitian pendahuluan ini adalah masing-masing selama 24 jam untuk tiap pelarut. Tahap pertama, sampel dimaserasi dengan n-heksan selama 24 jam pada suhu ruang. Sampel lalu disaring dengan kain blacu sebagai saringan kasar, dilanjutkan dengan kertas saring

whatman untuk pemisahkan filtrat dengan ampasnya. Filtrat yang diperoleh disebut filtrat n-heksan. Ampas selanjutnya dimaserasi dengan pelarut etil asetat selama 24 jam kemudian disaring sehingga diperoleh filtrat etil asetat. Ampas yang diperoleh dimaserasi kembali dengan pelarut metanol selama 24 jam lalu disaring sehingga diperoleh ekstrak metanol.

Filtrat n-heksan, etil asetat dan metanol yang diperoleh selanjutnya dievaporasi dengan vacum evaporator pada suhu antara 30oC – 40oC sehingga diperoleh ekstrak kasar n-heksan, etil asetat dan metanol. Penggunaan suhu tersebut dimaksudkan untuk menjaga kestabilan aktivitas antioksidan pada ekstrak, karena dikhawatirkan akan rusak pada suhu tinggi. Tahapan proses ekstraksi kijing Taiwan dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Tahapan proses ekstraksi

(Quinn 1988 diacu dalam Darusman et al 1995) Keterangan: Produk

Proses Pemisahan daging dari cangkang

Penimbangan Pencacahan Pencucian

Maserasi dengan n-heksan

Penyaringan

Evaporasi

Evaporasi

Penyaringan

Evaporasi Maserasi dengan etil asetat

Maserasi dengan metanol Penyaringan

Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.)

Filtrat n-heksan

Ekstrak kasar n-heksan

Ampas

Filtrat etil asetat

Ekstrak kasar etil asetat

Ampas

Filtrat metanol Ampas

Ekstrak kasar metanol

3.3.1.2. Uji Antioksidan (DPPH) (Molyneux 2004).

Ekstrak kijing Taiwan yang berasal dari proses maserasi dengan n-heksan, etil asetat, dan metanol dilarutkan dengan metanol pro analisis dengan konsentrasi 50, 100, 250, 500, dan 1000 ppm. Larutan pereaksi DPPH yang digunakan dibuat dengan melarutkan DPPH dalam metanol pro analisis dengan konsentrasi 400 ppm, yang dibuat segar dan dijaga pada suhu rendah serta terlindung dari cahaya. Sebanyak 4 ml larutan uji atau pembanding direaksikan dengan 1 ml larutan DPPH, lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 516 nm. Larutan standar dibuat dengan mencampur 4 ml metanol pro analisis dengan 1 ml DPPH. Persen peredaman dihitung dengan persamaan regresi terhadap konsentrasi larutan uji, mengikuti persamaan Y = aLn(x) + b, dengan Y menyatakan nilai IC (inhibitor concentration) yang dicari, yaitu sebesar 50 dan X menyatakan nilai dari IC50. Nilai IC50 menyatakan konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk mereduksi DPPH sebesar 50% (Molyneux 2004).

3.3.2. Penelitian Utama

Penelitian utama bertujuan untuk menetukan waktu maserasi terbaik yang dapat menghasilkan ekstrak dengan sifat antioksidan paling tinggi. Selain itu, juga untuk menentukan konsentrasi ekstrak terpilih yang paling optimal untuk penghambatan pembentukan peroksida pada emulsi minyak, serta untuk mengetahui komponen bioaktif dengan uji fitokimia.

3.3.2.1. Uji Antioksidan (DPPH) (Molyneux 2004).

Uji antioksidan dengan DPPH pada penelitian pendahuluan akan menghasilkan satu ekstrak terbaik berdasarkan jenis pelarut. Ekstrak terbaik tersebut selanjutnya dimodifikasi tu diberi perlakuan pada waktu maserasinya, yaitu selama 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Ekstrak yang didapatkan dari berbagai waktu maserasi tersebut diuji DPPH kembali untuk menentukan waktu maserasi yang terbaik. Metode pengujian dengan DPPH sama dengan pengujian pada tahap penelitian pendahuluan berdasarkan (Molyneux 2004). Ekstrak yang mempunyai sifat antioksidan terbaik selanjutnya digunakan pada tahap aplikasi terhadap emulsi minyak untuk menghambat pembentukan peroksida.

