Pembersihan Isi Sel Akar dan Jenis Warna Tinta untuk Deteksi Cendawan Mikoriza Arbuskula

PEMBERSIHAN ISI SEL AKAR DAN JENIS WARNA TINTA

UNTUK DETEKSI CENDAWAN MIKORIZA ARBUSKULA

SITI SULFIAH

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2012

ABSTRAK

SITI SULFIAH. Pembersihan Isi Sel Akar dan Jenis Warna Tinta untuk Deteksi Cendawan Mikoriza Arbuskula. Dibimbing oleh AGUSTIN WYDIA GUNAWAN dan NAMPIAH SUKARNO.

Cendawan mikoriza arbuskula (MA) ialah cendawan yang membentuk asosiasi simbiotik mutualistik dengan akar tumbuhan. Deteksi cendawan MA di dalam akar dilakukan dengan teknik pewarnaan menggunakan bahan kimia berbahaya. Penggunaan warna tinta dan asam cuka digunakan sebagai alternatif pengganti teknik pewarnaan biru tripan dan asam laktat. Penelitian ini bertujuan menentukan waktu pembersihan isi sel akar dan jenis warna tinta sehingga hasil pewarnaan MA diamati dengan jelas menggunakan mikroskop. Akar Pueraria javanica dipotong-potong sekitar 1cm dari 6 biakan pot. Akar dibersihkan dan diwarnai menggunakan 4 jenis zat warna. Sebanyak 20 potong akar dari masing-masing zat warna diambil secara acak untuk diamati. Waktu pembersihan isi sel selama 20 menit menunjukkan hasil yang terbaik. Tinta shaeffer hitam dan biru tripan menunjukkan struktur hifa eksternal, hifa internal, vesikula, dan arbuskula yang terlihat jelas. Arbuskula hanya terwarnai menggunakan tinta shaeffer hitam dan biru tripan. Berdasarkan hasil tersebut tinta shaeffer hitam dapat digunakan sebagai alternatif pewarnaan selain zat warna biru tripan untuk mendeteksi cendawan MA pada P. javanica.

Kata Kunci: cendawan mikoriza arbuskula, cuka, tinta, tripan biru

ABSTRACT

SITI SULFIAH. Clearing of Root Cell Content and Types of Ink Stain for Arbuscular Mycorrhizal Fungal Detection. Supervised by AGUSTIN WYDIA GUNAWAN and NAMPIAH SUKARNO.

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi is a symbiotic mutualistic fungi association with plant roots. Staining technique to detect AM fungi usually used hazardous chemical. The ink stain and vinegar were used as alternative technique to replace trypan blue and lactic acid in root staining method. This study aimed to determine time of clearing of root cell contents and types of ink stain to produced the best AM fungal structures within the root observed under microscope.

Pueraria javanica root from 6 pot cultures were cut into 1 cm long. They were cleared and stained using 4 types of stains. Twenty stained roots were taken randomly from each stain types, and observed. Root clearing process for 20 minutes showed the best result. Only shaeffer black ink and trypan blue produced clear structure of external hyphae, internal hyphae, vesicles, and arbuscule. Arbuscular structure only stained by shaeffer black ink and trypan blue. This indicated that shaeffer black ink could be used as an alternative stain to detect AM fungi within the P. javanica

root.

PEMBERSIHAN ISI SEL AKAR DAN JENIS WARNA TINTA

UNTUK DETEKSI CENDAWAN MIKORIZA ARBUSKULA

SITI SULFIAH

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2012

Judul : Pembersihan Isi Sel Akar dan Jenis Warna Tinta untuk Deteksi Cendawan Mikoriza Arbuskula

Nama : Siti Sulfiah NIM : G34080109

Disetujui

Diketahui Ketua Departemen Biologi

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP 19641002 198903 1 002

Tanggal lulus:

Pembimbing I

Ir. Agustin Wydia Gunawan, M.S. NIP 19480821 197301 2 001

Pembimbing II

Dr. Ir. Nampiah Sukarno NIP 19590504 198703 2 001

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunia sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan judul “Pembersihan Isi Sel Akar dan Jenis Warna Tinta untuk Deteksi Cendawan Mikoriza Arbuskula”. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Maret hingga Agustus 2012 di Laboratorium Mikologi dan Rumah Kaca Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Ir. Agustin Wydia Gunawan, M.S. dan Ibu Dr. Ir. Nampiah Sukarno selaku pembimbing atas arahan dan bimbingan yang diberikan dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberi masukan atas karya ilmiah ini. Di samping itu, ucapan terima kasih disampaikan kepada Pak Kus beserta staf mikologi yang telah membantu selama penelitian. Penulis juga ucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada keluarga tercinta ayah, ibu, serta seluruh keluarga atas segala do’a dukungan, dan kasih sayang yang diberikan.

Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.

Bogor, Oktober 2012

RIWAYAT HIDUP

Siti Sulfiah dilahirkan di Bogor pada tanggal 14 Maret 1990 dari ayah Amu Hayadi dan ibu Ekat. Penulis merupakan anak ke-dua dari empat bersaudara. Penulis lulus dari SMA Negeri 1 Ciampea pada tahun 2007 dan pada tahun 2008 lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN) pada Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif sebagai staff divisi OWA (Observasi Wahana Alam) Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) pada tahun 2009-2011, staf RnD Eko Agrifarm pada tahun 2008-2009, serta menjadi panitia di berbagai kegiatan. Penulis merupakan asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar Tingkat Persiapan Bersama IPB pada tahun 2010-2012, dan Biologi Cendawan tahun 2012.

Pada tahun 2010, penulis melakukan Studi Lapang di Taman Wisata Alam Pangandaran Ciamis, Jawa Barat dengan judul laporan “Keragaman Kapang dan Khamir di Taman Wisata Alam

Pangandaran”. Pada tahun 2011, penulis melakukan Praktik Kerja Lapang di PT. Alam Desa

Tapos dari bulan Juli sampai bulan Agustus dengan judul laporan “Budidaya jambu jamaika di PT.

