PENGARUH BEBERAPA FAKTOR PADA MEDIUM KULTUR TERHADAP PRODUKSI ENZIM CGT-ase DARI BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL LTi-21-3

(Skripsi)

Oleh Adek Purnawati

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2012

THE PRODUCTION OF CGT-ase FROM LOCAL ISOLATE’S AMYLOLITIC BACTERIA STRAIN LTi-21-3

By

Adek Purnawati

Microorganisms are potential resources for the production of various enzymes as well as its application on industries. Enzyme is a functional protein that enable to bind and catalyze a substrate biochemically into new compounds or products. In this research, a local amylolytic isolates named as LTi-21-3, which has been isolated by a previous researcher was used as ase producing bacteria. CGT-ase enzymes are enzymes that enable to convert starch into cyclodextrins. Optimization of CGT-ase enzyme production was carried out by varying the carbon’ssource (soluble starch, corn starch, sweet potato starch, sago starch, and

the addition of maltose), nitrogen’ssources (yeast extract, urea and NH4Cl), metal ion’ssources (CuSO4, ZnSO4 , FeSO4, and CaCl2) and the pH (on pH 7, 8, 9 and 11) of the modified culture medium Horikoshi's II. The results showed that the optimum conditions for production of the enzyme was on a culture medium containing cassava starch, NH4Cl, MgSO4 at pH 8 with optimum incubation time for 36 hours. In these conditions were obtained the value of the unit and specific activity are 546,86 U/mL and 595,72 U/mg, respectively. The specific activity on this condition was approximately 253% higher than that of the modified Horikoshi's II medium without treatment.

TERHADAP PRODUKSI ENZIM CGT-ase

DARI BAKTERI AMILOLITIK ISOLAT LOKAL LTi-21-3

Oleh

Adek Purnawati

Mikroorganisme merupakan sumber yang potensial sebagai bahan baku untuk produksi enzim. Saat ini, enzim dalam bentuk hasil isolasi maupun langsung dari mikroorganisme dapat dimanfaatkan dalam berbagai bidang industri. Enzim merupakan protein fungsional yang dapat berikatan dengan suatu substrat spesifik untuk mengkatalisasi reaksi biokimia menjadi suatu senyawa baru yang disebut produk. Pada penelitian ini, digunakan bakteri amilolitik isolat lokal LTi-21-3 yang telah berhasil diisolasi oleh peneliti sebelumnya, yang merupakan bakteri penghasil enzim CGT-ase. Enzim CGT-ase yaitu enzim ekstraseluler yang dapat mengubah pati menjadi siklodekstrin. Optimasi produksi enzim CGT-ase ini dilakukan dengan cara memvariasikan: sumber karbon (pati soluble, pati jagung,

pati ubi jalar, pati sagu, dan penambahan maltosa), sumber nitrogen (ekstrak ragi, urea dan NH4Cl), sumber ion logam (CuSO4, ZnSO4, FeSO4 dan CaCl2) dan variasi pH (7, 8, 9 dan 11) pada medium kultur Horikoshi’s II termodifikasi.

Hasil penelitian yang diperoleh menunjukkan bahwa kondisi optimum untuk produksi enzim CGT-ase dari isolat LTi-21-3 yaitu pada medium kultur yang mengandung pati singkong, NH4Cl, MgSO4 pada pH 8 dengan waktu inkubasi optimum ada pada 36 jam. Pada kondisi tersebut diperoleh nilai aktivitas unit dan spesifik secara berurutan yaitu 546,86 U/mL dan 595,72 U/mg. Persentase aktivitas spesifik pada kondisi optimum ini sekitar 253% lebih tinggi jika

dibandingkan dengan medium Horikoshi’s II termodifikasi tanpa perlakuan.

1. Tim Penguji

Ketua :Mulyono, Ph.D. …………....

Sekretaris :Dra. Aspita Laila, M.S. …………....

Penguji

Bukan Pembimbing :Prof. Dr. Tati Suhartati, M.S. …………....

2. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Prof. Suharso, Ph.D.

NIP 196905301995121001

Jadilah kamu manusia yang pada kelahiranmu semua orang

tertawa bahagia, tetapi hanya kamu sendiri yang menangis; dan

pada kematianmu semua orang menangis sedih, tetapi hanya kamu

sendiri yang tersenyum.

(Mahatma Gandhi)

Kebanyakan dari kita tidak mensyukuri apa yang sudah kita

miliki, tetapi kita selalu menyesali apa yang belum kita capai.

(Schopenhauer)

Ilmu itu lebih baik daripada harta. Ilmu akan menjaga engkau

dan engkau menjaga harta. Ilmu itu penghukum (hakim)

sedangkan harta terhukum. Kalau harta itu akan berkurang

apabila dibelanjakan, tetapi ilmu akan bertambah apabila

dibelanjakan.

(Sayidina Ali bin Abi Thalib)

Boleh jadi kamu membenci sesuatu padahal ia amat baik bagimu

dan boleh jadi kamu menyukai sesuatu padahal ia amat buruk

bagimu. Allah mengetahui sedang kamu tidak mengetahui.

(Q.S. Al-baqarah:256)

Dengan penuh rasa syukur dan bangga kupersembahkan karyaku ini sebagai bukti rasa cintaku kepada:

Allah SWT yang telah memberiku kemudahan dalam penyelesaian karya sederhana ini,

Kedua orang tuaku Bapak Mangsuri dan Ibu Sunarsih yang sangat ku cinta dan ku sayangi,

Kakak-kakakku tersayang

Siti Khotimah, Muhammad Khozin, Ahmad Jaelani dan Nita Komalasari, Segenap Keluarga besarku yang selalu mendoakan keberhasilanku,

Sahabat dan teman-temanku yang selalu berbagi kebahagiaan, Seseorang yang kelak akan mendampingiku,

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Perkembangan ilmu dan teknologi serta pendayagunaan enzim semakin meningkat dilihat dari segi diversifikasi maupun skala penggunaannya. Saat ini enzim dalam bentuk hasil isolasi maupun langsung dari mikroorganisme dapat digunakan dalam bidang produksi pangan. Selain itu, dapat juga digunakan pada produksi antibiotika, vitamin, asam-asam organik, etanol, tekstil, kertas, industri kulit, analisis biokimia, kedokteran dan untuk penanganan limbah industri (Judoamidjojo et al., 1989).

Enzim merupakan protein khusus yang dapat bergabung dengan suatu substrat spesifik untuk mengkatalisasi reaksi biokimia dari substrat tersebut (Maier

et al.,2000). Dalam reaksi tersebut enzim mengubah senyawa yang disebut

substrat menjadi bentuk suatu senyawa baru yang disebut produk. Enzim memiliki substrat spesifik dan reaksi kimia yang spesifik untuk dikatalisnya (Palmer, 1985). Aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu, pH dari lingkungan tempat enzim bekerja, konsentrasi substrat, aktivator dan inhibitor enzim.

Pada penelitian ini, digunakan bakteri amilolitik yang telah berhasil diisolasi oleh peneliti sebelumnya yaitu bakteri amilolitik isolat lokal LTi-21-3 yang berasal dari limbah singkong yang masih mengandung pati. Bakteri amilolitik

merupakan mikroorganisme yang mampu memecah pati menjadi senyawa yang lebih sederhana. Kebanyakan mikroorganisme amilolitik tumbuh subur pada bahan pangan yang banyak mengandung pati atau karbohidrat, misalnya pada berbagai jenis tepung. Siklodekstrin pada umumnya diproduksi dari pati menggunakan enzim CGT-ase (Leeet al.,1992).

Siklodekstrin merupakan oligosakarida non pereduksi produk pati dengan struktur kimia berbentuk cincin, dan terbentuk melalui proses siklisasi oleh aktivitas CGT-ase (Cyclodextrin Glycocyltransferase) (Szejtli, 1988; Schmid et al., 1989; Tonkova, 1998). Berdasarkan jumlah glukosa yang menyusunnya

siklodekstrin dibedakan atas α-siklodekstrin (6 unit glukosa), β-siklodekstrin

(7 unit glukosa), dan γ-siklodekstrin (8 unit glukosa) (Szejtli, 1988; Tonkova, 1998).

Siklodekstrin dapat digunakan dalam berbagai industri, seperti pada industri kimia, farmasi, pangan dan kosmetika. Hal ini karena siklodekstrin

mempunyai sifat enkapsulasi, termasuk peningkatan kelarutan dan

perlindungan komponen kimia yang labil dari pengaruh oksidasi (Laga, 2001). Produk siklodekstrin yang dihasilkan dipengaruhi oleh jumlah amilosa dalam pati (Whistleret al., 1984).

Untuk memproduksi enzim yang memiliki aktivitas yang tinggi, maka perlu diperhatikan faktor-faktor yang penting seperti suhu, substrat, dan pH yang digunakan pada medium kultur (Suriawiria, 1990). Dalam penelitian ini, telah dilakukan optimasi produksi enzim CGT-ase dari bakteri amilolitik isolat lokal

LTi-21-3 dengan cara memvariasikan sumber karbon, nitrogen, ion logam dan pH pada medium kultur.

Dengan ini diharapkan dapat diketahui kondisi yang optimum bagi bakteri amilolitik isolat lokal LTi-21-3 untuk menghasilkan enzim CGT-ase yang dapat mengkatalisis pembentukan siklodekstrin.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah :

1. Mempelajari pengaruh pemberian variasi sumber karbon, nitrogen, ion logam dan pH pada medium kultur terhadap bakteri amilolitik isolat lokal LTi-21-3 dalam memproduksi enzim CGT-ase.

2. Mengetahui kondisi kultur yang optimum dari bakteri amilolitik isolat lokal LTi-21-3 untuk memproduksi enzim CGT-ase yang memiliki aktivitas unit dan spesifik yang tinggi.

