PENGARUH BEBERAPA FAKTOR PADA MEDIUM KULTUR TERHADAP PRODUKSI ENZIM AMILASE DARI BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL

Kupersembahkan karya sederhana ini kepada :

Ayahanda alm. Haryanto dan Ibunda Yuliana, S.Pd. tercinta

Kakak dan adikku tersayang Engki Fandika dan Melania Fandika

Segenap Keluarga besarku yang selalu mendoakan keberhasilanku,

Sahabat dan teman-temanku yang selalu berbagi kebahagiaan,

Assalamu’alaikum Wr. Wb.

Alhamdulillah Puji dan syukur Penulis ucapkan atas kehadirat Allah SWT, karena

atas segala rahmat dan karunia-Nya skripsi ini dapat diselesaikan.

Skripsi dengan judul"PENGARUH BEBERAPA FAKTOR PADA MEDIUM KULTUR TERHADAP PRODUKSI ENZIM AMILASE DARI BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL"adalah salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

Dalam pelaksanaan dan penulisan skripsi ini tidak lepas dari kesulitan dan

rintangan, namun itu semua dapat penulis lalui berkat rahmat dan ridha Allah

SWT serta bantuan dan dorongan semangat dari orang-orang yang hadir

dikehidupan penulis. Dalam kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih

setulus-tulusnya kepada :

1. Bapak Mulyono, Ph.D., selaku pembimbing utama yang telah banyak

memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan, gagasan, bantuan, dukungan,

semangat, kritik dan saran kepada penulis dalam proses perencanaan dan

skripsi ini terselesaikan dengan baik.

3. Bapak Dr. Ir. Yandri A.S., M.S., selaku pembahas yang telah memberikan

kritik, saran, arahan yang diberikan kepada penulis sehingga skripsi ini

terselesaikan dengan baik.

4. Ibu Dra. Ilim, M.S., selaku Pembimbing Akademik atas kesediaannya utuk

memberikan bimbingan, bantuan, nasehat dan informasi yang bermanfaat

kepada penulis.

5. Seluruh dosen FMIPA Unila yang telah mendidik dan memberikan ilmu

pengetahuan yang sangat berguna kepada penulis selama kuliah.

6. Bapak Andi Setiawan, Ph.D., selaku ketua Jurusan Kimia FMIPA Unila.

7. Bapak Prof. Suharso, Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

8. Kedua orang tuaku yang sangat aku cintai dan sayangi. Papaku tersayang alm.

Haryanto yang selalu hidup di dalam hatiku, yang tetap menjadi inspirasi dan

semangat bagiku untuk tetap terus berjuang menggapai apa yang aku citakan,

Papaku Sensuri Gomar yang selalu memberikan motivasi, semangat dan kasih

sayang yang sangat luar biasa, mengajarkanku untuk menjadi orang yang kuat

dan berguna bagi orang lain, panutan dan tauladan yang terhebat bagiku.

Ibunda Yuliana, S.Pd tersayang dan tercinta yang selalu memberikan kasih

sayang, senantiasa sabar dan mendoakan keberhasilanku, nasehat dan senyum

9. Kakak dan adik ku tersayang, Engki Fandika dan Melania Fandika, terima

kasih atas kebahagiaan, motivasi, keceriaan dan canda tawa yang tercipta

selama ini. Kehadiran kalian adalah hal yang tak ternilai harganya dalam

hidupku.

10. Keluarga besarku yang selalu memberikan motivasi, dukungan dan doa untuk

keberhasilanku.

11. Sahabat-sahabat terbaikku yang tersayang : Feraliana, S.Si., Tutik, S.Si., Kurratul Uyun, Rika Yana, Triana Widya Sari terima kasih atas persahahabatan terhebat, segala dukungan, kebahagiaan, kesedihan, kasih sayang, rasa

kebersamaan, keceriaan dan canda tawa yang selalu hadir disetiap

hari-hariku, aku sangat bersyukur dan bangga mengenal kalian, semoga Allah

selalu memberikan rahmat-Nya untuk keberhasilan kita.

12. Teman-teman seperjuangan angkatan 2006 : Nindya Qurrata’ayun S.Si., Ayu

Puspita Sari S.Si., Devi Cendekia S.Si., Harniati S.N. S.Si., Rusyda Ulfa S.Si., Nurma Hayati S.Si., Ni Putu Inda S.Si., Septiyana S.Si., Edwin Riski Safitra S.Si., Mustika Soraya S.Si.,Idra Herlina S.Si, Ekawati S.Si, Winda, Jibe, Nova, S.Si., Lince, S.Si., Putri Wulandari, S.Si., Fretti, Kartika (Boboci), Eka Eva Krisna, S.Si. (kiting), Nini, S.Si., Reni, S.Si., Okta, S.Si., Vera Septaria, S.Si., Prio, S.Si., Roni, S.Si. (kirun), Agung,, Tomi, S.Si., Slamet (slem), Hadi, Deri, Anju, Awan, Alex, Riski (kiki), dan Purwanto terima kasih untuk kebersamaan dan keceriaan selama menjalankan perkuliahan, tetap semangat dan jangan menyerah,

Akhir kata, Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan.

Penulis berharap semoga skripsi yang sederhana ini dapat berguna dan bermanfaat

bagi kita semua. Amin.

