ANALISIS PRODUK HASIL BIOKATALISIS ENZIM CGT-ASE BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL DARI ONGGOK SINGKONG

ANALISIS PRODUK HASIL BIOKATALISIS ENZIM CGT-ASE BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL DARI ONGGOK SINGKONG

(Skripsi)

Oleh

FEBY DWI INDRI SYAPUTRI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2012

Judul Laporan : Analisis Produk Hasil Biokatalisis Enzim CGT-ase Bakteri Amilolitik Isolat Lokal dari Onggok Singkong

Nama Mahasiswa : Feby Dwi Indri Syaputri

Nomor Pokok Mahasiswa : 0717011036

Jurusan : Kimia

Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

MENYETUJUI

1.Komisi Pembimbing

Pembimbing I Pembimbing II

Mulyono, Ph.D. Prof. Dr. Tati Suhartati, M.S. NIP 197406112000031002 NIP 195405101988032001

2. Ketua Jurusan Kimia

Andi Setiawan, Ph.D. NIP 195809221988111001

MENGESAHKAN

1. Tim Penguji

Ketua : Mulyono, Ph.D. …………....

Sekretaris : Prof. Dr. Tati Suhartati, M.S. ...

Penguji

Bukan Pembimbing : Dra. Fifi Martasih, M.S. …………....

2. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Prof. Suharso, Ph.D. NIP 196905301995121001

ANALISIS PRODUK BIOKATALISIS ENZIM CGT-ASE BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL DARI ONGGOK SINGKONG

Oleh

Feby Dwi Indri Syaputri

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar SARJANA SAINS

Pada Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDARLAMPUNG 2012

Motto

“ Hidup bukan pilihan, tapi memilih bagaimana

cara kita hidup...Jalani sesuatu yang membuat

orang lain senang meskipun terkadang jalan kita

terseok-seok”

“ Berusaha terus untuk menjadi yang terbaik,

meskipun nyatanya kita bukan yang terbaik”

“ Jalani hidup seperti air mengalir”

“ Jangan selalu melihat ke atas karena nanti kita

bisa iri...tapi lihatlah ke bawah agar kita bisa

memicu semangat dan mengatakan kalau kita bisa

menjadi yang ter atas”

PERSEMBAHAN

Kupersembahkan karya sederhana ini kepada :

Ayahanda Syahril Baladiah dan Ibunda Siti Komariah yang tercinta dan tersayang,

Kakakku dan Adik-adikku tersayang

Febriansyah Eka Indra S, Juliana Norma Syahria dan Yanuar Ari Syaputra

Segenap Keluarga besarku yang selalu mendoakan keberhasilanku,

Sahabat dan teman-temanku yang selalu berbagi keceriaan,

SANWACANA

Assalamu’alaikum Wr. Wb.

Alhamdulillah Puji dan syukur Penulis ucapkan atas kehadirat Allah SWT, karena atas segala rahmat dan karunia-Nya skripsi ini dapat diselesaikan.

Skripsi dengan judul “Analisis Produk Hasil Biokatalisis Enzim CGT-ase

Bakteri Amilolitik Isolat Lokal dari Onggok Singkong” adalah salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

Dalam pelaksanaan dan penulisan skripsi ini tidak lepas dari kesulitan dan rintangan, namun itu semua dapat penulis lalui berkat rahmat dan ridha Allah SWT serta bantuan dan dorongan semangat dari orang-orang yang hadir dikehidupan penulis. Dalam kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih setulus-tulusnya kepada :

1. Bapak Mulyono, Ph.D., selaku pembimbing utama yang telah banyak memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan, gagasan, bantuan, dukungan, semangat, kritik dan saran kepada penulis dalam proses perencanaan dan pelaksanaan penelitian serta dalam penulisan skripsi ini.

2. Ibu Prof. Dr. Tati Suhartati, M.S., selaku pembimbing kedua yang telah memberikan semangat, kritik, saran dan arahan kepada penulis sehingga skripsi ini terselesaikan dengan baik.

3. Ibu Dra. Fifi Martasih, M.S., selaku pembahas pertama yang telah memberikan kritik, saran, arahan yang diberikan kepada penulis sehingga skripsi ini terselesaikan dengan baik.

4. Bapak Andi Setiawan, Ph.D., selaku Pembimbing Akademik sekaligus Ketua Jurusan Kimia FMIPA Unila atas kesediaannya untuk memberikan bimbingan, bantuan, nasehat dan informasi yang bermanfaat kepada penulis. 5. Seluruh dosen FMIPA Unila yang telah mendidik dan memberikan ilmu

pengetahuan yang sangat berguna kepada penulis selama kuliah.

