Isolasi Senyawa Flavonoida Dari Buah Tumbuhan Harimonting (Rhodomyrtus tomentosa W.Ait)

ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI BUAH TUMBUHAN HARIMONTING

( Rhodomyrtus tomentosa W.Ait )

SKRIPSI

DANNY JUNIOR SIMANJUNTAK 050802055

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2010

PERSETUJUAN

Judul : ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI

BUAH TUMBUHAN HARIMONTING (Rhodomyrtus tomentosa W.Ait)

Kategori : SKRIPSI

Nama : DANNY JUNIOR SIMANJUNTAK

Nomor Induk Mahasiswa : 050802055

Program Studi : Sarjana (S1) Kimia

Departemen : KIMIA

Fakultas : MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN

ALAM (F MIPA) UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

Disetujui di

Medan, Agustus 2010

Komisi Pembimbing :

Pembimbing 2 Pembimbing 1

(Drs. Albert Pasaribu, MSc) (Sovia Lenny, S.Si, M.Si)

NIP 19640810 199103 1 002 NIP 19751018 200003 2 001

Diketahui/Disetujui oleh

Departemen Kimia F MIPA USU Ketua,

(DR. Rumondang Bulan, MS) NIP 19540830 198503 2 001

PERNYATAAN

ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI BUAH TUMBUHAN HARIMONTING

(Rhodomyrtus tomentosa W.Ait)

SKRIPSI

Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil kerja saya sendiri, tapi kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.

Medan, Agustus 2010

DANNY JUNIOR SIMANJUNTAK 050802055

PENGHARGAAN

Segala puji dan syukur penulis panjatkan pada Tuhan Yang Maha Kasih dan Maha Penyayang, karena atas kasih dan berkat-Nya yang melimpah, penulis bisa menyelesaikan skripsi ini dalam waktu yang telah ditetapkan.

Ucapan terimah kasih saya sampaikan kepada Ibu Sovia Lenny, S.Si, M.Si dan Bapak Drs. Albert Pasaribu, MSc selaku pembimbing penulis pada penyelesaian skripsi ini yang telah memberikan panduan, nasehat dan motivasi kepada penulis untuk menyempurnakan skripsi ini. Ucapan terimakasih juga ditujukan kepada Ketua dan Sekretaris Departemen Kimia Ibu Dr. Rumondang Bulan Nst, M.S dan Bapak Drs. Firman Sebayang, M.S, Bapak Dekan dan Pembantu Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam serta semua dosen di Deprtemen Kimia F MIPA USU khususnya para Dosen Kimia Bahan Alam, Dosen laboratorium Dasar Bersama UNAIR Surabaya . Selanjutnya penulis menyampaikan penghargaan dan cinta kasih yang tulus kepada kedua orang tua saya yaitu, F. Simanjuntak dan D. Rajagukguk serta abang dan adik saya Valentino Simanjuntak, Agnes Simanjuntak, Orizabella Simanjuntak. Tak lupa juga saya mengucapkan terima kasih kepada rekan-rekan Kimia 2005 serta sahabat-sahabat saya Frans JH, Hervinna Simangunsong khususnya kepada Mawanti Tambunan atas dukungan moril kepada penulis. Semoga Tuhan memberkati kita semua.

ABSTRAK

Isolasi senyawa flavonoida yang terkandung di dalam buah tumbuhan Harimonting (Rhodomyrtus tomentosa. W.ait) dilakukan dengan cara maserasi dengan menggunakan pelarut metanol, dan diekstraksi partisi dengan pelarut n-heksana. Ekstrak pekat metanol dikromatografi kolom dengan menggunakan fasa gerak n-heksana : etil asetat (80:20 v/v) dan fasa diam silika gel 60 G (E.Merck). Senyawa yang diperoleh dimurnikan, berbentuk amorf, berwarna coklat sebanyak 60 mg. Senyawa ini diidentifikasi dengan menggunakan spektroskopi inframerah (FT-IR), spektroskopi resonansi magnetik inti proton (1H-NMR) dan spektroskopi UV-Visible. Data dari hasil spektrum tersebut dapat disimpulkan bahwa senyawa tersebut adalah senyawa flavonoid.

THE ISOLATION FLAVONOID COMPOUND FROM FRUIT OF HARIMONTING (Rhodomyrtus tomentosa. W.ait)

ABSTRACT

The isolation of Flavonoid compound which contained in the fruit of Harimonting (Rhodomyrtus tomentosa. W.ait) has been done by maceration with methanol solvent, and extracted partition by n-hexane. The concentrated methanol extract was put into column chromatography, eluted with mobil phase n-hexane : ethyl acetate (80:20 v/v) and stationary phase silica gel 60 G (E.merck). The compound yielded was purified. The weight of the pure compound is 60 mg, amorf and brown. The compound was then identified, by Infrared Spectroscopy (FT-IR), Nuclear Magnetic Resonance Proton (1H-NMR), and Spectroscopy UV-Visible Spectroscopic analysis shows that the compound belongs to Flavonoid.

DAFTAR ISI

Halaman

Persetujuan ii

Pernyataan iii

Penghargaan iv

Abstrak v

Abstract vi

Daftar isi vii

Daftar Lampiran viii

Bab 1 Pendahuluan 1

1.1. Latar Belakang 1

1.2. Permasalahan 2

1.3. Tujuan Penelitian 2

1.4. Manfaat Penelitian 2

1.5. Lokasi Penelitian 2

1.6. Metodologi Penelitian 2

Bab 2 Tinjauan Pustaka 4

2.1. Tumbuhan Harimonting 4

2.1.1. Morfologi Tumbuhan Harimonting 4

2.1.2. Sistematika Tumbuhan Harimonting 4

2.1.3. Manfaat Tumbuhan Harimonting 5

2.2. Senyawa Flavonoida 5

2.2.1. Struktur Dasar Senyawa Flavonoida 5

2.2.2. Klasifikasi Senyawa Flavonoida 6

2.2.3. Sifat Kelarutan Flavonoida 13

2.3. Tehnik Pemisahan 14

2.3.1. Kromatografi 14

2.3.1.1. Kromatografi Lapisan Tipis 15

2.3.1.2. Kromatografi Kolom 15

2.3.2. Ekstraksi 16

2.4. Teknik Spektroskopi 16

2.4.1. Spektroskopi Ultra Violet 17

2.4.2. Spektrofotometri Inframerah (FT-IR) 18

2.4.3. Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)18

Bab 3 Metodologi Penelitian 19

3.1. Alat 19

3.2. Bahan 20

3.3. Prosedur Penelitian 20

3.3.1. Penyediaan Sampel 20

Harimonting 20

3.3.2.1. Uji Busa 20

3.3.2.2. Skrining Fitokimia 21

3.3.2.3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis 21 3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia dari Ekstrak

Buah Tumbuhan Harimonting 22

3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatrografi

Kolom 22

3.3.5. Pemurnian 23

3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis

Tipis 23

3.3.7.1. Analisis Spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi

Spektrofotometer UV-Visible 23 3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi dengan