3.3.2.2. Evaluasi aktivitas antioksidan (penentuan bilangan peroksida)

Penentuan aktivitas antioksidan dari ekstrak kijing Taiwan diterapkan pada emulsi minyak. Antioksidan berfungsi untuk menghambat pembentukan peroksida pada minyak. Pengujian ini dilakukan melalui pembuatan minyak kelapa dan sistem emulsinya yang dilanjutkan dengan evaluasi aktivitas antioksidan dengan penentuan bilangan peroksida.

a) Pembuatan minyak kelapa dan sistem emulsinya (Santoso et al 2004)

Minyak yang digunakan dalam penelitian dibuat dari parutan kelapa yang diperas untuk diambil santan kentalnya. Santan kental tersebut dipanaskan dengan cara direbus untuk memisahkan komponen minyak yang terkandung di dalamnya, kemudian dilakukan penyaringan untuk memisahkan minyak dan ampas parutan kelapa. Filtrat yang dihasilkan kemudian disaring lagi dengan kertas whatman agar diperoleh minyak kelapa yang bening. Sistem emulsi minyak dibuat dengan mengacu pada metode Santoso et al (2004) yang dimodifikasi, yaitu dengan menghomogenkan 3% minyak kelapa dan 97% air yang mengandung 0,3% Tween 20.

b) Penentuan bilangan peroksida

Peroksida merupakan hasil reaksi antara lemak tidak jenuh dengan oksigen. Bilangan peroksida ditentukan berdasarkan jumlah iodin yang dibebaskan setelah lemak atau minyak ditambahkan alkali iodida. Peroksida yang terbentuk dalam minyak atau lemak berikatan dengan alkali sehingga iod terbebaskan. Iod ini ditangkap dengan natrium thuosulfat yang selanjutnya ditentukan jumlahnya dengan titrasi (Winarno 1996). Bilangan peroksida adalah nilai terpenting untuk menentukan derajat kerusakan pada minyak atau lemak (Ketaren 1986).

Sistem emulsi lemak ditambahkan ekstrak kijing Taiwan terbaik dari tahap sebelumnya sebanyak 0 ppm (tanpa penambahan ekstrak), 2000 ppm, 3000 ppm, dan 4000 ppm yang selanjutnya disebut sampel minyak. Sampel minyak selanjutnya disimpan selama tujuh hari dalam inkubator bersuhu 36,9oC untuk mempercepat oksidasi. Sampel minyak kemudian ditimbang sebanyak 5 gram di dalam labu erlenmeyer, kemudian ditambahkan 30 ml pelarut yang terdiri dari 60% asam asetat glasial dan 40% kloroform. Minyak yang telah larut

ditambahkan 0,5 ml larutan KI jenuh dan didiamkan 15 menit dalam ruang gelap sambil dikocok. Iod yang terbentuk dititrasi dengan larutan Na2S2O3 0,01 N dengan indikator pati 1%. Titrasi dihentikan saat larutan sampel menjadi tidak berwarna. Hasil pengurangan volume akhir terhadap volume awal larutan Na2S2O3 0,01 N yang ditunjukan oleh skala pada burret, merupakan volume total larutan Na2S2O3 0,01 N yang digunakan untuk titrasi sampel. Cara yang sama dibuat juga untuk penerapan blanko. Nilai bilangan peroksida dinyatakan dengan miliequivalen per 1 kg minyak atau lemak (Ketaren 1986), yaitu dengan rumus :

miliequivalen / kg bahan = (a - b) x N x 1000 G

Keterangan :

a = jumlah ml larutan Na2S2O3 untuk titrasi sampel b = jumlah ml larutan Na2S2O3 untuk titrasi blanko N = normalitas larutan Na2S2O3

G = berat sampel (g)

3.3.3. Fitokimia (Harborne 1987)

Penentuan kelompok bioaktif yang terdapat dalam ekstrak kijing Taiwan terpilih dilakukan terhadap tiga jenis senyawa, yaitu alkaloid, triterpenoid/steroid, dan flavonoid. Menurut Darusman et al (1995), komponen bioaktif yang secara umum dan dominan terdapat pada jenis kerang-kerangan adalah alkaloid, triterpenoid/steroid, dan flavonoid.