Bandar Lampung, 2 Februari 2012 Penulis

PENGARUH BEBERAPA FAKTOR PADA MEDIUM KULTUR TERHADAP PRODUKSI ENZIM AMILASE DARI

BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL

Oleh

Kartika Fandika

Peranan enzim sebagai biokatalisator semakin meningkat seiring dengan pesatnya perkembangan industri, khususnya industri makanan, minuman, industri tekstil, industri kulit, dan industri kertas. Pertumbuhan sel dan produksi enzim oleh suatu mikroorganisme sangat dipengaruhi oleh kondisi medium kultur yang digunakan seperti sumber C, sumber N, ion logam dan pH. Pada penelitian ini telah dilakukan uji pengaruh beberapa faktor kondisi kultur terhadap pertumbuhan sel dan produksi enzim amilase isolat LTE-6. Faktor yang diteliti meliputi: variasi sumber N (pepton, NaNO3, NH4NO3 dan CO(NH2)2), sumber C (glukosa,

arabinosa, fruktosa dan gula), ion logam (Fe, Mn, Mg, Zn) dan variasi pH (5, 6, 7 dan 8) dengan berbagai variasi konsentrasi, yakni antara 0,5 – 2 % (w/v). Pertumbuhan sel diamati melalui pengukuran OD sel pada  _{600nm. Jumlah}

produksi enzim ditentukan melalui pengukuran aktivitas dan kuantitas enzim menggunakan metode Fuwa dan metode Lowry. Sampling dilakukan dalam interval waktu 8, 24, 31, 48 dan 55 jam. Hasil perlakuan menunjukkan bahwa kondisi optimum bagi pertumbuhan sel dan produksi enzim amilase dari isolat LTE-6 secara berurutan yakni: sumber N adalah pepton 0,5% (w/v), sumber C adalah gula 0,5% (w/v), ion logam adalah Fe 0,5% (w/v), dan pada pH 6.0. Pada masing-masing kondisi tersebut, diperoleh perubahan nilai aktivitas unit enzim amilase isolat ini secara berurut yaitu 9,8 U/ml, 10,83 U/ml, 9,5 U/ml, 8,7 U/ml, pada usia kultur 24, 48, 24, dan 24 jam, dengan OD sel 1.91, 3.75, 3.32, 1.45. Dengan kata lain, secara umum variasi kondisi medium kultur berpengaruh terhadap pertumbuhan sel dan produksi enzim amilase isolat LTE-6, yaitu pada medium pati singkong tanpa perlakuan (secara berurut 5.5 U/ml, 31 jam, dan 1.9), sebagaimana telah dipaparkan oleh Mulatasih (2010).

THE INFLUENCE OF SOME FACTORS IN THE GROWTH OF CELL MEDIUM CONDITIONS ON THE PRODUCTION OF AMYLASE

ENZYMES FROM AMILOLITIK LOCAL ISOLATE

By

Kartika Fandika

The role of the enzyme as biokatalisator are increasing with the rapid industrial development, particularly the food industry, beverage, textile industry, leather industry and paper industry. Cell growth and enzyme production by a microorganism is affected by the culture medium used as the source of C, N sources, metal ions and pH. This research has been done on testing the influence of some factors on the growth of cell culture conditions and the production of amylase enzymes LTE-6 isolates. Factors studied include: variations in N sources (peptone, NaNO3, NH4NO3 and CO (NH2) 2), C source (glucose, arabinose,

fructose and sugar), metal ions (Fe, Mn, Mg, Zn) and the variation of pH (5 , 6, 7 and 8) with various concentrations, ie between 0.5 - 2% (w / v). Cell growth was observed by measuring the OD of cells at 600Nm _{. Production quantities are}

determined by measuring enzyme activity and quantity of the enzyme using the method of Fuwa and method of Lowry. Sampling is done in the time interval 8, 24, 31, 48 and 55 hours. The results showed that treatment of the optimum conditions for cell growth and production of amylase enzymes of isolate LTE-6 in sequence are: N source was peptone 0.5% (w / v), C is the source of glucose 0.5% (w / v), metal ion is Fe 0.5% (w / v), and at pH 6.0. In each of those conditions, acquired changes in the activity of amylase enzyme unit is a sequential isolates is 9.8 U / ml, 10.83 U / ml, 9.5 U / ml, 8.7 U / ml, at the age of culture 24, 48, 24, and 24 hours, with cell OD 1.91, 3.75, 3:32, 1:45. In other words, the general variation of the condition of the culture medium affects cell growth and production of amylase enzymes LTE-6 isolates, ie on cassava starch medium without treatment (sequentially 5.5 U / ml, 31 h, and 1.9), as has been described by Mulatasih (2010).

A. Enzim

Enzim adalah produk protein sel hidup yang berperan sebagai biokatalisator

dalam proses biokimia, baik yang terjadi di dalam sel maupun di luar sel

(Poedjadi, 1994). Berdasarkan cara menghasilkannya, enzim dibagi menjadi dua,

yaitu enzim ekstraseluler dan enzim intraseluler. Enzim ekstraseluler dapat

diperoleh dalam keadaan murni pada biakan cair dengan cara pemisahan dan

pemurnian yang tidak begitu rumit (Smith, 1990). Fungsi utama dari enzim

tersebut adalah melangsungkan perubahan-perubahan pada nutrien di sekitarnya

sehingga memungkinkan nutrien tersebut masuk ke dalam sel. Sedangkan enzim

intraseluler memiliki peran dalam mensintesis bahan seluler dan menguraikan

nutrien untuk menyediakan energi yang dibutuhkan oleh sel (Wirahadikusumah,

1989).

Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel. Semua enzim yang

diketahui hingga kini hampir seluruhnya adalah protein dan aktivitas katalitiknya

bergantung pada integritas strukturnya sebagai protein. Enzim, seperti protein

lain, memiliki berat molekul yang berkisar kira-kira 12.000 sampai lebih dari 1

juta. Oleh karena itu, enzim berukuran sangat besar dibandingkan substrat atau

1. Enzim Amilase

Amilase merupakan enzim pemecah pati, glikogen dan polisakarida lain dengan

cara menghidrolisis ikatan glikosidik α-1,4 atau ikatan glikosidik α-1,6. Amilase

dibagi menjadi empat golongan, yaitu: α-amilase, β-amilase, glukoamilase dan

enzim pemutus cabang. Berdasarkan produk akhir hidrolisisnya, enzim amilase

dibagi menjadi α-amilase sakarifikasi dan amilase likuifikasi. Golongan pertama

memberikan produk akhir gula bebas sedangkan golongan kedua adalah enzim

yang memecah pati tetapi tidak menghasilkan gula bebas, kedua golongan amilase

ini dibedakan secara eksperimen (Crueger, 1984).