Spektrofotometer Inframerah 24 3.3.7.3. Analisis Senyawa Hasil Isolasi dengan

Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton 24

3.5. Bagan Penelitian 25

Bab 4 Hasil dan Pembahasan 26

4.1. Hasil Penelitian 26

4.2. Pembahasan 28

Bab 5 Kesimpulan dan Saran 31

5.1. Kesimpulan 31

5.2. Saran 31

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Foto Tumbuhan Harimonting 34

Lampiran 2. Determinasi Tumbuhan Harimonting 35

Lampiran 3. Hasil Kromatografi Lapisan Tipis Ekstrak Metanol

Buah Tumbuhan Harimonting 36

Lampiran 4. Hasil Kromatografi Lapisan Tipis Senyawa Hasil Isolasi

Melalui Penampakan Noda dengan Penambahan Pereaksi 37 Lampiran 5. Spektrum Ultraviolet Visible (UV-Visible) Senyawa Hasil Isolasi 38 Lampiran 6. Spektrum Ultraviolet Tampak (UV-Visible) Senyawa

Pembanding 39

Lampiran 7. Spektrum Inframerah (FT-IR) Senyawa Hasil Isolasi 40 Lampiran 8. Spektrum Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)

Senyawa Hasil Isolasi 41

Lampiran 9. Spektrum Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)

ABSTRAK

Isolasi senyawa flavonoida yang terkandung di dalam buah tumbuhan Harimonting (Rhodomyrtus tomentosa. W.ait) dilakukan dengan cara maserasi dengan menggunakan pelarut metanol, dan diekstraksi partisi dengan pelarut n-heksana. Ekstrak pekat metanol dikromatografi kolom dengan menggunakan fasa gerak n-heksana : etil asetat (80:20 v/v) dan fasa diam silika gel 60 G (E.Merck). Senyawa yang diperoleh dimurnikan, berbentuk amorf, berwarna coklat sebanyak 60 mg. Senyawa ini diidentifikasi dengan menggunakan spektroskopi inframerah (FT-IR), spektroskopi resonansi magnetik inti proton (1H-NMR) dan spektroskopi UV-Visible. Data dari hasil spektrum tersebut dapat disimpulkan bahwa senyawa tersebut adalah senyawa flavonoid.

THE ISOLATION FLAVONOID COMPOUND FROM FRUIT OF HARIMONTING (Rhodomyrtus tomentosa. W.ait)

ABSTRACT

The isolation of Flavonoid compound which contained in the fruit of Harimonting (Rhodomyrtus tomentosa. W.ait) has been done by maceration with methanol solvent, and extracted partition by n-hexane. The concentrated methanol extract was put into column chromatography, eluted with mobil phase n-hexane : ethyl acetate (80:20 v/v) and stationary phase silica gel 60 G (E.merck). The compound yielded was purified. The weight of the pure compound is 60 mg, amorf and brown. The compound was then identified, by Infrared Spectroscopy (FT-IR), Nuclear Magnetic Resonance Proton (1H-NMR), and Spectroscopy UV-Visible Spectroscopic analysis shows that the compound belongs to Flavonoid.

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang

Tumbuh-tumbuhan merupakan salah satu sumber senyawa alam hayati yang memegang peranan penting yang digunakan sebagai obat untuk penyakit tertentu dan merupakan warisan turun temurun dari nenek moyang kita. Bertitik tolak dari sumber bahan alam hayati ini yang mempunyai peranan penting di dalam penyediaan senyawa-senyawa kimia dalam bidang obat-obatan maka pemerintah menghimbau para ahli untuk meningkatkan penelitiannya dalam bidang tersebut, hal ini merupakan suatu tantangan bagi para ahli untuk melibatkan diri dalam senyawa-senyawa baru yang dihasilkan dari tumbuhan-tumbuhan tersebut (Effendi, 1982).

Tumbuhan yang sangat bermanfaat dan banyak digunakan masyarakat di dataran tinggi adalah tumbuhan Harimonting. Tumbuhan ini bersifat kesat, hangat, dengan arah organ ke limpa dan hati. Sehingga bisa melancarkan aliran energi hati yang kacau penyebab nyeri haid, mengesatkan untuk keputihan dan memperkuat kerja limpa. Penyakit yang dapat diobati yaitu gangguan pencernaan (dispepsi), disentri basiler, diare, hepatitis, keputihan, sariawan, haid berlebihan, wasir darah, berak darah, bagian yang digunakan adalah daun, akar, buah dan biji (Keng, H. 1987).

Isolasi Flavonoid pernah dilakukan dari daun tumbuhan Karamunting oleh Agus Anwar dimana menunjukkan adanya senyawa golongan flavonoid, steroid, triterpenoid, tanin galat, tanin katekat, kuinon dan unsur natrium, kalsium, kalium serta magnesim. Dari Ekstrak etanol 95% diisolasi golongan flavonoid yang diduga mirisetin dalam bentuk glikosida, serta golongan asam fenolat yang diduga

asam p-hidroksibenzoat dan asam p-kumarat dalam bentuk ester (Agus Anwar, 1986).

Selain itu tumbuhan Harimonting juga pernah diteliti sebelumnya yaitu mengisolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan Harimonting (Rianto, 2009).

Dari skrining fitokimia yang dilakukan terhadap buah tumbuhan Harimonting(R. tomentosa W.ait) dengan menggunakan pereaksi flavonoida menyatakan adanya senyawa flavonoida pada buah tumbuhan Harimonting. Maka dari hal ini penulis merasa tertarik untuk mengisolasi senyawa flavonoida dari buah tumbuhan Harimonting (R. tomentosa W.ait.)

1.2. Permasalahan

Apakah di dalam buah tumbuhan Harimonting terdapat senyawa flavonoida serta metode untuk memperoleh senyawa flavonoida tersebut.

1.3. Tujuan Penelitian

Penelitian ini dilakukan untuk memperoleh senyawa flavonoida dari buah tumbuhan Harimonting (R. tomentosa. W.Ait.)

1.4. Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah dalam bidang kimia bahan alam hayati dan farmasi adanya senyawa flavonoida dari buah tumbuhan Harimonting (R. tomentosa. W.Ait.)

1.5. Lokasi Penelitian

Sampel yang digunakan diperoleh dari daerah Tambunan Baruara, Kabupaten Toba Samosir, Provinsi Sumatera Utara. Penelitian ini dilakukan di laboratorium Kimia Bahan Alam FMIPA , Universitas Sumatera Utara. Analisa Spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer Inframerah dan analisa Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) dilakukan di Laboratorium UNAIR Surabaya.