DAFTAR ISI

Halaman

PENDAHULUAN ... 1

BAHAN DAN METODE ... 1

HASIL ... 2

PEMBAHASAN... 4

SIMPULAN ... 5

DAFTAR PUSTAKA ... 6

PENDAHULUAN

Mikoriza arbuskula (MA) ialah salah satu bentuk asosiasi simbiotik mutualisme antara cendawan dan akar tumbuhan. Struktur cendawan mikoriza arbuskula (MA) pada akar tidak terlihat oleh mata telanjang. Struktur tersebut dapat dideteksi menggunakan pewarnaan akar. Phillips dan Hayman (1970) mengembangkan teknik pewarnaan cendawan MA menggunakan biru tripan yang berbahaya bagi kesehatan karena dapat menyebabkan kanker. Bahan kimia lainnya seperti KOH, HCl, dan H2O2 jika kontak langsung dengan tubuh menyebabkan iritasi kulit, mata, dan hidung. Demi alasan kesehatan, penggunaan bahan kimia perlu dikurangi serta meng-gantinya dengan bahan ramah lingkungan.

Biru tripan digantikan dengan asam fuksin (Kormanik & McGraw 1982) serta biru anilin dan E chlorazol hitam (Brundrett et al. 1984) yang masih termasuk ke dalam bahan berbahaya. Sebuah terobosan besar dilakukan oleh Vierheilig et al. (1998) untuk menjawab permasalahan zat warna yang berbahaya bagi kesehatan. Mereka menggunakan tinta dan cuka untuk mewarnai cendawan MA, namun teknik yang ramah lingkungan dan aman ini tidak banyak digunakan sampai sekarang. Hal ini karena tidak semua tinta dapat mewarnai akar.

Keberhasilan pewarnaan cendawan MA dipengaruhi oleh beberapa faktor, salah satunya ialah saat pembersihan isi sel akar menggunakan KOH 10%. Proses pembersihan isi sel dipengaruhi oleh kepekaan akar yang berbeda bergantung pada suhu, waktu, serta pigmen akar (Koske & Gemma 1989). Penelitian ini bertujuan menentukan waktu pembersihan isi sel akar dan jenis zat warna sehingga hasil pewarnaan cendawan MA dapat diamati dengan jelas.

BAHAN DAN METODE

Bahan yang digunakan ialah akar tanaman inang Pueraria javanica, tinta shaeffer hitam, tinta parker biru, tinta stempel biru, biru tripan, gliserol 50%, HCl 1%, cuka 5%, dan inokulum cendawan MA dari Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor.

Benih P. javanica disterilkan permukaan-nya menggunakan alkohol 70% selama 5 menit, lalu dibilas air steril selama 5 menit sebanyak 3 kali. Selanjutnya, benih direndam dalam H2O2 5% selama 1 menit dan dibilas air

steril selama 5 menit sebanyak 3 kali, lalu dikeringkan pada kertas steril, ditanam dalam medium zeolit tipe II steril (suhu 121 °C selama 45 menit) dan dipelihara hingga bibit berdaun 2-4 untuk mendapatkan akar bermikoriza dalam biakan pot.

Biakan pot dibuat dengan meng-inokulasikan akar P. javanica menggunakan inokulum cendawan MA. Sebanyak 100 g zeolit steril dimasukkan ke dalam pot kemudian ditambahkan 50 g inokulum cendawan MA. Sebanyak 25 g zeolit steril ditambahkan di atas inokulum cendawan MA. Pemeliharaan tanaman meliputi pemupukan setiap dua minggu sekali menggunakan 20 mL pupuk Hyponex hijau (1 g L-1), disiram setiap hari menggunakan air steril, dipangkas setiap empat minggu sekali dan serangga yang datang dibuang secara mekanik dari daun setiap tiga hari sekali.

Sebanyak enam biakan pot dengan inokulasi cendawan MA dipelihara untuk digunakan akarnya. Setiap dua pot cendawan MA dipanen akarnya pada tanaman berumur 16 minggu dan digunakan untuk satu kali ulangan sehingga ada tiga kali ulangan untuk penelitian ini. Tanaman yang telah berumur 16 minggu batangnya dipangkas dan akar dipotong sekitar 1 cm dari pangkal batang. Akar dari dua pot MA dipisahkan dari medium, dicuci, dipotong-potong sekitar 1 cm serta disimpan dalam alkohol 70%.

Penelitian ini disusun dalam rancangan acak faktorial. Pewarnaan disusun dengan dua perlakuan, yaitu waktu pembersihan isi sel terdiri atas empat faktor, yaitu 5, 10, 15, dan 20 menit dan jenis zat warna yang terdiri atas empat faktor, yaitu tinta shaeffer hitam, tinta parker biru, tinta stempel biru, dan biru tripan. Sebanyak 400 potongan akar yang terinokulasi cendawan MA dari dua biakan pot dicuci dari alkohol. Masing-masing 100 potongan akar dibersihkan dengan pemanasan dalam KOH 10% pada suhu 90 °C selama 5, 10, 15, dan 20 menit. Sebanyak 25 potong akar hasil pembersihan dengan KOH 10% diambil secara acak untuk diwarnai dalam setiap jenis zat warna, yaitu tinta shaeffer hitam, tinta parker biru, tinta stempel, dan biru tripan. Pewarnaan akar mengikuti metode Vierheillig et al. (1998) untuk zat warna tinta. Potongan akar dipanaskan dalam tinta-cuka 5% (1ml tinta dan 19 mL cuka 5%) pada suhu 90 °C selama tiga menit, kemudian zat warna dibuang dan akar dibilas dengan campuran cuka 5% dan air (50 mL cuka 5% dan 50 mL air).

2

Sebagai kontrol pewarnaan, akar diwarnai menggunakan biru tripan mengikuti metode Phillips dan Hayman (1970) yang dimodifikasi pada proses waktu pembersihan isi sel dalam KOH 10% pada suhu 90 °C selama 5, 10, 15, dan 20 menit. Selanjutnya, akar direndam dalam HCl 1% selama 30 menit, dipanaskan dalam biru tripan selama 3 menit pada suhu 90 °C kemudian akar direndam dalam gliserol 50% selama 60 menit.