6. Seluruh Staf Karyawan FMIPA Kimia, khususnya Mbk. Nora dan Bundo yang selalu memberiku kemudahan dalam bertransaksi.

7. Bapak Prof. Suharso, Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

8. Kedua orang tuaku sangat aku cintai dan sayangi . Terima kasih dengan sangat tulus dan ikhlas kuucapkan atas segala hal terbaik dan semua yang telah diberikan kepadaku yang takkan bisa aku ganti dengan apapun.

9. Keluarga besarku yang selalu memberikan motivasi, dukungan dan doa untuk keberhasilanku.

10. Sahabat-sahabat terbaikku yang tersayang : Dewi Puspa Ningrum Cantik, Ratna Maulina, Yanti Lianita, Refi Indarosa, dan Nia.

11. Teman-teman seperjuangan angkatan 2007 : Hade Sastra Wiyana (Thanx ya De ^^ dh banyak bersabar bantuin gw di leb, hehehehe...), Putri Amalia

(Thanx ya Put dh bantuin gw ambil foto di detik-detik terakhir gw gawek di leb), Dewi Asmarani, Rivera Siallagan, Ika Purnamasari, Sartika Putri F., Lisa Eka W., Ratna Maulina Dewi , Andi Yuli Firtiani, Clara Citra Resmie, Eka Sulis Sundari, Eka Eprianti, Nurtika Kurniati, Halimah, Tristian Martika, Mega Dewi F.S., Dwi Puji Astuti dan Gia Yustika K.A. Winda Rahmawati, Cantik, Astri Rahayu, Sari Handayani, Kartika Sari, Riri Napitupulu, Heryanto, Dwi Fitrian Saputro, Afriyorawan, Gunadi, M. Ishom, Hady N., Wikan Agung, Sunardi S., Sudarmono, Mitra S., Septian T., Yulis, Maryadi S.G., Aprian Agung B., terima kasih untuk kebersamaan dan keceriaan selama menjalankan perkuliahan, tetap semangat dan jangan menyerah, perjuangan kita masih panjang, sukses selalu untuk kita.

12. Teman seperjuangan di Laboratorium Biokimia : Mba Nina Anggraini, S.Si., Mba Mega '06, Mba Kartika '06, Mba Sifa '06, Kak Lukman '04, Mba Rikayana '06, Mba Lince '06, Adek '08 dan Ramdan '08 (Semangat buat kalian ya ^^...tolong bakterinya dijaga karena itu warisan leluhur...). Teman-teman Kimia 2005, 2006, 2008, 2009, dan 2010 FMIPA Unila terima kasih atas segala dukungannya.

Akhir kata, Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Penulis berharap semoga skripsi yang sederhana ini dapat berguna dan bermanfaat bagi kita semua. Amin.

Bandar Lampung, 7 Februari 2012 Penulis

RIWAYAT HIDUP

Penulis di lahirkan di Jakarta 15 Februari 1989, sebagai anak kedua dari empat bersaudara yang merupakan putri dari pasangan Syahril Baladiah dan Siti Komariah. Penulis menyelesaikan Taman Kanak-Kanak di TK XAVERIUS Bumi Dipasena pada tahun 1995. Sekolah Dasar di SDN 3 Sukabumi pada tahun 2001. Sekolah Lanjutan Tingkat Pertama Negeri di SLTPN 23 Bandar Lampung pada tahun 2004 dan Sekolah Menengah Atas Negeri di SMAN 8 Bandar Lampung pada tahun 2007. Pada tahun yang sama Penulis terdaftar sebagai Mahasiswa Jurusan Kimia FMIPA Unila melalui jalur SMPTN (Seleksi Masuk Perguruan Tinggi Negeri).

Pada tahun 2010 Penulis melakukan Praktik Kerja Lapangan di BARISTAND Industri (Balai Industri Riset dan Standardisasi Industri). Selama menjadi mahasiswa penulis pernah menjadi asisten praktikum Biokimia periode 2011-2012, serta Kimia Dasar 1 periode 2009-2010, 2010-2011 dan 2011-2012 untuk mahasiswa S1 FMIPA Jurusan Biologi dan Matematika.

ABSTRACT

ANALYSIS THE PRODUCT OF THE YIELDS BIOCATALYSIS ENZYMES CGT-ASE BACTERIA AMILOLITIK ISOLATE LOCAL

FROM ONGGOK CASSAVA

By

Feby Dwi Indri Syaputri

Cyclodextrin glukanotransferase (CGT-ase) ) is a distinguishing extracelluar matrix enzymes that can catalyze the multifungsional like maltodekstrin, amylose starch and others became cyclodextrin. Cyclodextrin (CD) ) is composed of some oligosaccharides yields simpler sugars units based on the number of units of glucose, cyclodextin is divided into three forms, α-clyclodextryn 6 units of glucose, -cyclodextryn 7 units of glucose and -clyclodextryn 8 units of glucose. -CD is used more for a variety of applications as compared to other CD, because it has low solubility in water and is easily separated from the mixture by the use of organic solvents. A series of amilolitik bacteria isolation from industrial waste processing cassava has been done using medium Horikoshi’s II. Based on the value of the diameter of the halozone isolate obtained on solid agar medium Horikoshi’s II, isolate LTi-A24-4 was chosen as the best potential size isolate halozone 2.6 cm. The isolate was selected based on the growth and the CGT-ase activity isolate. LTi-A2-4 showed maximum growth in 36 hours (OD600 = 4,58)