1.6. Metodologi Penelitian

Dalam penelitian ini, isolasi senyawa flavonoida digunakan buah tumbuhan Harimonting, berupa serbuk halus yang kering sebanyak 1500 gram. Tahap awal dilakukan uji skrining fitokimia dengan menggunakan pereaksi – pereaksi untuk senyawa flavonoida yaitu dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5%, NaOH 10%,

dan H2SO4(p)

Tahap isolasi yang dilakukan adalah , − Ekstraksi meserasi

− Analisis Kromatografi lapis Tipis (KLT) − Analisis Kromatografi Kolom (KK) − Rekristalisasi

− Analisis Kristal hasil Isolasi

Tahap analisis kristal isolasi yang dilakukan adalah ; − Analisis kristal mencakup Kromatografi Lapis Tipis − Pengukuran titik lebur

− Identifikasi dengan menggunakan spektrofotometer UV-Visible, spektrofotometer Inframerah (FT-IR) dan spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR).

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tumbuhan Harimonting

Tumbuhan Harimonting merupakan tumbuhan yang tumbuh liar pada tempat yang mendapat sinar matahari cukup, seperti di lereng gunung, semak belukar, lapangan yang tidak terlalu gersang.Tumbuhan ini biasanya ditemukan sampai pada ketinggian 1650 meter diatas permukaan laut.

2.1.1. Morfologi Tumbuhan Harimonting

Rhodomyrtus tomentosa W.ait. merupakan tanaman liar dengan tinggi mencapai 3 m. Pada saat mudanya, tipis, dan berwarna keputih-putihan seperti bulu domba. Daunnya bersebrangan dengan tiga tulang daun yang tegak, panjang tangkainya 0,25-0,5 cm. Daunnya memanjang dengan panjang 2,5-3 cm. Ujungnya tumpul sampai runcing, diatasnya berwarna keputih-putihan. Bunganya tersembunyi pada kelopak, dengan luas 3,7-4 cm, dan panjang tangkai kelopaknya 1,25-2,5 cm, dengan pasangan bilik pada dasar tiap bunganya: 5 kelopak, 5 daun bunga yang sedikit berwarna putih, diluar dengan merah keungu-unguan atau keseluruhan merah muda. Kebanyakan benang sari berwarna merah muda, dengan kepala putik berwarna kuning. Buahnya dapat dimakan dengan panjang 1-25 cm, mempunyai mahkota dengan daun yang keras, diatas hijau mengkilap sampai keungu-unguan, dengan daging buah yang manis. Biji-bijinya kebanyakan kecil-kecil ( F.S.P.Ng, 1978).

2.1.2. Sistematika tumbuhan Harimonting adalah sebagai berikut :

Kingdom : Plantae (tumbuhan )

Kelas : Magnoliopsida(berkeping dua / dikotil )

Ordo : Myrtales

Famili : Myrtaceae (Suku jambu – jambuan )

Genus : Rhodomyrtus

Spesies : Rhodomyrtus tomentosa W.ait.

2.1.3. Manfaat Tumbuhan Harimonting

Salah satu tumbuhan yang digunakan sebagai tumbuhan obat adalah tumbuhan Harimonting (R. tomentosa. W.Ait.). Bagian yang digunakan sebagai obat adalah daun yang berfungsi sebagai obat diare. Buahnya dapat dimakan karena rasanya manis.

2.2. Senyawa Flavonoida

Senyawa flavonoida sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, bunga, buah, dan biji. Kebanyakan flavonoida ini berada di dalam tumbuh – tumbuhan kecuali alga. Namun ada juga flavonoida yang terdapat dalam hewan, misalnya dalam kelenjar bau berang – berang dan sekresi lebah. Dalam sayap kupu – kupu dengan anggapan bahwa flavonoida berasal dari tumbuh – tumbuhan yang menjadi makanan hewan tersebut dan tidak dibiosintesis di dalam tubuh mereka. Penyebaran jenis flavonoida pada golongan tumbuhan yang tersebar yaitu angiospermae, klorofita, fungi, briofita (Markham, 1988).

2.2.1. Struktur dasar senyawa flavonoida

Senyawa flavonoida adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua inti fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Struktur dasar flavonoida dapat digambarkan sebagai berikut :

C C C

A B

Kerangka dasar senyawa flavonoida

Cincin A adalah karakteristik phloroglusinol atau bentuk resorsinol tersubstitusi O C₃ OH HO C₆

O

C

₃

HO

C

₆ Namun sering terhidroksilasi lebih lanjut :

O C3 OH HO HO C6 A OCH₃ O C₃ OCH₃ H₃CO

H₃CO

C6

A

Cincin B adalah karakteristik 4-, 3,4-, 3,4,5- terhidroksilasi

C₃ (A) C6 R R' R'' B

R = R’ = H, R’ = OH R = H, R’ = R” = OH R = R’ = R” = OH

2.2.2. Klasifikasi senyawa Flavonoida

Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spectrum sinar tampak, umumnya dalam tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida

(Harbone, 1996).

Menurut Robinson (1995), flavonoida dapat dikelompokkan berdasarkan keragaman pada rantai C3 yaitu :

1.Flavonol

Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida, dan aglikon flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan mirisetin yang berkhasiat sebagai antioksidan dan antiimflamasi. Flavonol lain yang terdapat di alam bebas kebanyakan merupakan variasi struktur sederhana dari flavonol. Larutan flavonol dalam suasana basa dioksidasi oleh udara tetapi tidak begitu cepat sehingga penggunaan basa pada pengerjaannya masih dapat dilakukan.

2. Flavon

Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3-hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksi warnanya. Flavon terdapat juga sebagai glikosidanya lebih sedikit daripada jenis

O O

OH

flavonol HO

HO

glikosida pada flavonol. Flavon yang paling umum dijumpai adalah apigenin dan luteolin. Luteolin merupakan zat warna yang pertama kali dipakai di Eropa. Jenis yang paling umum adalah 7-glukosida dan terdapat juga flavon yang terikat pada gula melalui ikatan karbon-karbon. Contohnya luteolin 8-C-glikosida. Flavon dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa flavonoida.

O O flavon OH OH 1 2 3 4 10 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' 3. Isoflavon

Isoflavon merupakan isomer flavon, tetapi jumlahnya sangat sedikit dan sebagai fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan sebagai pertahanan terhadap serangan penyakit. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar UV bila diuapi amonia, tetapi kebanyakan yang lain tampak sebagai bercak lembayung yang pudar dengan amonia berubah menjadi coklat.

O O OH OH HO Struktur Isoflavon

4. Flavanon

Flavanon terdistribusi luas di alam. Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga. Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah jeruk ; dua glikosida yang paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan jeruk.

O

O

Struktur Flavanon

5. Flavanonol

Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika dibandingkan dengan flavonoida lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena konsentrasinya rendah dan tidak berwarna.

O

O

OH

Struktur Flavanonol

6. Katekin

Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu. Senyawa ini mudah diperoleh dalam jumlah besar dari ekstrak kental Uncaria gambir

dan daun teh kering yang mengandung kira-kira 30% senyawa ini. Katekin berkhasiat sebagai antioksidan.

O HO

OH OH

OH OH

Struktur Katekin

7. Leukoantosianidin

Leukoantosianidin merupakan senyawa tan warna, terutama terdapat pada tumbuhan berkayu. Senyawa ini jarang terdapat sebagai glikosida, contohnya melaksidin, apiferol.