3.3.3.1. Uji alkaloid (Harborne 1987)

Satu gram sampel dilarutkan dalam 1,52% HCl dan larutan dibagi dalam tiga tabung reaksi. Tabung 1 ditambah 0,5 larutan asam encer sebagai pembanding, tabung 2 ditambah pereaksi Dragendorff, dan tabung 3 ditambah pereaksi Mayer. Terbentuknya endapan jingga pada tabung 2 dan endapan kekuningan pada tabung 3 menunjukkan adanya alkaloid. 3.3.3.2. Uji triterpenoid/steroid (Harborne 1987)

Ekstrak dilarutkan dalam 0,5 ml kloroform dan ditambahkan 0,5 ml asam asetat anhidrat. Larutan selanjutnya ditetesi dengan 12 ml H2SO4 melalui dinding tabung reaksi. Cincin kecoklatan atau violet pada

perbatasan dua pelarut menunjukkan adanya triterpen, sedangkan warna hijau kebiruan menunjukkan adanya sterol.

3.3.3.3. Uji flavonoid (Harborne 1987)

Sebanyak sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuaran dikocok. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.

3.3.4. Rancangan Percobaan dan Analisis Data (Steel dan Torrie 1980)

Analisis data dilakukan terhadap hasil pada tahap penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Tahapan penelitian pendahuluan bertujuan untuk menentukan ekstrak terbaik dari kijing Taiwan berdasarkan jenis pelarut. Faktor yang digunakan adalah jenis pelarut dengan tiga taraf yaitu n-heksan (pelarut polar), etil asetat (pelarut semi polar), dan metanol (pelarut nonpolar). Analisis data dilakukan terhadap hasil dari nilai IC50 yang menunjukkan kemampuan komponen antioksidan dalam menangkap radikal bebas (dalam pengujian ini radikal bebas yang digunakan adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH)). Nilai IC50 menyatakan konsentrasi ekstrak yang dibutuhkan untuk mereduksi DPPH sebesar 50% (Molyneux 2004).

Penelitian utama dilakukan untuk menentukan ekstrak terbaik dari kijing Taiwan berdasarkan waktu maserasi. Faktor yang digunakan dalam penelitian ini adalah waktu maserasi dengan tiga taraf yaitu 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Analisis data juga dilakukan terhadap hasil dari nilai IC50 yang menunjukkan kemampuan komponen antioksidan dalam menangkap radikal bebas. Tahapan aplikasi terhadap emulsi minyak bertujuan untuk menentukan seberapa besar konsentrasi ekstrak terpilih yang mampu menghambat pembentukan peroksida dalam sistem emulsi minyak. Faktor yang digunakan adalah konsentrasi ekstrak dengan empat taraf yaitu 0 ppm, 2000 ppm, 3000 ppm, dan 4000 ppm.

Semua perlakuan pada penelitian ini dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Rancangan yang digunakan untuk semua analisis data adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan model:

Keterangan :

Yij = Respon pengaruh konsentrasi pada taraf i ulangan ke-j = Pengaruh rata-rata umum

αi = Pengaruh konsentrasi pada taraf i

εij = Pengaruh acak (galat percobaan) pada konsentrasi taraf i ulangan ke-j i = n-heksan, etil asetat, metanol (penelitian pendahuluan)

= 24 jam, 48 jam, 72 jam (penentuan waktu maserasi)

= 0 ppm, 2000 ppm, 3000 ppm, dan 4000 ppm (penentuan konsentrasi ekstrak terpilih)