in Horikhosi’s II liquid medium and the activity for 291,83 U/mL. Analysis of the product biokatalisis using method of TLC show that isolate LTiA244 is cyclodextryn. This is indicated by the value of the sample Rf standards and -cyclodextryn is same; on eluen-butanol-ethanol-water ratio 5: 3: 2 of 0.81 cm; and on a comparison of the eluen 5: 3: 1 by 0.72 cm. It is suggested to do more research on the product of the biokatalisis enzyme CGT-ase using ase HPLC to better expresses the type of clyclodextryn is generated.

ABSTRAK

ANALISIS PRODUK HASIL BIOKATALISIS ENZIM CGT-ASE BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL DARI ONGGOK SINGKONG

Oleh

Feby Dwi Indri Syaputri

Siklodekstrin Glukanotransferase (CGT-ase) adalah enzim ekstraseluler multifungsional yang dapat mengkatalisis pati seperti maltodekstrin, amilosa dan lain-lain menjadi siklodekstrin. Siklodekstrin (CD) merupakan oligosakarida yang tersusun atas beberapa unit glukosa, berdasarkan jumlah unit glukosanya siklodekstrin dibagi menjadi tiga bentuk yaitu α-siklodekstrin yang terdiri dari 6 unit glukosa, -siklodekstrin 7 unit glukosa dan siklodekstrin 8 unit glukosa. -CD lebih banyak digunakan untuk berbagai aplikasi dibandingkan dengan -CD yang lain, karena memiliki kelarutan yang rendah di dalam air dan mudah dipisahkan dari campuran dengan menggunakan pelarut organik. Serangkaian isolasi bakteri amilolitik dari limbah industri pengolahan singkong telah dilakukan dengan menggunakan medium Horikoshi’s II. Berdasarkan nilai diameter

halozone isolat yang diperoleh pada medium agar padat Horikoshi’s II, isolat LTi-A24-4 dipilih sebagai isolat potensial terbaik dengan ukuran halozone 2,6 cm. Pada medium cair Horikoshi’ II, isolat LTi-A24-4 ini memiliki waktu pertumbuhan maksimum pada 36 jam (OD600 = 4,58) dengan nilai aktivitas unit

yaitu 291,83 U/mL. Analisis terhadap produk biokatalisis menggunakan metode KLT menunjukkan bahwa isolat LTi-A24-4 adalah -siklodekstrin. Hal ini ditunjukan oleh nilai Rf sampel yang sama dengan Rf standar -siklodekstrin; pada eluen butanol-etanol-air dengan perbandingan 5:3:2 sebesar 0,77 cm; dan pada perbandingan eluen 5:3:1 sebesar 0,72 cm. Disarankan untuk melakukan penelitian lebih lanjut terhadap produk biokatalisis enzim CGT-ase ini, misalnya menggunakan HPLC untuk lebih mempertegas jenis siklodekstrin yang dihasilkan.

I. PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang

Indonesia termasuk sebagai negara penghasil singkong terbesar ketiga (13.300.000 ton) setelah Brazil (25.554.000 ton), Thailand (13.500.000 ton) serta disusul negara-negara lain seperti Nigeria (11.000.000 ton), dan India (6.500.000 ton) dari total produksi dunia sebesar 122.134.000 ton per tahun (Pancallok, 2007). Berdasarkan kontribusi terhadap produksi nasional, terdapat sepuluh propinsi utama penghasil singkong di Indonesia yaitu Jawa Timur, Jawa Tengah, Lampung, Sumatera Selatan, Sulawesi Tenggara, Maluku, Sumatera Selatan dan Yogyakarta yang menyumbang sebesar 89,47 % dari produksi Nasional sedangkan produksi provinsi lainnya sekitar 11-12 % (Agrica, 2007).

Menurut Biro Pusat Statistik (2009), produksi tanaman singkong di Indonesia pada tahun 2008 sebesar 20.834.241 ton. Singkong sendiri merupakan salah satu komoditas pertanian Indonesia yang keberadaanya cukup melimpah. Tanaman singkong dikenal karena

produktivitasnya yang tinggi sekalipun tumbuh di lahan yang kritis. Singkong dapat tumbuh di dataran rendah dengan curah hujan yang tidak terlalu tinggi dan relatif tahan terhadap hama. Kandungan pati yang tinggi pada singkong sebesar 90 %, menjadikan singkong sangat potensial digunakan sebagai bahan dalam memperoleh mikroorganisme yang mampu

memproduksi enzim Siklodekstrin Glukanotransferase (CGT-ase).

