BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1. Alat – alat
1. Gelas ukur
50 ml pyrex
2. Gelas Beaker
250 ml pyrex
3. Gelas Erlenmeyer
250 ml pyrex
4. Corong Saring
5. Corong Pisah
500 ml duran
6. Kolom Kromatografi
2040 pyrex
7. Tabung Reaksi
8. Plat Skrining
9. Neraca Analitis
Mettler PM 480 10.
Alat Pengering Memmers
11. Rotari Evaporator
Buchi B-480 12.
Labu Alas 500 ml pyrex
13. Alat pengukur titik lebur
14. Statif dan klem
15. Lampu UV
254 nm 16.
Spatula 17.
Batang Pengaduk 18.
Pipet Tetes 19.
Botol Vial 20.
Bejana Kromatografi lapis tipis 21.
Spektrofotometer FT – IR Jasco
22. Spektrometer
1
H-NMR Hitahci FT-NMR R -
1986 23.
Spektrofotometer UV – Visibel 24.
Kertas Saring
Universitas Sumatera Utara
3.2. Bahan – bahan
1. Buah Tumbuhan Harimonting R. tomentosa. W.Ait.
2. Metanol
3. N-heksana
4. Etil Asetat
p.a E.merck 5.
Silikagel 60 F
254
E.merck Art. 554 6.
Silikagel 60 G type E E.merck Art. 7734
7. Pereaksi Feri Klorida 5
8. Pereaksi Natrium Hidroksida 10
9. H
2
SO
4p
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1.Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah buah tumbuhan Harimonting yang diperoleh dari daerah Tambunan Baruara, Kabupaten Toba Samosir, Sumatera Utara. Buah
tumbuhan Harimonting dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk sebanyak 1500 gram.
3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Buah Tumbuhan Harimonting
Serbuk buah tumbuhan Harimonting diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1.
Uji Busa 2.
Skrining Fitokimia 3.
Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Universitas Sumatera Utara
3.3.2.1.Uji Busa
Serbuk buah tumbuhan Harimonting sebanyak 1500 g dimaserasi dengan metanol, kemudian sebanyak 5ml ekstrak methanol dimasukkan kedalam tabung reaksi.
Kemudian ditambahkan 10 ml aquadest dan dipanaskan pada penangas air. Lalu dikocok-kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10
menit. Ternyata busa hilang yang membuktikan bahwa di dalam buah tumbuhan Harimonting tidak terdapat senyawa glikosida.
3.3.2.2. Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa Flavonoid pada buah tumbuhan Harimonting, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif. Serbuk buah tumbuhan
Harimonting diekstraksi maserasi dengan metanol, dikeringkan. Filtrat yang diperoleh ditambahkan pereaksi H
2
SO
4p
, NaOH 10, FeCl
3
5 dan Mg-HCl, terjadilah perubahan warna pada setiap penambahan pereaksi yang menunjukkan
adanya senyawa flavonoid.
3.3.2.3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-Heksana : Etil Asetat dengan perbandingan 90 : 10vv ; 80 :
20vv; 70: 30vv; 60 : 40vv ; 50 : 50vv.
Prosedur analisis kromatografi lapis tipis : Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan
90 : 10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang
telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan. Diamati warna bercak yang
timbul dibawah sinar Ultra Violet dengan λ= 254 nm dan dihitung harga Rf yang
Universitas Sumatera Utara
diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-Heksana : Etil asetat 80 : 20vv;70:30vv;60:40vv;50:50vv. Dari hasil analisis
KLT menunjukkan bahwa di dalam buah tumbuhan Harimonting terkandung senyawa flavonoid. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak n-
Heksana:Etil asetat80:20vv.
Harga Rf dapat dilihat pada kromatogram Lampiran 3.
3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Dari Ekstrak Buah Tumbuhan Harimonting
Serbuk buah tumbuhan Harimonting ditimbang sebanyak 1500 g, dimasukkan ke dalam bejana dan ditambahkan dengan pelarut metanol sampai semua terendam
oleh pelarut dan dibiarkan selama 48 jam dan sesekali diaduk. Maserat disaring dan diperoleh ekstrak berwarna hijau. Maserasi dilakukan berulang kali dengan
menggunakan pelarut metanol sampai ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa
flavonoid. Ekstrak metanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator pada suhu 60
C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-
heksan, sehingga terbentuk lapisan n-heksan dan lapisan metanol. Fraksi metanol ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan rotarievaporator, sehingga
diperoleh ekstrak pekat metanol sebanyak 10,23 gram.