C. Manfaat Penelitian

Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini antara lain yaitu mengetahui kondisi yang optimum dari bakteri amilolitik isolat lokal LTi-21-3 dalam memproduksi enzim CGT-ase yang dapat mengkatalisis pembentukan siklodekstrin. Siklodekstrin yang dihasilkan dapat dilakukan penelitian lanjutan untuk dimanfaatkan dalam pembuatan obat-obatan.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Mikroorganisme

Populasi mikroorganisme yang ada di alam sekitar kita ini sangatlah besar dan cukup kompleks. Beratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita. Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup besar. Sebagai contoh, sekali kita bersin dapat menebarkan beribu- ribu mikroorganisme. Satu gram tinja dapat mengandung jutaan bakteri. Alam di sekitar kita, baik itu tanah, air, maupun udara juga dihuni oleh kumpulan mikroorganisme. Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini, atau yang biasanya dikenal dengan istilah biakan campuran, menjadi spesies yang berbeda- beda yang dikenal dengan istilah biakan murni. Biakan murni ini terdiri dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk (Pelczar, 1986).

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunannya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anorganik ditambah sumber karbon organik seperti

gula. Sedangkan mikroorganisme lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya (Volk dan Wheeler,1993).

Mikroorganisme adalah sumber yang potensial sebagai bahan baku untuk produksi enzim. Hal ini disebabkan karena beberapa faktor yaitu: ekonomis, karena dapat dihasilkan dalam waktu yang cukup pendek dan media yang cukup murah, kondisi reaksi seperti pH dan temperatur mudah diatur, dan peningkatan produksi enzimnya dapat dikondisikan dengan cara penambahan induser tertentu (Wang, 1979).

B. Bakteri

Bakteri, berasal dari kata Latinbacterium, adalah kelompok raksasa dari

organisme hidup. Ukuran bakteri sangatlah kecil (mikroskopik) dan

kebanyakan uniselular, dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpanucleus

(inti sel),cytoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas.

Bakteri digolongkan menjadi dua, yaitu bakteri yang menguntungkan dan bakteri yang merugikan. Bakteri tersebar di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Bakteri rata-rata mengandung 40-70% protein, 13-34% asam nukleat, 10-30% lipid (angka-angka ini menunjukkan persen berat kering) (Suhartono, 1989).

Ada tiga bentuk dasar bakteri, yaitu bentuk bulat atau kokus, bentuk batang silindris, bentuk lengkung atau vibri. Bentuk bulat atau kokus dapat dibedakan dalam mikrokokus, diplokokus, streptokokus, tetrakokus, sarsina dan

stafilokokus. Bakteri berbentuk batang dapat dibedakan ke dalam bentuk batang panjang dan batang pendek dengan ujung datar atau lengkung. Bakteri berbentuk lengkung dapat dibagi menjadi bentuk koma (vibrio), jika

lengkungnya kurang dari setengah lingkaran. Bentuk bakteri dipengaruhi oleh umur dan syarat pertumbuhan tertentu (Hidayatet al., 2006).

1. Nutrien untuk Pertumbuhan Bakteri

Bakteri memerlukan nutrien dengan komposisi tertentu untuk tumbuh dan membelah diri. Kebutuhan nutrien meliputi unsur makroesensial dan unsur mikroesensial. Unsur makro digunakan oleh mikroba dalam metabolisme sel, sedangkan unsur mikro digunakan untuk mengaktifkan enzim

(Suhartono, 1989).

Organisme hidup memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya. Substansi kimia organik dan inorganik diperoleh dari lingkungan dalam berbagai macam bentuk. Nutrien diambil dari lingkungan kemudian

ditransformasikan melalui membran plasma menuju sel. Di sel beberapa nutrisi diolah menghasilkan energi yang digunakan dalam proses seluler (Lim, 1998).

Jasad renik heterotrof membutuhkan nutrien untuk kehidupan dan

pertumbuhannya, yakni sebagai: (1) sumber karbon, (2) sumber nitrogen, (3) sumber energi, (4) dan faktor pertumbuhan, yakni mineral dan vitamin. Nutrien tersebut dibutuhkan untuk membentuk energi dan menyusun komponen-komponen sel. Setiap jasad renik bervariasi dalam kebutuhannya akan zat-zat nutrisi tersebut.

Ada tujuh komponen utama yang dibutuhkan semua makhluk hidup, yaitu karbon, oksigen, nitrogen, hidrogen, fosfor, sulfur dan kalium. Untuk kebutuhan akan sumber karbon dipenuhi oleh adanya gula, pati, serta karbohidrat lainnya. Ada dua macam mikronutrien yakni mikronutrien organik dan mikronutrien anorganik. Zat-zat yang bertindak sebagai mikronutrien organik pada beberapa asam amino (triptofan) dan pada beberapa komponen-komponen DNA dan RNA (purin dan pirimidin). Beberapa unsur logam yang termasuk dalam mikronutrien anorganik adalah Co, Mo, Cu, Zn. Unsur logam ini sangat diperlukan untuk kehidupan sel meskipun jumlahnya sangat sedikit (Irianto, 2006).

Menurut Waluyo (2005), peran utama nutrien adalah sebagai sumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai akseptor elektron dalam reaksi

bioenergetik (reaksi yang menghasilkan energi). Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukan terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon, sumber akseptor elektron, sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan

nitrogen. “Selain itu, secara umum nutrien dalam media pembenihan harus mengandung seluruh elemen yang penting untuk sintesis biologik organisme

baru (Jawetz, 2001).”

a. Air

Air merupakan komponen utama sel mikroba dan medium. Fungsi air adalah sebagai sumber oksigen untuk bahan organik sel pada respirasi. Selain itu air berfungsi sebagai pelarut dan alat pengangkut dalam metabolisme.

b. Sumber Energi

Ada beberapa sumber energi untuk mikroba yaitu senyawa organik atau anorganik yang dapat dioksidasi dan cahaya terutama cahaya matahari.

c. Sumber Karbon

Sumber karbon untuk mikroba dapat berbentuk senyawa organik maupun anorganik. Senyawa organik meliputi karbohidrat, lemak, protein, asam amino, asam organik, garam asam organik, polialkohol, dan sebagainya. Senyawa anorganik misalnya karbonat dan gas CO2yang merupakan sumber karbon utama terutama untuk tumbuhan tingkat tinggi.

d. Sumber Akseptor Elektron

Proses oksidasi biologi merupakan proses pengambilan dan pemindahan elektron dari substrat. Karena elektron dalam sel tidak berada dalam bentuk bebas, maka harus ada suatu zat yang dapat menangkap elektron tersebut. Penangkap elektron ini disebut akseptor elektron. Akseptor elektron ialah agensia pengoksidasi. Pada mikrobia yang dapat berfungsi sebagai akseptor elektron ialah O2, senyawa organik, NO3-, NO2-, N2O, SO42-, CO2, dan Fe3+.

e. Sumber Mineral

Mineral merupakan bagian dari sel. Unsur penyusun utama sel ialah C, O, N, H, dan P. Unsur mineral lainnya yang diperlukan sel ialah K, Ca, Mg, Na, S, Cl. Unsur mineral yang digunakan dalam jumlah sangat sedikit ialah Fe, Mn, Co, Cu, Bo, Zn, Mo, Al, Ni, Va, Sc, Si, Tu, dan sebagainya yang tidak diperlukan jasad. Unsur yang digunakan dalam

jumlah besar disebut unsur makro, dalam jumlah sedang unsur oligo, dan dalam jumlah sangat sedikit unsur mikro. Unsur mikro sering terdapat sebagai ikutan (impurities) pada garam unsur makro, dan dapat masuk ke

dalam medium lewat kontaminasi gelas tempatnya atau lewat partikel debu. Selain berfungsi sebagai penyusun sel, unsur mineral juga berfungsi untuk mengatur tekanan osmosis, kadar ion H+_(kemasaman, pH), dan potensial oksidasi reduksi (redox potential) medium.

f. Faktor Tumbuh

Faktor tumbuh ialah senyawa organik yang sangat diperlukan untuk pertumbuhan (sebagai prekursor, atau penyusun bahan sel) dan senyawa ini tidak dapat disintesis dari sumber karbon yang sederhana. Faktor tumbuh sering juga disebut zat tumbuh dan hanya diperlukan dalam jumlah sangat sedikit. Berdasarkan struktur dan fungsinya dalam metabolisme, faktor tumbuh digolongkan menjadi asam amino, sebagai penyusun protein; basa purin dan pirimidin, sebagai penyusun asam nukleat; dan vitamin sebagai gugus prostetis atau bagian aktif dari enzim.

g. Sumber Nitrogen

Mikroba dapat menggunakan nitrogen dalam bentuk amonium, nitrat, asam amino, protein, dan sebagainya. Jenis senyawa nitrogen yang digunakan tergantung pada jenis jasadnya. Beberapa mikroba dapat menggunakan nitrogen dalam bentuk gas N2(zat lemas) udara. Mikroba ini disebut mikrobia penambat nitrogen.

Untuk mendapatkan bakteri yang potensial dilakukan dengan penapisan mikroorganisme dari lingkungan. Umumnya isolat bakteri yang diperoleh sesuai dengan lingkungan tempat hidupnya. Hal ini dikarenakan kondisi lingkungan tersebut biasanya digunakan bakteri sebagai substrat utamanya. Misalnya, bakteri amilolitik dapat diisolasi dari sampel yang berasal dari limbah pengolahan singkong, limbah sayur (Chakrabarty and Sen, 1984), rumen (Freer, 1993), serta hasil fermentasi ikan dan bahan makanan dari beras (Olympiaet al., 1995).

2. Fase Pertumbuhan Bakteri

Suatu mikroorganisme mempunyai siklus pertumbuhan tertentu tergantung produk yang akan dihasilkan. Fase pertumbuhan bakteri dapat dibagi menjadi 4 fase, yaitu fase lag, fase logaritma (eksponensial), fase stasioner dan fase kematian. Fase lag merupakan fase penyesuaian bakteri dengan lingkungan yang baru. Lama fase lag pada bakteri sangat bervariasi, tergantung pada komposisi media, pH, suhu, aerasi, jumlah sel pada

inokulum awal dan sifat fisiologis mikroorganisme pada media sebelumnya. Ketika sel telah menyesuaikan diri dengan lingkungan yang baru maka sel mulai membelah hingga mencapai populasi yang maksimum. Fase ini disebut fase logaritma atau fase eksponensial.