Sebanyak 20 potong akar setiap perlakuan diambil secara acak dan diamati menggunakan mikroskop. Penampakan isi sel akar dikelom-pokkan dalam tiga ciri, yaitu belum bersih (sisa sitoplasma masih banyak), cukup bersih (sisa sitoplasma sudah banyak yang hilang), dan bersih (tidak ada sisa sitoplasma). Penampakan isi sel akar akan mempengaruhi pengamatan struktur cendawan MA. Selanjutnya, perhitungan struktur cendawan MA dititikberatkan pada penampakan isi sel yang bersih. Struktur cendawan MA yang diamati ialah hifa internal, hifa eksternal, vesikula, dan arbuskula, serta kolonisasi mikoriza arbuskula dihitung berdasarkan pada rumus:

Kriteria struktur cendawan yang dihitung ialah yang terlihat bahwa struktur tersebut cendawan MA walaupun masih ada sisa sitoplasma. Data struktur cendawan MA dan hasil kolonisasi akar diolah menggunakan perangkat lunak SAS 9.1.3. Perlakuan diuji dengan uji Duncan pada taraf 5% untuk membedakan antarperlakuan.

HASIL

Pengamatan mikroskopi intensitas pembersihan isi sel akar P. javanica pada empat perlakuan tampak berbeda (Tabel 1). Proses pembersihan isi sel akar selama 5 menit memperlihatkan intensitas isi sel akar yang belum bersih (Gambar 1 a-d). Sisa sitoplasma terlihat keruh dan menghalangi penampakan stuktur cendawan MA saat pengamatan. Waktu pembersihan isi sel akar yang lebih lama berangsur menambah penampakan intensitas isi sel akar yang semakin bersih (Gambar 1 e-k). Waktu pembersihan 20 menit menunjukkan isi sel yang terlihat bersih (Gambar 1 l-p). Isi sel

yang bersih dari sitoplasma akan mempengaruhi kejelasan dari struktur cendawan MA yang diamati. Kategori sel yang telah bersih ialah ketika sel sudah terlihat jernih dan tidak ada sisa sitoplasma yang terdapat dalam sel. Dalam sel yang bersih stuktur cendawan MA dapat dilihat saat pengamatan. Perbedaan isi sel yang belum bersih, cukup bersih, dan bersih akan mempengaruhi penampakan struktur cen-dawan MA (Gambar 1).

Deteksi cendawan MA memerlukan teknik pewarnaan untuk mewarnai isi sel akar maupun cendawan MA sehingga mudah diamati. Isi sel yang diwarnai dengan tinta shaeffer hitam akan terwarnai cokelat bening hingga cokelat, struktur hifa internal, hifa eksternal, dan vesikula terlihat cokelat sedangkan arbuskula terlihat hitam kebiruan. Tinta parker biru akan mewarnai isi sel maupun struktur cendawan MA berwarna biru muda. Tinta stempel biru akan mewarnai isi sel akar maupun cendawan MA berwarna hijau kekuningan. Pewarnaan dengan tinta stempel biru sulit diamati karena warna struktur cendawan MA ada yang menyerupai isi sel akar. Isi sel akar dan cendawan MA yang diwarnai tripan biru akan berwarna biru tua.

Hifa eksternal, hifa internal, vesikula, dan arbuskula merupakan bagian dari struktur cendawan MA. Hifa eksternal, hifa internal, dan vesikula terlihat pada semua perlakuan waktu pembersihan isi sel dan semua perlakuan jenis zat warna yang digunakan. Hifa eksternal tidak menunjukkan perbedaan pada keempat jenis zat warna. Hifa internal yang diwarnai tinta shaeffer hitam dan biru tripan tidak berbeda sedangkan vesikula berbeda. Arbuskula hanya teramati menggunakan pewarna tinta shaeffer hitam dan biru tripan (Gambar 2). Tinta shaeffer hitam mewarnai arbuskula pada menit ke-5, 10, dan 15 sedangkan biru tripan pada menit ke 10, 15, dan 20.

Kombinasi antara pembersihan isi sel akar dan zat warna yang digunakan tidak menunjukkan perbedaan dalam hal kolonisasi cendawan MA. Perlakuan zat warna menunjukkan perbedaan pada kolonisasi cendawan MA (Tabel 2). Zat warna tinta shaeffer hitam tidak berbeda dengan biru tripan, namun keduanya berbeda dengan tinta parker biru dan tinta stempel biru.

3

50 µm

50 µm

50 µm

50 µm

Tabel 1 Penampakan isi sel akar Pueraria javanica berumur 16 minggu

Keterangan:1 belum bersih, 2 cukup bersih, 3 bersih

Tinta shaeffer hitam Tinta parker biru Tinta stempel biru Biru tripan

5’

10’

15’

20’

Gambar 1 Struktur vesikula pada akar Pueraria javanica berumur 16 minggu saat proses pembersihan isi sel 5 (a-d), 10 (e-h), 15 (i-l), dan 20 menit (m-p): a vesikula dengan pewarnaan tinta shaeffer, b vesikula dengan pewarnaan tinta parker, c vesikula dengan pewarnaan tinta stempel, d vesikula dengan pewarnaan biru tripan, e vesikula dengan pewarnaan tinta shaeffer, f vesikula dengan pewarnaan tinta parker, g vesikula dengan pewarnaan tinta stempel, h vesikula dengan pewarnaan biru tripan, i vesikula dengan pewarnaan tinta shaeffer, j vesikula dengan pewarnaan tinta parker, k vesikula dengan pewarnaan tinta stempel, l vesikula dengan pewarnaan biru tripan, m vesikula dengan pewarnaan tinta shaeffer, n vesikula dengan pewarnaan tinta parker, o vesikula dengan pewarnaan tinta stempel, p vesikula dengan pewarnaan biru tripan, (400x, bar = 50 µm).