3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoid dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoid secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol buah tumbuhan Harimonting yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan
adalah silika gel 60 G dan fasa gerak adalah campuran pelarut n-Heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:
10vv;80:20vv;70:30vv60:40vv;50:50vv. Prosedur isolasi senyawa flavonoid dengan kromatografi kolom:
Universitas Sumatera Utara
Dirangkai seperangkat alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60 G dengan menggunakan n-Heksan, diaduk-aduk hingga homogen
lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-Heksan 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan
10,23 g ekstrak pekat buah tumbuhan Harimonting ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel di puncak kolom, lalu ditambahkan fasa gerak n-
Heksana : etil asetat dengan perbandingan 90: 10vv;80:20vv;70:30vv60:40vv;50:50vv secara perlahan-lahan dan
diatur aliran fasa gerak yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam
botol vial setiap 5 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoid dan diuapkan sampai pelarutnya habis hingga
terbentuk kristal.
3.3.5. Pemurnian
Senyawa yang diperoleh dari fraksi yaitu pada fraksi 41-80 dilakukan pemurnian senyawa. Senyawa pada fraksi 41-80 dilarutkan dengan etil asetat, sehingga
pengotor pada amorf akan larut dan larutannya didekantasi kemudian disaring dan dimurnikan dilakukan secara berulang-ulang.
3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis TipisKLT
Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 80:20vv.
Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis: Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu
dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan pada KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh.
Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi Feri klorida
Universitas Sumatera Utara
dalam air menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid. Perlakuan yang sama dilakukan, dan difiksasi dengan Natrium
Hidroksida dalam air yang menghasilkan bercak berwarna biru violet.
3.3.7. Analisis Spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Laboratorium Dasar Bersama
UNAIR Surabaya Lampiran 5.
3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Inframerah
Analisis spektrum inframerah dengan spektrofotometer dilakukan di
Laboratorium Dasar Bersama UNAIR Surabaya Lampiran 7.
3.3.7.3. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisis ini dilakukan di Laboratorium Dasar Bersama UNAIR Surabaya dengan menggunakan CDCl
3
sebagai pelarut dan TMS sebagai standart dalam spektrum
absorbansi antara 0-14 ppm dibawah TMS Lampiran 8.
Universitas Sumatera Utara
3.5. Bagan Penelitian
←
diskrining fitokimia
←
dimaserasi dengan 6 L metanol selama ± 48 jam
←
disaring
←
dipekatkan dengan
rotari evaporator
←
dipartisi n-heksana
←
diskrining fitokimia
←
diskrining
←
dipekatkan dengan rotari evaporator
←
fitokimia
←
di analisis KLT untuk menentukan eluen pada pemisahan kromatografi kolom
←
dibuburkan sampel dengan silika gel
←
dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 GE netral dan fasa gerakeluen n-heksana : etil asetat 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 ; 50:50vv
←
ditampung setiap fraksi sebanyak 5 ml dalam botol vial
←
di KLT
←
digabung fraksi dengan Rf yang sama
←
diuji pereaksi
←
diuji pereaksi
←
diuji pereaksi
←
diuji pereaksi
←
diuji pereaksi
←
diuapkan
←
dimurnikan
←
dianalisis KLT
←
dianalisis dengan Spektrometer FT-IR, spektrometer
1
H- NMR,
Spektrofotometer UV-Visible 1500 g serbuk buah
Tumbuhan Harimonting
Residu Ekstrak Metanol sebanyak 4 L
Ekstrak pekat metanol sebanyak 2 L
Fraksi n-heksana 500 ml Fraksi metanol sebanyak 1,5 L
Ekstrak Pekat methanol sebanyak 10,23 g Hasil Negatif
Fraksi 1-20 Fraksi 21- 40
Fraksi 41-80 Fraksi 81-100
Fraksi 101-120
Hasil negatif Hasil positif
Fraksi 41-80 Hasil positif
Hasil negatif
senyawa Senyawa murni
Hasil analisis
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Penelitian
Dari hasil skrining pendahuluan terhadap ekstrak methanol dari buah tumbuhan
Harimonting R. tomentosa.W.Ait dengan adanya penambahan pereaksi-pereaksi
warna untuk menentukan golongan senyawa kimia yang dikandung dengan menggunakan pereaksi flavonoid yakni:
- Pereaksi FeCl
3
5 memberikan warna hitam -
Pereaksi NaOH 10 memberikan warna biru violet -
Pereaksi Mg-HCl memberikan warna merah muda -
Pereaksi H
2
SO
4p
memberikan warna coklat
Dari hasil kromatografi lapis tipis dengan menggunakan adsorben silika gel 60F
254
, dapat diketahui bahwa pelarut yang baik untuk mengisolasi senyawa flavonoid dari buah tumbuhan Harimonting R. tomentosa. W.Ait. adalah n-
heksan : etil asetat pada perbandingan 80 : 20 vv.
