Alat dan Bahan METODOLOGI 1.

3. METODOLOGI 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian tentang penapisan awal komponen bioaktif dari kijing Taiwan Anodonta woodiana Lea sebagai senyawa antioksidan ini dilaksanakan pada bulan Agustus sampai November 2008 di Laboratorium Pananganan Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Laboratorium Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor, serta Laboratorium Basah Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor.

3.2. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan antara lain cool box, pisau, talenan, timbangan, kertas label, aluminium foil, corong kaca, labu erlenmeyer, gelas piala, tabung reaksi, buret, rak tabung reaksi, plastik tahan panas, pinggan porselin, oven, penjepit, desikator, kompor listrik, pipet tetes, sudip, bulp, kain blacu, saringan whatman , freezer , vakum evaporator , magnetic stirrer, hot plate , spektrofotometer, botol steril, botol uji fitokimia dan lempeng tetes. Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah kijing Taiwan Anodonta woodiana Lea. Bahan tambahan lain yang digunakan antara lain es curai, pelarut n-heksan, etil asetat dan metanol, radikal bebas DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil, H 2 SO 4 2 M, HCl 1,57, KI, pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorff, pereaksi Wagner, eter, anhidrida asetat, H 2 SO 4 pekat, serbuk magnesium, NaOH 1 N, FeCl 3 1, aquades, minyak kelapa, asam asetat glasial, kloroform, dan natrium tiosulfat Na 2 S 2 O 3 . 3.3. Tahapan Penelitian Rangkaian kegiatan penelitian ini dibagi menjadi dua tahap. Tahap pertama merupakan penelitian pendahuluan yang meliputi ekstraksi senyawa bioaktif dan penentuan ekstrak terbaik berdasarkan jenis pelarut dengan uji antioksidan dengan metode DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil. Tahap kedua merupakan penelitian utama berupa penentuan ekstrak terbaik berdasarkan waktu maserasi dengan uji antioksidan dengan metode DPPH, pembuatan minyak kelapa dan sistem emulsinya, evaluasi aktivitas antioksidan kijing Taiwan dalam mencegah proses ketengikan pada emulsi minyak kelapa dengan mengukur bilangan peroksida serta analisis fitokimia sampel terpilih. 3.3.1. Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan meliputi ekstraksi senyawa bioaktif dan penentuan ekstrak terbaik berdasarkan jenis pelarut dengan uji antioksidan dengan DPPH. Tujuan yang ingin dicapai adalah menentukan jenis pelarut terbaik yang menghasilkan ekstrak dengan sifat antioksidan yang paling tinggi. 3.3.1.1. Ekstraksi Senyawa Bioaktif Darusman et al 1995. Proses ekstraksi kijing Taiwan Anodonta woodiana Lea meliputi penghancuran sampel, maserasi, penyaringan dan evaporasi. Kerang dipisahkan dengan cangkangnya, dicuci dan dicacah dengan pisau. Sampel kemudian ditimbang, dimasukkan dalam erlenmeyer dan dimaserasi dengan pelarut dengan perbandingan sampel : pelarut 1:2 bv. Pelarut yang digunakan secara berturut- turut yaitu n-heksan, etil asetat dan metanol. Waktu perendaman yang digunakan dalam penelitian pendahuluan ini adalah masing-masing selama 24 jam untuk tiap pelarut. Tahap pertama, sampel dimaserasi dengan n-heksan selama 24 jam pada suhu ruang. Sampel lalu disaring dengan kain blacu sebagai saringan kasar, dilanjutkan dengan kertas saring whatman untuk pemisahkan filtrat dengan ampasnya. Filtrat yang diperoleh disebut filtrat n-heksan. Ampas selanjutnya dimaserasi dengan pelarut etil asetat selama 24 jam kemudian disaring sehingga diperoleh filtrat etil asetat. Ampas