Enzimα-amilase (α-1,4 glukan-glukanhidrolase), termasuk enzim pemecah dari

dalam molekul, bekerja menghidrolisisdengan cepat ikatan α-1,4 glukosida pada

pati. Berat molekul α-amilase ± 50 kDa (Suhartono, 1989). Enzim ini banyak

digunakan pada industrisirup, sari buah, dan selai. Enzim α-amilase mengandung

paling sedikit 1 atom kalsium permolekul dan melekat dengan erat pada molekul

enzim. Adanya kalsium tersebut menyebabkan enzim ini disebut “calcim metal

coenzyme”(Judoamidjojo dkk., 1989). Ion kalsium ini penting untuk stabilitas

dan aktivitas enzim. Afinitas ion kalsium pada α-amilase lebih kuat dari

kation lain. Masih belum jelas apakah ion kalsium dapat diganti oleh

kation-kation lain (Vihinen and Mantsala, 1989).

Mekanisme kerja enzim α-amilase pada amilosa dibagi dalam dua tahap, pertama

degradasi secara cepat molekul amilosa menjadi maltosa dan maltotriosa yang

terjadi secara acak. Pada tahap ini terjadi penurunan kekentalan dengan cepat.

maltosa dengan laju lebih lambat dan tidak secara acak (Winarno, 1995).

Aktivitas α-amilase dapat diukur berdasarkan penurunan kadar pati yang larut,

kadar dekstrin yang terbentuk, dan pengukuran viskositas atau jumlah gula

pereduksi yang terbentuk (Judoamidjojo dkk., 1989).

Pati bereaksi secara kimiawi dengan iodium, reaksi ini terlihat sebagai warna

biru-kehitaman. Warna biru-kehitaman ini terjadi bila molekul iodium masuk ke

dalam bagian yang kosong pada molekul zat pati (amilosa) yang berbentuk spiral.

Proses iodinisasi zat pati menghasilkan molekul yang mengabsorpsi semua

cahaya, kecuali warna biru. Bila zat pati ini telah diuraikan menjadi maltosa atau

glukosa, warna biru ini tidak terjadi karena tidak adanya bentuk spiral

(Lay, 1994).

Aktivitas enzim α-amilase ditentukan dengan mengukur penurunan kadar pati

yang larut dengan menggunakan substrat jenuh. Kejenuhan pati berpengaruh

terhadap laju reaksi enzimatis. Apabila larutan pati terlalu jenuh maka enzim sulit

terdifusi ke dalam larutan sehingga kerja enzim akan terhambat (Winarno, 1995).

β-amilase (β-1,4 glukan maltohidrolase), memutus dari luar molekul dan

menghasilkan unit-unit maltosa dari ujung nonpereduksi pada rantai polisakarida.

Bila tiba pada ikatan α-1,6 glikosida seperti yang dijumpai pada amilopektin atau

glikogen, aktivitas enzim ini akan terhenti. Enzim ini bekerja pada ikatan α-1,4

dengan menginversi konfigurasi posisi atom C (1) atau atom C nomor 1 molekul

glukosa dari α menjadi β. Enzim β-amilase memiliki pH optimum antara 5-6

Gamma amilase (γ –amilase), EC.3.2.1.3. disebut juga glukan 1,4-α–glukosidase,

amiloglukosidase, ekso-1,4-α–glukosidase, lisosomal α-glukosidase,

glukoamilase, 1,4-α-D-glukan glukohidrolase. Merupakan pemutus terakhir

ikatan glikosida pada bagi ujung nonreduksi dari amilosa dan amilopektin untuk

menghasilkan unit glukosa.

Pullulanase, EC.3.2.1.41. merupakan enzim pemutus cabang, menghidrolisis

hanya pada ikatan α-1,6 glikosida, seperti pullulan 6-glukanohydrolase. α

-Glukosidase,EC.3.2.1.20. Memutus ikatan α-1,4 glikosida dari molekul amilosa

ataupun amilopektin menjadi rantai-rantai pendek oligosakarida

(Hagiharaet al., 2001).

Berdasarkan arah memutusnya ikatan glikosida dari amilum, maka enzim amilase

dapat dikategorikan menjadi 2 kelompok (Reddyet al., 2003) yaitu endoamilase

dan ektoamilase. Endoamilase melakukan hidrolisis secara acak dari bagian

depan molekul amilum sehingga menghasilkan molekul oligosakarida dalam

bentuk rantai lurus maupun bercabang dengan panjang rantai yang bervariasi

sedangkan ektoamilase melakukan hidrolisis dari ujung nonreduksi dan dengan

produk akhir molekul yang pendek.

Enzim amilase secara konstitusi merupakan kelompok enzim yang sangat

dibutuhkan dalam bidang industri, dengan pangsa pasar mencapai hampir 25%

dari pasaran enzim di dunia (de Carvalhoet al., 2008). Penggunaan enzim

amilase dalam industri sangat luas mulai dari industri pembuatan roti, sirup,

pengujian limbah cair yang mengandung amilum, industri detergen, industri obat

dan suplemen enzim (Palmer, 1985).

2. Fungsi dan Cara Kerja Enzim

Enzim adalah satu atau beberapa gugus polipeptida (protein) yang berfungsi

sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi)

dalam suatu reaksi kimia. Dimana suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108

sampai 1011kali lebih cepat daripada reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis.

Seperti katalis lainnya enzim dapat menurunkan energi aktivasi suatu reaksi

kimia.