Hipotesis

• Penelitian pendahuluan (penentuan jenis pelarut )

Ho = Jenis pelarut tidak mempengaruhi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan

H1 = Jenis pelarut memengparuhi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan

• Penelitian utama Penentuan waktu maserasi:

Ho = Waktu maserasi tidak mempengaruhi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan

H1 = Waktu maserasi mempengaruhi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan

Penentuan konsentrasi ekstrak terpilih:

Ho = Konsentrasi ekstrak tidak mempengaruhi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan

H1 = Konsentrasi ekstrak mempengaruhi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan

Jika hasil dari pengujian menunjukkan adanya pengaruh yang berbeda nyata pada selang 95% (α=0,05) maka dilakukan uji lanjut Duncan. Rumus uji Duncan adalah:

Rр = r (Σ p;dbs;α)

r kts

Keterangan:

Rр = nilai kritikal untuk perlakuan yang dibandingkan p = perlakuan

dbs = derajat bebas

kts = jumlah kuadrat tengah

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Penelitian Pendahuluan

Penelitian pendahuluan ini meliputi ekstraksi senyawa bioaktif dan penentuan ekstrak terbaik berdasarkan jenis pelarut dengan uji DPPH yang selanjutnya akan digunakan pada penelitian utama. Hasil ekstraksi dari kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) dinyatakan dalam persentase rendemen.

4.1.1. Ekstraksi Senyawa Bioaktif

Proses ekstraksi kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) meliputi penghancuran sampel, maserasi, penyaringan dan evaporasi. Sampel kijing Taiwan dibuka cangkangnya dengan bantuan pisau, kemudian diambil daging dan seluruh organnya. Tahapan maserasi merupakan perendaman daging kijing Taiwan dalam pelarut tanpa pengadukan. Metode ekstraksi yang digunakan adalah ekstraksi bertingkat yang dilakukan secara berturut-turut dimulai dengan pelarut nonpolar (n-heksan), pelarut yang kepolarannya menengah (etil asetat), dan pelarut polar (metanol). Hasil ekstraksi kijing Taiwan yang dinyatakan dalam persen rendemen dapat dilihat pada Tabel 3.

Kijing Taiwan yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari Situ Gede, Bogor. Sampel diambil pada awal bulan September 2008. Ukuran kijing Taiwan yang diperoleh bervariasi, antara 7 cm – 12 cm. Kondisi sampel pada saat akan dipreparasi adalah masih hidup, sehingga ekstraksi yang dilakukan adalah terhadap sampel segar. Kijing Taiwan yang diperoleh disajikan dalam Gambar 6.

Gambar 6. Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea.) yang digunakan dalam penelitian

Tabel 4. Data rendemen ekstrak kijing Taiwan pada berbagai pelarut

Jenis

pelarut Ulangan

Berat awal (gram) Berat ekstrak (gram) Rendemen (%) Rata-rata n-heksan

1 200 0,09 0,05

0,04

2 200 0,04 0,02

3 200 0,10 0,05

etil asetat

1 200 0,17 0,09

0,10

2 200 0,16 0,08

3 200 0,26 0,13

metanol

1 200 0,15 0,08

0,12

2 200 0,27 0,14

3 200 0,27 0,14

Berat awal yang dimaserasi merupakan semua bagian tubuh kijing Taiwan tanpa cangkang yang kemudian dicacah untuk mempermudah proses ekstraksi. Tabel analisis ragam terhadap rendemen ekstrak kijing Taiwan berdasarkan jenis pelarut (Lampiran 3) menunjukkan bahwa maserasi dengan jenis pelarut yang berbeda akan menghasilkan rendemen ekstrak yang jumlahnya berbeda pula. Hasil perhitungan menunjukkan bahwa rendemen terendah berasal dari ekstrak hasil maserasi dengan n-heksan dengan nilai rata-rata sebesar 0,04%, sedangkan rendemen tertinggi yaitu dari ekstrak hasil maserasi metanol dengan nilai rata-rata 0,12%. Perbedaan nilai rendemen ini disebabkan oleh perbedaan jenis pelarut yang digunakan. Pelarut yang berbeda akan melarutkan senyawa-senyawa yang berbeda tergantung tingkat kepolarannya. Oleh sebab itu, jumlah ekstrak yang dihasilkan pun juga tergantung jenis pelarutnya.