Pewarna Waktu pembersihan isi sel

5 menit 10 menit 15 menit 20 menit

Tinta shaeffer hitam 1 2 2 3

Tinta parker biru 1 2 2 3

Tinta stempel biru 1 2 2 3

Biru tripan 1 2 3 3

50 µm 50 µm 50 µm

50 µm 50 µm b c 50 µm d

e 50 µm f g _{50 µm}

i _{50 µm} j k _{50 µm l}

m 50 µm n o _{50 µm} p

a

4

Tinta shaeffer hitam Biru tripan

10’

15’

Gambar 2 Struktur Arbuskula pada akar Pueraria javanica menggunakan tinta shaeffer hitam (a-b) dan tripan biru (c-d) dengan waktu pembersihan isi sel selama 10 (a,c) dan 15 menit (b,d), (400x, bar = 50 µm).

Tabel 2 Kolonisasi mikoriza arbuskula pada Pueraria javanica menggunakan zat warna pada waktu pembersihan isi sel selama 20 menit

Pewarna Struktur cendawan MA

Kolonisasi akar (%)

HE HI V A

Tinta shaeffer hitam 2.33a 96.33a 85.00a 6.00a _98.33a

Tinta parker biru 1.33a 82.00b 68.33b 0.00a 83.33b

Tinta stempel biru 0.33a 68.33c 67.67b 0.00a 67.33c

Biru tripan 1.67a 89.67ab 70.67b 0.00a 91.33a

Keterangan:HE:hifa eksternal, HI:hifa internal, V:vesikula, A:arbuskula, angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada satu kolom tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (DMRT)

PEMBAHASAN

Keberhasilan pewarnaan bergantung pada proses pembersihan isi sel akar. Pembersihan isi sel akar dengan KOH 10% bertujuan membersihkan sitoplasma (Phillips & Hayman 1970) dan metabolit sekunder (Vierheillig et al. 2005). Pada umumnya pewarnaan sel cendawan dilakukan dalam kondisi asam karena zat warna akan diikat oleh hifa cendawan yang sebagian besar dinding selnya tersusun dari kitin. Pengondisian supaya akar dalam suasana asam umumnya menggunakan HCl 1% (Phillips & Hayman 1970), tetapi Vierheillig

et al. (1998) menggunakan cuka 5% untuk menggantikan HCl 1%. Penggunaan cuka lebih aman bagi kesehatan dibandingkan dengan dengan HCl 1%, selain itu cuka juga lebih murah dibandingkan dengan dengan HCl 1%.

Proses pembersihan isi sel akar memerlukan waktu yang berbeda. Pember-sihan isi sel untuk akar tidak berpigmen (tomat) memerlukan waktu selama 60 menit dan akar berpigmen (kacang) selama 120

menit pada suhu 90 °C (Phillips & Hayman 1970), sedangkan metode Vierheillig et al. (1998) selama 3-15 menit.

Pembersihan isi sel dengan metode Vierheillig et al. (1998) selain bergantung pada akar, juga bergantung pada jenis tinta. Pembersihan isi sel akar buncis dilakukan dalam KOH 10% selama 5 menit, sedangkan akar ketimun lebih pendek waktunya ialah 3 menit jika menggunakan tinta warna hitam dan biru. Tinta warna merah membutuhkan waktu pembersihan isi sel yang lebih lama, akar buncis selama 15 menit dengan akar ketimun selama 5 menit. Pada penelitian ini pembersihan isi sel akar P. javanica yang tidak berpigmen memerlukan waktu selama 20 menit supaya isi sel terlihat bersih.

Hidrogen peroksida digunakan oleh Phillips dan Hayman (1970) untuk menjer-nihkan akar berpigmen. Pada penelitian ini hidrogen peroksida tidak digunakan karena akar P. javanica tidak berpigmen.

Biru tripan merupakan zat warna yang paling banyak digunakan untuk mendeteksi kolonisasi cendawan MA. Kombinasi antara tinta-cuka diusulkan oleh Vierheillig et al.

50 µm a 50 µm

50 µm _b

50 µm d

5

(1998) sebagai alternatif pengganti biru tripan. Teknik ini selain membutuhkan biaya yang lebih murah juga bisa digunakan untuk jumlah sampel yang besar. Sayangnya sampai saat ini para peneliti lebih suka menggunakan biru tripan dibandingkan dengan dengan tinta-cuka karena kejelasan penampakan struktur cendawan MA di dalam akar. Pewarnaan cendawan MA menggunakan tinta-cuka belum mendapat perhatian. Salah satu alasannya ialah tidak semua tinta dapat digunakan untuk mewarnai cendawan MA.

Kualitas pewarnaan menggunakan tinta-cuka bergantung pada warna dan merek tinta. Warna tinta ungu dan hijau secara umum tidak cocok untuk mewarnai cendawan MA. Tinta hitam untuk semua merek (Carrefour, Pelikan, Shaeffer, dan Cross) dan beberapa tinta biru (Pelikan) serta merah (Parker) dapat mewarnai cendawan MA. Tinta shaeffer hitam memiliki kontras yang sangat baik (Vierheillig et al. 1998) dan tinta parker biru digunakan oleh Nusantara (2011) untuk mewarnai cendawan MA akar jati (Tectona grandis l.f). Tinta shaeffer hitam dan parker biru lebih baik dalam pewarnaan cendawan MA diban-dingkan dengan dengan tinta stempel biru dalam penelitian ini.

Proses pembersihan isi sel akar berpengaruh terhadap bersih tidaknya isi sel akar. Hal ini akan mempengaruhi struktur cendawan MA yang terlihat. Saat isi sel dikatakan cukup bersih ialah ketika isi sel belum terlihat jernih, namun tidak sekeruh isi sel yang belum bersih. Sel pada saat ini terlihat lebih bersih dibandingkan dengan dengan sel yang belum bersih sedangkan isi sel yang telah bersih ketika sel tersebut tidak memiliki sisa sitoplasma. Semakin lama waktu pembersihan isi sel maka isi sel semakin bersih sehingga semakin jelas penampakan struktur cendawan MA. Proses pembersihan isi sel yang belum sempurna akan meninggalkan sisa-sisa sitoplasma yang akan menghalangi pengamatan struktur cendawan MA-nya. Proses pembersihan isi sel akar P. javanica selama 20 menit dapat membersihkan sitoplasma secara sempurna.