Fase eksponensial ditandai dengan terjadinya periode pertumbuhan yang cepat. Variasi derajat pertumbuhan bakteri pada fase eksponensial ini sangat dipengaruhi oleh sifat genetik yang diturunkannya. Selain itu, derajat pertumbuhan juga dipengaruhi oleh kadar nutrien dalam media, suhu

inkubasi, kondisi pH dan aerasi. Ketika derajat pertumbuhan bakteri telah menghasilkan populasi yang maksimum, maka akan terjadi keseimbangan antara jumlah sel yang mati dan jumlah sel yang hidup.

Fase stasioner terjadi pada saat laju pertumbuhan bakteri sama dengan laju kematiannya, sehingga jumlah bakteri keseluruhan akan tetap.

Keseimbangan jumlah keseluruhan bakteri ini terjadi karena adanya

pengurangan derajat pembelahan sel. Hal ini disebabkan oleh kadar nutrisi yang berkurang dan terjadi akumulasi produk toksik sehingga mengganggu pembelahan sel. Fase stasioner ini dilanjutkan dengan fase kematian yang ditandai dengan peningkatan laju kematian yang melampaui laju

pertumbuhan, sehingga secara keseluruhan terjadi penurunan populasi bakteri (Volk dan Wheeler, 1993).

C. Amilum

Amilum atau dalam bahasa sehari-hari disebut pati terdapat pada umbi, daun, batang dan biji-bijian (Poedjiadi, 1994). Pati (C6H10O5)nadalah homopolimer

glukosa dengan ikatan α-glikosidik yang merupakan rantai gula yang panjang. Sifat berbagai macam pati tidak sama, tergantung dari panjang rantai C dan cabang rantai molekul. Pati terdiri dari dua fraksi yang dapat dipisahkan dengan air panas. Fraksi terlarut disebut amilosa dan fraksi tidak larut disebut amilopektin (Winarno, 1986). Berbagai macam pati ditemukan di alam karena dapat disintesis oleh berbagai macam tumbuhan. Setiap macam pati memiliki bentuk partikel atau granula yang berbeda, dan secara mikroskopis dipakai

untuk membedakan berbagai pati alamiah. Pati terbagi menjadi dua golongan yaitu pertama adalah amilosa (15-20%) yang merupakan rantai panjang tidak bercabang yang terdiri dari molekul-molekul α-D-glukopiranosa yang

bersambungan dengan ikatan α-1,4. Amilosa terdiri atas 250-300 unit D-glukosa yang terikat dengan ikatan α-1,4-glikosidik, jadi molekulnya merupakan rantai terbuka. Kedua adalah amilopektin (80-85%) yang

merupakan rantai bercabang sebanyak 20-30 molekul α-D-glukopiranosa yang

bersambungan dengan ikatan α-1,4 dan α-1,6. Adanya ikatan α-1,6-glikosidik ini menyebabkan terjadinya cabang, sehingga molekul amilopektin berbentuk rantai terbuka dan bercabang (Poedjiadi, 1994). Struktur amilosa dan

amilopektin dapat dilihat pada Gambar 1.

(B) Amilopektin

Gambar 1.Struktur kimia dari (A) Amilosa dan (B) Amilopektin

Amilum dapat dihidrolisis sempurna dengan menggunakan asam sehingga menghasilkan glukosa. Hidrolisis juga dapat dilakukan dengan bantuan enzim amilase. Pada reaksi hidrolisis parsial, amilum terpecah menjadi molekul-molekul yang lebih kecil yang dikenal dengan nama dekstrin. Jadi dekstrin adalah hasil antara pada proses hidrolisis amilum sebelum terbentuk maltosa (Poedjiadi, 1994). Untuk mengetahui adanya pati maka dilakukan pengujian dengan menggunakan larutan iodium (I2dalam KI). Bila terdapat amilosa, polimer-polimer glukosa yang lebih besar dari 20 maka akan menghasilkan warna biru. Bila polimer-polimer glukosa kurang dari 20 maka akan menghasilkan warna merah. Dekstrin dengan polimer enam, tujuh, dan delapan akan memberikan warna coklat. Polimer yang lebih kecil dari lima tidak memberikan warna dengan iodium (Winarno, 1986).

Dalam kehidupan manusia amilum berperan sebagai sumber makanan

penghasil energi utama dari golongan karbohidrat, di samping itu amilum juga dapat berperan sebagai bahan aditif pada proses pengolahan makanan,

misalnya sebagai penstabil dalam proses pembuatan puding. Amilum juga berperan dalam pembuatan sirup dan pemanis buatan seperti sakarin. Dalam bidang non makanan, amilum digunakan untuk bahan baku dalam proses pembuatan kertas, pakaian dari katun, industri cat, maupun untuk produksi hidrogen. Tabel 1. di bawah ini menunjukkan peran amilum di berbagai bidang industri.

Tabel 1.Penggunaan amilum di bidang industri (Liu, 2005)

Jenis Industri Penggunaan Amilum/Amilum Termodifikasi

Makanan

Bahan Perekat Kertas dan Papan Tekstil

Farmasi

Pengeboran Minyak Detergen

Kimia Pertanian

Plastik Kosmetik Purifikasi Bidang Medis

Pengental, pelapis makanan, film makanan

Pembuat lem

Kertas penjilid, pembungkus, pengepak Dalam prosessizing,finishingdan printing

Kapsul obat, bahan pelarut obat Modifikasi pengental

Surfaktan, bahan pensuspensi, bahan pemutih, aktivator pemutih

Pembungkus biji, pembungkus pestisida benang pintal

Pembungkus makananfiller

Bedak dantalk

Flokulan

Scaffold,plasma eksterder, produk

absorben untuk sanitasi

D. Enzim

Enzim merupakan katalisator protein yang mempercepat reaksi kimia dalam makhluk hidup atau dalam sistem biologik. Sebagai protein, enzim memiliki sifat-sifat umum protein, seperti enzim terdenaturasi pada suhu tinggi atau kondisi ekstrim lainnya. Beberapa oksidator, keadaan polaritas larutan, tekanan osmotik yang abnormal juga dapat menghambat kerja enzim (Suhartono, 1989).

Menurut Page (1997), sebagai katalis enzim adalah satu-satunya dibanding dengan katalis-katalis anorganik atau organik sederhana. Sifat-sifat katalitik dari enzim termasuk hal-hal berikut:

1. Enzim meningkatkan laju reaksi pada kondisi biasa (fisiologik) dari tekanan, suhu, dan pH. Hal ini merupakan keadaan yang jarang dengan katalis-katalis lain.

2. Enzim berfungsi dengan selektivitas dan spesifisitas bertingkat luar biasa tinggi terhadap reaktan yang dikerjakan dan jenis reaksi yang

dikatalisasikan.

3. Enzim memberikan peningkatan laju reaksi yang luar biasa dibanding dengan katalis biasa.

Peranan enzim sebagai biokatalisator dalam industri semakin meningkat seiring dengan pesatnya perkembangan industri, khususnya industri makanan,

minuman, industri tekstil, industri kulit dan industri kertas. Hal ini disebabkan karena enzim bersifat sangat spesifik dibandingkan dengan katalis anorganik. Selain itu, enzim bekerja sangat efisien, bekerja pada pH yang relatif netral dan suhu yang relatif rendah, aman, mudah dikontrol, dapat menggantikan bahan kimia yang berbahaya, dan dapat didegradasi secara biologis (Page, 1997).

Klasifikasi enzim secara internasional berdasarkan atas reaksi yang dikatalisis antara lain:

1. Oksidoreduktase, mengkatalisis berbagai macam reaksi oksidasi reduksi serta sering menggunakan koenzim seperti NAD, NADP, FAD, atau lipoleat sebagai akseptor hidrogen.

2. Transferase, mengkatalisis berbagai jenis transfer kelompok seperti aminotransferase, karnitin asil transferase, dan transkarboksilase.

3. Hidrolase, mengkatalisis pembelahan ikatan antara karbon dan beberapa atom lain dengan adanya penambahan air.

4. Liase, mengkatalisis pemecahan ikatan karbon-karbon, karbon sulfur dan karbon nitrogen tertentu.

5. Isomerase, mengkatalisis isomer optik dan geometrik dan oksidasi reduksi intramolekuler tertentu.

6. Ligase, mengkatalisis pembentukan ikatan antara karbon dan oksigen (Lehninger, 1997).

Semua enzim adalah protein, dan aktivitas katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai protein. Enzim seperti protein lain, mempunyai berat molekul berkisar dari kira-kira 12.000 sampai 1 juta. Oleh karena itu, enzim berukuran amat besar dibandingkan dengan substrat atau gugus

fungsional targetnya. Penataan tertentu pada rantai samping asam amino suatu enzim di sisi aktifnya menentukan tipe molekul yang dapat terikat dan bereaksi di situ. Biasanya ada sekitar lima rantai samping seperti itu dalam enzim apapun. Selain itu, banyak enzim yang molekul-molekul nonprotein kecil yang terhubung dengan sisi aktif atau didekatnya. Molekul-molekul enzim ini disebut kofaktor atau koenzim (Ngili, 2009).

Beberapa enzim memerlukan kofaktor atau koenzim untuk aktivitas

katalitiknya, dan enzim lain mungkin membutuhkan koenzim maupun satu atau lebih ion logam untuk aktivitas katalitiknya. Bagian haloenzim (koenzim dan

ion) bersifat stabil sewaktu pemanasan, sedangkan bagian apoenzim (protein) terdenaturasi oleh pemanasan (Poedjiadi dan Supriyanti, 1994).

1. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim a. Suhu

Pengaruh suhu sangat menentukan aktivitas enzim pada waktu mengkatalisa suatu reaksi. Seluruh enzim memerlukan jumlah panas tertentu untuk dapat aktif. Sejalan dengan meningkatnya suhu, makin meningkat pula aktivitas enzim. Secara umum, setiap peningkatan 10oC di atas suhu minimum, aktivitas enzim akan meningkat sebanyak dua kali lipat. Aktivitas enzim meningkat pada kecepatan ini hingga mencapai kondisi optimum. Peningkatan suhu yang melebihi suhu optimumnya menyebabkan lemahnya ikatan di dalam enzim secara struktural (Pratiwi, 2008). Pada suhu maksimum enzim akan terdenaturasi karena struktur protein terbuka dan gugus non polar yang berada di dalam molekul menjadi terbuka keluar, kelarutan protein di dalam air yang polar menjadi turun, sehingga aktivitas enzim juga akan turun (Lehninger, 1997).

b. Konsentrasi Substrat

Aktivitas enzim dipengaruhi oleh konsentrasi substrat. Pada konsentrasi substrat rendah, enzim tidak mencapai konversi maksimum akibat sulitnya enzim menemukan substrat yang akan direaksikan. Seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat, kecepatan reaksi juga akan meningkat akibat makin cepatnya substrat terikat pada enzim.