Jumlah rendemen ekstrak bergantung pada kondisi alamiah senyawa, metode ekstraksi, ukuran partikel sampel, kondisi dan waktu ekstraksi, serta perbandingan sampel dngan pelarut (Harborne 1987). Hess et al (2005) menyatakan bahwa ekstraksi dari jenis kerang-kerangan akan menghasilkan rendemen ekstrak berkisar antara 0,11% - 0,60% dari berat awal bahan baku.

4.1.2. Penentuan Jenis Pelarut dengan Uji Antioksidan Metode DPPH

Pengujian antioksidan dengan DPPH merupakan salah satu metode yang sederhana dengan menggunakan 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH) sebagai senyawa pendeteksi. DPPH merupakan senyawa radikal bebas yang bersifat stabil sehingga dapat bereaksi dengan atom hidrogen yang berasal dari suatu antioksidan

membentuk DPPH tereduksi (Molyneux 2004). Ekstrak kijing Taiwan yang diperoleh diharapkan mempunyai sifat sebagai antioksidan. Pengujian antioksidan dengan DPPH akan menghasilkan nilai IC50 (Inhibitor Concentration) yang menyatakan seberapa besar konsentrasi ekstrak yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas (DPPH) sebanyak 50%. Hasil uji antioksidan dengan metode DPPH terhadap ekstrak kijing Taiwan dapat dilihat pada Gambar 7.

Perhitungan nilai IC50 diperoleh dari penghambatan radikal bebas pada berbagai konsentrasi ekstrak. Larutan ekstrak yang diencerkan dengan metanol ditambah dengan DPPH. Warna awal larutan DPPH adalah ungu gelap. Penambahan ekstrak yang mempunyai sifat antioksidan akan menghasilkan perubahan warna menjadi kuning cerah. Larutan tersebut kemudian dilihat intensitas warnanya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 517 nm yang akan menghasilkan nilai absorbansi. Nilai absorbansi tersebut diolah untuk menghasilkan persen penghambatan yang dapat ditampilkan dalam bentuk kurva untuk menghasilkan suatu nilai IC50. Hasil perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 9.

5512,75 b

41833,03 c

201,52 a

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000

N

il

a

i

IC

5

0

(

p

p

m

)

n-heksan etil asetat metanol

Je nis pela rut

Keterangan: angka-angka pada histogram yang diikuti huruf berbeda pada jenis pelarut yang digunakan menunjukkan beda nyata (p<0,05)

Gambar 7. Grafik hasil uji antioksidan dengan metode DPPH terhadap ekstrak kijing Taiwan berdasarkan jenis pelarut

Grafik hasil uji antioksidan dengan DPPH terhadap ekstrak kijing Taiwan menunjukkan bahwa ekstrak yang berpotensi mempunyai sifat antioksidan adalah ekstrak hasil maserasi dengan metanol yang menghasilkan nilai IC50 sebesar

201,52 ppm. Molyneux (2004) menyatakan bahwa suatu zat mempunyai sifat antioksidan bila nilai IC50 kurang dari 200 ppm. Bila nilai IC50 yang diperoleh berkisar antara 200-1000 ppm, maka zat tersebut kurang aktif namun masih berpotensi sebagai zat antioksidan. Hasil ini selanjutnya digunakan pada penelitian utama untuk memperoleh ekstrak yang lebih baik dengan pelarut metanol.