Keempat jenis zat warna yang digunakan dapat mendeteksi struktur cendawan MA yang meliputi hifa eksternal, hifa internal, dan vesikula, sedangkan arbuskula hanya dapat diamati pada pewarna tinta shaeffer hitam dan biru tripan. Arbuskula merupakan struktur penting dari cendawan MA yang berkembang pada akar muda dan luruh seiring bertambahnya umur akar (Smith & Read 2008). Cendawan MA, Gigaspora dan

Scutellospora, hanya memiliki struktur arbuskula dalam asosiasinya dengan akar tumbuhan sehingga deteksi kolonisasinya hanya diamati dari struktur arbuskula. Genus lainnya seperti Glomus, Entrophospora, dan

Acaulospora selain memiliki arbuskula juga membentuk vesikula yang dapat dijadikan kriteria untuk melihat kolonisasi cendawan pada akar. Kualitas pewarnaan yang baik ialah ketika pewarna dapat mewarnai arbuskula karena cendawan MA ialah cendawan yang memiliki struktur arbuskula. Dengan demi-kian, arbuskula merupakan struktur cendawan yang penting dalam deteksi. Deteksi terhadap keberadaan arbuskula dipengaruhi oleh pewarna, pelarut, konsentrasi dan pH larutan pewarna, suhu, waktu pewarnaan, serta ketebalan akar (Gange et al. 1999).

Arbuskula yang tidak terlihat pada proses pembersihan isi sel selama 20 menit dengan biru tripan bukan disebabkan pewarnanya melainkan faktor lain. Arbuskula memiliki umur yang lebih pendek dibandingkan dengan dengan vesikula. Arbuskula akan lisis seiring bertambah tuanya umur akar, struktur arbuskula akan menggumpal dan cabang-cabang pada arbuskula tidak dapat dibedakan lagi (Smith & Read 2008). Setelah itu arbuskula akan menjadi struktur yang menggumpal yang memenuhi korteks akar. Penggumpalan struktur arbus-kula terjadi pada hari ke 4-15 setelah terjadinya penetrasi hifa yang berbeda-beda bergantung pada jenis cendawannya.

Tinta shaeffer hitam tidak menunjukkan perbedaan dengan biru tripan dalam mewarnai arbuskula. Tinta shaeffer hitam dapat mewarnai arbuskula seperti biru tripan. Pewarnaan dengan tinta shaeffer hitam memperlihatkan struktur koloni sejelas pewarnaan dengan biru tripan dan mem-perlihatkan kolonisasi akar yang tinggi dibandingkan dengan biru tripan. Oleh sebab itu, penggunaan tinta shaeffer hitam bisa dijadikan alternatif pengganti biru tripan untuk pengamatan cendawan MA. Selain itu, pewarnaan dengan tinta shaeffer hitam relatif murah dan lebih aman bagi kesehatan karena bahan-bahan yang digunakan sering diguna-kan dalam kehidupan sehari-hari

.

SIMPULAN

Pembersihan isi sel dengan KOH 10% selama 20 menit membersihkan isi sel secara menyeluruh untuk akar P. javanica sehingga struktur cendawan MA terlihat jelas. Tinta shaeffer hitam dan biru tripan dapat mewarnai

6

struktur arbuskula yang menjadi struktur penting untuk deteksi cendawan MA. Tinta shaeffer hitam dapat dijadikan alternatif untuk menggantikan biru tripan dalam pengamatan cendawan MA pada akar P. javanica selain karena murah dan aman, kualitas pewarnaannya juga baik.

DAFTAR PUSTAKA

Brundrett MC, Piche Y, Peterson RL. 1984. A new method for observing the morpho-logy of vesicular-arbuscular mycor-rhizae. Can J Bot 62:2128–2134. Gange AC, Bower E, Stagg PG, Aplin DM,

Gillam AE, Bracken M. 1999. A

comparision of visualization techni-ques for recording arbuscular mycor-rhizal colonization. New Phytol 142: 123-132.

Kormanik PP, McGraw AC. 1982. Quantifi-cation of vesicular-arbuscular mycor-rhizae in plant roots. Di dalam: Schenck NC, editor. Methods and Principles of Mycorrhizal Research. St. Paul: The American Phytopatho-logical Society.

Koske RE, Gemma JN. 1989. A modified pro-cedure for staining roots to detect VA mycorrhizas. Mycol Res 92:486-488. Nusantara AD. 2011. Pengembangan

produk-si inokulan fungi MA berbaproduk-sis bahan alami dan pemanfaatannya untuk produksi bibit jati (Tectona grandis l.f) [disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasar-jana, Institut Pertanian Bogor.

Phillips JM, Hayman DS. 1970. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular arbus-cular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Trans Br Mycol Soc 55:58–161.

Smith SE, Read DJ. 2008. Mycorrhizal Symbiosis, Ed ke-3. San Diego: Aca-demic Pr .

Vierheilig H, Coughlan AP, Wyss U, Piche Y. 1998. Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Appl Environ Microbiol 64:5004-5007.

Vierheilig H, Schweiger P, Brundrett M. 2005. An overview of methods for the detection and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots. Physiol Plant 125:393-404.

Lampiran

Tabel 1 Koloni cendawan MA akar Pueraria javanica berumur 16 minggu menggunakan empat zat warna tintapada waktu pembersihan isi sel berbeda.

Pewarna Kolonisasi akar (%)

5 menit 10 menit 15 menit 20 menit Tinta shaeffer hitam 81.33a 88.33a 92.00a 98.33a Tinta parker biru 72.33b 73.67b 78.33c 83.33b Tinta stempel biru 53.67c 59.33c 62.00d 67.33c

Biru tripan 73.67b 78.00b 86.00b 91.33a

Keterangan: angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada satu kolom tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (DMRT).