Peningkatan konsentrasi substrat pada titik jenuh tidak lagi dapat meningkatkan kecepatan laju reaksi (Pratiwi, 2008). Facilitation of

proximaty, atau kemudahan berdekatan yang disebut sebagai efek

keakraban, yang berarti bahwa laju reaksi antara dua molekul

ditingkatkan bila dalam larutan encer keduanya dijaga dalam jarak dekat dalam sisi aktif enzim, sehingga menaikkan konsentrasi efektif reaktan (Ngili, 2009).

c. pH

pH lingkungan juga berpengaruh terhadap kecepatan aktivitas enzim dalam mengkatalisis suatu reaksi. Hal ini disebabkan konsentrasi ion hidrogen mempengaruhi struktur tiga dimensi enzim dan aktivitasnya. Setiap enzim memiliki pH optimum yang dapat mengikat substrat dengan struktur tiga dimensi yang paling kondusif. Bila konsentrasi ion hidrogen berubah dari konsentrasi optimal, aktivitas enzim secara progesif hilang sampai pada akhirnya enzim menjadi tidak fungsional (Lehninger, 1997).

d. Inhibitor

Selain suhu, pH dan konsentrasi substrat, aktivitas enzim juga

dipengaruhi oleh ada tidaknya inhibitor. Jika terdapat pengurangan laju reaksi oleh suatu senyawa, senyawa tersebut dinamakan inhibitor. Inhibitor dapat bersaing dengan substrat dalam berikatan dengan enzim, sehingga menghalangi substrat terikat pada tapak aktif enzim (Poedjiadi dan Supriyanti, 1994). Peningkatan laju reaksi yang disebabkan oleh aktivator adalah kebalikan dari efek inhibitor.

2. Mekanisme Reaksi Enzim

Enzim bekerja dengan dua cara, yaitu menurut Teori Kunci-Gembok (Lock and Key Theory) dan Teori Kecocokan Induksi (Induced Fit Theory).

Mekanisme kerja enzim dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2.Mekanisme kerja reaksi enzim

Teori Kunci-Gembok (Lock and Key Theory) dikemukakan oleh Emil

Fisher yang menyatakan bahwa kerja enzim seperti kunci dan anak kunci, melalui hidrolisis senyawa gula dengan enzim invertase. Terjadinya reaksi antara substrat dengan enzim adalah karena adanya kesesuaian bentuk ruang antara substrat dengan sisi aktif (active site) dari enzim. Dengan

begitu sisi aktif enzim cenderung kaku. Substrat berperan sebagai kunci (key) dan sisi aktif (lock) berperan sebagai gembok. Substrat masuk ke

dalam sisi aktif sehingga terjadi kompleks enzim-substrat. Hubungan antara enzim dan substrat membentuk ikatan yang lemah. Pada saat ikatan kompleks enzim-substrat terputus, produk hasil reaksi akan dilepas dan enzim akan kembali pada konfigurasi semula.

Teori Kecocokan Induksi (Induced Fit Theory) dikemukakan oleh Daniel

Koshland yang menyatakan bahwa ini sisi aktif tidak bersifat kaku tetapi Enzim

Substrat Sisi Aktif Enzim

(Active Site)

Enzim

Sisi Aktif Enzim (Active Site)

Substrat

Teori Kunci Gembok Sisi Aktif cenderung kaku

Teori Kecocokan Induksi Sisi Aktif lebih fleksibel

lebih fleksibel. Sisi aktif secara terus menerus berubah bentuknya sesuai dengan interaksi antara enzim dan substrat. Ketika substrat memasuki sisi aktif enzim, bentuk sisi aktif akan termodifikasi menyesuaikan bentuk substrat sehingga terbentuk kompleks enzim substrat. Sisi aktif akan terus berubah bentuknya sampai substrat terikat secara sepenuhnya, yang mana bentuk akhir dan muatan enzim ditentukan. Ketika substrat terikat pada enzim, sisi aktif enzim mengalami beberapa perubahan sehingga ikatan yang terbentuk antara enzim dan substrat menjadi menjadi lebih kuat. Interaksi antara enzim dan substrat disebutInduced fit(Shahib, 2005).

E. Enzim CGT-ase

Enzim CGT-ase yaitu enzim ekstraseluler yang dapat mengubah pati menjadi siklodekstrin (Tonkova, 1998). CGT-ase diklasifikasikan menjadi tiga tipe berdasarkan jenis-jenis siklodekstrin yang dihasilkan dari ikatan

α-1,4-glikosida seperti pati, melalui reaksi transglikosilasi intramolekuler, yaitu tipeBacillus maceransyang menghasilkan α-siklodekstrin, tipeBacillus

megateriumyang menghasilkan β-siklodekstrin, dan tipeBacillussp.

menghasilkan γ-siklodekstrin (Moriet al.,1994).

CGT-ase merupakan keluarga dari enzim α-amilase (Leemhuiset al., 2003).

CGT-ase memiliki berat molekul yang bervariasi dari 60-110 kDa dan terdiri dari 700 asam amino. Sebagian memerlukan kalsium sebagai agen pelindung terhadap denaturasi panas (Bovettoet al., 1992) dan CGT-ase alkalofilik

optimum pada pH 9-10 (Tao, 1991). Suhu maksimal untuk bakteri yang menghasilkan enzim CGT-ase antara 40ºC sampai 80ºC. Sebagian besar

CGT-ase diinhibisi kuat oleh Zn2+, Cu2+dan Fe2+ (Tonkova, 1998).

Reaksi katalisis oleh enzim CGT-ase dapat terjadi secara intramolekul

(siklisasi) dan antarmolekul (kopling, disproporsionasi), serta reaksi hidrolisis (Penninga, 1996). Reaksi siklisasi yaitu transfer residu gula akhir ke residu gula yang lain pada rantai oligosakarida yang sama untuk membentuk suatu senyawa siklik. Ini merupakan reaksi intramolekul pada pati yang

dihubungkan dengan ikatan α-1,4-glukan yang dikonversi ke dalam

siklodekstrin. Reaksi ini bersifatreversibledan cincin dapat dibuka oleh

CGT-ase untuk reaksi lebih lanjut (Hedges, 1992). Siklisasi adalah reaksi utama dari CGT-ase untuk menghasilkan siklodekstrin. Produksiα-siklodekstrin,

β-siklodekstrindan γ-siklodekstrin oleh enzim CGT-ase tergantung pada beberapa faktor seperti pemilihan substrat pati untuk degradasi enzim, karakteristik enzim, komposisi medium dan kondisi yang digunakan pada proses reaksi katalisis pati oleh enzim CGT-ase (Salvaet al.,1997). Reaksi

siklisasi enzim CGT-ase dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3.Reaksi siklisasi enzim CGT-ase (Van der Veenet al., 2000)

F. Siklodekstrin

Siklodekstrin adalah merupakan oligosakarida yang tersusun atas 6, 7 atau 8 unit glukosa anhidrat melalui ikatan (1-4) dengan membentuk struktur

melingkar seperti kue donat. Berdasarkan jumlah unit glukosa penyusun, siklodekstrin dipilah menjadi tiga, yaitu alfa (6 unit), beta (7 unit) dan gamma (8 unit). Cincin luar struktur siklodekstrin bersifat polar (hidrofilik) sedangkan bagian dalam rongga bersifat lebih nonpolar (hidrofobik) (Szetjli, 1982). Produk siklik dapat terbentuk secara kompleks inklusi dengan senyawaan anorganik maupun organik. Sifat ini menyebabkan siklodektrin banyak digunakan dalam berbagai industri seperti pangan, kosmetika, farmasi, agrokimia serta untuk penanganan polusi (Bender, 1977; Kaneto and Fumithasi, 1996; Szetjli, 1982).

Adapun struktur α-siklodekstrin, β-siklodekstrindan γ-siklodekstrin dapat dilihat pada Gambar 4 serta sifat-sifat siklodekstrin dapat dilihat pada Tabel 2.

Gambar 4.Strukturα-, β-dan γ-siklodekstrin (Van der Veenet al.,2000)

Tabel 2.Sifat-sifat siklodekstrin (Van der Veenet al.,2000)

Tipe Siklodekstrin

Karakteristik Alfa Beta Gamma

Berat molekul (g/mol) Monomer glukosa

Diameter rongga internal (Å)

Kelarutan dalam air (g/100mL:25°C) Tegangan permukaan (mN/m) Rentang lebur (°C)

Air kristalisasi

Molekul air dalam rongga

972 6 5 14,2

71 255-260

10,2 6

1135 7 6 1,85

71 255-265

13-15 11

1297 8 8 23,2

71 240-245

8-18 17

G. Pengujian Aktivitas Enzim CGT-ase

Pada uji aktivitas, larutan pati berperan sebagai substrat untuk enzim CGT-ase. Enzim ini akan mengurai pati menjadi siklodekstrin. Proses penguraian pati menjadi siklodekstrin, berlangsung saat inkubasi pada suhu 55°C selama 10 menit. Penghentian reaksi antara pati dengan enzim dilakukan dengan penambahan Na2CO3. Selanjutnya, ditambahkan larutan fenolftalein untuk mengetahui terbentuk kompleks siklodekstrin dengan fenolftalein dengan menunjukkan perubahan warna menjadi merah muda keunguan. Besarnya pengurangan pati dapat dideteksi dari menurunnya serapan larutan pada daerah

visible(campuran reaksi berwarna merah muda keunguan) dengan

spektrofotometerUV-Vis. Nilai serapan yang terukur pada spektrofotometer UV-Visdapat digunakan untuk menghitung besarnya aktivitas unit enzim

CGT-ase. Sedangkan satu unit enzim β-siklodekstrin didefinisikan sebagai

jumlah enzim yang dapat membentuk satu µmol β-siklodekstrin per menit di bawah kondisi kultur (Alves-Pradoet al., 2008).