yang diperoleh dimaserasi kembali dengan pelarut metanol selama 24 jam lalu disaring sehingga diperoleh ekstrak metanol. Filtrat n-heksan, etil asetat dan metanol yang diperoleh selanjutnya dievaporasi dengan vacum evaporator pada suhu antara 30 o C – 40 o C sehingga diperoleh ekstrak kasar n-heksan, etil asetat dan metanol. Penggunaan suhu tersebut dimaksudkan untuk menjaga kestabilan aktivitas antioksidan pada ekstrak, karena dikhawatirkan akan rusak pada suhu tinggi. Tahapan proses ekstraksi kijing Taiwan dapat dilihat pada Gambar 5. Gambar 5. Tahapan proses ekstraksi Quinn 1988 diacu dalam Darusman et al 1995 Keterangan: Produk Proses Pemisahan daging dari cangkang Penimbangan Pencacahan Pencucian Maserasi dengan n-heksan Penyaringan Evaporasi Evaporasi Penyaringan Evaporasi Maserasi dengan etil asetat Maserasi dengan metanol Penyaringan Kijing Taiwan Anodonta woodiana Lea. Filtrat n-heksan Ekstrak kasar n-heksan Ampas Filtrat etil asetat Ekstrak kasar etil asetat Ampas Filtrat metanol Ampas Ekstrak kasar metanol 3.3.1.2. Uji Antioksidan DPPH Molyneux 2004. Ekstrak kijing Taiwan yang berasal dari proses maserasi dengan n-heksan, etil asetat, dan metanol dilarutkan dengan metanol pro analisis dengan konsentrasi 50, 100, 250, 500, dan 1000 ppm. Larutan pereaksi DPPH yang digunakan dibuat dengan melarutkan DPPH dalam metanol pro analisis dengan konsentrasi 400 ppm, yang dibuat segar dan dijaga pada suhu rendah serta terlindung dari cahaya. Sebanyak 4 ml larutan uji atau pembanding direaksikan dengan 1 ml larutan DPPH, lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 516 nm. Larutan standar dibuat dengan mencampur 4 ml metanol pro analisis dengan 1 ml DPPH. Persen peredaman dihitung dengan persamaan regresi terhadap konsentrasi larutan uji, mengikuti persamaan Y = aLnx + b, dengan Y menyatakan nilai IC inhibitor concentration yang dicari, yaitu sebesar 50 dan X menyatakan nilai dari IC 50 . Nilai IC 50 menyatakan konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk mereduksi DPPH sebesar 50 Molyneux 2004. 3.3.2. Penelitian Utama Penelitian utama bertujuan untuk menetukan waktu maserasi terbaik yang dapat menghasilkan ekstrak dengan sifat antioksidan paling tinggi. Selain itu, juga untuk menentukan konsentrasi ekstrak terpilih yang paling optimal untuk penghambatan pembentukan peroksida pada emulsi minyak, serta untuk mengetahui komponen bioaktif dengan uji fitokimia. 3.3.2.1. Uji Antioksidan DPPH Molyneux 2004. Uji antioksidan dengan DPPH pada penelitian pendahuluan akan menghasilkan satu ekstrak terbaik berdasarkan jenis pelarut. Ekstrak terbaik tersebut selanjutnya dimodifikasi tu diberi perlakuan pada waktu maserasinya, yaitu selama 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Ekstrak yang didapatkan dari berbagai waktu maserasi tersebut diuji DPPH kembali untuk menentukan waktu maserasi yang terbaik. Metode pengujian dengan DPPH sama dengan pengujian pada tahap penelitian pendahuluan berdasarkan Molyneux 2004. Ekstrak yang mempunyai sifat antioksidan terbaik selanjutnya digunakan pada tahap aplikasi terhadap emulsi minyak untuk menghambat pembentukan peroksida. 