Ekstrak yang diperoleh dari maserasi n-heksan dan etil asetat tidak menunjukkan sifat antioksidan karena nilai IC50 yang ditunjukkan berturut-turut sebesar 5512,75 ppm dan 41833,03 ppm. Hasil analisis ragam (Lampiran 10) menunjukkan bahwa jenis pelarut berpengaruh nyata terhadap sifat antioksidan ekstrak kijing Taiwan. Hasil uji lanjut Duncan (Lampiran 11) menunjukkan bahwa jenis pelarut berpengaruh nyata terhadap nilai IC50, dimana masing-masing jenis pelarut saling berbeda nyata. Hasil dengan nilai paling rendah adalah ekstrak dari maserasi dengan etil asetat. Hasil terbaik adalah ekstrak kijing Taiwan dari maserasi metanol karena menghasilkan nilai IC50 paling kecil. Hal ini sesuai dengan Molyneux (2004) yang menyebutkan bahwa sifat antioksidan lebih baik bila nilai IC50 lebih kecil. Suatu zat dikatakan memiliki sifat antioksidan bila nilai IC50 yang dihasilkan kurang dari 200 ppm.

4.2. Penelitian Utama

Penelitian utama yang dilakukan berupa penentuan ekstrak terbaik dari hasil penelitian pendahuluan, yang dilanjutkan dengan perlakuan waktu maserasi, dengan uji antioksidan dengan metode DPPH dan evaluasi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan dalam mencegah proses ketengikan pada emulsi minyak kelapa dengan mengukur bilangan peroksida.

4.2.1. Penentuan Waktu Maserasi dengan Uji Antioksidan Metode DPPH

Perlakuan yang dilakukan pada tahap penelitian utama adalah waktu maserasi dengan pelarut metanol yang didasarkan pada hasil penelitian pendahuluan. Waktu maserasi yang digunakan pada tahap ini adalah 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Data mengenai rendemen ekstrak yang dihasilkan dari berbagai waktu maserasi dapat dilihat pada Tabel 5.

Tabel 5. Data rendemen ekstrak kijing Taiwan pada berbagai waktu maserasi

Waktu

maserasi Ulangan

Berat awal (gram) Berat ekstrak (gram) Rendemen (%) Rata-rata 24 jam

1 200 0,54 0,27

0,26

2 200 0,46 0,23

3 200 0,53 0,27

48 jam

1 200 0,62 0,31

0,27

2 200 0,46 0,23

3 200 0,53 0,27

72 jam

1 200 0,61 0,31

0,28

2 200 0,57 0,29

3 200 0,50 0,25

Data tentang rendemen ekstrak ini merupakan data pendukung untuk mengetahui seberapa besar ekstrak yang diperoleh dari masing-masing perlakuan. Tabel sidik ragam terhadap rendemen ekstrak kijing Taiwan berdasarkan waktu maserasi (Lampiran 12) menunjukkan bahwa perlakuan waktu maserasi tidak memberikan pengaruh nyata terhadap jumlah rendemen ekstrak yang dihasilkan. Hasil data rendemen ekstrak kijing Taiwan pada Tabel 5 dianggap relatif sama.

Semua rata-rata rendemen ekstrak yang dihasilkan ternyata mempunyai nilai yang lebih rendah daripada hasil pengujian Liu et al (2007) yang menyebutkan bahwa rendemen ekstrak kijing Taiwan dari ekstraksi dengan metanol adalah sekitar 0,5%. Perbedaan ini disebabkan oleh proses ekstraksi lebih lengkap, meliputi maserasi metanol, pengendapan alkohol, pelarutan pada larutan garam, dan ultrafiltrasi. Sumber bahan yang digunakan juga lebih spesifik, yaitu dari liposom kijing Taiwan. Menurut Jufri (2004) liposom atau gelembung minyak merupakan partikel koloid yang terdiri dari molekul-molekul fosfolipid sebagai konstituen utama dalam pembentukan lemak lapis ganda tertutup. Bila bahan yang diekstrak telah diketahui secara spesifik, rendemen ekstrak yang dihasilkan diharapkan lebih banyak.

Ekstrak kijing Taiwan yang diperoleh dari maserasi yang semakin lama diharapkan akan meningkatkan aktivitas antioksidannya. Pengujian dilakukan dengan uji antioksidan menggunakan metode DPPH seperti yang dilakukan pada tahap penelitian pendahuluan. Data yang dihasilkan berupa nilai IC50 yang

menunjukkan reduksi radikal bebas (DPPH) oleh ekstrak sebesar 50%. Hasil pengujian ekstrak pada berbagai waktu maserasi dapat dilihat pada Gambar 8.