H. Penentuan Kadar Protein

Penentuan kadar protein dengan metode Lowry didasarkan pada pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang berwarna ungu. Ini terjadi karena protein bereaksi dengan tembaga dalam lingkungan alkali yang mudah larut, kompleks Cu2+dengan ikatan peptida akan tereduksi menjadi Cu+. Lalu, Cu+ akan mereduksi folin-ciocalteu yang mengikat protein sekitar pH 10. Sehingga kompleks fosfomolibdat-fosfotungstat menghasilkanheteropolymolybdenum

dari warna kuning menjadi biru. Ini disebabkan karena oksidasi gugus

aromatik terkatalis Cu, sehingga menghasilkan kompleks berwarna biru dalam derajat yang berbeda tergantung pada komposisi triftofan dan tirosinnya. Karena itu, protein yang berbeda akan memberikan tingkat warna yang berbeda (Alexander and Griffith, 1993).

Metode ini merupakan metode relatif sederhana dengan biaya yang relatif murah juga. Tetapi juga mempunyai kelemahan yaitu sensitif terhadap perubahan pH dan konsentrasi protein yang rendah. Hal ini dapat diatasi dengan menggunakan volume sampel yang sangat kecil sehingga tidak mempengaruhi reaksi (Lowryet al.,1951).

I. Fenolftalein

Sifat fisik dan kimia dari fenolftalein:

(a) Gambaran: Putih atau kekuningan-putih, kristal triklinik (b) Titik leleh: 258-262oC

(c) Kelarutan: Praktis tidak larut dalam air; larut dalam dietil eter, etanol dan larutan cair alkali hidroksida, sangat sedikit larut dalam kloroform (d) Konstanta disosiasi: pKa 9,7 pada suhu 25oC

(Budavari, 1996).

Berikut struktur kimia dari fenolftalein(3,3-Bis(4-hidroksifenil)-1-(3H)-isobenzofuranon) yang terdapat pada Gambar 5.

III. METODOLOGI PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini telah dilakukan pada bulan April sampai dengan Juni 2012 di Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain adalah alat-alat gelas, Bunsen, kasa, kapas, spatula, rak tabung reaksi, jarum ose, autoklaf

(model S-90N),laminar air flow(CURMA model 9005-FL), neraca analitik,

inkubator,shaker incubator(Stuart SSL2),waterbath, sentrifuga, tabung

sentrifuga, mikropipet, pH indikator, dan spektrofotometerUV-Vis

(Cary Win UV 32).

Sedangkan bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah pati singkong, pati ubi jalar, pati jagung, pati sagu, maltosa, urea, NH4Cl, CuSO4, FeSO4, ZnSO4, CaCl2.2H2O, pepton, ekstrak ragi, K2HPO4, MgSO4.7H2O, fenolftalein (PP), metil jingga, agar, natrium karbonat (Na2CO3), NaCl, Na(K)-tartarat, CuSO4.5H2O, reagenfolin ciocelteau, patisoluble, natrium asetat, asam asetat, buffer asetat 0,1 M pH 5,5, fenolftalein 1 mM, spiritus,

pereaksi C, pereaksi D, alkohol, dan akuades. Sampel yang digunakan adalah bakteri isolat lokal LTi-21-3 yang telah diperoleh dari peneliti sebelumnya.

C. Prosedur Penelitian

1. Peremajaan Bakteri dan Produksi Enzim CGT-ase dari Isolat LTi-21-3

Kegiatan rutin yang dilakukan untuk peremajaan bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah :

a. Peremajaan Bakteri Isolat LTi-21-3

Bakteri isolat LTi-21-3diremajakan dalam medium Horikoshi’s II

termodifikasi yang memiliki komposisi 1 g pati singkong, 0,5 g pepton, 0,5 g ekstrak ragi, 0,1 g K2HPO4, 0,02 g MgSO4.7H2O, 0,03 g

fenolftalein, 0,01 g metil jingga dan 1,5 g agar. Kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan dilarutkan dalam 80 mL akuades disebut larutan I. Larutan I dipanaskan sampai larutan jernih sambil diaduk. Selanjutnya membuat larutan natrium karbonat (Na2CO3) 1% dengan cara menimbang 0,25 g Na2CO3dilarutkan dalam 25 ml akuades dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer disebut larutan II. Sejumlah akuades disiapkan dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer disebut larutan III. Larutan I, larutan II dan larutan III disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm selama 30 menit. Medium Horikoshi’s IItermodifikasi disiapkan dengan mencampurkan

larutan I sebanyak 80 mL, larutan II sebanyak 17 mL dan larutan III sebanyak 3 mL yang dilakukan di dalamlaminar air flow. Setelah

dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak ± 5 mL, dimiringkan dan didiamkan pada suhu kamar. Setelah media memadat dilakukan

inokulasi bakteri isolat LTi-21-3 tersebut pada media agar miring. Kemudian diinkubasi selama 3 hari dalam inkubator.

b. Pembuatan MediumNutrien Broth_(NB)

Medium NB dibuat dengan komposisi 0,3% (b/v) ekstrak ragi, 0,5% (b/v) pepton dan 0,5% (b/v) NaCl, kemudian disterilisasi. Medium NB

digunakan sebagai penyiapan inokulum (starter) dengan cara

menginokulasikan satu ose galur bakteri isolat LTi-21-3 dari agar miring yang telah berusia 3 hari ke dalam masing-masing Erlenmeyer yang berisi 5 mL medium NB. Setelah diinokulasi, kemudian diinkubasi dalamshaker incubatordengan kecepatan 105 rpm pada suhu 37ºC

selama 1 malam (overnight: 16-20 jam).

c. Pembuatan Medium Kultur dan Ekstraksi Enzim CGT-ase

Medium kultur menggunakan mediumHorikoshi’s IItermodifikasi

(Parket al.,1989) yang mengandung pati singkong, pepton, ekstrak ragi,

K2HPO4, MgSO4.7H2O, Na2CO3tanpa fenolftalein dan metil jingga dengan pH medium 10. Produksi enzim CGT-ase dilakukan dengan menambahkan 1% inokulum daristarterisolat LTi-21-3 diinokulasikan

ke dalam media kultur volume 50 mL dalam Erlenmeyer 250 mL. Kultur kemudian diinkubasi padashaker incubatordengan kecepatan 105 rpm,

berkala setiap 12 jam dengan cara sentrifugasi, untuk mendapatkan ekstrak kasar enzim CGT-ase.

2. Penentuan Pertumbuhan Sel

Penentuan pertumbuhan sel ini digunakan untuk mengetahui pertumbuhan dari sel bakteri. Sebanyak 0,3 mL kultur dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 2,7 mL akuades lalu diukur serapannya

menggunakan spektrofotometerUV-Vispada panjang gelombang 600 nm.

3. Uji Aktivitas Enzim CGT-ase

a. Pembuatan Larutan Buffer Asetat 0,1 M (pH 5,5)

Sebanyak 100 mL Na-asetat 0,1M dimasukkan ke dalam Erlenmeyer kemudian ditambahkan 0,2 mL asam asetat 0,1M.

b. Pereaksi CGT-ase(Kanekoet al.,1987; Alves-Pradoet al.,2008)

Pereaksi CGT-ase digunakan untuk menguji aktivitas ekstrak kasar enzim CGT-ase. Pereaksi CGT-ase yaitu larutan patisoluble1% (b/v).

Larutan patisolubledisiapkan dengan melarutkan 1 g patisolubleke

dalam 100 mL 0,1M buffer asetat pH 5,5 kemudian dipanaskan hingga larut.

c. Penentuan Aktivitas Enzim CGT-ase

Ekstrak kasar enzim CGT-ase yang diperoleh kemudian diuji aktivitas enzim CGT-ase nya. Sebanyak 100 µL larutan enzim ditambahkan 800 µL patisoluble1% yang disiapkan dalam buffer asetat 0,1M

pH 5,5 dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 4 mL Na2CO30,25M dan 0,1 mL

larutan fenolftalein 1 mM. Absorbansi diukur menggunakan

spektrofotometerUV-Vispada λ_maks550 nm. Kontrol dibuat dengan cara

menginaktifkan larutan enzim pada suhu 100ºC selama 30 menit, dan selanjutnya diperlakukan sama dengan sampel.

4. Uji Kadar Protein Enzim CGT-ase a. Pereaksi Lowry(Lowryet al., 1951)

Pereaksi Lowry terdiri atas 4 macam, yang meliputi Pereaksi A, B, C, dan D. Masing-masing pereaksi tersebut disiapkan sebagai berikut : Pereaksi A : 2 g Na2CO3dilarutkan dalam 100 mL NaOH 0,1N; Pereaksi B : 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% (b/v) ditambahkan 5 mL larutan Na(K)-tartarat 1% (b/v); Pereaksi C : 2 mL pereaksi B ditambah 100 mL pereaksi A; dan Pereaksi D : reagenFolin-Ciocelteaudiencerkan dengan

akuades 1:1. Larutan standar protein digunakan BSA (Bovine Serum Albumine) dengan konsentrasi 500-5000 ppm.

b. Penentuan Kadar Protein Enzim CGT-ase

Ekstrak kasar enzim CGT-ase yang diperoleh kemudian diuji kadar proteinnya. Sebanyak 0,1 mL larutan enzim ditambahkan 0,9 mL akuades lalu ditambahkan dengan 5 mL pereaksi C. Campuran diaduk secara merata dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar.

Kemudian ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna. Setelah itu didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Sebagai kontrol, larutan enzim diganti dengan akuades. Perlakuan kontrol sama dengan perlakuan pada sampel. Pengukuran

serapan dilakukan menggunakan spektrofotometerUV-Vispada λ_maks

600 nm.