Saat berlangsungnya reaksi enzimatik terjadi ikatan sementara antara enzim

dengan substrat (reaktan). Ikatan sementara ini bersifat labil dan hanya untuk

waktu yang singkat saja. Selanjutnya ikatan enzim-substrat akan pecah menjadi

enzim dan hasil akhir. Enzim yang terlepas kembali setelah reaksi dapat

berfungsi lagi sebagai biokatalisator untuk reaksi yang sama. Enzim bekerja

dengan dua cara, yaitu menurut Teori Kunci-Gembok (Lock and Key Theory) dan

Teori Kecocokan Induksi (Induced Fit Theory).

Menurut teori kunci-gembok, terjadinya reaksi antara substrat dengan enzim

karena adanya kesesuaian bentuk ruang antara substrat dengan situs aktif (active

site) dari enzim, sehingga sisi aktif enzim cenderung kaku. Substrat berperan

sebagai kunci masuk ke dalam situs aktif, yang berperan sebagai gembok,

Gambar 1. Pembentukan kompleks enzim-substrat berdasarkan Teori Kunci-Gembok (Lock and Key Theory) dan Teori Kecocokan Induksi (Induced Fit Theory).

Pada saat ikatan kompleks enzim-substrat terputus, produk hasil reaksi akan

dilepas dan enzim akan kembali pada konfigurasi semula. Berbeda dengan teori

kunci gembok, menurut teori kecocokan induksi reaksi antara enzim dengan

substrat berlangsung karena adanya induksi substrat terhadap situs aktif enzim

sedemikian rupa sehingga keduanya merupakan struktur yang komplemen atau

saling melengkapi. Menurut teori ini situs aktif tidak bersifat kaku, tetapi lebih

fleksibel (Murrayet al., 1997).

3. Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Reaksi Enzimatik

Terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi reaksi enzimatik, antara lain:

a) Substrat (reaktan)

Kecepatan reaksi enzimatik umumnya dipengaruhi kadar substrat.

Penambahan kadar substrat sampai jumlah tertentu dengan jumlah

enzim yang tetap, akan mempercepat reaksi enzimatik sampai mencapai

maksimum. Penambahan substrat selanjutnya tidak akan menambah

b) Suhu

Seperti reaksi kimia pada umumnya, maka reaksi enzimatik dipengaruhi

oleh suhu. Kenaikan suhu sampai optimum akan diikuti pula oleh

kenaikan kecepatan reaksi enzimatik. Kepekaan enzim terhadap suhu

pada keadaan suhu melebihi optimum disebabkan terjadinya perubahan

fisikokimia protein penyusun enzim. Umumnya enzim mengalami

kerusakan (denaturasi) pada suhu diatas 50oC (Wolfe, 1993).

c) Keasaman (pH)

pH dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Daya katalisis enzim menjadi

rendah pada pH rendah maupun tinggi, karena terjadi denaturasi protein

enzim. Enzim mempunyai gugus aktif yang bermuatan positif (+) dan

negatif (-). Aktivitas enzim akan optimum kalau terdapat

keseimbangan antara kedua muatan. Pada keadaan asam cenderung

bermuatan positif, dan pada keadaan basa cenderung bermuatan negatif,

sehingga aktivitas enzim menjadi berkurang atau bahkan menjadi tidak

aktif. pH optimum untuk masing-masing enzim tidak selalu sama

(Orten and Neuhaus, 1970).

d) Penghambat enzim (Inhibitor)

Inhibitor enzim adalah zat atau senyawa yang dapat menghambat

enzim. Ada beberapa cara penghambatan enzim, seperti penghambat

secara bersaing (kompetitif), penghambat tidak bersaing

(non-kompetitif), penghambat umpan balik (feed back inhibitor), dan

e) Waktu inkubasi

Waktu yang diperlukan oleh enzim untuk bereaksi secara optimum

dengan produk tidaklah seragam, ada beberapa yang membutuhkan

waktu yang lebih lama untuk bereaksi (Orten and Neuhaus, 1970).

B. Mikroorganisme

Sel merupakan unit struktural dan fungsional organisme hidup. Organisme

terkecil terdiri dari sel tunggal. Terdapat berbagai jenis sel yang amat bervariasi

dalam ukuran, bentuk, dan fungsi khususnya. Ada dua kelas utama sel, yaitu sel

prokariot dan sel eukariot (Albertet al., 1994). Sel yang paling tua dikenal

sebagai prokaryotis (dari kata “pro” yan artinya sebelum, dan “karyon” yang

artinya nukleus). Golongan ini terdiri dari dua golongan utama yaitu bakteri dan

sianobakteri (alga hijau-biru), dimana molekul nukleid terdapat secara langsung

pada sitoplasma tanpa ada sistem membran yang memisahkannya sebagai

kompartemen yang terpisah ( Wolfe, 1993).

Sel prokariot memiliki struktur yang sederhana, pertumbuhan selnya mudah dan

cepat, serta mekanisme yang relatif sederhana dalam proses reproduksi. Sel

prokariot bereproduksi dengan cara aseksual yang sangat sederhana. Organisme

ini tumbuh hingga ukurannya berlipat ganda, kemudian membelah diri menjadi sel

anak yang identik (Lehninger, 1988).

1. Nutrien Mikroba

Kebutuhan nutrien harus meliputi unsur makro esensial dan mikro esensial yang

mensintesis vitamin dan berperan dalam sporulasi. Nutrien dasar bagi

mikroorganisme harus mengandung sumber energi untuk tumbuh seperti unsur

karbon, nitrogen, dan logam. Nutrien yang tergolong sumber energi adalah

senyawa hasil oksidasi dari lemak, protein, amonium, karbohidrat, dan gula

sederhana. Kebutuhan sumber karbon dapat dipenuhi dengan adanya CO2atau

senyawa seperti gula, pati, dan karbohidrat lai. Kebutuhan akan nitrogen dapat

dipenuhi oleh NH4+ atau senyawa nitrat organik/anorganik. Untuk pertumbuhan

normal mikroorganisme membutuhkan ion logam yang berfungsi sebagai kofaktor

(Suhartono, 1989).