Siklodekstrin merupakan oligosakarida yang tersusun atas 6, 7, atau 8 unit glukosa anhidrat melalui ikatan alfa 1-4. Berdasarkan jumlah unit glukosanya, siklodekstrin dibagi menjadi

tiga bentuk yaitu α-siklodekstrin yang terdiri dari 6 unit glukosa, β-siklodekstrin 7 unit

dengan cincin luar struktur siklodekstrin bersifat tidak polar (hidrofobik), sedangkan bagian dalam rongga bersifat lebih polar (hidrofilik) (Szetjli, 1982). Adanya bentuk tersebut

mengakibatkan siklodekstrin dapat digunakan sebagai kompleks penginklusi suatu senyawa, dan penggunaan siklodekstrin juga telah dilakukan di berbagai industri seperti di industri pangan, kosmetika, dan farmasi (Szejtli, 1982., Vassileva et al., 2005).

Penelitian tentang produksi siklodekstrin di Indonesia sebenarnya telah dilakukan sebelumnya oleh Mangunwidjaja, dengan menggunakan sel utuh Bacillus macerans

(Mangunwidjaja et al., 1998). Pada penelitian tersebut, aktivitas enzim CGT-ase dalam sel utuh Bacillus macerans dikaji untuk mengkonversi pati menjadi siklodekstrin, namun Mangunwidjaja belum menyebutkan jenis siklodekstrin yang dapat dihasilkannya.

Analisis lebih lanjut dilakukan dalam penelitian ini terhadap hasil produk biokatalisis enzim CGT-ase menggunakan KLT (Kromatografi Lapis Tipis) untuk mengetahui jenis

siklodekstrin yang dihasilkan. Sebelum analisis dilakukan, terlebih dahulu dilakukan skrining (penapisan) dengan menggunakan medium Horikoshi II, medium ini merupakan medium spesifik yang digunakan untuk menginokulasikan mikroorganisme yang mampu

menghasilkan enzim CGT-ase. (Lee et al., 1992).

1.2. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah :

1. Memperoleh mikroorganisme isolat lokal yang mampu memproduksi enzim CGT-ase. 2. Mengetahui aktivitas enzim CGT-ase isolat terbaik dengan sumber pati pada medium

cair.

3. Menganalisis produk hasil biokatalisis enzim CGT-ase dengan metode KLT.

Manfaat yang dapat diambil dari hasil penelitian ini adalah siklodekstrin hasil katalisis enzim CGT-ase isolat lokal dapat dimanfaatkan bagi kemaslahatan umat manusia, seperti di industri pangan, kosmetika, farmasi dan lain sebagainya.

I. METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan April 2011 sampai dengan Desember 2011 di Laboratorium Biokimia, Laboratorium Organik, Laboratorium Instrumentasi Biokimia Jurusan Kimia dan Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

3.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, pemanas bunsen, jarum ose, pipa kapiler, lempeng KLT, autoclave (model S-90N), laminar air flow

(CURMA model 9005-FL), shaker (orbit enviro shaker), sentrifuga, tabung sentrifuga, mikropipet, waterbath, spektrofotometer UV-VIS (Pharmacia Biotech), timbangan digital, oven, dan inkubator. Sedangkan bahan yang digunakan adalah onggok singkong yang merupakan limbah atau ampas hasil dari pengolahan singkong sebagai sumber

mikroorganisme penghasil enzim CGT-ase, pati singkong segar, pepton, yeast extract, K2HPO4, MgSO4.7H2O, fenolftalein (PP), methyl orange, agar, Na2CO3, NaCl, pH indikator, Bacillus firmus ITBCC, Na(K)-tartarat, CuSO4.5H2O, reagen folin ciocelteau, soluble starch,

buffer asetat0,1 M pH 5,5, fenolftalein 1 mM, pereaksi C, pereaksi D, spiritus dan alkohol, serta akuades, alkohol, butanol, etanoldan H2SO4 5%.

3.3. Prosedur Penelitian

1. Pembuatan Medium

Medium NB digunakan untuk adaptasi awal pertumbuhan bakteri pada medium cair. Medium NB ini mengandung 0,3% (w/v) yeast extract, 0,5% (w/v) pepton dan 0,5% (w/v) NaCl yang dilarutkan dalam 100 mL akuades kemudian disterilkan dalam autoclave.