201,52 c

190,19 b

166,64 c

0 50 100 150 200 250

N

il

a

i

IC

5

0

(

p

p

m

)

24 jam 48 jam 72 jam

Wa ktu masera si

Keterangan: angka-angka pada histogram yang diikuti huruf berbeda pada waktu maserasi yang digunakan menunjukkan beda nyata (p<0,05)

Gambar 8. Grafik hasil uji antioksidan dengan metode DPPH terhadap ekstrak kijing Taiwan berdasarkan waktu maserasi

Grafik hasil uji antioksidan dengan metode DPPH terhadap ekstrak kijing Taiwan di atas menunjukkan bahwa waktu maserasi dengan metanol selama 24 jam menghasilkan nilai IC50 yang paling besar, yaitu 201,52 ppm. Maserasi selama 48 jam menghasilkan nilai IC50 sebesar 190,19 ppm, sedangkan nilai yang paling kecil berasal dari maserasi selama 72 jam dengan nilai sebesar 166,64 ppm. Nilai IC50 yang dihasilkan menunjukkan bahwa semakin lama waktu maserasi dengan pelarut metanol, maka sifat antioksidan semakin tinggi. Diduga bahwa pada waktu maserasi yang lebih lama, metanol dapat melarutkan komponen lain yang dapat memberikan efek sinergis dengan senyawa antioksidan yang telah terekstrak sebelumnya sehingga efektivitasnya meningkat. Dapat pula dinyatakan bahwa maserasi selama 72 jam belum optimal untuk mengekstrak komponen bioaktif yang bersifat antioksidan dari kijing Taiwan karena aktivitasnya terus meningkat.

Hasil analisis ragam (Lampiran 17) menunjukkan bahwa waktu maserasi memberikan pengaruh nyata terhadap nilai IC50 dari ekstrak. Pengujian dilanjutkan dengan uji Duncan terhadap waktu maserasi pelarut metanol

Lampiran 14. Kurva aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan dengan waktu maserasi 24 jam

y = 15.021Ln(x) - 29.562 R2 _{= 0.8249}

0 20 40 60 80 100

0 500 1,000 1,500 2,000 2,500

konsentrasi ekstrak (ppm)

%

i

n

h

ib

is

i

Ulangan 1

y = 15.118Ln(x) - 30.541 R2 _{= 0.8258}

0 20 40 60 80 100

0 500 1,000 1,500 2,000 2,500

konsentrasi ekstrak (ppm)

%

i

n

h

ib

is

i

Ulangan 2

y = 15.244Ln(x) - 30.687 R2 = 0.841

0 20 40 60 80 100

0 500 1,000 1,500 2,000 2,500

konsentrasi ekstrak (ppm)

%

i

n

h

ib

is

i

Lampiran 15. Kurva aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan dengan waktu maserasi 48 jam

y = 22.29Ln(x) - 67.355 R2 _{= 0.8518}

0 20 40 60 80 100 120

0 500 1,000 1,500 2,000 2,500

konsentrasi ekstrak (ppm)

%

i

n

h

ib

is

i

Ulangan 1

y = 22.955Ln(x) - 70.094 R2 _{= 0.8694}

0 20 40 60 80 100 120

0 500 1,000 1,500 2,000 2,500

konsentrasi ekstrak (ppm)

%

i

n

h

ib

is

i

Ulangan 2

y = 22.832Ln(x) - 69.802 R2 _{= 0.865}

0 20 40 60 80 100 120

0 500 1,000 1,500 2,000 2,500

konsentrasi eks trak (ppm)

%

i

n

h

ib

is

i

Lampiran 16. Kurva aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan dengan waktu maserasi 72 jam

y = 15.201Ln(x) - 27.878 R2 _{= 0.9631}

0 20 40 60 80 100

0 500 1,000 1,500 2,000 2,500

konsentrasi ekstrak (ppm)