Histidin, ditiotreitol dan merkaptoetanol merupakan senyawa yang berperan

sebagai kofaktor enzim ini. Selain itu beberapa logam juga dapat berperan

sebagai kofaktor antara lain Ca2+, Ba2+, Mn2+, Ag+, dan Fe2+. Sedangkan Hg2+,

Cu2+, Mg2+, Rb2+, Fe3+, Al3+, Cd2+dan Ni2+merupakan inhibitorenzim α-amilase

(Schomburg and Salzmann, 1991).

2. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme

Pertumbuhan mikroorganisme untuk menghasilkan produk tertentu mempunyai

siklus pertumbuhan tertentu tergantung produk yang akan dihasilkan. Fase

pertumbuhan mikroorganisme dibagi menjadi empat diantaranya fase lag, fase

esponensial, fase stasioner, dan fase menurun (kematian) (Dwidjoseputro, 1987).

a. Fase lag

Pada fase ini mikroorganisme melakukan metabolisme

belum terjadi pembelahan sel dan berlangsung cepat atau lambat

tergantung jenis mikroorganisme dan inokulum serta kondisi

lingkungan.

b. Fase eksponensial

Pada fase ini sel akan membelah diri sampai mencapai jumlah

maksimum sesuai dengan kondisi lingkungannya. Saat ini

mikroorganisme mengalami pertumbuhan yang tertinggi tetapi tidak

berlangsung sama karena pertumbuhan dibatasi oleh jumlah nutrien

dan penimbunan zat racun sebagai hasil metabolisme sekunder.

c. Fase stasioner

Pada fase ini pertumbuhan mikroorganisme seimbang dengan

kematiannya. Pertumbuhan mikroorganisme terhenti dan terjadi

akumulasi produk di dalam sel atau media fermentasi. Dengan

terakumulasinya produk pada media fermentasi akan mengganggu

proses sintesis enzim. Pada fase ini sel-sel menjadi lebih tahan

terhadap keadaan ekstrim seperti panas, dingin, radiasi, dan bahan

kimia.

d. Fase menurun (fase menuju kematian)

Pada fase ini sebagian mikroorganisme mulai mengalami kematian.

Jumlah sel yang mati semakin lama akan semakin banyak, dan

kecepatan kematian dipengaruhi oleh kondisi nutrien, lingkungan, dan

3. Amilase dari Mikroorganisme

Enzim yang digunakan untuk keperluan industri sebagian besar diisolasi

dari mikroba. Pemilihan mikroba sebagai sumber enzim mempunyai beberapa

keuntungan bila dibandingkan dengan enzim yang diisolasi dari tumbuhan

maupun hewan. Keuntungan itu antara lain sel mikroba lebih mudah untuk

ditumbuhkan dan kecepatan pertumbuhannya relatif lebih cepat, skala produksi

sel lebih mudah ditingkatkan apabila dikehendaki produksi yang lebih besar, biaya

produksinya relatif lebih murah, kondisi selama produksi tidak tergantung oleh

adanya perubahan musim dan waktu yang dibutuhkan dalam proses produksi lebih

singkat (Poernomo, 2003).

Amilase secara umum diproduksi oleh tumbuhan, hewan, manusia dan

mikroba, tetapi enzim amilase yang berasal dari fungi dan bakteri mendominasi

penggunaan enzim amilase di bidang industri. Beberapa dari jenisBacillus sp.dan

Actinomycetes,termasukTermomonosporadanThermoactinomycetesmerupakan

kelompok yang memiliki kemampuan besar dalam meproduksi enzim amilase.

Bacillus licheniformismemiliki kemampuan untuk menghasilkan enzim amilase

dalam kondisi lingkungan yang bersifat alkalis (Reddyet al., 2003). Enzim

amilase yang dihasilkan oleh mikroba terutama dari bakteri, merupakan jenis

enzim ekstraseluler (Palmer, 1985).

Bakteri menghasilkan enzim ekstraseluler di dalam sel dan menggunakannya di

luar sel, yaitu untuk menghidrolisis sumber makanan yang mengandung amilum

yang terdapat di lingkungannya. Molekul amilum tidak dapat masuk ke dalam sel

terlebih dahulu oleh enzim amilase ekstraselular menjadi molekul karbohidrat

yang lebih sederhana dan kecil ukuran molekulnya. Molekul hasil hidrolisis

amilum oleh enzim amilase tersebut selanjutnya akan diangkut masuk ke dalam

sel bakteri dan digunakan sebagai sumber karbon bagi aktivitas pertumbuhan dan

kehidupannya (Benson, 1994).

Enzim amilase ekstraseluler yang dihasilkan bakteri maupun fungi tersebut

dimanfaatkan sebagai katalisator dalam industri maupun untuk keperluaan dalam

bidang kesehatan. Untuk mendapatkan enzim amilase dari mikroba

tersebut maka kultur mikroba yang memproduksi enzim amilase ekstraseluler

tersebut disentrifugasi untuk mendapatkan supernatan yang mengandung enzim

amilase ekstraselular (Palmer, 1985).

4. Amilum

Amilum adalah polimer karbohidrat dengan rumus molekul (C6H10O5)n.

Karbohidrat golongan polisakarida ini banyak terdapat di alam, terutama pada

sebagian besar tumbuhan. Amilum dalam bahasa sehari-hari disebut juga pati

terdapat pada umbi, daun, batang dan biji-bijian. Amilum merupakan kelompok

terbesar karbohidrat cadangan yang dimiliki oleh tumbuhan sesudah selulosa (Liu,

2005). Butir-butir pati apabila diamati dengan mikroskop ternyata berbeda-beda

bentuknya dan ukurannya tergantung dari tumbuhan apa pati tersebut diperoleh

(Poedjiadi, 1994).