Sebagai kontrol pewarnaan, akar diwarnai menggunakan biru tripan mengikuti metode Phillips dan Hayman (1970) yang dimodifikasi pada proses waktu pembersihan isi sel dalam KOH 10% pada suhu 90 °C selama 5, 10, 15, dan 20 menit. Selanjutnya, akar direndam dalam HCl 1% selama 30 menit, dipanaskan dalam biru tripan selama 3 menit pada suhu 90 °C kemudian akar direndam dalam gliserol 50% selama 60 menit.

Sebanyak 20 potong akar setiap perlakuan diambil secara acak dan diamati menggunakan mikroskop. Penampakan isi sel akar dikelom-pokkan dalam tiga ciri, yaitu belum bersih (sisa sitoplasma masih banyak), cukup bersih (sisa sitoplasma sudah banyak yang hilang), dan bersih (tidak ada sisa sitoplasma). Penampakan isi sel akar akan mempengaruhi pengamatan struktur cendawan MA. Selanjutnya, perhitungan struktur cendawan MA dititikberatkan pada penampakan isi sel yang bersih. Struktur cendawan MA yang diamati ialah hifa internal, hifa eksternal, vesikula, dan arbuskula, serta kolonisasi mikoriza arbuskula dihitung berdasarkan pada rumus:

Kriteria struktur cendawan yang dihitung ialah yang terlihat bahwa struktur tersebut cendawan MA walaupun masih ada sisa sitoplasma. Data struktur cendawan MA dan hasil kolonisasi akar diolah menggunakan perangkat lunak SAS 9.1.3. Perlakuan diuji dengan uji Duncan pada taraf 5% untuk membedakan antarperlakuan.

HASIL

Pengamatan mikroskopi intensitas pembersihan isi sel akar P. javanica pada empat perlakuan tampak berbeda (Tabel 1). Proses pembersihan isi sel akar selama 5 menit memperlihatkan intensitas isi sel akar yang belum bersih (Gambar 1 a-d). Sisa sitoplasma terlihat keruh dan menghalangi penampakan stuktur cendawan MA saat pengamatan. Waktu pembersihan isi sel akar yang lebih lama berangsur menambah penampakan intensitas isi sel akar yang semakin bersih (Gambar 1 e-k). Waktu pembersihan 20 menit menunjukkan isi sel yang terlihat bersih (Gambar 1 l-p). Isi sel

yang bersih dari sitoplasma akan mempengaruhi kejelasan dari struktur cendawan MA yang diamati. Kategori sel yang telah bersih ialah ketika sel sudah terlihat jernih dan tidak ada sisa sitoplasma yang terdapat dalam sel. Dalam sel yang bersih stuktur cendawan MA dapat dilihat saat pengamatan. Perbedaan isi sel yang belum bersih, cukup bersih, dan bersih akan mempengaruhi penampakan struktur cen-dawan MA (Gambar 1).

Deteksi cendawan MA memerlukan teknik pewarnaan untuk mewarnai isi sel akar maupun cendawan MA sehingga mudah diamati. Isi sel yang diwarnai dengan tinta shaeffer hitam akan terwarnai cokelat bening hingga cokelat, struktur hifa internal, hifa eksternal, dan vesikula terlihat cokelat sedangkan arbuskula terlihat hitam kebiruan. Tinta parker biru akan mewarnai isi sel maupun struktur cendawan MA berwarna biru muda. Tinta stempel biru akan mewarnai isi sel akar maupun cendawan MA berwarna hijau kekuningan. Pewarnaan dengan tinta stempel biru sulit diamati karena warna struktur cendawan MA ada yang menyerupai isi sel akar. Isi sel akar dan cendawan MA yang diwarnai tripan biru akan berwarna biru tua.

Hifa eksternal, hifa internal, vesikula, dan arbuskula merupakan bagian dari struktur cendawan MA. Hifa eksternal, hifa internal, dan vesikula terlihat pada semua perlakuan waktu pembersihan isi sel dan semua perlakuan jenis zat warna yang digunakan. Hifa eksternal tidak menunjukkan perbedaan pada keempat jenis zat warna. Hifa internal yang diwarnai tinta shaeffer hitam dan biru tripan tidak berbeda sedangkan vesikula berbeda. Arbuskula hanya teramati menggunakan pewarna tinta shaeffer hitam dan biru tripan (Gambar 2). Tinta shaeffer hitam mewarnai arbuskula pada menit ke-5, 10, dan 15 sedangkan biru tripan pada menit ke 10, 15, dan 20.

Kombinasi antara pembersihan isi sel akar dan zat warna yang digunakan tidak menunjukkan perbedaan dalam hal kolonisasi cendawan MA. Perlakuan zat warna menunjukkan perbedaan pada kolonisasi cendawan MA (Tabel 2). Zat warna tinta shaeffer hitam tidak berbeda dengan biru tripan, namun keduanya berbeda dengan tinta parker biru dan tinta stempel biru.

50 µm

50 µm

50 µm

50 µm

Tabel 1 Penampakan isi sel akar Pueraria javanica berumur 16 minggu

Keterangan:1 belum bersih, 2 cukup bersih, 3 bersih

Tinta shaeffer hitam Tinta parker biru Tinta stempel biru Biru tripan

5’

10’

15’

20’

Gambar 1 Struktur vesikula pada akar Pueraria javanica berumur 16 minggu saat proses pembersihan isi

sel 5 (a-d), 10 (e-h), 15 (i-l), dan 20 menit (m-p): a vesikula dengan pewarnaan tinta shaeffer, b vesikula dengan pewarnaan tinta parker, c vesikula dengan pewarnaan tinta stempel, d vesikula dengan pewarnaan biru tripan, e vesikula dengan pewarnaan tinta shaeffer, f vesikula dengan pewarnaan tinta parker, g vesikula dengan pewarnaan tinta stempel, h vesikula dengan pewarnaan biru tripan, i vesikula dengan pewarnaan tinta shaeffer, j vesikula dengan pewarnaan tinta parker, k vesikula dengan pewarnaan tinta stempel, l vesikula dengan pewarnaan biru tripan, m vesikula dengan pewarnaan tinta shaeffer, n vesikula dengan pewarnaan tinta parker, o vesikula dengan pewarnaan tinta stempel, p vesikula dengan pewarnaan biru tripan, (400x, bar = 50 µm).