3.3.2.2. Evaluasi aktivitas antioksidan penentuan bilangan peroksida Penentuan aktivitas antioksidan dari ekstrak kijing Taiwan diterapkan pada emulsi minyak. Antioksidan berfungsi untuk menghambat pembentukan peroksida pada minyak. Pengujian ini dilakukan melalui pembuatan minyak kelapa dan sistem emulsinya yang dilanjutkan dengan evaluasi aktivitas antioksidan dengan penentuan bilangan peroksida. a Pembuatan minyak kelapa dan sistem emulsinya Santoso et al 2004 Minyak yang digunakan dalam penelitian dibuat dari parutan kelapa yang diperas untuk diambil santan kentalnya. Santan kental tersebut dipanaskan dengan cara direbus untuk memisahkan komponen minyak yang terkandung di dalamnya, kemudian dilakukan penyaringan untuk memisahkan minyak dan ampas parutan kelapa. Filtrat yang dihasilkan kemudian disaring lagi dengan kertas whatman agar diperoleh minyak kelapa yang bening. Sistem emulsi minyak dibuat dengan mengacu pada metode Santoso et al 2004 yang dimodifikasi, yaitu dengan menghomogenkan 3 minyak kelapa dan 97 air yang mengandung 0,3 Tween 20. b Penentuan bilangan peroksida Peroksida merupakan hasil reaksi antara lemak tidak jenuh dengan oksigen. Bilangan peroksida ditentukan berdasarkan jumlah iodin yang dibebaskan setelah lemak atau minyak ditambahkan alkali iodida. Peroksida yang terbentuk dalam minyak atau lemak berikatan dengan alkali sehingga iod terbebaskan. Iod ini ditangkap dengan natrium thuosulfat yang selanjutnya ditentukan jumlahnya dengan titrasi Winarno 1996. Bilangan peroksida adalah nilai terpenting untuk menentukan derajat kerusakan pada minyak atau lemak Ketaren 1986. Sistem emulsi lemak ditambahkan ekstrak kijing Taiwan terbaik dari tahap sebelumnya sebanyak 0 ppm tanpa penambahan ekstrak, 2000 ppm, 3000 ppm, dan 4000 ppm yang selanjutnya disebut sampel minyak. Sampel minyak selanjutnya disimpan selama tujuh hari dalam inkubator bersuhu 36,9 o C untuk mempercepat oksidasi. Sampel minyak kemudian ditimbang sebanyak 5 gram di dalam labu erlenmeyer, kemudian ditambahkan 30 ml pelarut yang terdiri dari 60 asam asetat glasial dan 40 kloroform. Minyak yang telah larut ditambahkan 0,5 ml larutan KI jenuh dan didiamkan 15 menit dalam ruang gelap sambil dikocok. Iod yang terbentuk dititrasi dengan larutan Na 2 S 2 O 3 0,01 N dengan indikator pati 1. Titrasi dihentikan saat larutan sampel menjadi tidak berwarna. Hasil pengurangan volume akhir terhadap volume awal larutan Na 2 S 2 O 3 0,01 N yang ditunjukan oleh skala pada burret, merupakan volume total larutan Na 2 S 2 O 3 0,01 N yang digunakan untuk titrasi sampel. Cara yang sama dibuat juga untuk penerapan blanko. Nilai bilangan peroksida dinyatakan dengan miliequivalen per 1 kg minyak atau lemak Ketaren 1986, yaitu dengan rumus : miliequivalen kg bahan = a - b x N x 1000 G Keterangan : a = jumlah ml larutan Na 2 S 2 O 3 untuk titrasi sampel b = jumlah ml larutan Na 2 S 2 O 3 untuk titrasi blanko N = normalitas larutan Na 2 S 2 O 3 G = berat sampel g 3.3.3. Fitokimia Harborne 1987 Penentuan kelompok bioaktif yang terdapat dalam ekstrak kijing Taiwan terpilih dilakukan terhadap tiga jenis senyawa, yaitu alkaloid, triterpenoidsteroid, dan flavonoid. Menurut Darusman et al 1995, komponen bioaktif yang secara umum dan dominan terdapat pada jenis kerang-kerangan adalah alkaloid, triterpenoidsteroid, dan flavonoid. 3.3.3.1. Uji alkaloid Harborne 1987 Satu gram sampel dilarutkan dalam 1,52 HCl dan larutan dibagi dalam tiga tabung reaksi. Tabung 1 ditambah 0,5 larutan asam encer sebagai pembanding, tabung 2 ditambah pereaksi Dragendorff, dan tabung 3 ditambah pereaksi Mayer. Terbentuknya endapan jingga pada tabung 2 dan endapan kekuningan pada tabung 3 menunjukkan adanya alkaloid. 3.3.3.2. Uji triterpenoidsteroid Harborne 1987 Ekstrak dilarutkan dalam 0,5 ml kloroform dan ditambahkan 0,5 ml asam asetat anhidrat. Larutan selanjutnya ditetesi dengan 12 ml H 2 SO 4 melalui dinding tabung reaksi. Cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut menunjukkan adanya triterpen, sedangkan warna hijau kebiruan menunjukkan adanya sterol. 