O

OH

HO _OH

Struktur Leukoantosianidin

8. Antosianin

Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar luas dalam tumbuhan. Pigmen yng berwarna kuat dan larut dalam air ini adalah penyebab hampir semua warna merah jambu, merah marak , ungu, dan biru dalam daun, bunga, dan buah pada tumbuhan tinggi. Secara kimia semua antosianin merupakan turunan suatu struktur aromatik tunggal yaitu sianidin, dan semuanya

terbentuk dari pigmen sianidin ini dengan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil atau dengan metilasi atau glikosilasi.

O

OH

Struktur Antosianin

9.Khalkon

Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat kuat dengan sinar UV bila dikromatografi kertas. Aglikon flavon dapat dibedakan dari glikosidanya, karena hanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas dalam pengembang air (Harborne, 1996).

O

Struktur Khalkon

10. Auron

Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita. Dalam larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan tampak pada kromatografi kertas berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet warna kuning kuat berubah menjadi merah jingga bila diberi uap amonia (Robinson, 1995).

HC O

O

Struktur Auron

Prazat utama flavonoida sendiri sudah diketahui tanpa keraguan sebagai hasil dari banyak percobaan, tetapi masih banyak pertanyaan yang belum terjawab

mengenai jalur rinci yang diikuti. Sering teramati bahwa dalam spesies tumbuhan tertentu semua flavoida yang berbeda-beda mempunyai pola hidroksilasi cincin yang sama, perbedaan hanya terdapat asetilasi, glikosilasi, dan struktur bagian C-3. Pengamatan ini menunjukkan bahwa terdapat senyawa antara C-15 yang umum diubah menjadi berbagai senyawa flavonoida setelah pola hidroksilasi cincin terbentuk.

Akan tetapi, tampaknya berbagai gugus hidroksil ini sesungguhnya dimasukkan pada tahap yang berlainan dalam sintesis. Misalnya, jika hidroksil-7 harus terdapat pada produk akhir (misalnya sianidin), gugus ini harus terdapat pada cincin A kalkon. Pemasukan gugus hidroksil-3 ke dalam molekul yang sudah mengandung hidroksil-4 dapat terjadi bahkan pada tahap akhir jalur, dan jika telah ditambahkan tidak dapat dihilangkan. Hidroksil-3 ini terjadi dalam sistem bebas sel. Gugus hidroksil-2 yang tidak begitu lazim sering kali ditambahkan pada tahap flavonol dan jika telah ditambahkan biasanya tidak dihilangkan. Hidroksil-3 yang menjadi ciri flavonol dan antosianidin tampaknya juga ditambahkan pada tahap flavanonol. Hidroksilase-3 adalah oksigenase mikrosom, tetapi hidriksilasi-3 dikatalisis oleh enzim yamg larut. Pada flavonoida C-glikosida, gula terikat pada atom karbon flavonoida dan dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzene dengan suatu ikatan karbon-karbon yang tahan asam (Robinson,1995).

Menurut Harborne (1996), dikenal sekitar sepuluh kelas flavonoida dimana semua flavonoida, menurut strukturnya, merupakan turunan senyawa induk flavon dan semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama yakni:

Golongan flavonoida Penyebaran Ciri khas

Antosianin

Proantosianidin

Flavonol

Flavon

pigmen bunga merah marak, dan biru juga dalam daun dan jaringan lain.

terutama tan warna, dalam daun tumbuhan berkayu.

Terutamako-pigmen tanwarna dalam bunga sianik dan asianik; tersebar luas dalam daun.

seperti flavonol

larut dalam air, λmaks 515-545 nm,

bergerak dengan BAA pada kertas.

menghasilkan antosianidin (warna dapat diekstraksi dengan amil alkohol) bila jaringan dipanaskan dalam HCl 2M selama setengah jam. Setelah hidrolisis, berupa bercak kuning mirip pada kromatogram Forestal bila disinari dengan sinar UV;maksimal spektrum pada 330-350 nm.

Setelah hidrolisis, berupa bercak coklat redup pada kromatogram forestal; maksimal spektrum pada 330-350nm.

Golongan flavonoida Penyebaran Ciri khas

Biflavonil

Khalkon dan auron

Flavanon

Isoflavon

Glikoflavon

tanwarna; hampir seluruhnya terbatas pada gimnospermae.

pigmen bunga kuning, kadang-kadang terdapat juga dalam jaringan lain

tanwarna; dalam daun dan buah ( terutama dalam Citrus ) tanwarna; sering kali dalam akar; hanya terdapat dalam satu suku,Leguminosae

Seperti Flavonol

Pada kromatogram BAA berupa bercak redup dengan Rf tinggi. Dengan amonia berwarna merah

Maksimal spektrum 370-410nm.

Berwarna merah kuat dengan Mg/HCl; kadang-kadang sangat pahit.

Bergerak pada kertas dengan pengembang air; tak ada uji warna yang khas

Mengandung gula yang terikat melalui ikatan C-C; bergerak dengan pengembang air, tidak seperti flavon biasa.

2.2.3. Sifat kelarutan Flavonoida

Aglikon flavonoida adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi harus diingat, bila dibiarkan dalam larutan basa, dan di samping itu terdapat oksigen, banyak yang akan terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksi, atau suatu gula, flavonoida merupakan senyawa polar, maka umumnya flavonoida cukup larut dalam pelarut polar seperti Etanol (EtOH), Metanol (MeOH), Butanol (BuOH), Aseton, Dimetilsulfoksida (DMSO), Dimetilformamida (DMF), Air dan lain-lain. Adanya gula yang terikat pada flavonoida (bentuk yang umum ditemukan) cenderung menyebabkan flavonoida lebih mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut yang disebut diatas dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon dan flavon serta flavonol yang termetoksilasa

cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti Eter dan Kloroform (Markham, 1988).

2.3. Teknik Pemisahan

Tujuan dari teknik pemisahan adalah untuk memisahkan komponen yang akan ditentukan berada dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponen lainnya. Ada 2 jenis pemisahan:

1. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan di pisahkan.

2. Pemisahan fisika adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifat antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam suatu golongan (Muldja, 1995).

2.3.1. Kromatografi

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusiskan antara dua fase, satu dari fasa-fasa ini membentuk lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat. Fasa stasioner mungkin suatu zat padat atau suatu cairan dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas (Underwood, 1981).

2.3.1.1. Kromatografi Lapisan Tipis

Kromatografi lapisan tipis (KLT) dapat dipakai dengan dua tujuan. Yang pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, dan preparative.Kedua dipkai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi.