Pewarna Waktu pembersihan isi sel

5 menit 10 menit 15 menit 20 menit

Tinta shaeffer hitam 1 2 2 3

Tinta parker biru 1 2 2 3

Tinta stempel biru 1 2 2 3

Biru tripan 1 2 3 3

50 µm 50 µm 50 µm

50 µm 50 µm b c 50 µm d

e 50 µm f g _{50 µm}

i _{50 µm} j k _{50 µm l}

m 50 µm n o _{50 µm} p

a

Tinta shaeffer hitam Biru tripan

10’

15’

Gambar 2 Struktur Arbuskula pada akar Pueraria javanica menggunakan tinta shaeffer hitam (a-b)

dan tripan biru (c-d) dengan waktu pembersihan isi sel selama 10 (a,c) dan 15 menit (b,d), (400x, bar = 50 µm).

Tabel 2 Kolonisasi mikoriza arbuskula pada Pueraria javanica menggunakan zat warna pada waktu pembersihan isi sel selama 20 menit

Pewarna Struktur cendawan MA

Kolonisasi akar (%)

HE HI V A

Tinta shaeffer hitam 2.33a 96.33a 85.00a 6.00a _98.33a

Tinta parker biru 1.33a 82.00b 68.33b 0.00a 83.33b

Tinta stempel biru 0.33a 68.33c 67.67b 0.00a 67.33c

Biru tripan 1.67a 89.67ab 70.67b 0.00a 91.33a

Keterangan:HE:hifa eksternal, HI:hifa internal, V:vesikula, A:arbuskula, angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada satu kolom tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (DMRT)

PEMBAHASAN

Keberhasilan pewarnaan bergantung pada proses pembersihan isi sel akar. Pembersihan isi sel akar dengan KOH 10% bertujuan membersihkan sitoplasma (Phillips & Hayman 1970) dan metabolit sekunder (Vierheillig et al. 2005). Pada umumnya pewarnaan sel cendawan dilakukan dalam kondisi asam karena zat warna akan diikat oleh hifa cendawan yang sebagian besar dinding selnya tersusun dari kitin. Pengondisian supaya akar dalam suasana asam umumnya menggunakan HCl 1% (Phillips & Hayman 1970), tetapi Vierheillig

et al. (1998) menggunakan cuka 5% untuk menggantikan HCl 1%. Penggunaan cuka lebih aman bagi kesehatan dibandingkan dengan dengan HCl 1%, selain itu cuka juga lebih murah dibandingkan dengan dengan HCl 1%.

Proses pembersihan isi sel akar memerlukan waktu yang berbeda. Pember-sihan isi sel untuk akar tidak berpigmen (tomat) memerlukan waktu selama 60 menit dan akar berpigmen (kacang) selama 120

menit pada suhu 90 °C (Phillips & Hayman 1970), sedangkan metode Vierheillig et al. (1998) selama 3-15 menit.

Pembersihan isi sel dengan metode Vierheillig et al. (1998) selain bergantung pada akar, juga bergantung pada jenis tinta. Pembersihan isi sel akar buncis dilakukan dalam KOH 10% selama 5 menit, sedangkan akar ketimun lebih pendek waktunya ialah 3 menit jika menggunakan tinta warna hitam dan biru. Tinta warna merah membutuhkan waktu pembersihan isi sel yang lebih lama, akar buncis selama 15 menit dengan akar ketimun selama 5 menit. Pada penelitian ini pembersihan isi sel akar P. javanica yang tidak berpigmen memerlukan waktu selama 20 menit supaya isi sel terlihat bersih.

Hidrogen peroksida digunakan oleh Phillips dan Hayman (1970) untuk menjer-nihkan akar berpigmen. Pada penelitian ini hidrogen peroksida tidak digunakan karena akar P. javanica tidak berpigmen.

Biru tripan merupakan zat warna yang paling banyak digunakan untuk mendeteksi kolonisasi cendawan MA. Kombinasi antara tinta-cuka diusulkan oleh Vierheillig et al.

50 µm a 50 µm

50 µm _b

50 µm d

(1998) sebagai alternatif pengganti biru tripan. Teknik ini selain membutuhkan biaya yang lebih murah juga bisa digunakan untuk jumlah sampel yang besar. Sayangnya sampai saat ini para peneliti lebih suka menggunakan biru tripan dibandingkan dengan dengan tinta-cuka karena kejelasan penampakan struktur cendawan MA di dalam akar. Pewarnaan cendawan MA menggunakan tinta-cuka belum mendapat perhatian. Salah satu alasannya ialah tidak semua tinta dapat digunakan untuk mewarnai cendawan MA.

Kualitas pewarnaan menggunakan tinta-cuka bergantung pada warna dan merek tinta. Warna tinta ungu dan hijau secara umum tidak cocok untuk mewarnai cendawan MA. Tinta hitam untuk semua merek (Carrefour, Pelikan, Shaeffer, dan Cross) dan beberapa tinta biru (Pelikan) serta merah (Parker) dapat mewarnai cendawan MA. Tinta shaeffer hitam memiliki kontras yang sangat baik (Vierheillig et al. 1998) dan tinta parker biru digunakan oleh Nusantara (2011) untuk mewarnai cendawan MA akar jati (Tectona grandis l.f). Tinta shaeffer hitam dan parker biru lebih baik dalam pewarnaan cendawan MA diban-dingkan dengan dengan tinta stempel biru dalam penelitian ini.

Proses pembersihan isi sel akar berpengaruh terhadap bersih tidaknya isi sel akar. Hal ini akan mempengaruhi struktur cendawan MA yang terlihat. Saat isi sel dikatakan cukup bersih ialah ketika isi sel belum terlihat jernih, namun tidak sekeruh isi sel yang belum bersih. Sel pada saat ini terlihat lebih bersih dibandingkan dengan dengan sel yang belum bersih sedangkan isi sel yang telah bersih ketika sel tersebut tidak memiliki sisa sitoplasma. Semakin lama waktu pembersihan isi sel maka isi sel semakin bersih sehingga semakin jelas penampakan struktur cendawan MA. Proses pembersihan isi sel yang belum sempurna akan meninggalkan sisa-sisa sitoplasma yang akan menghalangi pengamatan struktur cendawan MA-nya. Proses pembersihan isi sel akar P. javanica selama 20 menit dapat membersihkan sitoplasma secara sempurna.