B. Pembuatan Medium Horikoshi’s II

Medium Horikoshi II ini merupakan medium spesifik yang digunakan untuk

menginokulasikan mikroorganisme yang mampu menghasilkan enzim CGT-ase. Medium ini disiapkan dengan cara menimbang pati singkong segar sebanyak 1 gram, pepton 0,5 gram,

yeast extract 0,5 gram, K2HPO4 0,1 gram, MgSO4.7H2O 0,02 gram, fenolftalein (PP) 0,03

gram, methyl orange 0,01 gram, agar 1,5 gram, kemudian semua bahan tersebut dimasukan ke dalam Erlenmeyer, dilarutkan dengan akuades sebanyak 80 mL dan dipanaskan di atas bunsen disebut sebagai larutan (1). Selanjutnya, sebanyak 0,25 gram Na2CO3 dimasukan ke

dalam Erlenmeyer dan dilarutkan dengan akuades sebanyak 25 mL disebut sebagai larutan (2), disiapkan juga akuadessebanyak 5 mL yang telah dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan disebut sebagai larutan (3) dan kemudian semua larutan (1), (2), dan (3) disterilkan dalam

autoclave selama 30menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121°C. Setelah semua larutan steril selanjutnya larutan (1), (2) dan (3) dicampurkan dalam satu Erlenmeyer, pH optimum untuk pertumbuhan bakteri pada medium Horikoshi II ini adalah 10 (yang diketahui dengan menggunakan indikator pH). Kemudian, campuran tersebut dimasukkan ke 7 cawan petri dan dibiarkan hingga memadat pada suhu kamar 25ºC.

2. Pembuatan Larutan Pereaksi

Pereaksi yang digunakan pada penelitian ini yakni: pereaksi CGT-ase dan pereaksi Lowry. Pereaksi CGT-ase digunakan untuk menguji aktivitas ekstrak kasar enzim CGT-ase

sedangkan pereaksi Lowry digunakan untuk menguji kadar protein ekstrak kasar enzim CGT-ase

Pereaksi CGT-ase disiapkan dengan cara melarutkan 1 gram soluble starch ke dalam 100 mL 0,1 M buffer asetat (pH 5,5) kemudian dipanaskan hingga larut.

Pereaksi Lowry terdiri atas 4 macam, yang meliputi Pereaksi A, B, C, dan D. Masing-masing pereaksi tersebut disiapkan sebagai berikut: Pereaksi A: 2 g Na2CO3 dilarutkan dalam 100

mL NaOH 0,1 N; Pereaksi B: 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% (w/v) ditambahkan 5 mL

larutan Na(K)-tartarat 1% (w/v); Pereaksi C: 2 mL pereaksi B ditambah 100 mL pereaksi A; dan Pereaksi D: reagen Folin-Ciocelteau diencerkan dengan akuades1:1. Larutan standar protein digunakan BSA (Bovine Serum Albumine) dengan konsentrasi 0-100 ppm.

3. Pembuatan Larutan Buffer Asetat 0,1 M (pH 5,5)

Sebanyak 50 mL Na-asetat 0,1M dimasukan ke dalam Erlenmeyer kemudian ditambahkan 0,1 mL asam asetat 0,1M.

4. Pembuatan Larutan Salin

Larutan salin ini berfungsi sebagai larutan penyangga pH yang bertujuan agar sel bakteri tidak rusak akibat penurunan pH. Larutan ini dibuat dengan cara menimbang sebanyak 0,85 gram NaCl, dimasukan ke dalam Erlenmeyer dan dilarutkan dengan akuadessebanyak 100 mL, disumbat dengan rapat menggunakan kapas yang telah dibungkus kain kasa

menyesuaikan bentuk Erlenmeyer, kemudian disterilkan dalam autoclave.

5. Skrining dan Isolasi Mikroorganisme Penghasil Enzim CGT-ase

Onggok singkong yang berasal dari limbah atau ampas hasil pengolahan singkong diambil sebanyak 1 gram kemudian dilarutkan dalam larutan salin dan dilakukan pengenceran secara bertingkat hingga 5 kali (10-5_{). Dari pengenceran 10}-5 _{diambil 200µL kemudian ditumbuhkan}

pada medium Horikhosi’s II padat dengan metode streak plate. Medium tersebut kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu 37 °C (waktu dan suhu yang digunakan tersebut

merupakan kondisi optimum untuk pertumbuhan bakteri yang mampu menghasilkan enzim CGT-ase). Koloni yang tumbuh pada medium kemudian diambil 1 ose lalu dipindahkan ke medium yang baru. Setelah itu, diinkubasi selama 3 hari pada suhu 37 °C (Higuti et al., 2003). Setelah 3 hari diamati terbentuknya enzim CGT-ase yang ditandai dengan adanya koloni yang ber-halozone (Mahat et al., 2004).