Pada hakikatnya Kromatografi lapisan tipis melibatkan dua sifat fase : sifat fasa diam atau sifat lapisan dan sifat fase gerak atau campuran pelarut pengembang .Fasa diam dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap (kromatografi cair padat ) atau berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair (kromatografi cair-cair).Fasa diam pada KLT sering disebut penyerap, walaupun sering berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair di dalam sistem kromatogarafi cair-cair . Hampir segala macam serbuk dapat dipakai sebagai penyerap pada KLT , yaitu : silika gel (asam silikat). Alumina (aluminium oksida),kiselgur (tanah diatome), dan selulosa. Fasa gerak dapat berupa hampir segala macam pelarut atau campuran pelarut (Sudjadi, 1986).

2.3.1.2. Kromatografi Kolom

Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut. Ukuran keseluruhan kolom sungguh beragam, tetapi biasanya panjangnya sekurang –kurangnya 10 kali garis tengah dalamnya dan mungkin saja sampai 100 kali.

Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastik. Pelarut (fasa gerak ) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong oleh tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom (Gritter , 1991).

2.3.1.3.Harga Rf (Retension Factor)

Mengidentifikasi noda – noda dalam lapisan tipis lazim menggunakan harga Rf yang diidentifikasi sebagai perbandingan antara jarak perambatan suatu zat

dengan jarak perambatan pelarut yang dihitung dari titik penotolan pelarut zat. Jarak yang ditempuh oleh tiap bercak dari titik penotolan diukur dari pusat bercak. Untuk mengidentifikasi suatu senyawa, maka harga Rf senyawa tersebut dapat dibandingkan dengan harga Rf senyawa pembanding (Sastrohamidjojo, 1991).

penotolan titik dari pelarut peramba Jarak penotolan titik dari bercak n perambat Jarak Rf tan a = 2.3.2. Ekstraksi

Ekstraksi dapat dilakukan dengan metode maserasi, sokletasi, dan perkolasi. Sebelum ekstraksi dilakukan, biasanya serbuk tumbuhan dikeringkan lalu, dihaluskan dengan derajat kehalusan tertentu, kemudian diekstraksi dengan salah satu cara diatas. Ekstraksi dengan metode sokletasi dapat dilakukan secara bertingkat dengan berbagai pelarut berdasarkan kepolarannya, misalnya n-heksana, eter, benzena, kloroform, etil asetat, metanol, etanol, dan air.

Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif terhadap senyawa yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan ekstrak pekat biasanya pelarut ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotari evaporator (Harbone, 1996).

2.4.Teknik Spektroskopi

Teknik spektroskopi adalah salah satu teknik analisis kimia – fisika yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektronagnetik. Ada dua macam instrument pada teknik spekstroskopi yaitu spectrometer dan spektrofotometer. Instrumen yang memakai monokromator celah tetap pada bidang focus disebut sebagai spectrometer. Apabila spectrometer tersebut

dilengkapi dengan detektor yang bersifat fotoelektrik maka disebut spektrofotometer (Muldja, 1995).

Informasi Spektroskoi Inframerah menunjukkan tipe-tipe dari adanya gugus fungsi dalam satu molekul . Resonansi magnetik inti memberikan informasi tentang bilangan dari setiap tipe dari atom hidrogen. Kombinasinya dan data kadang-kadang menentukan struktur yang lengkap dari molekul yang tidak diketahui (Pavia, 1986).

Walaupun spektrum infra – merah merupakan kekhasan sebuah molekul secara menyeluruh, gugus atom tertentu memberikan penambahan pita-pita pada kerapatan tertentu, ataupun didekatnya, apapun bangun molekul selebihnya. Keberlakuan seperti itulah yang memungkinkan kimiawan memperoleh informasi tentang struktur yang berguna serta mendapatkan acuan bagi peta umum frekuensi gugus yang khas (Silverstain , 1986).

2.4.1. Spektrometri ultra violet

Serapan molekul di dalam derah ultra ungu dan terlihat dari spektrum bergantung pada struktur ultra elektronik dari molekul. Penyerapan sejumlah energi, menghasilkan percepatan dari elektron dalam orbital tingkat dasar ke orbital yang berenergi lebih tinggi di dalam keadaan tereksitasi (Silverstein, 1986).

Spektrum Flavonoida biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut Metanol (MeOH) atau Etanol (EtOH). Spektrum khas terdiri atas dua maksima pada rentang 240-285 nm (pita II) dan 300-550 nm (pita I). Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksima tersebut memberikan informasi yang berharga mengenai sifat flavonoida dan pola oksigenasinya. Ciri khas spektrum tersebut ialah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dihidroflavon, dihidroflavonol, dan isoflavon serta kedudukan pita I pada spektrum khalkon, auron dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi.

Ciri spektrum golongan flavonoida utama dapat ditunjukkan sebagai berikut : (Markam, 1988)

λ maksimum utama (nm)

λ maksimum tambahan (nm) (dengan intensitas nisbi) Jenis flavonoida 475-560 390-430 365-390 350-390 250-270 330-350 300-350

± 275 (55%) 240-270 (32%) 240-260 (30%) ± 300 (40%) ± 300 (40%) tidak ada tidak ada Antosianin Auron Kalkol Flavonol Flavonol

Flavon dan biflavonil Flavon dan biflavonil

λ maksimum utama (nm)

λ maksimum tambahan (nm) (dengan intensitas nisbi) Jenis flavonoida 275-295 ± 225 310-330 310-330 (30%) 310-330 (30%) 310-330 (25%)

Flavanon dan flavononol Flavonon dan flavononon Isoflavon

2.4.2. Spektrofotometri Infra Merah (FT - IR)

Spekrum infra merah suatu molekul adalah hasil transisi antara tingkat energi getaran yang berlainan. Pancaran infra merah yang kerapatannya kurang dari 100 cm-1 (panjang gelombang lebih daripada 100 µ m) diserap oleh sebuah molekul organik dan diubah menjadi putaran energi molekul.

Penyerapan ini tercantum, namun spektrum getaran terlihat bukan sebagai garis – garis melainkan berupa pita – pita. Hal ini disebabkan perubahan energi

getaran tunggal selalu disertai sejumlah perubahan energi putaran (Silverstein, 1986).

2.4.3. Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)

Spektrometri Resonansi Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Rresonance, NMR ) merupakan alat yang berguna pada penentuan struktur molekul organik. Teknik ini memberikan informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam molekul. Struktur NMR memberikan informasi mengenai lingkungan kimia atom hydrogen, jumlah atom hydrogen dalam setiap lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom hydrogen (Cresswell, 1982).