Amilum disusun oleh dua kelompok polisakarida yaitu amilosa, kira kira 20–28%

amilopektin memiliki monomer yang sama yaitu molekul glukopiranosa. Amilosa

terdiri dari 100-10000 unit D-glukopiranosa permolekulnya, yang tiap unitnya

berikatan lewat ikatan α-1,4 glikosida (Liu, 2005). Tiap rantai polimer

molekulnya memiliki satu ujung gula tereduksi dan satu ujungnya lagi gula

nonreduksi sehingga molekul amilosa merupakan rantai terbuka (Poedjiadi, 1994).

Amilosa merupakan bagian terdepan dari rantai amilum, bersifat larut

dalam air yang dipanaskan dan dapat membentuk endapan dalam air, yang

sifatnya tidak dapat balik (Aiyer, 2005). Amilopektin merupakan rantai molekul

polisakarida yang memiliki banyak percabangan. Molekul D-glukopiranosa yang

menjadi unit monomernya yang berikatan lewat ikatan α-1,4 glikosida seperti

pada amilosa yang membentuk rantai lurus dan ikatan α-1,6 glikosida yang

membentuk percabangan pada rantai amilopektin tersebut (Murrayet al., 2003).

Molekul amilopektin lebih besar dari molekul amilosa dengan berat moleklunya

berkisar antara 106–109 g permolnya (Liu, 2005). Molekul amilosa merupakan

molekul yang larut dalam air dan memberikan warna biru apabila tercampur

dengan larutan iodin, sedang amilopektin merupakan molekul yang tidak larut

dalam air dan akan kelihatan berwarna merah bila terkena iodin (Sale, 1961).

Butir-butir pati tidak larut dalam air dingin, tetapi apabila suspensi dalam

air dipanaskan terbentuk suatu larutan koloid yang kental. Bila pati dipanaskan

dan didilusi dengan asam, pati akan terhidrolisis menjadi dekstrin, maltosa dan

D-glukosa (Sale, 1961). Semua hasil hidrolisis ini memiliki sifat yang larut dalam

akanmengubah amilum menjadi maltosa dalam bentuk β-maltosa (Poedjiadi,

1994).

Gambar 3. Struktur Kimia dari (1) Amilosa dan (2) Amilopektin

Dalam kehidupan manusia amilum berperan sebagai sumber makanan penghasil

energi utama dari golongan karbohidrat, disamping itu amilum juga dapat

berperan sebagai bahan aditif pada proses pengolahan makanan, misalnya sebagai

penstabil dalam proses pembuatan puding. Amilum juga berperan dalam

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Agustus 2010 sampai dengan bulan April

2011 di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Instrumentasi Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain spektrofotometer

UV-VIS, sentrifuga, mikropipet, shaker (orbit environ shaker), laminarair flow, pH

universal, autoklaf, jarum ose, pembakar spiritus, neraca analitik dan alat-alat

gelas laboratorium lainnya.

Bahan-bahan yang digunakan adalah pati singkong, pepton, NaNO3, NH4NO3,

CO(NH2)2, glukosa, fruktosa, maltosa, ekstrak ragi, NaCl, CaCl2,K2HPO4,

KH2PO4, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, FeSO4,CaCl2, (NH4)2HPO4, NaOH,

pereaksi iodin, BSA (Bovine Serum Albumin), Na2CO3, Na-K- tartarat,

CuSO4.5H2O, reagenfolin ciocelteau,alkohol, spiritus, akuades serta isolat

C. Prosedur Penelitian

1. Penyiapan Medium dan Pereaksi

a. Pembuatan Pereaksi untuk Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase MetodeFuwa(Fuwa, 1954)

Pembuatan pereaksi iodin yaitu dengan cara melarutkan 2 g KI dengan sedikit

akuades di dalam labu takar 100 mL, lalu ditambahkan 0,2 g I2dan ditambahkan

dengan akuades hingga tanda batas.

Pembuatan larutan pati yaitu dengan cara memasukkan 0,5 gram pati ke dalam

labu takar 100 mL kemudian ditambahkan 0,1 M buffer asetat hingga tanda batas,

lalu dipanaskan.

b. Pembuatan PereaksiLowryuntuk Pengukuran Kadar Protein (Lowryet al., 1951).

Pereaksi A dapat dibuat dengan cara melarutkan 2 g Na2CO3dengan 100 mL

NaOH 0,1N. Pereaksi B dapat dibuat dengan cara menambahkan 5 ml

CuSO4.5H2O 1% (w/v) ke dalam 5 mL larutan Na-K-tartarat 1% (w/v). Pereaksi

C dapat dibuat dengan cara menambahkan 2 mL pereaksi B dengan 100 mL

pereaksi A. Pereaksi D dapat dibuat dengan cara mengencerkan reagen

Folin-Ciocelteau dengan akuades 1:1.

2. Penumbuhan Mikroba

Diinokulasi 1 ose mikroba dari isolat terpilih yaitu isolat LTE-6 masing-masing

ke dalam erlenmeyer yang telah berisi medium NB cair steril. Tiap 100 mL

diinkubasi padashakerdengan kecepatan 180 rpm pada suhu 37 C selama 1

malam (overnight: 16-20 jam). Sebanyak 1% inokulum ini selanjutnya digunakan

untuk menginokulasi media kultur dengan volume yang lebih besar.

3. Penentuan Profil Pertumbuhan

Profil pertumbuhan mikroorganisme meliputi fase lag, fase ekspenensial, fase

stasioner dan fase kematian. Untuk mengetahui profil pertumbuhan tersebut

dilakukan pengukuranoptical density(OD) pada selang waktu (8, 31, 48, dan 55

jam). Pengukuran OD dilakukan pada panjang gelombang 600 nm.