6. Profil Isolat Terbaik pada Medium Horikhosi’s II

Isolat dengan diameter halozone yang besar sama dengan atau lebih besar dari kontrol positif (Bacillus firmus) dipilih sebagai isolat potensial. Isolat terbaik adalah isolat yang memiliki ukuran diameter halozone (zona bening bewarna kuning keunguan disekitar koloni) yang besar diantara isolat yang diperoleh secara keseluruhan.

7. Produksi Enzim CGT-ase

Produksi enzim CGT-ase dilakukan dengan menyiapkan medium inokulum dan medium kultur yang akan digunakan. Inokulum disiapkan dengan menginokulasikan 1 ose biakan isolat ke dalam Erlenmeyer 250 mL yang berisi larutan NB, kemudian diinkubasi pada shaker

dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37ºC selama 1 malam (overnight: 16-20 jam). Inokulum ini selanjutnya akan digunakan untuk diinokulasikan ke dalam medium kultur. Medium kultur menggunakan medium yang mengandung pati singkong, pepton,yeast

extract, K2HPO4, dan MgSO4.7H2O. Medium kultur yang telah diinokulasikan sebanyak 0,01

mL inokulum kemudian diinkubasi pada shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm, suhu 37 ºC selama 3 hari dan di-sampling secara berkala 12 jam, 24 jam, 36 jam, 48 jam, 60 jam dan 72 jam. Kemudian disentrifugasi selama 15 menit untuk mendapatkan ekstrak kasar

enzim CGT-ase yang kemudian dapat ditentukan pertumbuhan selnya, diuji aktivitasnya dan kadar proteinnya.

8. Penentuan Pertumbuhan Sel

Penentuan pertumbuhan sel ini digunakan untuk mengetahui pertumbuhan dari sel bakteri. Pertumbuhan sel ini ditentukan dengan mengencerkan sampel kultur 10 kali pengenceran. Sebanyak 0,3 mL ekstrak kasar enzim CGT-ase dimasukan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 2,7 mL akuades lalu diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV-VIS

pada panjang gelombang 600 nm.

9. Uji Aktivitas Enzim CGT-ase

Ekstrak kasar enzim CGT-ase yang telah diperoleh (pada prosedur 6) kemudian diuji aktivitas enzim CGT-ase nya. Sebanyak 100 µL larutan enzim ditambahkan 800 µL soluble starch 1% (w/v) yang disiapkan dalam buffer asetat 0,1 M pH 5,5 dan diinkubasi pada suhu 55 ºC selama 10 menit (pH, suhu, dan waktu tersebut merupakan kondisi optimum enzim CGT-ase). Reaksi dihentikan dengan menambahkan 4 mL Na2CO3 0,25 M dan 0,1 mL larutan fenolftalein1 mM. Absorbansi diukur pada panjang λmaks 550 nm. Kontrol dibuat dengan cara

menginaktifkan larutan enzim pada suhu 100 ºC selama 30 menit, dan selanjutnya

diperlakukan sama dengan sampel. Larutan standar yang digunakan adalah β-siklodekstrin dengan konsentrasi 0-10000 ppm. Satu unit enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mampu mereduksi warna merah muda keunguan antara kompleks siklodekstrin dan

fenolftalein sebesar 10 % per menit.

10. Uji Kadar Protein Enzim CGT-ase

Ekstrak kasar enzim CGT-ase yang telah diperoleh (pada prosedur 6) kemudian diuji kadar proteinnya dengan cara 0,1 mL larutan enzim ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan

dengan 5 mL pereaksi C. Campuran diaduk secara merata dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Kemudian ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna. Setelah itu didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Sebagai kontrol, larutan enzim diganti dengan akuades. Perlakuan kontrol sama dengan perlakuan pada

sampel. Pengukuran serapan dilakukan pada λmaks 600 nm.

11. Analisis Produk Hasil Biokatalisis Enzim CGT-ase dengan Metode KLT

A. Analisis dengan Metode KLT

(1). Persiapan sampel/ standar

Sampel yang diuji pada KLT adalah hasil produk biokatalisis enzim CGT-ase dengan kondisi optimum (sesuai prosedur 6). Standar β-siklodekstrin dengan konsentrasi tertentu dan supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi diambil dengan pipa kapiler, lalu ditotolkan pada plat KLT dengan jarak dari pinggir bawah plat 0,5 cm.

(2). Persiapan bejana pengelusi

Bejana pengelusi yang kecil diisi dengan larutan pengelusi butanol-etanol-air dengan komposisi 5:3:2 dan untuk melihat perubahan yang terjadi pada nilai Rf selanjutnya komposisi eluen diturunkan menjadi 5:3:1, kemudian bejana ditutup, hingga jenuh dengan uap eluen sehingga bejana siap digunakan.