Pergeseran kimia adalah pengukuran medan dalam keadaan bebas. Semua proton-proton dalam satu molekul yang ada dalam lingkungan kimia yang serupa kadang-kadang menunujukkan pergeseran kimia yang sama. Setiap senyawa memberikan penaikan menjadi puncak absorpsi tunggal dalam spektrum NMR

BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1. Alat – alat

1. Gelas ukur 50 ml pyrex

2. Gelas Beaker 250 ml pyrex

3. Gelas Erlenmeyer 250 ml pyrex

4. Corong Saring

5. Corong Pisah 500 ml duran

6. Kolom Kromatografi 20/40 pyrex 7. Tabung Reaksi

8. Plat Skrining

9. Neraca Analitis Mettler PM 480

10.Alat Pengering Memmers

11.Rotari Evaporator Buchi B-480

12.Labu Alas 500 ml pyrex 13.Alat pengukur titik lebur

14.Statif dan klem

15.Lampu UV 254 nm

16.Spatula

17.Batang Pengaduk 18.Pipet Tetes 19.Botol Vial

20.Bejana Kromatografi lapis tipis

21.Spektrofotometer FT – IR Jasco

22.Spektrometer 1H-NMR Hitahci FTNMR R

-1986

23.Spektrofotometer UV – Visibel 24.Kertas Saring

3.2. Bahan – bahan

1. Buah Tumbuhan Harimonting ((R. tomentosa. W.Ait.) 2. Metanol

3. N-heksana

4. Etil Asetat p.a E.merck

5. Silikagel 60 F254 E.merck Art. 554

6. Silikagel 60 G type E E.merck Art. 7734

7. Pereaksi Feri Klorida 5 %

8. Pereaksi Natrium Hidroksida 10 % 9. H2SO4(p)

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1.Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah buah tumbuhan Harimonting yang diperoleh dari daerah Tambunan Baruara, Kabupaten Toba Samosir, Sumatera Utara. Buah tumbuhan Harimonting dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk sebanyak 1500 gram.

3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Buah Tumbuhan Harimonting

Serbuk buah tumbuhan Harimonting diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Uji Busa

2. Skrining Fitokimia

3.3.2.1.Uji Busa

Serbuk buah tumbuhan Harimonting sebanyak 1500 g dimaserasi dengan metanol, kemudian sebanyak 5ml ekstrak methanol dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 10 ml aquadest dan dipanaskan pada penangas air. Lalu dikocok-kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10 menit. Ternyata busa hilang yang membuktikan bahwa di dalam buah tumbuhan Harimonting tidak terdapat senyawa glikosida.

3.3.2.2. Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa Flavonoid pada buah tumbuhan Harimonting, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif. Serbuk buah tumbuhan Harimonting diekstraksi maserasi dengan metanol, dikeringkan. Filtrat yang diperoleh ditambahkan pereaksi H2SO4(p), NaOH 10%, FeCl3 5% dan Mg-HCl,

terjadilah perubahan warna pada setiap penambahan pereaksi yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid.

3.3.2.3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254. Fasa gerak yang digunakan adalah

campuran n-Heksana : Etil Asetat dengan perbandingan (90 : 10)v/v ; (80 : 20)v/v; (70: 30)v/v; (60 : 40)v/v ; (50 : 50)v/v.

Prosedur analisis kromatografi lapis tipis :

Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (90 : 10) v/v ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan. Diamati warna bercak yang timbul dibawah sinar Ultra Violet dengan λ= 254 nm dan dihitung harga Rf yang

diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-Heksana : Etil asetat (80 : 20)v/v;(70:30)v/v;(60:40)v/v;(50:50)v/v. Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam buah tumbuhan Harimonting terkandung senyawa flavonoid. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak n-Heksana:Etil asetat(80:20)v/v.

Harga Rf dapat dilihat pada kromatogram (Lampiran 3).

3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Dari Ekstrak Buah Tumbuhan Harimonting

Serbuk buah tumbuhan Harimonting ditimbang sebanyak 1500 g, dimasukkan ke dalam bejana dan ditambahkan dengan pelarut metanol sampai semua terendam oleh pelarut dan dibiarkan selama 48 jam dan sesekali diaduk. Maserat disaring dan diperoleh ekstrak berwarna hijau. Maserasi dilakukan berulang kali dengan menggunakan pelarut metanol sampai ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoid. Ekstrak metanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator pada suhu 600C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksan, sehingga terbentuk lapisan n-heksan dan lapisan metanol. Fraksi metanol ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan rotarievaporator, sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol sebanyak 10,23 gram.

3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoid dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoid secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol buah tumbuhan Harimonting yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60 G dan fasa gerak adalah campuran pelarut n-Heksana : etil

asetat dengan perbandingan (90: 10)v/v;(80:20)v/v;(70:30)v/v(60:40)v/v;(50:50)v/v.

Dirangkai seperangkat alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60 G dengan menggunakan n-Heksan, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-Heksan 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 10,23 g ekstrak pekat buah tumbuhan Harimonting ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel di puncak kolom, lalu ditambahkan fasa gerak n-Heksana : etil asetat dengan perbandingan (90: 10)v/v;(80:20)v/v;(70:30)v/v(60:40)v/v;(50:50)v/v secara perlahan-lahan dan diatur aliran fasa gerak yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoid dan diuapkan sampai pelarutnya habis hingga terbentuk kristal.

3.3.5. Pemurnian

Senyawa yang diperoleh dari fraksi yaitu pada fraksi 41-80 dilakukan pemurnian senyawa. Senyawa pada fraksi 41-80 dilarutkan dengan etil asetat, sehingga pengotor pada amorf akan larut dan larutannya didekantasi kemudian disaring dan dimurnikan dilakukan secara berulang-ulang.

3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis(KLT)

Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat

(80:20)v/v.

Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis:

Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan pada KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi Feri klorida

dalam air menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid. Perlakuan yang sama dilakukan, dan difiksasi dengan Natrium Hidroksida dalam air yang menghasilkan bercak berwarna biru violet.

3.3.7. Analisis Spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi

3.3.7.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer UV-Visible

Analisis Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Laboratorium Dasar Bersama UNAIR Surabaya (Lampiran 5).

3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Inframerah

Analisis spektrum inframerah dengan spektrofotometer dilakukan di Laboratorium Dasar Bersama UNAIR Surabaya (Lampiran 7).

3.3.7.3. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)

Analisis ini dilakukan di Laboratorium Dasar Bersama UNAIR Surabaya dengan menggunakan CDCl3 sebagai pelarut dan TMS sebagai standart dalam spektrum

3.5. Bagan Penelitian

← diskrining fitokimia

← dimaserasi dengan 6 L metanol selama ± 48 jam ← disaring

← dipekatkan

dengan rotari evaporator ←dipartisi n-heksana

← diskrining fitokimia ← diskrining ← dipekatkan dengan rotari evaporator ← fitokimia

← di analisis KLT untuk menentukan eluen pada pemisahan kromatografi kolom ← dibuburkan sampel dengan silika gel

← dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 GE netral dan fasa gerak(eluen) n-heksana : etil asetat (90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 ; 50:50)v/v ← ditampung setiap fraksi sebanyak 5 ml dalam botol vial

← di KLT

← digabung fraksi dengan Rf yang sama

← diuji pereaksi ← diuji pereaksi ← diuji pereaksi ← diuji pereaksi ← diuji pereaksi