4 Penentuan Profil Kadar Protein dan Aktivitas Enzim Amilase

Isolat LTE-6 dikultur selama 55 jam dan dilakukan sampling dengan kisaran

waktu 8, 24,31,48, dan 55 jam. Sampel kultur disentrifugasi dengan kecepatan

5000 rpm dan supernatan yang diperoleh diuji kadar proteinnya dengan metode

Lowrydan aktivitasnya menggunakan metodeFuwa, seperti yang dijelaskan pada

prosedur 5 dan 6.

5 Penentuan Kadar protein MetodeLowry

MetodeLowrydigunakan untuk mengetahui kadar protein (Lowryet al., 1951).

Sebanyak 0,1 mL enzim ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan dengan 5

mL pereaksi C. Campuran diaduk secara merata dan dibiarkan selama 10 menit

pada suhu kamar. Kemudian ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan

diaduk dengan sempurna. Setelah itu didiamkan selama 30 menit pada suhu

dilakukan pada λ 600 nm. Konsentrasi protein enzim ditentukan dengan

menggunakan kurva standar BSA.

6 Penentuan Aktivitas Enzim MetodeFuwa

Aktivitasα-amilase ditentukan oleh metode iodin (Fuwa, 1954). Patisoluble

0,5% di dalam buffer asetat 0,1 M sebanyak 300μL ditambahkan dengan enzim

sebanyak 100μL dipanaskan pada suhu 55oC selama 10 menit lalu ditambahkan

0,2 M HCl sebanyak 40μL, ditambahkan larutan iodin 0,5 mL, dan ditambahkan

H2O hingga volumenya 10 mL, lalu diukur dengan spektrofotometer UV-VIS

padaλ700 nm. Kontrol dibuat dengan cara memanaskan enzim pada suhu 100oC

selama 30 menit. Aktivitas unit dihitung dari jumlah enzim yang mereduksi

warna biru 10% permenit.

7. Pengaruh Beberapa FaktorTerhadap Pertumbuhan Bakteri dan Produksi Enzim Amilase

a. Pengaruh Sumber N

Sumber N yang digunakan adalah pepton, NaNO3, CO(NH2)2dan NH4NO3.

Masing-masing sumber N sebesar 0,5% (w/v) ditambahkan ke dalam medium

standar. Medium kultur dengan komposisi tersebut kemudian diinokulasi dengan

starter dan ditumbuhkan seperti yang dijelaskan pada prosedur 4. Sampling

dilakukan pada rentang waktu 8, 24, 31, 48, dan 55 jam. Sampel kultur diukur

nilai OD, kadar protein, dan aktivitas enzim seperti pada prosedur 3, 5 dan 6.

Untuk sumber N terbaik kemudian dilakukan uji pengaruh variasi konsentrasi dari

b. Pengaruh Sumber C

Sumber C yang digunakan adalah glukosa, fruktosa, arabinosa, dan gula.

Masing-masing sumber C sebanyak 0,5% (w/v) ditambahkan ke dalam medium tanpa

perlakuan Medium kultur dengan komposisi tersebut kemudian diinokulasi

dengan starter dan ditumbuhkan seperti yang dijelaskan pada prosedur 4.

Sampling dilakukan pada setiap 24 jam selama 72 jam. Sampel kultur diukur nilai

OD, kadar protein, dan aktivitas enzim seperti pada prosedur 3, 5 dan 6. Untuk

sumber C terbaik kemudian dilakukan uji pengaruh variasi konsentrasi dari 0,5–

2 % (w/v) dan diukur sebagaimana tersebut di atas.

c Pengaruh Ion Logam

Sumber ion logam yang digunakan adalah MgSO4,ZnSO4, MnSO4,dan FeSO4.

Masing-masing sumber ion logam sebanyak 0,5% (w/v) ditambahkan ke dalam

medium tanpa perlakuan. Medium kultur dengan komposisi tersebut kemudian

diinokulasi dengan starter dan ditumbuhkan seperti yang dijelaskan pada prosedur

4. Sampling dilakukan pada rentang waktu 8, 24, 31, 48, dan 55 jam. Sampel

kultur diukur nilai OD, kadar protein, dan aktivitas enzim seperti pada prosedur 3,

5 dan 6. Untuk sumber ion logam terbaik kemudian dilakukan uji pengaruh

variasi konsentrasi dari 0,5–2% (w/v) dan diukur sebagaimana tersebut di atas.

d. Pengaruh pH

Medium yang digunakan untuk menginokulasi bakteri divariasikan pHnya dari pH

6 - 8. Medium kultur dengan komposisi tersebut kemudian diinokulasi dengan

dilakukan pada rentang waktu 8, 24, 31, 48, dan 55 jam. Sampel kultur diukur

nilai OD, kadar protein dan aktivitas enzim seperti pada prosedur 3, 5 dan 6.

Untuk pH terbaik kemudian dilakukan uji pengaruh variasi dari 6 - 8 dan diukur

Isolat Bakteri

Profil Pertumbuhan Bakteri pada Medium Tanpa Perlakuan

Profil Aktivitas dan Kadar Protein Enzim Amilase pada Medium Tanpa Perlakuan

Pengaruh Beberapa Faktor terhadap Pertumbuhan dan Produksi Enzim

Sumber N Sumber C Sumber Ion Logam

-diukur aktivitas dan kadar protein

-ditumbuhkan dalam medium tanpa perlakuan (24, 48, 72 jam)

-diukur nilai OD -diukur aktivitas dan kadar protein

-diukur nilai OD

Profil Pertumbuhan Bakteri pada Medium Optimasi

Profil Aktivitas dan Kadar Protein Enzim Amilase pada Medium Optimasi

Pengaruh Variasi pH

(6, 7, 8)

-diukur nilai OD

-diukur aktivitas dan kadar protein

A. Simpulan

Berdasarkan hasil yang diperoleh dari percobaan yang telah dilakukan maka

dapat ditarik simpulan sebagai berikut:

1. Kondisi optimum bagi pertumbuhan sel dan produksi enzim amilase isolat

LTE-6 adalah dengan menggunakan sumber N pepton 0,5% (w/v), sumber

C gula 0,5% (w/v), sumber ion logam Fe 0,5% (w/v) pada pH 6.0.