3.3.3.3. Uji flavonoid Harborne 1987 Sebanyak sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol campuran asam klorida 37 dan etanol 95 dengan volume sama dan 4 ml alkohol kemudian campuaran dikocok. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid. 3.3.4. Rancangan Percobaan dan Analisis Data Steel dan Torrie 1980 Analisis data dilakukan terhadap hasil pada tahap penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Tahapan penelitian pendahuluan bertujuan untuk menentukan ekstrak terbaik dari kijing Taiwan berdasarkan jenis pelarut. Faktor yang digunakan adalah jenis pelarut dengan tiga taraf yaitu n-heksan pelarut polar, etil asetat pelarut semi polar, dan metanol pelarut nonpolar. Analisis data dilakukan terhadap hasil dari nilai IC 50 yang menunjukkan kemampuan komponen antioksidan dalam menangkap radikal bebas dalam pengujian ini radikal bebas yang digunakan adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil DPPH. Nilai IC 50 menyatakan konsentrasi ekstrak yang dibutuhkan untuk mereduksi DPPH sebesar 50 Molyneux 2004. Penelitian utama dilakukan untuk menentukan ekstrak terbaik dari kijing Taiwan berdasarkan waktu maserasi. Faktor yang digunakan dalam penelitian ini adalah waktu maserasi dengan tiga taraf yaitu 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Analisis data juga dilakukan terhadap hasil dari nilai IC 50 yang menunjukkan kemampuan komponen antioksidan dalam menangkap radikal bebas. Tahapan aplikasi terhadap emulsi minyak bertujuan untuk menentukan seberapa besar konsentrasi ekstrak terpilih yang mampu menghambat pembentukan peroksida dalam sistem emulsi minyak. Faktor yang digunakan adalah konsentrasi ekstrak dengan empat taraf yaitu 0 ppm, 2000 ppm, 3000 ppm, dan 4000 ppm. Semua perlakuan pada penelitian ini dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Rancangan yang digunakan untuk semua analisis data adalah Rancangan Acak Lengkap RAL dengan model: Y ij = + αi + ε ij Keterangan : Y ij = Respon pengaruh konsentrasi pada taraf i ulangan ke-j = Pengaruh rata-rata umum αi = Pengaruh konsentrasi pada taraf i ε ij = Pengaruh acak galat percobaan pada konsentrasi taraf i ulangan ke-j i = n-heksan, etil asetat, metanol penelitian pendahuluan = 24 jam, 48 jam, 72 jam penentuan waktu maserasi = 0 ppm, 2000 ppm, 3000 ppm, dan 4000 ppm penentuan konsentrasi ekstrak terpilih Hipotesis • Penelitian pendahuluan penentuan jenis pelarut Ho = Jenis pelarut tidak mempengaruhi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan H 1 = Jenis pelarut memengparuhi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan • Penelitian utama Penentuan waktu maserasi: Ho = Waktu maserasi tidak mempengaruhi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan H 1 = Waktu maserasi mempengaruhi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan Penentuan konsentrasi ekstrak terpilih: Ho = Konsentrasi ekstrak tidak mempengaruhi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan H 1 = Konsentrasi ekstrak mempengaruhi aktivitas antioksidan ekstrak kijing Taiwan Jika hasil dari pengujian menunjukkan adanya pengaruh yang berbeda nyata pada selang 95 α=0,05 maka dilakukan uji lanjut Duncan. Rumus uji Duncan adalah: R р = r Σ p;dbs;α r kts Keterangan: R р = nilai kritikal untuk perlakuan yang dibandingkan p = perlakuan dbs = derajat bebas kts = jumlah kuadrat tengah r = ulangan

4. HASIL DAN PEMBAHASAN