← diuapkan

←dimurnikan ← dianalisis KLT

← dianalisis dengan Spektrometer FT-IR, spektrometer 1 H-NMR,

Spektrofotometer UV-Visible 1500 g serbuk buah

Tumbuhan Harimonting

Residu Ekstrak Metanol sebanyak 4 L

Ekstrak pekat metanol sebanyak 2 L

Fraksi n-heksana 500 ml Fraksi metanol sebanyak 1,5 L

Ekstrak Pekat methanol sebanyak 10,23 g Hasil Negatif

Fraksi 1-20 Fraksi 21- 40 Fraksi 41-80 Fraksi 81-100 Fraksi 101-120

Hasil negatif Hasil positif Fraksi 41-80 Hasil positif Hasil negatif

senyawa

Senyawa murni

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Penelitian

Dari hasil skrining pendahuluan terhadap ekstrak methanol dari buah tumbuhan Harimonting (R. tomentosa.W.Ait) dengan adanya penambahan pereaksi-pereaksi warna untuk menentukan golongan senyawa kimia yang dikandung dengan menggunakan pereaksi flavonoid yakni:

- Pereaksi FeCl3 5% memberikan warna hitam

- Pereaksi NaOH 10% memberikan warna biru violet - Pereaksi Mg-HCl memberikan warna merah muda - Pereaksi H2SO4(p) memberikan warna coklat

Dari hasil kromatografi lapis tipis dengan menggunakan adsorben silika gel 60F254, dapat diketahui bahwa pelarut yang baik untuk mengisolasi senyawa

flavonoid dari buah tumbuhan Harimonting ((R. tomentosa. W.Ait.) adalah n-heksan : etil asetat pada perbandingan ( 80 : 20 )v/v.

Dari hasil isolasi buah tumbuhan Harimonting (R. tomentosa. W.Ait.) diperoleh senyawa berwarna coklat berbentuk amorf sebanyak 60 mg.

Dari Spektrum UV-Visible memberikan 2 pita serapan yaitu pita II dengan λ = 256 nm dan pita I dengan λ = 310 nm sebagai bahu.

Hasil analisis Spektrofotometer FT-IR dari senyawa hasil isolasi menghasilkan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang sebagai berikut :

1. Pada bilangan gelombang 3443,59 cm-1 puncak sedang (menunjukkan adanya vibrasi yang mengikat gugus OH).

2. Pada bilangan gelombang 2924-2853,59 cm-1 puncak kuat (menunjukkan adanya vibrasi gugus CH alifatis)

3 Pada bilangan gelombang 1627,65 cm-1 puncak kuat ( menunjukkan adanya vibrasi gugus C=O dari keton )

4 Pada bilangan gelombang 1497,68 – 1464,67 cm-1 puncak sedang (menunjukkan adanya vibrasi gugus C=C)

5 Pada bilangan gelombang 1376,70 cm-1 puncak lemah (menunjukkan adanya vibrasi gugus CH3)

6 Pada bilangan gelombang 1288,69 – 1215,69 cm-1 puncak lemah (menunjukkan adanya vibrasi gugus C-O)

7 Pada bilangan gelombang 1172,70 – 614,75 cm-1 puncak lemah (menunjukkan adanya vibrasi gugus CH senyawa aromatik)

Hasil analisis Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) memberikan pergeseran kimia pada daerah (δ/ppm) sebagai berikut :

1. Pergeseran kimia pada daerah δ = 1,831 ppm puncak singlet (s) menunjukkan adanya proton-proton gugus metil pada prenil (-CH2

-CH=C(CH3)2) (Markham, 1988).

2. Pergeseran kimia pada daerah δ = 3,402 ppm puncak singlet (s) menunjukkan adanya proton-proton gugus CH pada prenil (-CH2

-CH=C(CH3)2) (Markham, 1988).

3. Pergeseran kimia pada daerah δ = 3,803 ppm puncak singlet (s) menunjukkan adanya proton metoksi (-OCH3-6 dan –OCH3-4’)

(Markham, 1988).

4. Pergeseran kimia pada daerah δ = 4,057 ppm puncak singlet (s) menunjukkan adanya proton pada CH gula (Markham, 1988).

5. Pergeseran kimia pada daerah δ = 5,206 ppm puncak singlet (s) menunjukkan adanya proton –OH pada cincin A atau pada cincin B.

6. Pergeseran kimia pada daerah δ = 6,219 ppm puncak singlet (s) menunjukkan adanya proton H6 pada cincin A (Markham, 1988).

7. Pergeseran kimia pada daerah δ = 6,75 ppm puncak singlet (s) menunjukkan adanya proton H2 pada cincin C (Markham, 1988).

8. Pergeseran kimia pada daerah δ = 7,254 ppm puncak singlet (s) menunjukkan adanya pelarut CDCl3.

4.2. Pembahasan

Buah tumbuhan Harimonting ((R. tomentosa. W.Ait.) dinyatakan mengandung senyawa flavonoid berdasarkan hasil skrining fitokimia yang dilakukan dengan pereaksi FeCl3 5%, NaOH 10%, Mg-HCl, dan H2SO4(p). Terhadap buah tumbuhan

Harimonting ((R. tomentosa. W.Ait.) dilakukan ekstraksi maserasi dan juga partisi dengan menggunakan perbandingan pelarut n-Heksan : etil asetat (80 : 20)v/v berdasarkan KLT yang dilakukan, karena pada perbandingan tersebut menghasilkan noda lebih banyak dan pemisahannya lebih baik.

Dari hasil analisis Spektrofotometer ultra violet-visible (UV-Visible) dengan pelarut metanol (Lampiran 5) memberikan 2 pita serapan panjang gelombang yaitu pada pita I dengan λ = 310 nm bahu dan pita II dengan λ = 256 nm. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa adalah golongan flavonoida yang mempunyai struktur seperti Isoflavon (Lampiran 6)

O OH O OH HO A C B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' Isoflavon

Dari hasil interpretasi spektrum FT-IR dan spektrum resonansi magnetik inti proton (1H-NMR) senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut CDCl3

dalam standardt TMS diperoleh bahwa :

1 Pergeseran kimia pada daerah δ = 1,831ppm puncak singlet (s) menunjukkan adanya proton-proton gugus metil pada prenil (-CH2

-CH=C(CH3)2). Hal ini didukung oleh Spektrofotometer IR pada

bilangan gelombang 1376,70 cm-1 terdapat puncak lemah yang menunjukkan adanya vibrasi gugus metil (-CH3)

2 Pergeseran kimia pada daerah δ = 3,402 ppm puncak singlet (s). menunjukkan adanya proton-proton gugus CH pada prenil (-CH2

-CH=C(CH3)2). Hal ini didukung oleh Spektrofotometer IR pada

bilangan gelombang 2924-2853,59 cm-1 terdapat puncak kuat menunjukkan adanya vibrasi gugus CH alifatis.

3 Pergeseran kimia pada daerah δ = 3,803 ppm puncak singlet (s) menunjukkan adanya proton metoksi. Hal ini didukung oleh Spektrofotometer IR pada bilangan gelombang 1288,69-1215,69 cm-1 terdapat puncak lemah menunjukkan adanya vibrasi gugus C-O.

4 Pergeseran kimia pada daerah δ = 4,057 ppm puncak singlet (s) menunjukkan adanya proton pada CH gula. Hal ini didukung oleh Spektrofotometer IR pada bilangan gelombang 2924-2853,59 cm-1 terdapat puncak kuat menunjukkan adanya vibrasi gugus CH alifatis.

5 Pergeseran kimia pada daerah δ = 5,206 ppm puncak singlet (s) menunjukkan adanya proton –OH. Hal ini didukung oleh Spektrofotometer IR pada bilangan gelombang 3443,59 cm-1 terdapat puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi dari atom C yang mengikat gugus OH.

6 Pergeseran kimia pada daerah δ = 6,219ppm, 6,75ppm menunjukkan adanya proton pada senyawa aromatik. Hal ini didukung oleh Spektrofotometer IR pada bilangan gelombang 1172,70-614,75 cm-1 terdapat puncak lemah menunjukkan adanya vibrasi gugus CH senyawa aromatik.

Berdasarkan data dan analisa terhadap spektrum UV-Visible, spektrum FT-IR dan spektrum 1H-NMR, memperlihatkan bahwa senyawa hasil isolasi adalah senyawa flavonoida yang struktur senyawanya jenis Isoflavon dengan kemungkinan estimasi kedudukan relatif gugus-gugusnya seperti struktur berikut:

O

OH O

OH HO

A C

B

1

2

3 4 5

6 7

8 9

10 1'

2' 3'

4'

5' 6'

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan

1. Hasil isolasi yang diperoleh dari 1500 gram buah tumbuhan Harimonting (Rhodomyrtus tomentosa. W.Ait), diperoleh berupa amorf yang berwarna coklat sebanyak 60 mg.

2. Berdasarkan hasil uji skrining fitokimia dan análisis Spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer Inframerah (FT-IR) dan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) dapat disimpulkan bahwa senyawa hasil isolasi adalah senyawa Isoflavonoida.

5.2. Saran

1. Perlu dilakukan analisis Spektroskopi Massa agar diperoleh data-data yang lebih mendukung untuk menentukan struktur senyawa flavonoida yang diperoleh dari hasil isolasi.

DAFTAR PUSTAKA

Agus Anwar, 1986. Pemeriksaan Pendahuluan Senyawa Kimia Daun Karamunting.Departemen Farmasi ITB. Bandung

Bernasconi, G. 1995. Teknologi Kimia. Jilid 2. Edisi pertama. Jakarta. PT. Pradaya Paramita.

Creswell, C. J. 1982. Analisa Spektrum Senyawa Organik. Edisi ke-2. Terjemahan Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Bandung: ITB.

Effendy, S. 1982.Ensiklopedia Tumbuh-tumbuhan Berkhasiat yang ada di Bumi Nusantara. Surabaya : Penerbit Karya Anda.

F.S.P.Ng. D Phil. 1978. Tree Flora Of Malaya A Manual for Foresters. Volume Three. Forest Depertment Ministry of Primary Industries. Malaysia.

Gritter, R. J. 1991. Pengantar Kromatografi. Terbitan ke-2.Terjemahan Kosasih Padmawinata. ITB. Bandung.

Harbone, J. B. 1996. Metode Fitokimia. Penentuan Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Terbitan ke-2. Terjemahan Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. ITB. Bandung.

Keng, H. 1987. Order And Families Of Malayan Seed Plants Singapore. Singapore University Press.

Markham, K. R.1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoida. Terjemahan Kosasih Padmawinata. ITB. Bandung.

Muldja, M. H. 1995. Analisis Instrumental. Cetakan ke-1. Universitas Airlangga Press. Surabaya.

Pavia, L. D. 1979. Introduction to Spectroscopy a Guide for Students of Organic Chemistry. Saunders College. Philadelphia.

Rianto, D. S. 2009.Isolasi Senyawa Flavonoida Dari Tumbuhan Harimonting. Departemen Kimia. FMIPA USU. Medan.

Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Edisi ke-4 Terjemahan

Kosasih Padmawinata. ITB Press. Bandung.

Sastrohamidjojo, H. 1991. Kromatografi. Edisi ke-1. Penerbit Liberty. Yogyakarta.

Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam.Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Silverstein, R. M. 1986. Penyidikan Spektrometrik Senyawa Organik. Edisi ke-4. Terjemahan A. J. Hartomo dan Anny Victor Purba. Erlangga. Jakarta.

Sudjadi. 1986. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta.

Underwood, A. L. 1981. Analisa Kimia Kuantitatif. Edisi ke-4. Erlangga. Jakarta.

Lampiran 1. Gambar buah Tumbuhan Harimonting (Rhodomyrtus tomentosa W.ait.)

Lampiran 2. Determinasi Tumbuhan Harimonting (Rhodomyrtus tomentosa W.ait.)

Lampiran 3. Hasil Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak Metanol Buah Tumbuhan Harimonting

Fasa Diam : Silikagel 60 F254 ( E. MERCK ART 554

E : Ekstrak metanol buah tumbuhan Harimonting

No Fasa Gerak Jumlah

noda

Warna Noda Rf

1 2

3

4

5

n-heksana: etil asetat(90:10)v/v n-heksana: etil asetat(80:20)v/v

n-heksana: etil asetat(70:30)v/v

n-heksana: etil asetat(60:40)v/v

n-heksana: etil asetat(50:50)v/v

- 5 4 3 - - Merah Lembayung gelap Merah Merah Merah Merah Merah Merah Lembayung gelap Merah Merah Merah - - 0,81 0,79 0,76 0,40 0,33 0,86 0,81 0,70 0,52 0,76 0,62 0,52 -

Lampiran 4. Hasil Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Hasil Isolasi Melalui Penampakan Noda Dengan Pereaksi

No Penampakan bercak Pereaksi Warna Noda Rf

1 I FeCl3 5% Hitam 0,81

Lampiran 5. Spektrum Ultraviolet- Tampak (UV-Visible) Senyawa hasil isolasi

Lampiran 6. Spektrum Ultraviolet Tampak (UV-Visible) senyawa pembanding

Lampiran 8. Spektrum Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) senyawa hasil isolasi

Lampiran 9. Spektrum Resonansi Magnetik Inti Proton ( 1H-NMR) Senyawa Pembanding (Markham,1988)

Lampiran 4. Hasil Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Hasil Isolasi Melalui Penampakan Noda Dengan Pereaksi

No Penampakan bercak Pereaksi Warna Noda Rf

1 I FeCl3 5% Hitam 0,81

2 II NaOH 10% Biru Violet 0,81

Lampiran 5. Spektrum Ultraviolet- Tampak (UV-Visible) Senyawa hasil isolasi

Lampiran 6. Spektrum Ultraviolet Tampak (UV-Visible) senyawa pembanding

Lampiran 8. Spektrum Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) senyawa hasil isolasi

Lampiran 9. Spektrum Resonansi Magnetik Inti Proton ( 1H-NMR) Senyawa Pembanding (Markham,1988)