2. Bila dibandingkan dengan data yang dilaporkan oleh Mulatasih (2010),

maka kondisi kultur tersebut di atas memberikan pengaruh sebagai berikut:

• Pepton mempersingkat waktu produksi enzim yaitu 24 jam dengan nilai aktivitas unit 9,8 U/ml.

• Gula memperlambat waktu produksi enzim menjadi 48 jam dengan aktivitas unit 10,83 U/ml.

• Ion Fe pada kondisi sumber N dan sumber C optimum mampu mengembalikan kecepatan produksi enzim ke 24 jam dengan

aktivitas unit 9,5 U/ml.

• pH 6.0 merupakan pH yang optimum bagi pertumbuhan sel dan produksi enzim dengan aktivitas unit sebesar 8,7 U/ml dalam

B. Saran

Kondisi optimum yang diperoleh pada penelitian ini, kedepan diharapkan dapat

(Skripsi)

Oleh

KARTIKA FANDIKA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2012

niscaya Allah akan meninggikan orang-orang

yang beriman di antaramu dan orang-orang yang

diberi ilmu pengetahuan beberapa derajat. Dan

Allah Maha Mengetahui apa yang kamu kerjakan.

(QS. Al Mujaadilah : 11)

Tanda akal seseorang itu adalah pekerjaannya, dan

tanda ilmu seseorang itu adalah perkataannya.

(Imam Gozhali)

Orang yang luar biasa tidak pernah memperhatikan

hasil, tetapi mereka hanya memikirkan dan

mengerjakan prosesnya

(Asep Hilman)

If you want something you ve never had, you must

be willing to do something you ve never done

Penulis dilahirkan di Kotaagung, Tanggamus, Lampung pada tanggal 3 Mei 1988,

sebagai anak kedua dari tiga bersaudara, putri dari Bapak alm. Haryanto dan Ibu

Yuliana, S.Pd.

Jenjang pendidikan diawali dari Sekolah Dasar (SD) di SD Negeri 1 Pasar

Madang diselesaikan pada tahun 2000. Sekolah Menengah Pertama (SMP) di

SMP Negeri 1 Kotaagung diselesaikan pada tahun 2003, dan Sekolah Menengah

Atas (SMA) di SMA Negeri Alkautsar Bandar Lampung diselesaikan pada tahun

2006. Tahun 2006, penulis terdaftar sebagai Mahasiswa Jurusan Kimia FMIPA

Unila melalui jalur PKAB (Penelusuran Kemampuan Akademik dan Bakat).

Selama menjadi mahasiswa penulis pernah menjadi asisten praktikum Biokimia

untuk Fakultas Pertanian dan Jurusan Biologi Fakultas MIPA, serta menjadi

asisten mikrobiologi untuk Jurusan Analis Kimia Fakultas MIPA. Pada tahun

2008 penulis melakukan Praktek Kerja Lapangan di laboratorium Biokimia dan

Laboratorium Instrumentasi Jurusan Kimia FMIPA Unila, dan pada tahun 2010,

penulis memulai penelitiannya di tempat yang sama. Selama di Universitas,

penulis aktif dibeberapa organisasi internal diantaranya Rohis FMIPA sebagai

Kepala Biro Keputrian kepengurusan 2008/2009 dan Himaki sebagai anggota

Motto

niscaya Allah akan meninggikan orang-orang

yang beriman di antaramu dan orang-orang yang

diberi ilmu pengetahuan beberapa derajat. Dan

Allah Maha Mengetahui apa yang kamu kerjakan.

(QS. Al Mujaadilah : 11)

Tanda akal seseorang itu adalah pekerjaannya, dan

tanda ilmu seseorang itu adalah perkataannya.

(Imam Gozhali)

Orang yang luar biasa tidak pernah memperhatikan

hasil, tetapi mereka hanya memikirkan dan

mengerjakan prosesnya

(Asep Hilman)

If you want something you ve never had, you must

be willing to do something you ve never done

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kotaagung, Tanggamus, Lampung pada tanggal 3 Mei 1988,

sebagai anak kedua dari tiga bersaudara, putri dari Bapak alm. Haryanto dan Ibu

Yuliana, S.Pd.

Jenjang pendidikan diawali dari Sekolah Dasar (SD) di SD Negeri 1 Pasar

Madang diselesaikan pada tahun 2000. Sekolah Menengah Pertama (SMP) di

SMP Negeri 1 Kotaagung diselesaikan pada tahun 2003, dan Sekolah Menengah

Atas (SMA) di SMA Negeri Alkautsar Bandar Lampung diselesaikan pada tahun

2006. Tahun 2006, penulis terdaftar sebagai Mahasiswa Jurusan Kimia FMIPA

Unila melalui jalur PKAB (Penelusuran Kemampuan Akademik dan Bakat).

Selama menjadi mahasiswa penulis pernah menjadi asisten praktikum Biokimia

untuk Fakultas Pertanian dan Jurusan Biologi Fakultas MIPA, serta menjadi

asisten mikrobiologi untuk Jurusan Analis Kimia Fakultas MIPA. Pada tahun

2008 penulis melakukan Praktek Kerja Lapangan di laboratorium Biokimia dan

Laboratorium Instrumentasi Jurusan Kimia FMIPA Unila, dan pada tahun 2010,

penulis memulai penelitiannya di tempat yang sama. Selama di Universitas,

penulis aktif dibeberapa organisasi internal diantaranya Rohis FMIPA sebagai

Kepala Biro Keputrian kepengurusan 2008/2009 dan Himaki sebagai anggota