Keempat jenis zat warna yang digunakan dapat mendeteksi struktur cendawan MA yang meliputi hifa eksternal, hifa internal, dan vesikula, sedangkan arbuskula hanya dapat diamati pada pewarna tinta shaeffer hitam dan biru tripan. Arbuskula merupakan struktur penting dari cendawan MA yang berkembang pada akar muda dan luruh seiring bertambahnya umur akar (Smith & Read 2008). Cendawan MA, Gigaspora dan

Scutellospora, hanya memiliki struktur arbuskula dalam asosiasinya dengan akar tumbuhan sehingga deteksi kolonisasinya hanya diamati dari struktur arbuskula. Genus lainnya seperti Glomus, Entrophospora, dan

Acaulospora selain memiliki arbuskula juga membentuk vesikula yang dapat dijadikan kriteria untuk melihat kolonisasi cendawan pada akar. Kualitas pewarnaan yang baik ialah ketika pewarna dapat mewarnai arbuskula karena cendawan MA ialah cendawan yang memiliki struktur arbuskula. Dengan demi-kian, arbuskula merupakan struktur cendawan yang penting dalam deteksi. Deteksi terhadap keberadaan arbuskula dipengaruhi oleh pewarna, pelarut, konsentrasi dan pH larutan pewarna, suhu, waktu pewarnaan, serta ketebalan akar (Gange et al. 1999).

Arbuskula yang tidak terlihat pada proses pembersihan isi sel selama 20 menit dengan biru tripan bukan disebabkan pewarnanya melainkan faktor lain. Arbuskula memiliki umur yang lebih pendek dibandingkan dengan dengan vesikula. Arbuskula akan lisis seiring bertambah tuanya umur akar, struktur arbuskula akan menggumpal dan cabang-cabang pada arbuskula tidak dapat dibedakan lagi (Smith & Read 2008). Setelah itu arbuskula akan menjadi struktur yang menggumpal yang memenuhi korteks akar. Penggumpalan struktur arbus-kula terjadi pada hari ke 4-15 setelah terjadinya penetrasi hifa yang berbeda-beda bergantung pada jenis cendawannya.

Tinta shaeffer hitam tidak menunjukkan perbedaan dengan biru tripan dalam mewarnai arbuskula. Tinta shaeffer hitam dapat mewarnai arbuskula seperti biru tripan. Pewarnaan dengan tinta shaeffer hitam memperlihatkan struktur koloni sejelas pewarnaan dengan biru tripan dan mem-perlihatkan kolonisasi akar yang tinggi dibandingkan dengan biru tripan. Oleh sebab itu, penggunaan tinta shaeffer hitam bisa dijadikan alternatif pengganti biru tripan untuk pengamatan cendawan MA. Selain itu, pewarnaan dengan tinta shaeffer hitam relatif murah dan lebih aman bagi kesehatan karena bahan-bahan yang digunakan sering diguna-kan dalam kehidupan sehari-hari

.

SIMPULAN

Pembersihan isi sel dengan KOH 10% selama 20 menit membersihkan isi sel secara menyeluruh untuk akar P. javanica sehingga struktur cendawan MA terlihat jelas. Tinta shaeffer hitam dan biru tripan dapat mewarnai

struktur arbuskula yang menjadi struktur penting untuk deteksi cendawan MA. Tinta shaeffer hitam dapat dijadikan alternatif untuk menggantikan biru tripan dalam pengamatan cendawan MA pada akar P. javanica selain karena murah dan aman, kualitas pewarnaannya juga baik.

DAFTAR PUSTAKA

Brundrett MC, Piche Y, Peterson RL. 1984. A new method for observing the morpho-logy of vesicular-arbuscular mycor-rhizae. Can J Bot 62:2128–2134. Gange AC, Bower E, Stagg PG, Aplin DM,

Gillam AE, Bracken M. 1999. A comparision of visualization techni-ques for recording arbuscular mycor-rhizal colonization. New Phytol 142: 123-132.

Kormanik PP, McGraw AC. 1982. Quantifi-cation of vesicular-arbuscular mycor-rhizae in plant roots. Di dalam: Schenck NC, editor. Methods and Principles of Mycorrhizal Research. St. Paul: The American Phytopatho-logical Society.

Koske RE, Gemma JN. 1989. A modified pro-cedure for staining roots to detect VA mycorrhizas. Mycol Res 92:486-488. Nusantara AD. 2011. Pengembangan

produk-si inokulan fungi MA berbaproduk-sis bahan alami dan pemanfaatannya untuk produksi bibit jati (Tectona grandis l.f) [disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasar-jana, Institut Pertanian Bogor.

Phillips JM, Hayman DS. 1970. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular arbus-cular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Trans Br Mycol Soc 55:58–161.

Smith SE, Read DJ. 2008. Mycorrhizal Symbiosis, Ed ke-3. San Diego: Aca-demic Pr .

Vierheilig H, Coughlan AP, Wyss U, Piche Y. 1998. Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Appl Environ Microbiol 64:5004-5007.

Vierheilig H, Schweiger P, Brundrett M. 2005. An overview of methods for the detection and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots. Physiol Plant 125:393-404.

Lampiran

Tabel 1 Koloni cendawan MA akar Pueraria javanica berumur 16 minggu menggunakan empat zat warna tintapada waktu pembersihan isi sel berbeda.

Pewarna Kolonisasi akar (%)

5 menit 10 menit 15 menit 20 menit Tinta shaeffer hitam 81.33a 88.33a 92.00a 98.33a Tinta parker biru 72.33b 73.67b 78.33c 83.33b Tinta stempel biru 53.67c 59.33c 62.00d 67.33c

Biru tripan 73.67b 78.00b 86.00b 91.33a

Keterangan: angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada satu kolom tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (DMRT).