5. Pengaruh Beberapa Faktor Pada Medium KulturHorikoshi’s II Termodifikasi Terhadap Pertumbuhan Bakteri dan Produksi Enzim CGT-ase dari Isolat LTi-21-3

a. Pengaruh Sumber Karbon

Pada medium kulturHorikoshi_{’s II termodifikasi}dengan sumber karbon

pati singkong dianggap sebagai medium kultur tanpa perlakuan variasi. Selanjutnya dilakukan variasi sumber karbon dengan cara mengganti pati singkong 1% (b/v) dengan patisoluble, pati jagung, pati ubi jalar, pati

sagu masing-masing 1% (b/v) dan penambahan maltosa 0,5% (b/v). Kemudian dilakukan perlakuan yang sama dengan prosedur 2, 3 bagian c dan 4 bagian b lalu hasilnya dibandingkan antara tanpa dan dengan perlakuan variasi.

b. Pengaruh Sumber Nitrogen

Sumber karbon terbaik kemudian dilakukan variasi terhadap sumber

nitrogen. Medium kultur Horikoshi’s IItermodifikasi yang mengandung

pepton sebagai sumber nitrogen dianggap sebagai tanpa perlakuan variasi. Selanjutnya dilakukan variasi sumber nitrogen dengan cara mengganti pepton 0,5% (b/v) dengan ekstrak ragi, urea dan NH4Cl masing-masing 0,5% (b/v). Kemudian dilakukan perlakuan yang sama dengan prosedur 2, 3 bagian c dan 4 bagian b lalu hasilnya dibandingkan antara tanpa dan dengan perlakuan variasi.

c. Pengaruh Sumber Ion Logam

Sumber karbon dan nitrogen terbaik kemudian dilakukan variasi terhadap sumber ion logam. Medium kultur Horikoshi’s IItermodifikasi yang

mengandung MgSO4sebagai sumber ion logam dianggap sebagai tanpa perlakuan variasi. Selanjutnya dilakukan variasi sumber ion logam dengan cara mengganti MgSO40,02% (b/v) dengan CuSO4,FeSO4, ZnSO4dan CaCl2masing-masing 0,02% (b/v). Kemudian dilakukan perlakuan yang sama dengan prosedur 2, 3 bagian c dan 4 bagian b lalu hasilnya dibandingkan antara tanpa dan dengan perlakuan variasi.

d. Pengaruh pH

Sumber karbon, nitrogen dan ion logam terbaik kemudian dilakukan variasi pH-nya. Medium kultur Horikoshi’s IItermodifikasi dengan pH

10 dianggap sebagai tanpa perlakuan variasi. Selanjutnya dilakukan variasi pH-nya yaitu pada pH 7, 8, 9 dan 11 dengan cara perbedaan penambahan larutan Na2CO3. Kemudian dilakukan perlakuan yang sama dengan prosedur 2, 3 bagian c dan 4 bagian b lalu hasilnya dibandingkan antara tanpa dan dengan perlakuan variasi.

6. Diagram Alir Prosedur Penelitian

-divariasikan sumber karbon pada medium Horikoshi’s II

termodifikasi

-divariasikan sumber nitrogen pada medium Horikoshi’s II

termodifikasi

-dilakukan seperti prosedur 4

--divariasikan sumber ion logam pada medium Horikoshi’s II

termodifikasi

-dilakukan seperti prosedur 4

--divariasikan pH pada medium Horikoshi’s IItermodifikasi

-dilakukan seperti prosedur 4

1. Peremajaan bakteri isolat LTi-21-3

2. Penanaman bakteri ke dalam media NB

3. Inokulasi dari media NB ke medium

Horikoshi’s IItermodifikasi

1.

4. Produksi Enzim CGT-ase - Penentuan pertumbuhan sel - Penentuan aktivitas enzim - Penentuan kadar protein

Medium Horikoshi’s IItermodifikasi dengan

sumber karbon terbaik

Medium Horikoshi’s IItermodifikasi dengan

sumber karbon dan nitrogen terbaik

Prosedur 1, 2, 3

Prosedur 1, 2, 3

Medium Horikoshi’s IItermodifikasi dengan

sumber karbon, nitrogen dan ion logam terbaik

Prosedur 1, 2, 3

Medium Horikoshi’s IItermodifikasi dengan

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengaruh Beberapa Faktor Pada Medium Kultur Terhadap Pertumbuhan Sel dan Produksi Enzim CGT-ase Isolat LTi-21-3

Pertumbuhan mikroorganisme tertentu sangat dipengaruhi oleh sumber karbon, nitrogen, ion logam dan pH, dari sumber-sumber tersebut ada yang berfungsi mengkatalisis jumlah sel dan jumlah produksi enzim dan ada juga yang berfungsi menghambat pertumbuhan dan produksi enzim.

Pada penelitian ini, variasi komposisi medium sumber karbon, nitrogen, ion logam dan pH terbaik dipilih berdasarkan aktivitas spesifik tertinggi dari isolat LTi-21-3. Aktivitas spesifik merupakan hasil bagi antara aktivitas unit

terhadap kadar protein. Dengan adanya aktivitas spesifik yang tinggi ini akan memudahkan dalam proses pemurnian enzim CGT-ase.

Hasil dari keseluruhan penelitian ini menunjukkan bahwa waktu optimum untuk menghasilkan enzim CGT-ase ekstraseluler untuk isolat LTi-21-3 ada pada 36 jam. Pada waktu optimum ini, enzim CGT-ase ekstraseluler banyak diproduksi oleh isolat bakteri. Hal ini ditunjukkan dengan aktivitas yang tinggi pada waktu inkubasi optimumnya.

1. Pengaruh Sumber Karbon

Menurut Posciet al.(1998), patisolubleadalah sumber karbon terbaik

untukB. firmusdanB. maceransdalam memproduksi enzim CGT-ase.

PadaB. circulansDF 9R sumber karbon terbaiknya yaitu 1,5% pati

singkong (Rossoet al., 2002) danBacillussp. TS1-1 alkalofilik dan

Bacillus stearothermophilusHR1 secara berurutan dengan 1,48% dan 1,5%

pati sagu (Mahatet al., 2004; Rahmanet al., 2004) dalam memproduksi

enzim CGT-ase. Menurut Ibrahimet al. (2005),BacillusG1 memiliki

aktivitas CGT-ase tertinggi ketika digunakan pati singkong sebagai sumber karbonnya.

Pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi medium sumber karbon dapat dilihat pada Gambar 6–11

berikut:

Gambar 6.Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s II dengan sumber karbonpati

singkong 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) Pati Singkong

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Gambar 7.Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s II dengan sumber karbonpati

soluble

Gambar 8.Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s II dengan sumber karbon pati jagung

Gambar 9.Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s II dengan sumber karbonpati ubi

jalar 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam)

PatiSoluble

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) Pati Jagung

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72 A

k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) Pati Ubi Jalar

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Gambar 10. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s II dengan sumber karbonpati

sagu

Gambar 11. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi dengan sumber

karbon penambahan maltosa

Pada Tabel 3. berikut dapat dilihat pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas spesifik dari isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi medium sumber karbon dengan waktu inkubasi optimum 36 jam. Data lengkap untuk pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas spesifik dari isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi medium sumber karbon dapat dilihat pada Lampiran 4.

0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72 A

k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) Pati Sagu

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) Penambahan Maltosa

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Tabel 3. Pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas

spesifik isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi medium sumber karbon dengan waktu inkubasi optimum 36 jam.

Medium Kultur

Pertumbuhan Sel OD600

Aktivitas Unit (U/mL) Kadar Protein (mg/mL) Aktivitas Spesifik (U/mg) Pati

Singkong 8,10 664,37 2,62 253,31

Pati

Soluble 7,37 630,19 3,09 203,68

Pati

Jagung 4,94 569,78 3,06 186,32

Pati

Ubi Jalar 7,89 606,95 2,78 218,12

Pati

Sagu 7,71 684,00 2,88 237,39

Penambahan

Maltosa 8,32 632,39 2,97 212,76

Tabel 4. Perbandingan pertumbuhan sel, aktivitas unit dan aktivitas

spesifik antara medium tanpa dan dengan perlakuan variasi komposisi medium sumber karbon

Jenis Perlakuan Medium Kultur Pertumbuhan Sel OD600 Aktivitas Unit (U/mL) Aktivitas Spesifik (U/mg) Nilai/Persentase (%)

OD AU AS

Tanpa Perlakuan

Variasi

Pati Singkong 8,10 664,37 253,31 100 100 100

Dengan Perlakuan

Variasi

PatiSoluble 7,37 630,19 203,68 91 95 80

Pati Jagung 4,94 569,78 186,32 61 86 74 Pati

Ubi Jalar 7,89 606,95 218,12 97 91 86 Pati Sagu 7,71 684,00 237,39 95 103 94 Penambahan

Maltosa 8,32 632,39 212,76 103 95 84 Keterangan: OD = pertumbuhan sel, AU = aktivitas unit dan

AS = aktivitas spesifik

Dari kedua data yang disajikan di atas, diketahui bahwa isolat LTi-21-3 menghasilkan aktivitas unit tertinggi pada sumber karbon pati sagu yaitu 684 U/mL. Untuk penambahan maltosa pada mediumHorikoshi’s II

termodifikasi hanya meningkatkan pertumbuhan sel tanpa diikuti dengan meningkatnya aktivitas unit dan aktivitas spesifiknya. Terdapatnya gula sederhana dalam substrat hidrolisat seperti glukosa, maltosa dan

maltotriosa, menyebabkan aktivitas CGT-ase tidak dapat mengkonversi substrat menjadi siklodekstrin secara optimal. Hal tersebut disebabkan gula sederhana menghambat reaksi siklisasi akibat terjadinya reaksi

couplingyaitu pemecahan cincin siklodekstrin sehingga terbentuk

maltooligosakarida yang menghasilkan maltooligosakarida lain dan gula pereduksi (Charoenlapet al.,2004; Burhanet al., 2005). Namun, pada

medium kultur Horikoshi’s II termodifikasiyang mengandung sumber

karbon pati singkong menghasilkan aktivitas unit dan aktivitas spesifik secara berurutan yaitu 664,37 U/mL dan 253,31 U/mg. Nilai aktivitas spesifik ini merupakan nilai tertinggi dari sumber karbon yang lainnya. Untuk itu, pada variasi komposisi medium sumber karbon dengan pati singkong dipilih sebagai sumber karbon terbaik.