%

i

n

h

ib

is

i

Ulangan 1

y = 15.602Ln(x) - 29.804 R2 _{= 0.961}

0 20 40 60 80 100

0 500 1,000 1,500 2,000 2,500

konsentrasi ekstrak (ppm)

%

i

n

h

ib

is

i

Ulangan 2

y = 18.157Ln(x) - 42.77 R2 _{= 0.9543}

0 20 40 60 80 100 120

0 500 1,000 1,500 2,000 2,500

konsentrasi ekstrak (ppm)

%

i

n

h

ib

is

i

Lampiran 17. Analisis sidik ragam perlakuan waktu maserasi

ANOVA Sumber keragaman

Jumlah

kuadrat dB

Kuadrat

tengah F hitung F tabel

Perlakuan 1898,667 2 949,3335 109,3628 5,1432

Sisa 52,0836 6 8,6806

Total 1950,7506 8

Keterangan:

Bila F hitung > F tabel, maka tolak H0, artinya perlakuan memberikan pengaruh yang berbeda nyata

Lampiran 18. Hasil uji Duncan terhadap perlakuan waktu maserasi

Perlakuan N α = 0,05

a b c

72 jam 48 jam 24 jam

3 3 3

166,64367

190,18660

201,51563

Keterangan:

α = 0,05 menunjukkan tingkat kepercayaan sebesar 95%

Lampiran 19. Contoh perhitungan bilangan peroksida emulsi minyak dengan penambahan ekstrak kijing Taiwan

Sampel

Konsentrasi

ekstrak Ulangan

Berat bahan (gram) Volume tio (ml) Bil. peroksida Rata-rata

blanko 0 0,2

emulsi minyak 0 ppm

1 2,1 1,2 4,7619

4,67

2 2 1,1 4,5000

3 2,1 1,2 4,7619

2000 ppm

1 2,1 0,9 3,3333

3,36

2 2 0,85 3,2500

3 2 0,9 3,5000

3000 ppm

1 2 0,9 3,5000

3,34

2 2,2 0,9 3,1818

3 2,1 0,9 3,3333

4000 ppm

1 2 0,65 2,2500

2,38

2 2 0,7 2,5000

3 2,1 0,7 2,3810

Rumus perhitungan bilangan peroksida:

mg O2 / kg bahan = (a - b) x N x 1000 G

Keterangan :

a = jumlah ml larutan Na2S2O3 untuk titrasi sampel b = jumlah ml larutan Na2S2O3 untuk titrasi blanko N = normalitas larutan Na2S2O3

G = berat sampel (g)

Contoh perhitungan:

Emulsi minyak

Konsentrasi ekstrak = 0 ppm

Ulangan = 1

Bilangan peroksida = (1,2 – 0,2) ml x 0,01 N x 1000

2,1 gram

= 4,7619 Meq / kg bahan

Rata-rata pada tabel merupakan rata-rata rendemen dari masing-masing bilangan peroksida, contoh:

Konsentrasi ekstrak = 0 ppm

Ulangan = 1, 2, dan 3

Rata-rata = 4,7619 + 4,5000 + 4,7619 3

Lampiran 20. Analisis sidik ragam terhadap bilangan peroksida sampel minyak dengan penambahan ekstrak kijing Taiwan

ANOVA Sumber keragaman

Jumlah

kuadrat dB

Kuadrat

tengah F hitung F tabel

Perlakuan 405,12 3 135,04 90,4286 4,0662

Sisa 11,9467 8 1,4933

Total 417,0667 11

Keterangan:

Bila F hitung > F tabel, maka tolak H0, artinya perlakuan memberikan pengaruh yang berbeda nyata

Lampiran 21. Hasil uji Duncan terhadap bilangan peroksida sampel minyak dengan

penambahan ekstrak kijing Taiwan

Perlakuan N α = 0,05

a b c

4000 ppm 3000 ppm 2000 ppm 0 ppm

3 3 3 3

4,67

3,36 3,34

2,38

Keterangan:

α = 0,05 menunjukkan tingkat kepercayaan sebesar 95%