(3). Elusi

Plat yang telah ditotolkan larutan standar β-siklodekstrin dan sampel siklodekstrin hasil biokatalisis enzim CGT-ase (sesuai prosedur 6) dimasukkan ke dalam bejana yang telah diisi eluen (jaga agar noda senyawa tidak terendam dalam larutan pengelusi). Proses elusi akan berlangsung sampai pergerakan pelarut mencapai batas yang telah diberi tanda pada

bagian atas plat. Setelah itu, plat diangkat dari dalam bejana dan pelarut dibiarkan kering. Bercak noda divisualisasikan dengan menyemprot plat dengan H2SO4 5 % kemudian

dipanaskan dalam oven dengan suhu 120 °C selama 15 menit (Labes and Schonheit, 2007). Noda (spot) yang terbentuk bewarna gelap, selanjutnya noda diberi tanda sehingga nilai Rf standar dan sampel dapat diketahui dengan membandingkan jarak (dalam ukuran cm) antara migrasi sampel dan jarak migrasi eluen yang digunakan. Jika nilai Rf yang

diperoleh sama dengan nilai standar β-siklodekstin berarti sampel tersebut adalah β -siklodekstrin.

ANALISIS PRODUK HASIL BIOKATALISIS ENZIM CGT-ASE BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL DARI ONGGOK SINGKONG

(Skripsi)

Oleh

FEBY DWI INDRI SYAPUTRI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2012

1 V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil yang diperoleh dari penelitian yang telah dilakukan maka dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :

1. Isolat amilolitik dipilih dan diseleksi berdasarkan kemampuan membentuk zona bening (diameter halozone) pada sekitar koloni bakteri dan aktivitas enzim CGT-ase yang dihasilkan.

2. Berdasarkan pengukuran diameter halozone terhadap isolat hasil isolasi dan kontrol, ternyata tidak diperoleh satu isolat pun yang memiliki diameter yang melebihi ukuran dari isolat LTi-A24-4, sehingga isolat tersebut tetap dipilih sebagai isolat potensial terbaik. Karakterisasi produk biokatalisis dilakukan menggunakan isolat LTi-A24-4.

3. Hasil penelitian menunjukan bahwa waktu inkubasi optimum untuk menghasilkan enzim CGT-ase ekstraseluler pada medium cair Horikoshi’s II dari isolat LTi-A24-4 ada pada waktu 36 jam.

4. Analisis dilakukan dengan menggunakan metode KLT dan produk biokatalisis enzim CGT-ase yang dihasilkan isolat LTi-A24-4 adalah β -siklodekstrin (Rf sampel dengan eluen butanol:etanol:air5:3:2 sebesar

0,77 cm sesuai dengan Rf standar β-siklodekstrin sebesar 0,77 cm dan Rf sampel dengan perbandingan eluen 5:3:1 sebesar 0,72 cm sesuai dengan

2 B. Saran

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan untuk lebih mempertegas bahwa analisis hasil produk biokatalisis enzim CGT-ase yang diperoleh adalah β -siklodekstrin maka disarankan untuk dilakukan penelitian lebih lanjut tentang analisis siklodekstrin ini menggunakan HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography).

enzim CGT-ase yang kemudian dapat ditentukan pertumbuhan selnya, diuji aktivitasnya dan kadar proteinnya.

8. Penentuan Pertumbuhan Sel

Penentuan pertumbuhan sel ini digunakan untuk mengetahui pertumbuhan dari sel bakteri. Pertumbuhan sel ini ditentukan dengan mengencerkan sampel kultur 10 kali pengenceran. Sebanyak 0,3 mL ekstrak kasar enzim CGT-ase dimasukan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 2,7 mL akuades lalu diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 600 nm.

9. Uji Aktivitas Enzim CGT-ase

Ekstrak kasar enzim CGT-ase yang telah diperoleh (pada prosedur 6) kemudian diuji aktivitas enzim CGT-ase nya. Sebanyak 100 µL larutan enzim ditambahkan 800 µL soluble starch 1% (w/v) yang disiapkan dalam buffer asetat 0,1 M pH 5,5 dan diinkubasi pada suhu 55 ºC selama 10 menit (pH, suhu, dan waktu tersebut merupakan kondisi optimum enzim CGT-ase). Reaksi dihentikan dengan menambahkan 4 mL Na2CO3 0,25 M dan 0,1 mL larutan fenolftalein 1 mM. Absorbansi diukur pada panjang λmaks 550 nm. Kontrol dibuat dengan cara menginaktifkan larutan enzim pada suhu 100 ºC selama 30 menit, dan selanjutnya

diperlakukan sama dengan sampel. Larutan standar yang digunakan adalah β-siklodekstrin dengan konsentrasi 0-10000 ppm. Satu unit enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mampu mereduksi warna merah muda keunguan antara kompleks siklodekstrin dan

fenolftalein sebesar 10 % per menit.