2. Pengaruh Sumber Nitrogen

Ibrahimet al. (2005) mengamati adanya pengaruh sumber nitrogen

organik dan anorganik pada produksi CGT-ase dariBacillusG1. Mereka

menemukan bahwa produksi CGT-ase tertinggi ketika sumber nitrogen organik ada di dalam medium. Menurut Illiaset al. (2003) sumber

nitrogen terbaik untuk produksi CGT-ase adalah pepton. Tetapi Mahat

et al. (2004) mengamati bahwa pati sagu dan ekstrak ragi mempunyai efek

yang signifikan untuk produksi CGT-ase. Gawande and Patkar (1999), mengamati produksi CGT-ase maksimum ketika digunakan pepton sebagai

sumber nitrogen untukKlebsiella pneumoniaeAS-22. Urea dan NH4NO3 diketahui menghambat pertumbuhan bakteri dan selanjutnya tidak ada enzim yang dihasilkan.

Pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3 pada variasi sumber nitrogen dapat dilihat pada Gambar 12–15 berikut:

Gambar 12. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi dengan sumber

nitrogen pepton

Gambar 13. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi dengan sumber

nitrogen ekstrak ragi

0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72 A

k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) Pepton

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72 A

k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) Ekstrak Ragi

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Gambar 14. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi dengan sumber

nitrogen urea

Gambar 15. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi dengan sumber

nitrogen NH4Cl

Berikut data pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas spesifik dari isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi medium sumber nitrogen dengan waktu inkubasi optimum 36 jam dapat dilihat pada Tabel 5. Data lengkap untuk pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas spesifik dari isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi medium sumber nitrogen dapat dilihat pada Lampiran 5.

0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) Urea

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) NH₄Cl

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Tabel 5. Pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas

spesifik isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi medium sumber nitrogen dengan waktu inkubasi optimum 36 jam

Medium Kultur

Pertumbuhan Sel OD600

Aktivitas Unit (U/mL) Kadar Protein (mg/mL) Aktivitas Spesifik (U/mg)

Pepton 7,26 642,48 2,40 267,68

Ekstrak Ragi 4,74 673,02 1,68 400,30

Urea 3,17 664,92 1,17 567,14

NH4Cl 3,82 611,55 0,76 808,36

Tabel 6. Perbandingan pertumbuhan sel, aktivitas unit dan aktivitas

spesifik antara medium tanpa dan dengan perlakuan variasi komposisi medium sumber nitrogen

Jenis Perlakuan

Medium Kultur

Pertumbuhan Sel OD600

Aktivitas Unit (U/mL) Aktivitas Spesifik (U/mg) Nilai/Persentase (%)

OD AU AS

Tanpa Perlakuan

Variasi Pepton 7,26 642,48 267,68 100 100 100 Dengan

Perlakuan Variasi

Ekstrak

Ragi 4,74 673,02 400,30 65 105 150 Urea 3,17 664,92 567,14 44 103 212 NH4Cl 3,82 611,55 808,36 53 95 302 Keterangan: OD = pertumbuhan sel, AU = aktivitas unit dan

AS = aktivitas spesifik

Dari kedua data di atas, diketahui bahwa aktivitas unit pada waktu

inkubasi optimum 36 jam dengan sumber nitrogen pepton dan ekstrak ragi secara berurutan yaitu 642,48 U/mL dan 673,02 U/mL. Nilai aktivitas unit kedua sumber nitrogen tersebut lebih tinggi jika dibandingkan dengan sumber nitrogen NH4Cl (611,55 U/mL). Walaupun pepton dan ekstrak ragi merupakan sumber nitrogen organik sedangkan urea dan NH4Cl adalah sumber nitrogen anorganik. Namun, sumber nitrogen NH4Cl memiliki aktivitas spesifik yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan pepton dan ekstrak ragi yaitu 808,36 U/mL. Pertumbuhan sel

menggunakan NH4Cl mengalami penurunan sekitar 47% dari medium tanpa perlakuan. Dengan demikian, sumber nitrogen NH4Cl dipilih sebagai variasi komposisi medium terbaik.

3. Pengaruh Sumber Ion Logam

Menurut Ibrahimet al.(2005), Gawandeet al.(1998), Gawande and

Patkar (1999) dan Jin-Bonget al.(1990) menemukan bahwa magnesium

diperlukan untuk produksi CGT-ase. Cu2+_{dan Zn}2+_{merupakan efek} inhibitor yang signifikan dalam kestabilan CGT-ase untukBrevibacterium

sp. No. 9605 (Moriet al., 1994),B. agaradhaerens (Martins and

Hatti-Kaul, 2002) danBacillussp.AL-6 (Fujitaet al., 1990). Sebagian besar

CGT-ase diinhibisi kuat oleh Zn2+, Cu2+dan Fe2+ (Tonkova, 1998).

Pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi medium sumber ion logam dapat dilihat pada Gambar 16–20

berikut:

Gambar 16. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi dengan sumber

ion logam MgSO4

0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72 A

k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) MgSO₄

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Gambar 17. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi dengan sumber

ion logam CuSO4

Gambar 18. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi dengan sumber

ion logam ZnSO4

Gambar 19. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi dengan sumber

ion logam FeSO4

0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) CuSO₄

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) ZnSO₄

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) FeSO₄

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Gambar 20. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi dengan sumber

ion logam CaCl2

Medium Horikoshi’s IItermodifikasi yang mengandung sumber ion logam

MgSO4merupakan medium tanpa perlakuan. Selain logam yang berkombinasi dengan anion sulfat (SO42-), digunakan juga logam yang berkombinasi dengan anion klorida yaitu CaCl2.

Berikut data pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas spesifik dari isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi medium sumber ion logam dengan waktu inkubasi optimum 36 jam dapat dilihat pada Tabel 7. Data lengkap untuk pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas spesifik dari isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi medium sumber ion logam dapat dilihat pada Lampiran 6.

0 200 400 600 800 1000

0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A

k

ti

v

ita

s

S

p

es

ifi

k

(

U

/m

g

)

O

D

6

0

0

n

m

Waktu Inkubasi (Jam) CaCl₂

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Tabel 7. Pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas

spesifik isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi medium sumber ion logam dengan waktu inkubasi optimum 36 jam

Medium Kultur

Pertumbuhan Sel OD600

Aktivitas Unit (U/mL) Kadar Protein (mg/mL) Aktivitas Spesifik (U/mg)

MgSO4 1,08 529,19 1,29 410,23

CuSO4 0,40 504,63 1,56 322,71

ZnSO4 0,42 480,37 1,42 338,40

FeSO4 0,38 522,55 1,53 340,54

CaCl2 1,18 416,27 1,53 272,86

Tabel 8. Perbandingan pertumbuhan sel, aktivitas unit dan aktivitas

spesifik antara medium tanpa dan dengan perlakuan variasi komposisi medium sumber ion logam

Jenis Perlakuan

Medium Kultur

Pertumbuhan

Sel OD600

Aktivitas Unit (U/mL) Aktivitas Spesifik (U/mg) Nilai/Persentase (%)

OD AU AS

Tanpa Perlakuan

Variasi

MgSO4 1,08 529,19 410,23 100 100 100

Dengan Perlakuan

Variasi

CuSO4 0,40 504,63 322,71 37 95 79 ZnSO4 0,42 480,37 338,40 39 91 82 FeSO4 0,38 522,55 340,54 35 99 83 CaCl2 1,18 416,27 272,86 109 84 80 Keterangan: OD = pertumbuhan sel, AU = aktivitas unit dan

AS = aktivitas spesifik

Dari data yang disajikan di atas, isolat LTi-21-3 memiliki aktivitas unit dan aktivitas spesifik yang tinggi pada sumber ion logam MgSO4secara berurutan yaitu 529,19 U/mL dan 410,23 U/mg. Untuk sumber ion logam CaCl2menghasilkan aktivitas unit dan aktivitas spesifik yang terendah dan pertumbuhan selnya tertinggi dibandingkan dengan sumber ion logam yang lain. Pada pengaruh variasi sumber ion logam ini, aktivitas spesifik

dengan sumber ion logam MgSO4mengalami penurunan begitu juga dengan pertumbuhan selnya dibandingkan dengan penelitian sebelumnya pada variasi komposisi medium sumber nitrogen. Sumber ion logam MgSO4dipilih sebagai sumber ion logam terbaik karena memiliki aktivitas spesifik tertinggi sesuai dengan beberapa literatur yang telah disebutkan di atas.

4. Pengaruh Variasi pH

Pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi pH medium dapat dilihat pada Gambar 21- 25 berikut:

Gambar 21. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi pH 7

Gambar 22. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi pH 8 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72 A

k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) pH 7

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72 A

k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) pH 8

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Gambar 23. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi pH 9

Gambar 24. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi pH 10

Gambar 25. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi pH 11 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) pH 9

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) pH 10

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) pH 11

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Pada Tabel 9 berikut dapat dilihat pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas spesifik dari isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi pH medium dengan waktu inkubasi optimum 36 jam. Data lengkap untuk pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas spesifik dari isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi pH medium dapat dilihat pada Lampiran 7.

Tabel 9. Pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas

spesifik isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi pH medium dengan waktu inkubasi optimum 36 jam

Medium Kultur

Pertumbuhan Sel OD600

Aktivitas Unit (U/mL) Kadar Protein (mg/mL) Aktivitas Spesifik (U/mg)

pH 7 3,87 520,44 0,98 529,58

pH 8 3,75 546,86 0,92 595,72

pH 9 1,75 467,39 1,29 361,15

pH 10 0,93 494,01 1,45 340,24

pH 11 0,76 520,55 0,93 556,93

Tabel 10.Perbandingan pertumbuhan sel, aktivitas unit dan aktivitas

spesifik antara medium tanpa dan dengan perlakuan variasi komposisi pH medium

Jenis Perlakuan

Medium Kultur

Pertumbuhan Sel OD600

Aktivitas Unit (U/mL) Aktivitas Spesifik (U/mg) Nilai/Persentase (%)

OD AU AS

Tanpa Perlakuan

Variasi

pH 10 0,93 494,01 340,24 100 100 100

Dengan Perlakuan

Variasi

pH 7 3,87 520,44 529,58 416 105 156 pH 8 3,75 546,86 595,72 403 111 175 pH 9 1,75 467,39 361,15 188 95 106 pH 11 0,76 520,55 556,93 82 105 164 Keterangan: OD = pertumbuhan sel, AU = aktivitas unit dan

Dari data yang disajikan di atas, pH 8 merupakan pH optimum untuk isolat LTi-21-3 dengan dihasilkan aktivitas unit dan aktivitas spesifik secara berurutan yaitu 546,86 U/mL dan 595,72 U/mg. Pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik pada pH 8 lebih tinggi dibandingkan pada pH 10 dengan komposisi medium yang sama. Pada pH 8, pertumbuhan sel pada waktu inkubasi optimum 36 jam mencapai 3,75 sedangkan pada pH 10 hanya 0,93.

B. Profil Kondisi Optimum Isolat LTi-21-3

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, kondisi optimum untuk isolat LTi-21-3 yaitu pada medium kulturHorikoshi’s IIyang mengandung 1%

(b/v) pati singkong, 0,5% (b/v) NH4Cl, 0,02% (b/v) MgSO4dengan pH medium 8. Berikut merupakan profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3 pada kondisi optimum yang dapat dilihat pada Gambar 26.

Gambar 26. Profil pertumbuhan sel dan produksi enzim CGT-ase isolat

LTi-21-3 padamedium Horikoshi’s II termodifikasi dengan

kondisi optimum 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) Kondisi Optimum

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Tabel 11.berikut merupakan perbandingan antara medium Horikoshi’s II

termodifikasi dengan medium variasi terbaik.

Tabel 11. Perbandingan pertumbuhan sel, aktivitas unit, dan aktivitas spesifik

isolat LTi-21-3antara medium Horikoshi’s IItermodifikasi dengan

medium variasi terbaik pada waktu inkubasi optimum 36 jam

Jenis Perlakuan Pertumbuhan Sel OD600

Aktivitas Unit (U/mL)

Aktivitas Spesifik (U/mg)

Nilai/Persentase (%)

OD AU AS

Medium Horikoshi’s II

Termodifikasi 8,10 664,37 253,31 100 100 100

Medium Horikoshi’s II

termodifikasi dengan Variasi Terbaik

3,75 546,86 595,72 46 82 253 Keterangan: OD = pertumbuhan sel, AU = aktivitas unit dan

AS = aktivitas spesifik

Dari data di atas, isolat LTi-21-3 dari variasi terbaik menghasilkan aktivitas

spesifik 253% lebih tinggi jika dibandingkan dengan medium Horikoshi’s II

tanpa perlakuan variasi. Dengan aktivitas spesifik yang tinggi ini akan memudahkan dalam proses pemurnian enzim CGT-ase.

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan hasil yang diperoleh dari penelitian yang telah dilakukan maka dapat ditarik simpulan sebagai berikut:

1. Kondisi optimum untuk isolat LTi-21-3 yaitu pada mediumHorikoshi’s II

yang mengandung pati singkong 1% (b/v), 0,5% (b/v) NH4Cl, 0,02% (b/v) MgSO4dengan pH 8. Nilai aktivitas unit dan spesifik yang dihasilkan secara berurutan yaitu 546,86 U/mL dan 595,72 U/mg.

2. Pada medium Horikoshi’s II termodifikasi dengan perlakuan variasi

terbaik menghasilkan kenaikan persentase aktivitas spesifiknya sekitar 253% lebih tinggijika dibandingkan pada medium Horikoshi’s II

termodifikasi tanpa perlakuan.

B. Saran

1. Perlu dilakukan identifikasi lebih lanjut terhadap bakteri isolat LTi-21-3 untuk mengetahui jenis dan morfologinya serta perlu diketahui juga komponen kimia dalam pati singkong yang dapat menghasilkan enzim CGT-ase pada isolat LTi-21-3.

2. Kedepan, aplikasi enzim yang diharapkan dari isolat LTi-21-3 adalah untuk menghasilkan siklodekstrin dari pati singkong yang akan dimanfaatkan untuk proses pembentukan obat-obatan. Oleh karena itu, perlu dilakukan tahap pemurnian enzim CGT-ase terhadap isolat LTi-21-3 dengan kondisi optimum yang telah diperoleh dari penelitian ini.

Gambar 23. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi pH 9

Gambar 24. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi pH 10

Gambar 25. Profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3

pada mediumHorikoshi’s IItermodifikasi pH 11

0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) pH 9

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) pH 10

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg) 0 200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A k ti v ita s S p es ifi k ( U /m g ) O D 6 0 0 n m

Waktu Inkubasi (Jam) pH 11

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Pada Tabel 9 berikut dapat dilihat pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas spesifik dari isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi pH medium dengan waktu inkubasi optimum 36 jam. Data lengkap untuk pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas spesifik dari isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi pH medium dapat dilihat pada Lampiran 7.

Tabel 9. Pertumbuhan sel, aktivitas unit, kadar protein dan aktivitas

spesifik isolat LTi-21-3 pada variasi komposisi pH medium dengan waktu inkubasi optimum 36 jam

Medium Kultur

Pertumbuhan

Sel OD600

Aktivitas Unit (U/mL)

Kadar Protein (mg/mL)

Aktivitas Spesifik

(U/mg)

pH 7 3,87 520,44 0,98 529,58

pH 8 3,75 546,86 0,92 595,72

pH 9 1,75 467,39 1,29 361,15

pH 10 0,93 494,01 1,45 340,24

pH 11 0,76 520,55 0,93 556,93

Tabel 10.Perbandingan pertumbuhan sel, aktivitas unit dan aktivitas

spesifik antara medium tanpa dan dengan perlakuan variasi komposisi pH medium

Jenis Perlakuan

Medium Kultur

Pertumbuhan Sel OD600

Aktivitas Unit (U/mL)

Aktivitas Spesifik

(U/mg)

Nilai/Persentase (%)

OD AU AS

Tanpa Perlakuan

Variasi

pH 10 0,93 494,01 340,24 100 100 100

Dengan Perlakuan

Variasi

pH 7 3,87 520,44 529,58 416 105 156

pH 8 3,75 546,86 595,72 403 111 175

pH 9 1,75 467,39 361,15 188 95 106

pH 11 0,76 520,55 556,93 82 105 164

Keterangan: OD = pertumbuhan sel, AU = aktivitas unit dan AS = aktivitas spesifik

Dari data yang disajikan di atas, pH 8 merupakan pH optimum untuk isolat LTi-21-3 dengan dihasilkan aktivitas unit dan aktivitas spesifik secara berurutan yaitu 546,86 U/mL dan 595,72 U/mg. Pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik pada pH 8 lebih tinggi dibandingkan pada pH 10 dengan komposisi medium yang sama. Pada pH 8, pertumbuhan sel pada waktu inkubasi optimum 36 jam mencapai 3,75 sedangkan pada pH 10 hanya 0,93.

B. Profil Kondisi Optimum Isolat LTi-21-3

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, kondisi optimum untuk isolat LTi-21-3 yaitu pada medium kulturHorikoshi’s IIyang mengandung 1%

(b/v) pati singkong, 0,5% (b/v) NH4Cl, 0,02% (b/v) MgSO4dengan pH

medium 8. Berikut merupakan profil pertumbuhan sel dan aktivitas spesifik isolat LTi-21-3 pada kondisi optimum yang dapat dilihat pada Gambar 26.

Gambar 26. Profil pertumbuhan sel dan produksi enzim CGT-ase isolat

LTi-21-3 padamedium Horikoshi’s II termodifikasi dengan

kondisi optimum

0 200 400 600 800 1000

0 2 4 6 8 10

12 24 36 48 60 72

A

k

ti

v

ita

s

S

p

es

ifi

k

(

U

/m

g

)

O

D

6

0

0

n

m

Waktu Inkubasi (Jam) Kondisi Optimum

OD 600 nm Aktivitas Spesifik (U/mg)

Tabel 11.berikut merupakan perbandingan antara medium Horikoshi’s II

termodifikasi dengan medium variasi terbaik.

Tabel 11. Perbandingan pertumbuhan sel, aktivitas unit, dan aktivitas spesifik

isolat LTi-21-3antara medium Horikoshi’s IItermodifikasi dengan

medium variasi terbaik pada waktu inkubasi optimum 36 jam

Jenis Perlakuan Pertumbuhan Sel OD600

Aktivitas Unit (U/mL)

Aktivitas Spesifik (U/mg)

Nilai/Persentase (%)

OD AU AS Medium Horikoshi’s II

Termodifikasi 8,10 664,37 253,31 100 100 100

Medium Horikoshi’s II

termodifikasi dengan Variasi Terbaik

3,75 546,86 595,72 46 82 253

Keterangan: OD = pertumbuhan sel, AU = aktivitas unit dan AS = aktivitas spesifik

Dari data di atas, isolat LTi-21-3 dari variasi terbaik menghasilkan aktivitas

spesifik 253% lebih tinggi jika dibandingkan dengan medium Horikoshi’s II

tanpa perlakuan variasi. Dengan aktivitas spesifik yang tinggi ini akan memudahkan dalam proses pemurnian enzim CGT-ase.

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan hasil yang diperoleh dari penelitian yang telah dilakukan maka dapat ditarik simpulan sebagai berikut:

1. Kondisi optimum untuk isolat LTi-21-3 yaitu pada mediumHorikoshi’s II

yang mengandung pati singkong 1% (b/v), 0,5% (b/v) NH4Cl, 0,02% (b/v)

MgSO4dengan pH 8. Nilai aktivitas unit dan spesifik yang dihasilkan

secara berurutan yaitu 546,86 U/mL dan 595,72 U/mg.

2. Pada medium Horikoshi’s II termodifikasi dengan perlakuan variasi

terbaik menghasilkan kenaikan persentase aktivitas spesifiknya sekitar 253% lebih tinggijika dibandingkan pada medium Horikoshi’s II

termodifikasi tanpa perlakuan.

B. Saran

1. Perlu dilakukan identifikasi lebih lanjut terhadap bakteri isolat LTi-21-3 untuk mengetahui jenis dan morfologinya serta perlu diketahui juga komponen kimia dalam pati singkong yang dapat menghasilkan enzim CGT-ase pada isolat LTi-21-3.

2. Kedepan, aplikasi enzim yang diharapkan dari isolat LTi-21-3 adalah untuk menghasilkan siklodekstrin dari pati singkong yang akan dimanfaatkan untuk proses pembentukan obat-obatan. Oleh karena itu, perlu dilakukan tahap pemurnian enzim CGT-ase terhadap isolat LTi-21-3 dengan kondisi optimum yang telah diperoleh dari penelitian ini.