Dari hasil isolasi buah tumbuhan Harimonting R. tomentosa. W.Ait.
diperoleh senyawa berwarna coklat berbentuk amorf sebanyak 60 mg.
Dari Spektrum UV-Visible memberikan 2 pita serapan yaitu pita II dengan λ = 256 nm dan pita I dengan λ = 310 nm sebagai bahu.
Hasil analisis Spektrofotometer FT-IR dari senyawa hasil isolasi menghasilkan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang sebagai berikut :
1. Pada bilangan gelombang 3443,59 cm
-1
puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi yang mengikat gugus OH.
2. Pada bilangan gelombang 2924-2853,59 cm
-1
puncak kuat menunjukkan adanya vibrasi gugus CH alifatis
Universitas Sumatera Utara
3 Pada bilangan gelombang 1627,65 cm
-1
puncak kuat menunjukkan adanya vibrasi gugus C=O dari keton
4 Pada bilangan gelombang 1497,68 – 1464,67 cm
-1
puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi gugus C=C
5 Pada bilangan gelombang 1376,70 cm
-1
puncak lemah menunjukkan adanya vibrasi gugus CH
3
6 Pada bilangan gelombang 1288,69 – 1215,69 cm
-1
puncak lemah menunjukkan adanya vibrasi gugus C-O
7 Pada bilangan gelombang 1172,70 – 614,75 cm
-1
puncak lemah menunjukkan adanya vibrasi gugus CH senyawa aromatik
Hasil analisis Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR memberikan pergeseran kimia pada daerah
δppm sebagai berikut : 1.
Pergeseran kimia pada daerah δ = 1,831 ppm puncak singlet s
menunjukkan adanya proton-proton gugus metil pada prenil -CH
2
- CH=CCH
3 2
Markham, 1988. 2.
Pergeseran kimia pada daerah δ = 3,402 ppm puncak singlet s menunjukkan adanya proton-proton gugus CH pada prenil -CH
2
- CH=CCH
3 2
Markham, 1988. 3.
Pergeseran kimia pada daerah δ = 3,803 ppm puncak singlet s menunjukkan adanya proton metoksi -OCH
3
-6 dan –OCH
3
-4’ Markham, 1988.
4. Pergeseran kimia pada daerah δ = 4,057 ppm puncak singlet s
menunjukkan adanya proton pada CH gula Markham, 1988. 5.
Pergeseran kimia pada daerah δ = 5,206 ppm puncak singlet s menunjukkan adanya proton –OH pada cincin A atau pada cincin B.
Universitas Sumatera Utara
6. Pergeseran kimia pada daerah δ = 6,219 ppm puncak singlet s
menunjukkan adanya proton H6 pada cincin A Markham, 1988. 7.
Pergeseran kimia pada daerah δ = 6,75 ppm puncak singlet s menunjukkan adanya proton H2 pada cincin C Markham, 1988.
8. Pergeseran kimia pada daerah δ = 7,254 ppm puncak singlet s
menunjukkan adanya pelarut CDCl
3
.
4.2. Pembahasan Buah tumbuhan Harimonting R. tomentosa. W.Ait. dinyatakan mengandung
Kategori