Kultur jaringan tanaman tebu Sterilisasi dan penanaman eksplan

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Lingkungan Pusat Penelitian Lingkungan Hidup PPLH IPB dari bulan Februari 2003, Laboratorium Bioteknologi Tanaman Fakultas Pertanian IPB dari bulan Juni 2004, dan Laboratorium Molekuler PT. Saraswanti Indo Genetech di Bogor dari bulan Januari 2005 hingga bulan Mei 2005. Metode Penelitian Penelitian ini terdiri atas dua bagian yaitu: 1 Kultur jaringan tanaman tebu, dan 2 Transformasi tebu dengan gen fitase.

1. Kultur jaringan tanaman tebu Sterilisasi dan penanaman eksplan

Eksplan tebu kultivar PA 117 dan PSJT 94-33 berasal dari daun muda dan sehat yang masih menggulung berumur 4–6 bulan. Pucuk tebu dipotong 20 cm di atas jaringan meristem. Secara aseptik, pucuk tebu dicelupkan ke dalam alkohol 70 lalu dibakar di atas api bunsen. Lapisan pucuk daun dibuka dan dibuang, diulang sebanyak tiga kali atau sampai kelihatan warna merah muda pada pucuk tebu. Media MS-I disiapkan lebih dahulu melalui sterilisasi dengan autoklaf 121 o C selama 10 menit pada tekanan 1,5 atm. Selanjutnya untuk induksi kalus, bagian pucuk dipotong sepanjang 2–3 mm sebanyak 12 potong kemudian ditanam pada media MS-I RNI 1999. Setiap petridis diisi 5-6 potong kemudian diinkubasi dalam ruang gelap bersuhu ±22 o C. Selama 1 bulan dapat diperoleh kalus dari jaringan parenkimatis yang mempunyai struktur kompak dan mampu berproli- ferasi. Untuk mempertahankan kalus dalam status embriogenik maka setiap 2-3 minggu kalus disubkulturkan pada media yang sama. Kalus embriogenik di- regenerasikan menjadi planlet pada media MS-II P3GI 1999. Khusus untuk tebu kultivar PS 851 diberikan oleh RNI Cirebon dalam bentuk kalus sehingga siap digunakan untuk transformasi. Regenerasi tanaman tebu Ada dua tahap regenerasi tebu, yaitu: 1 optimasi media regenerasi kalus PA 117 dan PSJT 94-33; dan 2 regenerasi kalus transforman PSJT 94-33 pBINPI-II 18 EC dan PA 117 pBINPI-II EC pada media optimasi regenerasi, dan regenerasi kalus transforman PS 851 pBINPI-II EC pada media Modifikasi P3GI. Tahap pertama, sebanyak enambelas perlakuan optimasi media regenerasi kalus PA 117 dan PSJT 94-33 adalah kombinasi media yang terdiri dari media dasar MS-II P3GI 1999 dengan penambahan zat pengatur tumbuh IAA β- indoleacetic acid dan dalapon 2,2-dichloropropionic acid. Secara berurutan, perlakuan tersebut diberi prelabel R dan angka perbandingan dalam kurung menunjukan kombinasi IAA dan dalapon mgL. Label R1 1:55, R2 1:57, R3 1:59, R4 1:61, R5 1,5:55, R6 1,5:57, R7 1,5:59, R8 1,5:61, R9 2:55, R10 2:57, R11 2:59, R12 2:61, R13 2,5:55, R14 2,5:57, R15 2,5:59, dan R16 2,5:61. Kultur ditumbuhkan pada kondisi terang dengan suhu 22 o C. Setiap perlakuan diulang sebanyak 10 kali, pengamatan jumlah tunas dan daun dilakukan selama 4 minggu. Pada minggu berikutnya, kultur dipindahkan ke media cair yang sesuai dengan media optimum berdasarkan respon kultivar. Sebelum dipindahkan, bagian basalnya dipotong untuk induksi akar. Jumlah akar diamati selama 4 minggu. Tahap kedua, regenerasi kalus transforman PA 117 pBINPI-II EC dan PSJT 94-33 pBINPI-II EC pada media optimasi regenerasi dilakukan berdasarkan hasil pada tahap pertama. Perbedaan respon kultivar terhadap kombinasi media mengakibatkan regenerasi kalus transforman kedua kultivar tersebut mengguna- kan media yang berbeda pula. Di bagian lain, regenerasi kalus transforman PS 851 pBINPI-II EC pada media Modifikasi 2 mgL IAA + 59 mgL dalapon menggunakan media dengan penambahan glukosa 1, asam sitrat dan asam askorbat masing-masing 2,5 mgL P3GI 1999. Analisis data penelitian disusun menggunakan Rancangan Petak Terbagi split plot experiment dan Rancangan Acak Lengkap. Perhitungan statistik menggunakan SAS v8.2 Statistics Software SAS Institute, NC-USA dengan prosedur General Linier Model. Uji lanjut signifikansi menggunakan uji beda nyata jujur BNJTukey dengan α 5 Steel Torrie 1993. Optimasi media regenerasi kalus PA 117 dan PSJT 94-33 dilakukan meng- gunakan Rancangan Faktorial Petak Terbagi dengan 10 ulangan. Pengamatan variabel respon terjadi berulang selama empat minggu, sehingga koreksi karena 19 faktor pengamatan berulang adalah rancangan petak terbagi. Model rancangan petak terbagi adalah: Y ijk = µ + ρ k + α i + δ ik + βj + α β ij + ε ijk µ : Nilai rataan umum ρ k : Pengaruh kelompok ulangan ke-k k = 1-10 α i : Pengaruh perlakuan, yaitu kombinasi IAA dan dalapon pada media regenerasi δ ik : Galat a, interaksi kelompok dan perlakuan. β j : Pengaruh minggu pengamatan media regenerasi ke-j j = 1, 2, 3, 4 α β ij : Pengaruh interaksi antara minggu dan perlakuan pada media regenerasi. ε ijk : Galat percobaan b Y ijk : Nilai pengamatan Analisis statistik regenerasi kalus transforman PA 117 dan PSJT 94-33 pada media hasil optimasi dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan 10 ulangan dan waktu pengamatan 4 minggu. Rancangan yang sama digunakan pada hasil regenerasi kalus transforman PS 851 dalam media Modifikasi P3GI. Variabel respon yang dianalisis adalah jumlah tunas, daun dan akar yang terbentuk. Model rancangan acak lengkap adalah: Y ij = µ + αi + ε ij µ : Nilai rataan umum α i : Pengaruh minggu ke-i i = 1, 2, 3, 4 ε ij : Galat percobaan pada minggu ke-i ulangan ke-j j = 1-10 Y ij : Nilai pengamatan

2. Transformasi tebu dengan gen fitase