10. Uji Kadar Protein Enzim CGT-ase

Ekstrak kasar enzim CGT-ase yang telah diperoleh (pada prosedur 6) kemudian diuji kadar proteinnya dengan cara 0,1 mL larutan enzim ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan

dengan 5 mL pereaksi C. Campuran diaduk secara merata dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Kemudian ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna. Setelah itu didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Sebagai kontrol, larutan enzim diganti dengan akuades. Perlakuan kontrol sama dengan perlakuan pada

sampel. Pengukuran serapan dilakukan pada λmaks 600 nm.

11. Analisis Produk Hasil Biokatalisis Enzim CGT-ase dengan Metode KLT

A. Analisis dengan Metode KLT

(1). Persiapan sampel/ standar

Sampel yang diuji pada KLT adalah hasil produk biokatalisis enzim CGT-ase dengan kondisi optimum (sesuai prosedur 6). Standar β-siklodekstrin dengan konsentrasi tertentu dan supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi diambil dengan pipa kapiler, lalu ditotolkan pada plat KLT dengan jarak dari pinggir bawah plat 0,5 cm.

(2). Persiapan bejana pengelusi

Bejana pengelusi yang kecil diisi dengan larutan pengelusi butanol-etanol-air dengan komposisi 5:3:2 dan untuk melihat perubahan yang terjadi pada nilai Rf selanjutnya komposisi eluen diturunkan menjadi 5:3:1, kemudian bejana ditutup, hingga jenuh dengan uap eluen sehingga bejana siap digunakan.

(3). Elusi

Plat yang telah ditotolkan larutan standar β-siklodekstrin dan sampel siklodekstrin hasil biokatalisis enzim CGT-ase (sesuai prosedur 6) dimasukkan ke dalam bejana yang telah diisi eluen (jaga agar noda senyawa tidak terendam dalam larutan pengelusi). Proses elusi akan berlangsung sampai pergerakan pelarut mencapai batas yang telah diberi tanda pada

bagian atas plat. Setelah itu, plat diangkat dari dalam bejana dan pelarut dibiarkan kering. Bercak noda divisualisasikan dengan menyemprot plat dengan H2SO4 5 % kemudian dipanaskan dalam oven dengan suhu 120 °C selama 15 menit (Labes and Schonheit, 2007). Noda (spot) yang terbentuk bewarna gelap, selanjutnya noda diberi tanda sehingga nilai Rf standar dan sampel dapat diketahui dengan membandingkan jarak (dalam ukuran cm) antara migrasi sampel dan jarak migrasi eluen yang digunakan. Jika nilai Rf yang

diperoleh sama dengan nilai standar β-siklodekstin berarti sampel tersebut adalah β -siklodekstrin.

ANALISIS PRODUK HASIL BIOKATALISIS ENZIM CGT-ASE BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL DARI ONGGOK SINGKONG

(Skripsi)

Oleh

FEBY DWI INDRI SYAPUTRI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2012

1 V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil yang diperoleh dari penelitian yang telah dilakukan maka dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :

1. Isolat amilolitik dipilih dan diseleksi berdasarkan kemampuan membentuk zona bening (diameter halozone) pada sekitar koloni bakteri dan aktivitas enzim CGT-ase yang dihasilkan.

2. Berdasarkan pengukuran diameter halozone terhadap isolat hasil isolasi dan kontrol, ternyata tidak diperoleh satu isolat pun yang memiliki diameter yang melebihi ukuran dari isolat LTi-A24-4, sehingga isolat tersebut tetap dipilih sebagai isolat potensial terbaik. Karakterisasi produk biokatalisis dilakukan menggunakan isolat LTi-A24-4.

3. Hasil penelitian menunjukan bahwa waktu inkubasi optimum untuk menghasilkan enzim CGT-ase ekstraseluler pada medium cair Horikoshi’s II dari isolat LTi-A24-4 ada pada waktu 36 jam.

4. Analisis dilakukan dengan menggunakan metode KLT dan produk biokatalisis enzim CGT-ase yang dihasilkan isolat LTi-A24-4 adalah β -siklodekstrin (Rf sampel dengan eluen butanol:etanol:air5:3:2 sebesar

0,77 cm sesuai dengan Rf standar β-siklodekstrin sebesar 0,77 cm dan Rf sampel dengan perbandingan eluen 5:3:1 sebesar 0,72 cm sesuai dengan

2 B. Saran

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan untuk lebih mempertegas bahwa analisis hasil produk biokatalisis enzim CGT-ase yang diperoleh adalah β -siklodekstrin maka disarankan untuk dilakukan penelitian lebih lanjut tentang analisis siklodekstrin ini menggunakan HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography).