Isolation, Characterization, Cloning Coat protein Gene of Begomovirus As DNA Probe.
1
ISOLASI, KARAKTERISASI, KLONING GEN PROTEIN
SELUBUNG (COAT PROTEIN) BEGOMOVIRUS SEBAGAI
PELACAK DNA (DNA PROBE)
DEVI AGUSTINA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
2
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi, Karakterisasi,
Kloning Gen Protein Selubung (Coat Protein) Begomovirus Sebagai Pelacak
DNA (DNA Probe) adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Februari 2010
Devi Agustina
NRP P052106041
3
ABSTRACT
DEVI AGUSTINA. Isolation, Characterization, Cloning Coat protein Gene of
Begomovirus As DNA Probe. Supervised By UTUT WIDYASTUTI and SRI
HENDRASTUTI HIDYAT.
Begomoviruses has been reported to cause serious diseases in a number of
economically crops in the world. Infection of Begomovirus in Indonesia was
reported since 1999 and caused significant yield losses especially in chillipepper.
The objectives of this research were to isolate, characterize and clone coat protein
gene from Begomovirus infecting chillipepper into pGEM-T Easy vector and to
use the clone as DNA Probe in dot blot hybridization. Coat protein gene of
Begomovirus isolate originated from Ngluwar-Magelang was successfully
isolated, characterized and cloned to pGEM-T Easy. Based on multiple alignment
analysis using clustal W it is evidenced that recombinant DNA of Begomovirus
isolate Ngluwar has high homology (> 90%, e value 0,0) with other
Begomoviruses published earlier in GenBank. Dot blot hybridization method
using recombinant DNA clone of Begomovirus isolate Ngluwar as DNA probe
was able to detect Begomovirus from various sources (infected plants, PCR
products from total DNA, cloned DNA) with sensitivity up to 0,0001 µg/µl. The
use of DNA probe should be further evaluated for its use as detection tool for
Begomovirus.
Keywords: Begomovirus, Coat Protein, DNA Probe
4
RINGKASAN
DEVI AGUSTINA. Isolasi, Karakterisasi, Kloning Gen Protein Selubung (Coat
Protein) Begomovirus Sebagai Pelacak DNA (DNA Probe). Dibimbing oleh
UTUT WIDYASTUTI dan SRI HENDRASTUTI HIDYAT.
Infeksi Begomovirus (Famili Geminiviridae) dilaporkan telah
menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi pada beberapa jenis tanaman. Di
Indonesia serangan Begomovirus pada pertanaman cabai pertama kali dilaporkan
pada tahun 1999 di daerah Jawa Barat oleh Hidayat et al. (2006). Selanjutnya
Sulandari et al. (2006) melaporkan bahwa kejadian penyakit yang tinggi pada
pertanaman cabai yang disebabkan oleh Begomovirus berlangsung sejak awal
tahun 2000, telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi di beberapa daerah
yaitu: Daerah Istimewa Yogyakarta, Jawa Tengah dan Jawa Barat, dengan
kehilangan hasil pada cabai besar mencapai 100% dan pada cabai kecil 50-70%.
Hingga saat ini Begomovirus masih menjadi patogen penting yang menyebabkan
kehilangan hasil yang tinggi pada pertanaman cabai di Indonesia. Begomovirus
penyebab penyakit pada tanaman cabai di beberapa daerah di Indonesia tersebut
selanjutnya disebut Pepper Yellow Leaf Curl Indonesia Virus (PYLCIV).
Karakteristik Begomovirus yang tinggi turut menentukan sulitnya mengendalikan
serangan penyakit pada berbagai tanaman inangnya yaitu keragaman genetiknya
yang tinggi. Implikasi dari keragaman tersebut bermanfaat dalam pengembangan
metode deteksi Begomovirus yang tepat dan cepat mendeteksi keberadaan
Begomovirus.
Pengendalian penyakit yang disebabkan oleh Begomovirus memerlukan alat
deteksi yang tepat untuk menentukan infeksi dini. Seiring dengan kemajuan di
bidang bioteknologi telah membuka peluang besar bagi terealisasinya
ketersediaan teknik deteksi yang efektif dan efisien. Salah satunya yaitu dengan
mengkonstruksi suatu pelacak DNA (DNA probe ) sebagai alat deteksi penyakit
dengan prinsip hibridisasi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan
memperoleh klon rekombinan gen protein selubung (coat protein) Begomovirus
yang akan digunakan sebagai pelacak DNA pada pengembangan sistem deteksi
penyakit tanaman yang disebabkan oleh Begomovirus.
Gen protein selubung Begomovirus isolat Ngluwar yang berukuran 780 bp
berhasil diisolasi melalui amplifikasi dengan PCR menggunakan primer spesifik
untuk gen AV1 Begomovirus yaitu: CPPROTEIN-V1 dan CPPROTEIN-C1.
Melalui teknik rekayasa genetik gen protein selubung tersebut berhasil diklon
dalam plasmid pGEM-T Easy.
Karakterisasi terhadap gen protein selubung rekombinan Begomovirus
melalui analisis kesejajaran dan sesifisitas menunjukkan bahwa klon rekombinan
tersebut memiliki kesamaan dan spesifisitas yang tinggi terhadap isolat
Begomovirus lain yang terdapat di GenBank sehingga dapat digunakan sebagai
pelacak DNA (DNA probe) melalui pelabelan menggunakan digoksigenin.
Hubungan kekerabatan tertinggi dengan kelompok Ageratum yellow vein virus.
Pelacak DNA Begomovirus memiliki spesifisitas yang tinggi terhadap
Begomovirus karena tidak mendeteksi virus yang lain, dengan sensitifitas untuk
mendeteksi Begomovirus pada kisaran konsentrasi 1-0,0001 µg/µl.
5
Metode penyiapan sampel tanaman uji dengan kemampuan untuk
mengekstrak titer virus yang tinggi menjadi kunci utama untuk menjawab
permasalahan sensitifitas dalam pengembangan teknik deteksi pelacak DNA yang
diperoleh dalam penelitian ini sebagai alat deteksi Begomovirus, Geminiviridae
yang efektif dan efisien.
Kata Kunci: Begomovirus, Gen Protein Selubung, Pelacak DNA (DNA Probe)
6
© Hak cipta milik IPB, tahun 2010
Hak cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
7
ISOLASI, KARAKTERISASI, KLONING GEN PROTEIN
SELUBUNG (COAT PROTEIN) BEGOMOVIRUS SEBAGAI
PELACAK DNA (DNA PROBE)
DEVI AGUSTINA
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
8
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Miftahuddin
9
Judul :
Nama :
NIM :
Isolasi, Karakterisasi, Kloning Gen Protein Selubung (Coat Protein)
Begomovirus Sebagai Pelacak DNA (DNA Probe).
Devi Agustina
P052060041
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si
Ketua
Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Bioteknologi
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Suharsono, DEA
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS
Tanggal Ujian: 25 Februari 2010
Tanggal Lulus:
10
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Lampung Utara, 24 Agustus 1984. Penulis
merupakan anak sulung dari dua bersaudara pasangan Suhardi (Alm) dan
Rohimah, S.Pd.
Gelar Sarjana Pertanian dengan predikat kelulusan: Dengan Pujian (cum
laude) sekaligus sebagai Mahasiswa Terbaik I Fakultas Pertanian diperoleh pada
tahun 2006 di Universitas Lampung, program studi Ilmu Hama dan Penyakit
Tumbuhan, jurusan Proteksi Tanaman. Pada tahun yang sama penulis terdaftar
sebagai mahasiswa program Magister Sains di program studi Bioteknologi,
Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Selama menjadi mahasiswa
penulis aktif mengikuti berbagai seminar dan pelatihan yang berhubungan dengan
bidang bioteknologi dan proteksi tanaman.
11
PRAKATA
Alhamdulillahhirrabil’alamin. Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah
SWT karena hanya atas ridho dan karuniaNya tesis dengan judul Isolasi,
Karakterisasi, Kloning Gen Protein Selubung (Coat Protein) Begomovirus
Sebagai Pelacak DNA (DNA Probe) ini dapat diselesaikan dengan baik.
Penulis mempersembahkan rasa terimakasih dan penghargaan yang tak
terhingga kepada Dr. Utut Widyastuti dan Dr. Sri Hendrastuti Hidayat atas
kesempatan dan kepercayaan yang diberikan kepada penulis serta segala
bimbingan yang diberikan dengan setulus hati kepada penulis demi lahirnya
sebuah karya tesis ini. Penelitian tugas akhir (tesis) ini dapat terlaksana dengan
adanya bantuan dana dari Hibah Kompetisi Direktorat Pendidikan Tinggi,
Kementrian Pendidikan Nasional, RI Tahun Anggaran 2008 atas nama Dr. Sri
Hendrastuti Hidayat.
Terimakasih penulis sampaikan kepada: Dr. Trijoko Santoso yang telah
memberi kesempatan dan kesediaan waktu bagi penulis selama bekerja di Lab.
Biologi Molekuler, BB-BIOGEN (Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian) Cimanggu-Bogor, Saudari Tuti
S. Legiastuti yang telah memberikan pengarahan kepada penulis selama bekerja di
Laboratorium Virologi-Departemen Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas
Pertanian, IPB serta Bapak Saefudin (Mput) atas bantuannya di rumah kaca
Cikabayan, Darmaga.
Terimakasih penulis ucapkan untuk semua anggota Laboratorium Virologi
dan teman-teman Bioteknologi khususnya angkatan 2006 dan 2007, Ilmu Pangan
2006, Ilmu Pengetahuan Kehutanan 2006 serta semua keluarga di Felix House,
Pondokan Sunda Karya dan Wisma Radar 36 untuk semua kebersamaan kita yang
sarat akan arti perjuangan dan pelajaran untuk menjadi manusia yang dewasa dan
bertanggungjawab. Semoga Allah senantiasa melimpahi kesuksesan dan
kebahagiaan bagi kita semua. Amin.
Rasa terimakasih yang tiada henti berikut penghargaan yang tak terhingga
penulis persembahkan kepada ayahanda Suhardi (Alm), ibunda Rohimah, S.Pd,
adinda Suhendra dan sahabat Georgius Andhan K atas limpahan cinta dan kasih
sayang serta doa panjang sepenuh hati demi terselesaikan tesis ini.
Terimakasih pula penulis persembahkan untuk keluarga besar Muhammad
Jusuf (Alm) dan Sultan Permata Alam (Alm) atas dukungan moral dan material
yang telah diberikan kepada penulis. Semoga Allah SWT senantiasa memberikan
ridhoNya bagi kita semua di dunia dan akhirat dengan memeluk hati dan mimpi
kita dalam ikatan kekeluargaan yang indah, selamanya. Amin.
Pada akhirnya penulis berharap semoga karya ini mampu berkontribusi
bagi kemajuan dan kearifan ilmu pengetahuan di masa yang akan datang. Amin
Bogor, Februari 2010
Penulis
12
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................... vi
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... vi
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... vii
PENDAHULUAN ......................................................................................... 1
Latar Belakang ......................................................................................... 1
Tujuan Penelitian ..................................................................................... 4
TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................
Karakter Molekuler Begomovirus..............................................................
Penyakit Tanaman yang Disebabkan Begomovirus...................................
Keragaman Genetik Begomovirus ............................................................
Deteksi Begomovirus .................................................................................
5
5
6
7
8
BAHAN DAN METODE ..............................................................................
Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................................
Metode Penelitian ......................................................................................
Isolasi DNA Total Begomovirus..............................................................
Amplifikasi DNA Begomovirus..............................................................
Pengklonan DNA Begomovirus Hasil Amplifikasi ................................
Ligasi ..................................................................................................
Transformasi.......................................................................................
Penyiapan Bakteri Kompeten ........................................................
Introduksi DNA Rekombinan ........................................................
Konfirmasi Klon Rekombinan................................................................
Seleksi Plasmid Rekombinan dengan Media Selektif ........................
Isolasi Plasmid Rekombinan ..............................................................
Isolasi DNA Sisipan Melalui Pemotongan dengan Enzim Restriksi .
Perunutan DNA ..................................................................................
Karakterisasi Gen Protein Selubung Begomovirus .................................
Hibridisasi DNA .....................................................................................
Persiapan Sampel Uji .........................................................................
Persiapan Membran ............................................................................
Pelabelan Pelacak DNA .....................................................................
Prehibridisasi ......................................................................................
Pencucian Membran ...........................................................................
Hibridisasi ..........................................................................................
Deteksi................................................................................................
10
10
10
10
11
12
12
12
12
13
13
13
13
14
15
15
15
15
16
16
17
17
17
17
HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................................
Isolasi dan Amplifikasi DNA Total Begomovirus .....................................
Isolasi DNA Total Begomovirus .............................................................
Amplifikasi Gen Protein Selubung Begomovirus...................................
Pengklonan Gen Protein Selubung Begomovirus ......................................
19
19
19
21
22
13
Konfirmasi Klon Rekombinan...................................................................
Seleksi Plasmid Rekombinan dengan Media Selektif .............................
Isolasi Plasmid Rekombinan ..................................................................
Isolasi DNA Sisipan melalui Pemotongan dengan Enzim Restriksi ......
Perunutan DNA ......................................................................................
Karakterisasi Gen Protein Selubung Begomovirus ....................................
Analisis Kesejajaran ................................................................................
Analisis Spesifisitas................................................................................
Hibridisasi DNA ........................................................................................
23
23
24
25
27
28
28
29
35
SIMPULAN DAN SARAN............................................................................. 40
Simpulan .................................................................................................... 40
Saran .......................................................................................................... 40
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 41
LAMPIRAN..................................................................................................... 46
14
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Kualifikasi DNA total Begomovirus berdasarkan nilai adsorbansi ........... 21
2 Hasil analisis kesejajaran gen protein selubung Begomovirus ................... 29
3 Nilai penyejajaran (alignment score) gen protein selubung rekombinan
terhadap ke-12 isolat Begomovirus ............................................................. 30
15
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Struktur genom Begomovirus Bipartit dan Monopartit .............................. 6
2 Gejala infeksi Begomovirus pada tanaman Tomat (A) dan
Tembakau (B).............................................................................................. 7
3 Situs pemotongan EcoR1 pada plasmid pGEMT-Easy............................... 14
4 Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer AV1 terhadap 4 isolat
Begomovirus................................................................................................ 22
5 Klon rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar hasil seleksi biru-putih (A)
dan replika klon rekombinan (B)................................................................. 24
6 Hasil isolasi plasmid terhadap 14 klon rekombinan Ngluwar
Begomovirus................................................................................................ 25
7 Pemotongan klon rekombinan menggunakan enzim restriksi EcoR1 ........ 27
8 Kladogram sekuen klon rekombinan Begomovirus, Ngluwar A dan B
dibandingkan dengan ke-12 isolat Begomovirus......................................... 31
9 Hubungan kekerabatan gen protein selubung rekombinan Begomovirus
isolat Ngluwar A dengan beberapa Begomovirus yang terdapat di
GenBank pada tingkat kemiripan 75%........................................................ 34
10 Hasil hibridisasi dot-blot pelacak DNA Begomovirus. ............................ 36
16
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Hasil perunutan nukleotida gen protein selubung Begomovirus hasil
amplifikasi PCR .......................................................................................... 47
2 Hasil perunutan nukleotida gen protein selubung rekombinan
Begomovirus isolat Ngluwar A ................................................................... 48
3 Hasil perunutan nukleotida gen protein selubung rekombinan
Begomovirus isolat Ngluwar B ................................................................... 49
4 Hasil penyejajaran dan kaldogram terhadap ketiga gen protein selubung
Begomovirus: rekombinan isolat Ngluwar A (A), rekombinan isolat
Ngluwar B (B) dan hasil amplifikasi PCR (C) ........................................... 50
17
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Begomovirus dilaporkan telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi
dengan luas serangan yang tinggi pula. Serangan Begomovirus di Indonesia yaitu
pada pertanaman cabai pertama kali dilaporkan pada tahun 1999 di daerah Jawa
Barat oleh Hidayat et al. (2006). Selanjutnya Sulandari et al. (2006) melaporkan
bahwa kejadian penyakit pada pertanaman cabai yang disebabkan oleh
Begomovirus berlangsung sejak awal tahun 2000 dan telah menyebabkan
kehilangan hasil yang tinggi di beberapa daerah yaitu: Daerah Istimewa
Yogyakarta, Jawa Tengah dan Jawa Barat. Kehilangan hasil pada cabai besar saat
itu mencapai 100% dan pada cabai kecil 50-70%. Hingga saat ini Begomovirus
masih menjadi patogen penting yang menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi
pada pertanaman cabai di Indonesia. Begomovirus penyebab penyakit pada
tanaman cabai di beberapa daerah di Indonesia tersebut selanjutnya disebut
Pepper Yellow Leaf Curl Indonesia Virus (PYLCIV).
Begomovirus merupakan anggota Famili Geminiviridae yaitu pada
Subkelompok III (ICTVdB 2006). Begomovirus merupakan anggota geminivirus
dengan jumlah spesies yang paling melimpah yaitu lebih dari seratus spesies
dengan tanaman dikotil sebagai inangnya dan ditularkan oleh vektor kutu kebul
Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Secara morfologi, Begomovirus
memiliki partikel yang tidak beramplop, berbentuk ikosahedral simetri dan
ditemukan selalu berpasangan atau geminate (kembar), dengan ukuran partikel
masing-masing sekitar 15-30 nm (Fauquet 2005). Asam nukleat Begomovirus
berupa utas tunggal DNA (ssDNA). Genom berbentuk sirkuler dan ditemukan
dalam bentuk monopartit (terdiri dari satu genom) atau bipartit (terdiri dari dua
genom) (ICVdB 2006; Van Regenmortel et al. 2000; Voyles 2002).
Diketahui bahwa Begomovirus memiliki keragaman genetik yang tinggi.
Santoso (2008) melaporkan adanya keragaman genetik di antara isolat-isolat
Begomovirus yang berasal dari daerah-daerah di Jawa dan Sumatera melalui
analisis teknik PCR-RFLP. Selanjutnya berdasarkan analisis filogenetik diketahui
bahwa isolat-isolat Begomovirus terbagi menjadi tiga kelompok berbeda. Isolat
Brastagi, Bogor, Sragen, Ketep dan Boyolali berkerabat dekat dengan ToLCV-
18
Java (Tobacco Leaf Curl Virus-Java), isolat Malang dan Blitar berkerabat dekat
dengan AYVV-China (Ageratum Yellow Vein Virus-China) sedangkan isolat
Kaliurang berkerabat dengan TYLCV-China (Tomatto Yellow Leaf Curl VirusChina) atau ToLCV-Laos (Tobacco Leaf Curl Virus-Laos). Trisno (2010) juga
melaporkan mengenai keragaman genetik 11 isolat Begomovirus pada tanaman
cabai di Sumatera Barat yang terbagi menjadi tiga kelompok. Keragaman genetik
yang tinggi ini di duga karena adanya kejadian rekombinasi genetik di antara
isolat-isolat Begomovirus. Sifat penularan Begomovirus melalui vektor dengan
penularan secara tunggal atau bersamaan dengan strain yang berbeda maupun
geminivirus lainnya pada tanaman inang yang sama maupun berkerabat dekat
turut menentukan peluang terjadinya rekombinasi genetik yang tinggi antar isolatisolat Begomovirus. Implikasi dari keragaman genetik yang tinggi ini menjadi
bahan pertimbangan bagi para pemulia tanaman untuk merakit tanaman yang
tahan terhadap Begomovirus, yaitu untuk merakit varietas yang tahan terhadap
beberapa isolat Begomovirus atau merakit beberapa varietas tahan untuk isolat
Begomovirus tertentu. Selain itu informasi mengenai keragaman genetik ini
bermanfaat dalam pengembangan metode deteksi Begomovirus yang tepat dan
cepat.
Beberapa metode deteksi geminivirus yang telah dikembangkan antara lain:
teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) dan RFLP-PCR (Restriction Fragment
Length Polymorphism-PCR), uji serologi dengan metode ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) dan teknik hibridisasi DNA yang menggunakan pelacak
DNA (DNA probe). Teknik PCR merupakan metode yang umum digunakan
untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus (Yuwono 2006; Aidawati et al.
2005; Palmer et al. 1998). Amplifikasi geminivirus, umumnya menggunakan
primer universal yaitu PAL1v 1978 dan PAR1c 715 dengan ukuran fragmen DNA
yang diharapkan sebesar 1,6 kb (Rojas et al. 1993; Rusli 2000; Sudiono 2001).
Selain itu dapat juga digunakan primer spesifik yaitu AV1 yang akan
mengamplifikasi daerah penyandi gen protein selubung (coat protein) dengan
ukuran fragmen 780 bp (Santoso 2008; Meliyansah 2010; Fauziah 2010). Metode
deteksi dengan teknik RFLP-PCR, dengan prinsip dasar PCR dan enzim restriksi,
selain mampu mendeteksi keberadaan geminivirus juga mampu menunjukkan
19
perbedaan strain antar virus sehingga dapat digunakan untuk menelusuri
hubungan genetik dan keragaman virus (Gilbertson et al. 1993), seperti yang
dilakukan oleh Sudiono et al. (2004) yang menemukan adanya 2 strain
Begomovirus yang berbeda yang menyerang cabai di Jawa Barat. Teknik ELISA
merupakan teknik deteksi virus berdasarkan pada pengujian serologi. Beberapa
keunggulan teknik ELISA yaitu memberikan hasil pengujian yang sensitif,
mampu menyajikan data kuantitatif dan prosedur ELISA dapat dibuat otomatisasi
(Agrios 2005). Akan tetapi teknik ini memiliki kelemahan yaitu penyediaan
antigen yang spesifik membutuhkan alokasi waktu yang lama dengan biaya yang
tidak murah. Khususnya untuk geminivirus, sampai saat ini ketersediaan
antiserum dan stabilitasnya masih menjadi faktor penghambat utama untuk
memanfaatkan teknik ini sebagai alat deteksi yang efektif dan efisien. Hal tersebut
disebabkan oleh sifat fisik dan kimia partikel virus yang membuatnya sulit untuk
dimurnikan dalam bentuk yang stabil, sifat imunogenik dari virion yang lemah,
homologi protein selubung terutama bagi virus-virus yang ditularkan oleh B.
tabaci (Roberts et al. 1984). Teknik deteksi geminivirus berbasis asam nukleat
dengan prinsip hibridisasi menggunakan pelacak DNA telah banyak digunakan
untuk menjawab kelemahan dari teknik deteksi PCR maupun ELISA. Prinsip
teknik deteksi ini yaitu terjadinya komplementasi asam nukleat antara asam
nukleat pelacak dengan genom virus. Beberapa kelebihan teknik deteksi ini
dibandingkan dengan teknik deteksi geminivirus lainnya yaitu tingkat spesifisitas
yang tinggi, relatif mudah dan pelaksanaannya cepat dengan jumlah sampel yang
banyak (Aidawati 2006; Rubio et al. 2003). Selain spesifisitas yang tinggi, teknik
ini mampu menunjukkan korelasi positif antara akumulasi DNA virus yang
dideteksi dengan intensitas gejala (Rom et al. 1993; Rubio et al. 2003).
Pelacak DNA yang digunakan dalam teknik deteksi hibridisasi dapat
bersifat universal maupun spesifik terhadap Geminivirus. Spesifisitas pelacak
DNA memegang peranan sangat penting dalam pengembangannya sebagai alat
deteksi yang efektif dan efisien. Semakin spesifik pelacak DNA yang digunakan
akan menambah keakuratan hasil deteksi (Keller & Manak 1992).
Aidawati
(2006) telah menggunakan teknik deteksi hibridisasi dot-blot menggunakan
pelacak DNA yaitu klon partial DNA Tobacco Leaf Curl Virus (TobLCV), yang
20
mencakup sebagian daerah ORF V1 yang menyandikan protein selubung dan
ORF C1 yang menyandikan gen replikasi, yang dilabel dengan digoxigenin, yang
bersifat universal terhadap geminivirus dan mampu mendeteksi keberadaan
geminivirus pada sap tanaman hingga faktor pengenceran 10-2. Untuk menjawab
kebutuhan akan teknik deteksi berbasis pada uji asam nukleat dengan teknik
hibridisasi Dot-Blot yang efektif dan efisien, maka dalam penelitian ini telah
dikonstruksi suatu pelacak DNA yang bersifat spesifik terhadap Begomovirus
dengan memanfaatkan gen protein selubung Begomovirus.
Gen protein selubung Begomovirus yang disandikan oleh ORF AV1 pada
DNA A Begomovirus merupakan daerah genom yang berfungsi sebagai
pembentuk selubung protein, penularan dengan vektor serta untuk pergerakan
virus. Selain itu gen protein selubung memiliki daerah genom yang mempunyai
runutan susunan DNA dengan derajat kesamaan yang tinggi (conserved) antar
anggota geminivirus. Oleh karena sifatnya tersebut, daerah genom tersebut banyak
digunakan sebagai dasar pemilihan primer untuk mengamplifikasi DNA
geminivirus dalam pengembangan teknik deteksi dan identifikasi Begomovirus
(Morin et al. 2000; Astier et al. 2001; Fraquet et al. 2005; Santoso 2008). Teknik
deteksi yang dikembangkan dalam penelitian ini diharapkan kelak bermanfaat
sebagai alat deteksi penyakit yang disebabkan oleh geminivirus khususnya
Begomovirus sekaligus juga bermanfaat untuk menyeleksi genotipe tanaman yang
rentan, resisten maupun toleran terhadap Begomovirus.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan
memperoleh klon rekombinan gen protein selubung (coat protein) Begomovirus
yang akan digunakan sebagai pelacak DNA pada pengembangan sistem deteksi
penyakit tanaman yang disebabkan oleh Begomovirus.
21
TINJAUAN PUSTAKA
Karakter Molekuler Begomovirus
Begomovirus merupakan anggota geminivirus dengan jumlah spesies yang
paling melimpah yaitu lebih dari seratus spesies dengan tanaman dikotil sebagai
inangnya.
International
Committee
on
Taxonomy
of
Viruses
(ICTV)
mengklasifikasikan Begomovirus ke dalam Famili Geminiviridae yaitu pada
Subkelompok III (ICTVdB 2006). Secara morfologi, Begomovirus memiliki
partikel yang tidak beramplop dengan bentuk partikel yang memanjang dan
ikosahedral simetris. Partikel virus ditemukan selalu berpasangan atau geminate
(kembar) sebagai ciri khas famili geminiviridae sehingga disebut geminivirus,
dengan ukuran partikel masing-masing sekitar 15-30 nm (Fauquet 2005).
Asam nukleat Begomovirus berupa utas tunggal DNA (ssDNA). Genom
Begomovirus berbentuk sirkuler. Ditemukan dalam bentuk monopartit (terdiri dari
satu genom) maupun bipartit (terdiri dari dua genom). Umumnya Begomovirus
ditemukan dalam bentuk bipartit, dengan ukuran masing-masing genom yang
disebut DNA-A dan DNA-B sekitar 2,5-3,0 kb, sehingga total ukuran genom
mencapai 5,5 kb (ICVdB 2006; Van Regenmortel et al. 2000; Voyles 2002).
Bipartit
Monopartit
Gambar 1 Struktur genom Begomovirus Bipartit dan Monopartit
Genom bipartit Begomovirus terdiri dari DNA A dan DNA B. Keduanya
memiliki daerah intergenik (IR = Intergenic Region) yang mencakup daerah
common region (CR) dengan fungsi pengaturan (regulatory function) yang terdiri
dari beberapa ORF (Open Reading Frame). Pada IR/CR terdapat promotor dan
urutan basanya sebagai awal terjadi transkripsi.
22
Pada DNA A, terdapat protein selubung yang disandikan oleh Coat Protein
gene (ORF AV1) berfungsi sebagai pembentuk selubung protein, penularan
dengan vektor serta untuk pergerakan virus. Gen penyandi selubung protein
merupakan daerah genom yang mempunyai runutan susunan DNA dengan derajat
kesamaan yang tinggi (conserved) antar anggota geminivirus. Oleh karena
sifatnya tersebut, daerah genom tersebut banyak digunakan sebagai dasar
pemilihan primer untuk mengamplifikasi DNA geminivirus. Komponen AV1 juga
berperan dalam melindungi ssDNA virus dan penularan oleh vektor ketika virus
masuk ke dalam sistem pencernaan serangga vektor dengan melindungi partikel
virus dari degradasi (Morin et al. 2000; Astier et al. 2001; Fauquet et al. 2005).
CP dan Pre CP (BV1) berperan untuk pergerakan keluar masuk genom virus dari
inti sel inang (Briddon et al. 1989). Replikasi Begomovirus diatur oleh Rep gene
pada ORF AC1. Adapun transkripsi Begomovirus diaktivasi oleh TrAP gene pada
ORF AC2 yang merupakan protein aktivator transkripsi. Pada ORF AC3 terdapat
Ren gene yang berfungsi sebagai pembentukan protein untuk penginduksi
replikasi (replication enhancer). Ekspresi gejala penyakit diatur regulasinya oleh
C4 pada DNA A. Pada DNA B dapat ditemukan adanya Nuclear Shuttle Protein
(NSP) gene pada ORF BV1 yang berfungsi sebagai penyandi virion DNA B dan
membentuk nuclear shuttle protein. Selain itu pada DNA B, terdapat Movement
Protein (MP) gene (ORF BC1) yang berfungsi sebagai protein yang
bertanggungjawab untuk perpindahan dari satu sel ke sel lain dalam
plasmodesmata inang (Fauquet et al. 2005; Hull 2002; Van Regenmortel et al.
2000). Genom monopartit merupakan kombinasi antara DNA A dan DNA B pada
genom bipartit yang dikemas dalam satu partikel dengan fungsi yang sama
(Fauquet et al. 2005; Hull 2002).
Penyakit Tanaman yang Disebabkan Begomovirus
Begomovirus adalah virus tanaman dengan kisaran inang yang sangat luas,
terutama tanaman dikotil dari famili: Asclepiadaceae, Asteraceae, Apiaceae,
Fabaceae, Malvaceae dan Solanaceae. Begomovirus adalah anggota kelompok
geminiviridae dengan anggota yang paling banyak yaitu lebih dari 80 anggota, di
antaranya adalah: Abutilon mosaic virus, Acalypha yellow mosaic virus, African
cassava mosaic virus, Ageratum yellow vein virus, Bean calico mosaic virus,Bean
23
dwarf mosaic virus, Bean golden mosaic virus, Bean golden yellow mosaic virus,
Tomato golden mosaic virus, Watermelon chlorotic stunt virus, Watermelon curly
mottle virus (Fauquet et al. 2005). Sebagian besar dari tanaman inang tersebut
merupakan tanaman dengan nilai ekonomi tinggi.
Infeksi Begomovirus pada tanaman menunjukkan gejala yang bervariasi.
Namun secara umum gejala berupa perubahan warna dan bentuk daun yaitu: daun
mengeriting dan berwarna kuning, diikuti dengan ukuran daun yang mengecil,
tanaman menjadi kerdil (Gambar 2), ukuran buah yang menjadi kecil sehingga
pada akhirnya menyebabkan penurunan hasil mencapai 100%. Keberagaman
gejala tersebut disebabkan oleh beberapa faktor antara lain: strain virus, kultivar
dan umur tanaman pada waktu terinfeksi serta kondisi lingkungan (Polston &
Anderson 1997).
A
B
Gambar 2 Gejala infeksi Begomovirus pada tanaman tomat (A) dan
tembakau (B)
Begomovirus hanya dapat ditularkan melalui serangga vektor. Vektor
Begomovirus adalah serangga ordo Hemiptera, family Aleyrodidae, yaitu: kutu
kebul (Bemisia tabaci Gennadius). Vektor B. tabaci memiliki sifat penularan yang
persisten, dengan periode akuisisi yaitu fase pengambilan virus melalui proses
makan (sekitar 10 menit), periode laten yaitu fase virus tertahan pada vektor
sebelum periode inokulasi (sekitar 4-21 jam) dan periode inokulasi yaitu fase
makan inokulasi (12-24 jam) (Fauquet et al. 2005).
Keragaman Genetik Begomovirus
Keragaman genetik Begomovirus yang tinggi merupakan salah satu kendala
dalam pengendalian penyakit dan kerusakan yang ditimbulkan. Rekombinasi
genetik pada Begomovirus adalah kunci utama yang berperan dalam keragaman
diversifikasi dan evolusi Begomovirus, dengan frekuensi rekombinasi tertinggi
24
pada N-terminal dari ORF C1/AC1 yang menyandikan gen Replication-associated
protein yang berperan dalam proses replikasi virus (Prasana & Rai 2007).
Keragaman genetik Begomovirus yang tinggi berasosiasi dengan tanaman
inangnya dimana terjadi transfer genetik Begomovirus dari tanaman inang aslinya
yang liar ke tanaman budidaya yang menyebabkan rekombinasi genetik
Begomovirus (Ambrozevicius et al. 2005). Selain itu, Ala-Poikela et al. (2005)
menyatakan bahwa infeksi ganda Begomovirus pada suatu tanaman inang
menyebabkan terjadinya rekombinasi genetik dan memberi peluang bagi
munculnya strain baru Begomovirus. Rekombinasi antara geminivirus dapat
berimplikasi pada lahirnya strain baru yang sangat patogenik yang mampu
mematahkan ketahanan tanaman inangnya seperti yang dilaporkan oleh Monci et
al. (2002) yang menemukan adanya rekombinasi alami antara Tomato yellow leaf
curl Sardinia virus dan Tomato yellow leaf curl virus yang menghasilkan suatu
fenotip baru yang bersifat patogenik dan menyebabkan epidemi penyakit di
Spanyol. Keragaman genetik Begomovirus turut dipengaruhi oleh vektornya yaitu
B. tabaci sebagai satu-satunya agen penularan Begomovirus yang juga memiliki
keragaman genetik yang tinggi seperti yang telah dilaporkan oleh Aidawati
(2006).
Keragaman genetik Begomovirus memiliki berbagai implikasi. Diantaranya
bagi para pemulia tanaman informasi keragaman genetik dapat digunakan sebagai
acuan dalam pendekatan perakitan varietas tahan, untuk merakit varietas yang
tahan, untuk isolat-isolat Begomovirus tertentu saja. Informasi keragaman genetik
bermanfaat dalam perakitan suatu teknik deteksi, dengan melihat suatu bagian
yang memiliki konservasi tinggi pada genom Begomovirus dan peluang terendah
untuk terjadinya rekombinasi.
Deteksi Begomovirus
Secara konvensional deteksi Begomovirus dapat dilakukan dengan
pengamatan gejala penyakit, uji penularan melalui vektor dan pengamatan partikel
di bawah mikroskop elektron (Bos 1990). Kemajuan di bidang biologi molekuler
telah menghasilkan berbagai metode deteksi yang lebih akurat, efektif dan efisien.
Beberapa metode deteksi tersebut antara lain: teknik PCR (Polymerase Chain
Reaction) dan RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR), uji
25
serologi dengan metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), teknik
hibridisasi DNA dengan menggunakan pelacak DNA (DNA probe). Selain teknik
PCR, metode deteksi hibridisasi Dot-Blot dengan menggunakan pelacak DNA
merupakan metode yang telah umum digunakan untuk mendeteksi keberadaan
Begomovirus. Keberhasilan teknik deteksi ini sangat bergantung pada spesifisitas
pelacak (probe) yang digunakan (Keller & Mark 1992). Teknik hibridisasi ini
mampu menjawab kekurangan teknik deteksi lainnya (PCR dan ELISA) yaitu:
tingkat spesifisitas yang tinggi, mudah dan cepat dilakukan dengan jumlah sampel
yang banyak, seperti yang dilaporkan oleh Rom et al. (1993), Pico et al. (1999)
dan Rubio et al. (2003) yang mendeteksi TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl
Virus) dengan teknik hibridisasi menggunakan pelacak DNA TYLCV yang
dilabel dengan digoxigenin.
Tingkat spesifisitas yang tinggi dicerminkan oleh kemampuan teknik
deteksi ini untuk mendeteksi keberadaan DNA virus dalam titer virus yang
rendah. Dilaporkan oleh Aidawati (2006) bahwa pelacak DNA yang dilabel
dengan digoksigenin berhasil mendeteksi cairan perasan tanaman yang terinfeksi
Begomovirus hingga pengenceran 10-2.
Rubio et al. (2003) menyatakan bahwa teknik deteksi hibridisasi mampu
memberikan informasi terkait adanya korelasi yang positif antara gejala dan titer
virus pada tanaman terinfeksi. Hal yang sama juga dilaporkan oleh Rom et al.
(1993) yang menunjukkan bahwa akumulasi DNA virus yang dideteksi dengan
teknik hibridisasi berkorelasi positif dengan intensitas gejala. Oleh karena itu
selain bermanfaat sebagai alat deteksi penyakit yang disebabkan oleh
Begomovirus, teknik ini juga bermanfaat untuk menyeleksi genotipe tanaman
yang rentan, resisten maupun toleran terhadap Begomovirus. Maka untuk tujuan
tersebut teknik hibridisasi lebih baik dibandingkan dengan teknik PCR, seperti
yang dilaporkan oleh Pico et al. (1999).
26
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Kegiatan penelitian dilakukan di Laboratorium Virologi, Departemen
Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium
Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan
Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN), Cimanggu-Bogor, sejak Juni 2008
hingga Februari 2010.
Metode Penelitian
Kegiatan penelitian ini meliputi lima tahapan utama yaitu: (1) isolasi DNA
total Begomovirus, (2) amplifikasi DNA Begomovirus, (3) kloning DNA
Begomovirus hasil amplifikasi dan konfirmasi klon rekombinan, (4) karakterisasi
gen Begomovirus dan (5) hibridisasi DNA dengan pelabelan digoxigenin
menggunakan DIG-High Prime DNA labeling and Detection Starter Kit I (Roche
2004).
Isolasi DNA Total Begomovirus
Isolat Begomovirus dalam penelitian ini berasal dari tanaman tomat yang
terinfeksi oleh Begomovirus yang diperoleh dari Segunung-Cianjur, SeyeganSleman, Ngluwar-Magelang dan Sedan-Rembang. DNA total diperoleh dengan
teknik isolasi DNA metode CTAB (Doyle & Doyle 1990).
Tahapan isolasi DNA total diawali dengan memanaskan 10 ml bufer
ekstraksi (2% CTAB, 100 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1%
2-β-merkaptoetanol) dalam penangas air pada suhu 65°C. Sampel daun tanaman
sakit (seberat 0,1 gram) digerus sampai lembut dengan menggunakan mortar
dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro
berukuran 1,5 ml dan ditambahkan 500 μl bufer ekstraksi yang sudah dipanaskan
kemudian dicampur dengan baik. Campuran hasil gerusan dan bufer ekstraksi
diinkubasi pada suhu 65 °C selama 60 menit dan setiap 10 menit tabung mikro
dibolak-balik untuk membantu proses lisis. Setelah 60 menit, campuran tersebut
diambil dari penangas air dan didiamkan sebentar (2 menit) pada suhu ruang,
kemudian ditambahkan 500 μl campuran Kloroform:Isoamilalkohol (CI) dengan
perbandingan 24:1. Agar tercampur dengan baik, tabung divorteks selama 5 menit
27
kemudian disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 12.000 rpm. Supernatan
yang terbentuk diambil secara hati-hati dan dipindahkan ke tabung mikro yang
baru, lalu ditambahkan 0,1 volume sodium asetat 3 M CH3COONa, pH 5,2 (408,1
g Na-asetat.3H2O di dalam 800 ml H2O) dan dicampur dengan baik. Setelah itu,
ditambahkan lagi dengan 2/3 x volume isopropanol atau 2,5 x volume etanol
absolut yang bertujuan untuk mengendapkan DNA dengan membolak-balik
tabung perlahan. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu -20°C selama 60
menit atau semalam, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama
10 menit untuk mengendapkan DNA. Endapan DNA yang diperoleh kemudian
dikeringanginkan.
Sebagai tahap akhir dari isolasi DNA adalah pencucian dan suspensi DNA.
Pencucian DNA dilakukan dengan etanol 70% yang berfungsi untuk
membersihkan sisa-sisa garam maupun kontaminan lainnya yang mengendap.
Selanjutnya endapan dilarutkan dengan bufer TE 1x (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1
mM EDTA) sebanyak 50-100 μl.
Amplifikasi DNA Begomovirus
Amplifikasi DNA Begomovirus dilakukan dengan teknik PCR yang
dilakukan mengikuti prosedur Rojas et al. (1993) dengan primer spesifik untuk
gen AV1 Begomovirus yaitu: CPPROTEIN-V1 dan CPPROTEIN-C1 yang akan
mengamplifikasi bagian gen protein selubung (coat protein). Sekuen nukleotida
primer
CPPROTEIN-V1
TCGAAGCGACCCGCCGA-3’
yaitu:
sedangkan
5’TAATTCTAGATG
CPPROTEIN-C1
yaitu:
5’-
GGCCGAATTCTTAATTTTGAACAGAATCA-3’ (AVRDC, Taiwan). Program
amplifikasi terdiri atas 30 siklus dengan tahapan: predenaturasi pada suhu 940C
selama 4 menit, denaturasi (fase pemisahan utas DNA) pada suhu 940C selama 1
menit, annealing (pengintegrasian primer) pada suhu 500C
selama 2 menit,
amplifikasi (sintesis untaian DNA baru) pada suhu 720C selama 3 menit dan
tahapan pasca extention pada suhu DNA 720C selama 5 menit. DNA hasil
amplifikasi dielektroforesis pada gel agarosa 1% dan divisualisasi di bawah UV
transiluminator. Untuk memperoleh fragmen tunggal DNA yang tidak tercampur
dari fragmen DNA lainnya, fragmen DNA yang teramplifikasi dielusi dengan
menggunakan QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Selanjutnya fragmen DNA
28
dikonfirmasi dengan perunutan nukleotida dan digunakan sebagai DNA sisipan
(insert) dalam proses ligasi.
Pengklonan DNA Begomovirus Hasil Amplifikasi
Tahapan pengklonan meliputi 3 kegiatan yaitu: Ligasi, Transformasi dan
Konfirmasi klon rekombinan.
Ligasi
Ligasi merupakan proses penyambungan antara vektor dan DNA sisipan
dengan bantuan enzim ligase. Ligasi dilakukan mengikuti metode Promega
(2007). Fragmen DNA hasil amplifikasi PCR disisipkan pada plasmid pGEM -T
Easy dengan bantuan enzim ligase. Reaksi ligasi terdiri atas 60 ng fragmen DNA,
50 ng DNA vektor pGEM-T Easy, 5 μl 2x bufer ligasi T4 DNA ligase, 1 μl T4
DNA Ligase (3 Weiss Unit/μl) dan ditambahkan ddH2O sampai mencapai volume
akhir 10 μl. Bahan-bahan yang sudah dicampur dalam tabung mikro kemudian
diinkubasi pada suhu 4oC selama 16 jam.
Transformasi
Tahapan ligasi dilanjutkan dengan proses introduksi rekombinan yang
dilakukan mengikuti metode Sambrook (1989). Hasil ligasi diintroduksi ke dalam
sel E. coli DH5α yang kompeten sebagai inang, kemudian ditumbuhkan dalam
media yang mengandung agen seleksi untuk mengetahui adanya sisipan di dalam
plasmid.
Penyiapan Bakteri Kompeten. Bakteri E. coli DH5α yang akan digunakan dalam
tahapan transformasi harus berada dalam kondisi kompeten. Penyiapan bakteri
kompeten dilakukan mengikuti metode Sambrook (1989). Sebuah koloni bakteri
E. coli DH5α dari biakan media LB agar (1% Bacto tryptone, 0,5% yeast extract,
0,5% NaCl, pH 7) diambil dan dikulturkan dalam 50 ml medium LB cair pada
suhu 37oC di dalam penggoyang (shaker) pada 200-250 rpm selama 16-18 jam.
Kultur E. coli DH5α tersebut diambil sebanyak 1 ml, diinokulasi pada 10 ml
media LB cair, serta diinkubasi pada kondisi yang sama dengan sebelumnya
sampai diperoleh kerapatan optik A600=0,4-0,5. Selanjutnya kultur bakteri
diinkubasi dalam es selama 10 menit dan dilanjutkan dengan proses pengendapan
dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4oC selama 1 menit.
29
Endapan yang diperoleh disuspensi dengan menambahkan 1 ml 0,1 M CaCl2,
divortex secara perlahan-lahan dan dibiarkan di dalam es selama 10 menit. Setelah
itu suspensi bakteri disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4oC selama
1 menit. Endapan yang diperoleh kemudian disuspensi dengan hati-hati ke dalam
200 l LB cair dan dibiarkan dalam es selama 15 menit. Bakteri yang kompeten
tersebut siap untuk digunakan dalam tahapan transformasi.
Introduksi DNA Rekombinan. Introduksi DNA dilakukan dengan mencampurkan
10-50 ng plasmid hasil ligasi (volumenya kurang dari 10 μl) dengan 100-200 μl
bakteri kompeten dalam 1,5 ml tabung mikro dan setelah itu diinkubasi pada es
selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan perlakuan panas (heat shock) pada suhu
42oC selama 90 detik dan segera diinkubasi pada es selama 2 menit. Sebanyak
250 μl media LB diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit dengan kecepatan
250 rpm. Setelah itu bakteri disebar pada media LB padat yang telah mengandung
100 mg/l ampisilin. Pada media LB ditambahkan juga 0,1 M IPTG (10 μl/ cawan)
dan 2% X-Gal (50 μl/ cawan) untuk memudahkan seleksi koloni. Biakan tersebut
dinkubasi pada suhu 37oC semalam.
Konfirmasi Klon Rekombinan
Konfirmasi klon rekombinan dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu:
seleksi plasmid rekombinan dengan media selektif, isolasi plasmid rekombinan,
isolasi DNA sisipan melalui pemotongan dengan enzim restriksi EcoR1 dan
perunutan DNA (sequensing) terhadap fragmen sisipan dari klon tersebut
sehingga klon yang diperoleh dipastikan membawa fragmen DNA target
Begomovirus.
Seleksi Plasmid Rekombinan dengan Media Selektif. Seleksi plasmid
rekombinan dilakukan berdasarkan warna koloni yang tumbuh pada media selektif
(LB + Ampisilin + IPTG/X-Gal). Koloni berwarna putih akan dipilih dan
dikonfirmasi pada tahapan berikutnya.
Isolasi Plasmid Rekombinan. Isolasi plasmid dilakukan dengan menggunakan
GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas 2006). Koloni E. coli yang
mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam 2 ml media LB yang
mengandung 100 mg/l ampisilin dan diinkubasi di dalam shaker (250 rpm) pada
suhu 37oC selama semalam. Biakan bakteri dalam volume besar kemudian dibagi
30
kedalam tabung mikro yang pangkalnya meruncing (konical). Setelah itu bakteri
diendapkan dengan sentrifugasi pada 13.000 rpm, pada suhu 4oC selama 5 menit
dan hasil endapan bakteri disuspensi dalam 250 μl bufer resuspensi sel (50 mM
Tris HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA). Setelah tersuspensi dengan baik, yaitu ditandai
dengan tidak adanya endapan (atau gumpalan), bakteri dilisis dengan penambahan
250 μl bufer lisis (0,2 M NaOH; 1% SDS). Supaya bufer lisis tercampur rata,
tabung reaksi dibalik-balikkan sebanyak 4-6 x dan dibiarkan 1-2 menit. Bakteri
yang telah lisis ditambah 350 μl bufer netralisasi (1,32 M potasium asetat, pH 4,8)
dan tabung reaksi dibalik-balikkan 4-6 x hingga bufer netralisasi tercampur
merata. Campuran kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 2
menit. Cairan jernih dibagian atas diambil dan dipindahkan ke kolom tabung
reaksi yang bersih. Setelah itu ditambahkan 500 μl bufer pencuci dan
disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit, diulangi kembali
kemudian sentrifugasi kolom kosong (tanpa cairan) pada kecepatan 13.000 rpm
selama 1 menit. Langkah berikutnya adalah memindahkan kolom ke tabung mikro
baru dan steril, menambahkan 50 μl bufer elusi, inkubasi selama 2 menit di suhu
ruang dan sentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit.
Isolasi DNA Sisipan Melalui Pemotongan dengan Enzim Restriksi. DNA
sisipan dipisahkan dari plasmid pGEM-T menggunakan enzim restriksi EcoR1
(Gambar 3).
Gambar 3 Situs pemotongan EcoR1 pada plasmid pGEMT-Easy
31
Sebanyak 10 μl DNA plasmid rekombinan, 2,5 μl larutan penyangga 3NIB
dan 1,5 μl enzim restriksi EcoRI (10 unit/μl) dimasukkan ke dalam tabung mikro
yang kemudian ditambah H2O hingga volume akhir larutan menjadi 25 μl.
Larutan diinkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam. Visualisasi hasil pemotongan
dengan enzim restriksi dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1,5%
seperti diuraikan sebelumnya.
Perunutan DNA. Untuk memastikan bahwa fragmen DNA yang diperoleh dari
klon rekombinan tersebut adalah DNA Begomovirus maka perlu dilakukan
perunutan nukleotida dengan teknik perunutan. Perunutan dilakukan oleh PT.
Macrogen, Korea Selatan.
Karakterisasi Gen Protein Selubung Begomovirus
Gen protein selubung Begomovirus yang diperoleh dalam penelitian ini
selanjutnya akan dikarakterisasi melalui beberapa analisis yaitu analisis
kesejajaran urutan nukleotida gen protein selubung dengan program BLAST
(Basic Local Aligment Search Tools) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) dan
analisis spesifisitas gen protein selubung dilakukan dengan program multiple
alignment, Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/Clustal W). Melalui tahapan analisis
ini dipastikan bahwa fragmen DNA yang diperoleh adalah DNA Begomovirus dan
memiliki tingkat spesifisitas yang tinggi terhadap anggota Begomovirus lainnya
sebagai salah satu syarat utama dalam pengembangannya sebagai metode deteksi .
Hibridisasi DNA
Hibridisasi pelacak DNA sebagai metode deteksi Begomovirus meliputi
beberapa tahapan yaitu: persiapan sampel uji, persiapan membran, pelabelan
pelacak DNA, prehibridisasi, pencucian membran, hibridisasi dan deteksi.
Persiapan Sampel Uji
Pengujian spesifisitas pelacak DNA dilakukan dengan menggunakan
beberapa tanaman sampel yaitu: tanaman tomat sehat (bebas infeksi virus) sebagai
kontrol negatif, tanaman tomat terinfeksi Begomovirus sebagai kontrol positif,
tanaman target terdiri dari gulma Babadotan (Ageratum conyzoides) dan tanaman
tomat yang dikumpulkan dari lapangan yang menunjukkan gejala infeksi
Begomovirus, tanaman yang terinfeksi oleh virus lain terdiri atas tanaman tomat
32
yang terinfeksi ToCV (Tomatto Chlorosis Virus), tanaman cabai yang terinfeksi
ChiVMV (Chilli Veinal Mottle Virus) dan tanaman tembakau yang terinfeksi
TMV (Tobacco Mosaic Virus). Sampel yang akan digunakan terdiri dari 3 jenis
penyiapan: 1) DNA total tanaman yang diperoleh dengan metode ekstraksi
Doyle&Doyle yang dimodifikasi (1990), 2) Cairan perasan tanaman yang
diperoleh berdasarkan prosedur Gilbertson et al. (1991) yaitu 1 gr daun tanaman
dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, lalu ditambahkan 200 μl bufer TE (pH
7,5) kemudian digerus dengan pistil dan selanjutnya tabung tersebut disentrifugasi
pada 10000 rpm selama 10 menit, dan 3) DNA produk amplifikasi menggunakan
primer spesifik AV1 dengan teknik PCR (Rojas et al. 1993). Sebagai pembanding
digunakan plasmid rekombinan utuh, sisipan gen protein selubung Begomovirus
dan vektor pGEM-T Easy serta beberapa plasmid rekombinan Begomovirus yaitu:
plasmid rekombinan gen AV1 TYLCV (TJ Santoso, BB-Biogen), plasmid
rekombinan Full Length dan partial PYLCV (WS Tsai, AVRDC). Seluruh sampel
yang disiapkan dikuantifikasi (1µg/µl) melalui pengukuran nilai absorbansinya
dengan spektrofotometer. Pengujian sensitifitas teknik hibridisasi dilakukan
melalui pengenceran berseri terhadap seluruh sampel yaitu: 10, 10-1 , 10-2 ,10 -3 , 10
-4
,10
-5
-6
, 10 .
Persiapan Membran
Membran nilon Hybond-N (Roche) dipotong sesua
ISOLASI, KARAKTERISASI, KLONING GEN PROTEIN
SELUBUNG (COAT PROTEIN) BEGOMOVIRUS SEBAGAI
PELACAK DNA (DNA PROBE)
DEVI AGUSTINA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
2
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi, Karakterisasi,
Kloning Gen Protein Selubung (Coat Protein) Begomovirus Sebagai Pelacak
DNA (DNA Probe) adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Februari 2010
Devi Agustina
NRP P052106041
3
ABSTRACT
DEVI AGUSTINA. Isolation, Characterization, Cloning Coat protein Gene of
Begomovirus As DNA Probe. Supervised By UTUT WIDYASTUTI and SRI
HENDRASTUTI HIDYAT.
Begomoviruses has been reported to cause serious diseases in a number of
economically crops in the world. Infection of Begomovirus in Indonesia was
reported since 1999 and caused significant yield losses especially in chillipepper.
The objectives of this research were to isolate, characterize and clone coat protein
gene from Begomovirus infecting chillipepper into pGEM-T Easy vector and to
use the clone as DNA Probe in dot blot hybridization. Coat protein gene of
Begomovirus isolate originated from Ngluwar-Magelang was successfully
isolated, characterized and cloned to pGEM-T Easy. Based on multiple alignment
analysis using clustal W it is evidenced that recombinant DNA of Begomovirus
isolate Ngluwar has high homology (> 90%, e value 0,0) with other
Begomoviruses published earlier in GenBank. Dot blot hybridization method
using recombinant DNA clone of Begomovirus isolate Ngluwar as DNA probe
was able to detect Begomovirus from various sources (infected plants, PCR
products from total DNA, cloned DNA) with sensitivity up to 0,0001 µg/µl. The
use of DNA probe should be further evaluated for its use as detection tool for
Begomovirus.
Keywords: Begomovirus, Coat Protein, DNA Probe
4
RINGKASAN
DEVI AGUSTINA. Isolasi, Karakterisasi, Kloning Gen Protein Selubung (Coat
Protein) Begomovirus Sebagai Pelacak DNA (DNA Probe). Dibimbing oleh
UTUT WIDYASTUTI dan SRI HENDRASTUTI HIDYAT.
Infeksi Begomovirus (Famili Geminiviridae) dilaporkan telah
menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi pada beberapa jenis tanaman. Di
Indonesia serangan Begomovirus pada pertanaman cabai pertama kali dilaporkan
pada tahun 1999 di daerah Jawa Barat oleh Hidayat et al. (2006). Selanjutnya
Sulandari et al. (2006) melaporkan bahwa kejadian penyakit yang tinggi pada
pertanaman cabai yang disebabkan oleh Begomovirus berlangsung sejak awal
tahun 2000, telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi di beberapa daerah
yaitu: Daerah Istimewa Yogyakarta, Jawa Tengah dan Jawa Barat, dengan
kehilangan hasil pada cabai besar mencapai 100% dan pada cabai kecil 50-70%.
Hingga saat ini Begomovirus masih menjadi patogen penting yang menyebabkan
kehilangan hasil yang tinggi pada pertanaman cabai di Indonesia. Begomovirus
penyebab penyakit pada tanaman cabai di beberapa daerah di Indonesia tersebut
selanjutnya disebut Pepper Yellow Leaf Curl Indonesia Virus (PYLCIV).
Karakteristik Begomovirus yang tinggi turut menentukan sulitnya mengendalikan
serangan penyakit pada berbagai tanaman inangnya yaitu keragaman genetiknya
yang tinggi. Implikasi dari keragaman tersebut bermanfaat dalam pengembangan
metode deteksi Begomovirus yang tepat dan cepat mendeteksi keberadaan
Begomovirus.
Pengendalian penyakit yang disebabkan oleh Begomovirus memerlukan alat
deteksi yang tepat untuk menentukan infeksi dini. Seiring dengan kemajuan di
bidang bioteknologi telah membuka peluang besar bagi terealisasinya
ketersediaan teknik deteksi yang efektif dan efisien. Salah satunya yaitu dengan
mengkonstruksi suatu pelacak DNA (DNA probe ) sebagai alat deteksi penyakit
dengan prinsip hibridisasi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan
memperoleh klon rekombinan gen protein selubung (coat protein) Begomovirus
yang akan digunakan sebagai pelacak DNA pada pengembangan sistem deteksi
penyakit tanaman yang disebabkan oleh Begomovirus.
Gen protein selubung Begomovirus isolat Ngluwar yang berukuran 780 bp
berhasil diisolasi melalui amplifikasi dengan PCR menggunakan primer spesifik
untuk gen AV1 Begomovirus yaitu: CPPROTEIN-V1 dan CPPROTEIN-C1.
Melalui teknik rekayasa genetik gen protein selubung tersebut berhasil diklon
dalam plasmid pGEM-T Easy.
Karakterisasi terhadap gen protein selubung rekombinan Begomovirus
melalui analisis kesejajaran dan sesifisitas menunjukkan bahwa klon rekombinan
tersebut memiliki kesamaan dan spesifisitas yang tinggi terhadap isolat
Begomovirus lain yang terdapat di GenBank sehingga dapat digunakan sebagai
pelacak DNA (DNA probe) melalui pelabelan menggunakan digoksigenin.
Hubungan kekerabatan tertinggi dengan kelompok Ageratum yellow vein virus.
Pelacak DNA Begomovirus memiliki spesifisitas yang tinggi terhadap
Begomovirus karena tidak mendeteksi virus yang lain, dengan sensitifitas untuk
mendeteksi Begomovirus pada kisaran konsentrasi 1-0,0001 µg/µl.
5
Metode penyiapan sampel tanaman uji dengan kemampuan untuk
mengekstrak titer virus yang tinggi menjadi kunci utama untuk menjawab
permasalahan sensitifitas dalam pengembangan teknik deteksi pelacak DNA yang
diperoleh dalam penelitian ini sebagai alat deteksi Begomovirus, Geminiviridae
yang efektif dan efisien.
Kata Kunci: Begomovirus, Gen Protein Selubung, Pelacak DNA (DNA Probe)
6
© Hak cipta milik IPB, tahun 2010
Hak cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
7
ISOLASI, KARAKTERISASI, KLONING GEN PROTEIN
SELUBUNG (COAT PROTEIN) BEGOMOVIRUS SEBAGAI
PELACAK DNA (DNA PROBE)
DEVI AGUSTINA
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
8
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Miftahuddin
9
Judul :
Nama :
NIM :
Isolasi, Karakterisasi, Kloning Gen Protein Selubung (Coat Protein)
Begomovirus Sebagai Pelacak DNA (DNA Probe).
Devi Agustina
P052060041
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si
Ketua
Dr. Ir. Sri Hendrastuti Hidayat, M.Sc
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Bioteknologi
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Suharsono, DEA
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS
Tanggal Ujian: 25 Februari 2010
Tanggal Lulus:
10
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Lampung Utara, 24 Agustus 1984. Penulis
merupakan anak sulung dari dua bersaudara pasangan Suhardi (Alm) dan
Rohimah, S.Pd.
Gelar Sarjana Pertanian dengan predikat kelulusan: Dengan Pujian (cum
laude) sekaligus sebagai Mahasiswa Terbaik I Fakultas Pertanian diperoleh pada
tahun 2006 di Universitas Lampung, program studi Ilmu Hama dan Penyakit
Tumbuhan, jurusan Proteksi Tanaman. Pada tahun yang sama penulis terdaftar
sebagai mahasiswa program Magister Sains di program studi Bioteknologi,
Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Selama menjadi mahasiswa
penulis aktif mengikuti berbagai seminar dan pelatihan yang berhubungan dengan
bidang bioteknologi dan proteksi tanaman.
11
PRAKATA
Alhamdulillahhirrabil’alamin. Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah
SWT karena hanya atas ridho dan karuniaNya tesis dengan judul Isolasi,
Karakterisasi, Kloning Gen Protein Selubung (Coat Protein) Begomovirus
Sebagai Pelacak DNA (DNA Probe) ini dapat diselesaikan dengan baik.
Penulis mempersembahkan rasa terimakasih dan penghargaan yang tak
terhingga kepada Dr. Utut Widyastuti dan Dr. Sri Hendrastuti Hidayat atas
kesempatan dan kepercayaan yang diberikan kepada penulis serta segala
bimbingan yang diberikan dengan setulus hati kepada penulis demi lahirnya
sebuah karya tesis ini. Penelitian tugas akhir (tesis) ini dapat terlaksana dengan
adanya bantuan dana dari Hibah Kompetisi Direktorat Pendidikan Tinggi,
Kementrian Pendidikan Nasional, RI Tahun Anggaran 2008 atas nama Dr. Sri
Hendrastuti Hidayat.
Terimakasih penulis sampaikan kepada: Dr. Trijoko Santoso yang telah
memberi kesempatan dan kesediaan waktu bagi penulis selama bekerja di Lab.
Biologi Molekuler, BB-BIOGEN (Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian) Cimanggu-Bogor, Saudari Tuti
S. Legiastuti yang telah memberikan pengarahan kepada penulis selama bekerja di
Laboratorium Virologi-Departemen Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas
Pertanian, IPB serta Bapak Saefudin (Mput) atas bantuannya di rumah kaca
Cikabayan, Darmaga.
Terimakasih penulis ucapkan untuk semua anggota Laboratorium Virologi
dan teman-teman Bioteknologi khususnya angkatan 2006 dan 2007, Ilmu Pangan
2006, Ilmu Pengetahuan Kehutanan 2006 serta semua keluarga di Felix House,
Pondokan Sunda Karya dan Wisma Radar 36 untuk semua kebersamaan kita yang
sarat akan arti perjuangan dan pelajaran untuk menjadi manusia yang dewasa dan
bertanggungjawab. Semoga Allah senantiasa melimpahi kesuksesan dan
kebahagiaan bagi kita semua. Amin.
Rasa terimakasih yang tiada henti berikut penghargaan yang tak terhingga
penulis persembahkan kepada ayahanda Suhardi (Alm), ibunda Rohimah, S.Pd,
adinda Suhendra dan sahabat Georgius Andhan K atas limpahan cinta dan kasih
sayang serta doa panjang sepenuh hati demi terselesaikan tesis ini.
Terimakasih pula penulis persembahkan untuk keluarga besar Muhammad
Jusuf (Alm) dan Sultan Permata Alam (Alm) atas dukungan moral dan material
yang telah diberikan kepada penulis. Semoga Allah SWT senantiasa memberikan
ridhoNya bagi kita semua di dunia dan akhirat dengan memeluk hati dan mimpi
kita dalam ikatan kekeluargaan yang indah, selamanya. Amin.
Pada akhirnya penulis berharap semoga karya ini mampu berkontribusi
bagi kemajuan dan kearifan ilmu pengetahuan di masa yang akan datang. Amin
Bogor, Februari 2010
Penulis
12
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ........................................................................................... vi
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... vi
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... vii
PENDAHULUAN ......................................................................................... 1
Latar Belakang ......................................................................................... 1
Tujuan Penelitian ..................................................................................... 4
TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................
Karakter Molekuler Begomovirus..............................................................
Penyakit Tanaman yang Disebabkan Begomovirus...................................
Keragaman Genetik Begomovirus ............................................................
Deteksi Begomovirus .................................................................................
5
5
6
7
8
BAHAN DAN METODE ..............................................................................
Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................................
Metode Penelitian ......................................................................................
Isolasi DNA Total Begomovirus..............................................................
Amplifikasi DNA Begomovirus..............................................................
Pengklonan DNA Begomovirus Hasil Amplifikasi ................................
Ligasi ..................................................................................................
Transformasi.......................................................................................
Penyiapan Bakteri Kompeten ........................................................
Introduksi DNA Rekombinan ........................................................
Konfirmasi Klon Rekombinan................................................................
Seleksi Plasmid Rekombinan dengan Media Selektif ........................
Isolasi Plasmid Rekombinan ..............................................................
Isolasi DNA Sisipan Melalui Pemotongan dengan Enzim Restriksi .
Perunutan DNA ..................................................................................
Karakterisasi Gen Protein Selubung Begomovirus .................................
Hibridisasi DNA .....................................................................................
Persiapan Sampel Uji .........................................................................
Persiapan Membran ............................................................................
Pelabelan Pelacak DNA .....................................................................
Prehibridisasi ......................................................................................
Pencucian Membran ...........................................................................
Hibridisasi ..........................................................................................
Deteksi................................................................................................
10
10
10
10
11
12
12
12
12
13
13
13
13
14
15
15
15
15
16
16
17
17
17
17
HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................................
Isolasi dan Amplifikasi DNA Total Begomovirus .....................................
Isolasi DNA Total Begomovirus .............................................................
Amplifikasi Gen Protein Selubung Begomovirus...................................
Pengklonan Gen Protein Selubung Begomovirus ......................................
19
19
19
21
22
13
Konfirmasi Klon Rekombinan...................................................................
Seleksi Plasmid Rekombinan dengan Media Selektif .............................
Isolasi Plasmid Rekombinan ..................................................................
Isolasi DNA Sisipan melalui Pemotongan dengan Enzim Restriksi ......
Perunutan DNA ......................................................................................
Karakterisasi Gen Protein Selubung Begomovirus ....................................
Analisis Kesejajaran ................................................................................
Analisis Spesifisitas................................................................................
Hibridisasi DNA ........................................................................................
23
23
24
25
27
28
28
29
35
SIMPULAN DAN SARAN............................................................................. 40
Simpulan .................................................................................................... 40
Saran .......................................................................................................... 40
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 41
LAMPIRAN..................................................................................................... 46
14
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Kualifikasi DNA total Begomovirus berdasarkan nilai adsorbansi ........... 21
2 Hasil analisis kesejajaran gen protein selubung Begomovirus ................... 29
3 Nilai penyejajaran (alignment score) gen protein selubung rekombinan
terhadap ke-12 isolat Begomovirus ............................................................. 30
15
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Struktur genom Begomovirus Bipartit dan Monopartit .............................. 6
2 Gejala infeksi Begomovirus pada tanaman Tomat (A) dan
Tembakau (B).............................................................................................. 7
3 Situs pemotongan EcoR1 pada plasmid pGEMT-Easy............................... 14
4 Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer AV1 terhadap 4 isolat
Begomovirus................................................................................................ 22
5 Klon rekombinan Begomovirus isolat Ngluwar hasil seleksi biru-putih (A)
dan replika klon rekombinan (B)................................................................. 24
6 Hasil isolasi plasmid terhadap 14 klon rekombinan Ngluwar
Begomovirus................................................................................................ 25
7 Pemotongan klon rekombinan menggunakan enzim restriksi EcoR1 ........ 27
8 Kladogram sekuen klon rekombinan Begomovirus, Ngluwar A dan B
dibandingkan dengan ke-12 isolat Begomovirus......................................... 31
9 Hubungan kekerabatan gen protein selubung rekombinan Begomovirus
isolat Ngluwar A dengan beberapa Begomovirus yang terdapat di
GenBank pada tingkat kemiripan 75%........................................................ 34
10 Hasil hibridisasi dot-blot pelacak DNA Begomovirus. ............................ 36
16
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Hasil perunutan nukleotida gen protein selubung Begomovirus hasil
amplifikasi PCR .......................................................................................... 47
2 Hasil perunutan nukleotida gen protein selubung rekombinan
Begomovirus isolat Ngluwar A ................................................................... 48
3 Hasil perunutan nukleotida gen protein selubung rekombinan
Begomovirus isolat Ngluwar B ................................................................... 49
4 Hasil penyejajaran dan kaldogram terhadap ketiga gen protein selubung
Begomovirus: rekombinan isolat Ngluwar A (A), rekombinan isolat
Ngluwar B (B) dan hasil amplifikasi PCR (C) ........................................... 50
17
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Begomovirus dilaporkan telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi
dengan luas serangan yang tinggi pula. Serangan Begomovirus di Indonesia yaitu
pada pertanaman cabai pertama kali dilaporkan pada tahun 1999 di daerah Jawa
Barat oleh Hidayat et al. (2006). Selanjutnya Sulandari et al. (2006) melaporkan
bahwa kejadian penyakit pada pertanaman cabai yang disebabkan oleh
Begomovirus berlangsung sejak awal tahun 2000 dan telah menyebabkan
kehilangan hasil yang tinggi di beberapa daerah yaitu: Daerah Istimewa
Yogyakarta, Jawa Tengah dan Jawa Barat. Kehilangan hasil pada cabai besar saat
itu mencapai 100% dan pada cabai kecil 50-70%. Hingga saat ini Begomovirus
masih menjadi patogen penting yang menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi
pada pertanaman cabai di Indonesia. Begomovirus penyebab penyakit pada
tanaman cabai di beberapa daerah di Indonesia tersebut selanjutnya disebut
Pepper Yellow Leaf Curl Indonesia Virus (PYLCIV).
Begomovirus merupakan anggota Famili Geminiviridae yaitu pada
Subkelompok III (ICTVdB 2006). Begomovirus merupakan anggota geminivirus
dengan jumlah spesies yang paling melimpah yaitu lebih dari seratus spesies
dengan tanaman dikotil sebagai inangnya dan ditularkan oleh vektor kutu kebul
Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Secara morfologi, Begomovirus
memiliki partikel yang tidak beramplop, berbentuk ikosahedral simetri dan
ditemukan selalu berpasangan atau geminate (kembar), dengan ukuran partikel
masing-masing sekitar 15-30 nm (Fauquet 2005). Asam nukleat Begomovirus
berupa utas tunggal DNA (ssDNA). Genom berbentuk sirkuler dan ditemukan
dalam bentuk monopartit (terdiri dari satu genom) atau bipartit (terdiri dari dua
genom) (ICVdB 2006; Van Regenmortel et al. 2000; Voyles 2002).
Diketahui bahwa Begomovirus memiliki keragaman genetik yang tinggi.
Santoso (2008) melaporkan adanya keragaman genetik di antara isolat-isolat
Begomovirus yang berasal dari daerah-daerah di Jawa dan Sumatera melalui
analisis teknik PCR-RFLP. Selanjutnya berdasarkan analisis filogenetik diketahui
bahwa isolat-isolat Begomovirus terbagi menjadi tiga kelompok berbeda. Isolat
Brastagi, Bogor, Sragen, Ketep dan Boyolali berkerabat dekat dengan ToLCV-
18
Java (Tobacco Leaf Curl Virus-Java), isolat Malang dan Blitar berkerabat dekat
dengan AYVV-China (Ageratum Yellow Vein Virus-China) sedangkan isolat
Kaliurang berkerabat dengan TYLCV-China (Tomatto Yellow Leaf Curl VirusChina) atau ToLCV-Laos (Tobacco Leaf Curl Virus-Laos). Trisno (2010) juga
melaporkan mengenai keragaman genetik 11 isolat Begomovirus pada tanaman
cabai di Sumatera Barat yang terbagi menjadi tiga kelompok. Keragaman genetik
yang tinggi ini di duga karena adanya kejadian rekombinasi genetik di antara
isolat-isolat Begomovirus. Sifat penularan Begomovirus melalui vektor dengan
penularan secara tunggal atau bersamaan dengan strain yang berbeda maupun
geminivirus lainnya pada tanaman inang yang sama maupun berkerabat dekat
turut menentukan peluang terjadinya rekombinasi genetik yang tinggi antar isolatisolat Begomovirus. Implikasi dari keragaman genetik yang tinggi ini menjadi
bahan pertimbangan bagi para pemulia tanaman untuk merakit tanaman yang
tahan terhadap Begomovirus, yaitu untuk merakit varietas yang tahan terhadap
beberapa isolat Begomovirus atau merakit beberapa varietas tahan untuk isolat
Begomovirus tertentu. Selain itu informasi mengenai keragaman genetik ini
bermanfaat dalam pengembangan metode deteksi Begomovirus yang tepat dan
cepat.
Beberapa metode deteksi geminivirus yang telah dikembangkan antara lain:
teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) dan RFLP-PCR (Restriction Fragment
Length Polymorphism-PCR), uji serologi dengan metode ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) dan teknik hibridisasi DNA yang menggunakan pelacak
DNA (DNA probe). Teknik PCR merupakan metode yang umum digunakan
untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus (Yuwono 2006; Aidawati et al.
2005; Palmer et al. 1998). Amplifikasi geminivirus, umumnya menggunakan
primer universal yaitu PAL1v 1978 dan PAR1c 715 dengan ukuran fragmen DNA
yang diharapkan sebesar 1,6 kb (Rojas et al. 1993; Rusli 2000; Sudiono 2001).
Selain itu dapat juga digunakan primer spesifik yaitu AV1 yang akan
mengamplifikasi daerah penyandi gen protein selubung (coat protein) dengan
ukuran fragmen 780 bp (Santoso 2008; Meliyansah 2010; Fauziah 2010). Metode
deteksi dengan teknik RFLP-PCR, dengan prinsip dasar PCR dan enzim restriksi,
selain mampu mendeteksi keberadaan geminivirus juga mampu menunjukkan
19
perbedaan strain antar virus sehingga dapat digunakan untuk menelusuri
hubungan genetik dan keragaman virus (Gilbertson et al. 1993), seperti yang
dilakukan oleh Sudiono et al. (2004) yang menemukan adanya 2 strain
Begomovirus yang berbeda yang menyerang cabai di Jawa Barat. Teknik ELISA
merupakan teknik deteksi virus berdasarkan pada pengujian serologi. Beberapa
keunggulan teknik ELISA yaitu memberikan hasil pengujian yang sensitif,
mampu menyajikan data kuantitatif dan prosedur ELISA dapat dibuat otomatisasi
(Agrios 2005). Akan tetapi teknik ini memiliki kelemahan yaitu penyediaan
antigen yang spesifik membutuhkan alokasi waktu yang lama dengan biaya yang
tidak murah. Khususnya untuk geminivirus, sampai saat ini ketersediaan
antiserum dan stabilitasnya masih menjadi faktor penghambat utama untuk
memanfaatkan teknik ini sebagai alat deteksi yang efektif dan efisien. Hal tersebut
disebabkan oleh sifat fisik dan kimia partikel virus yang membuatnya sulit untuk
dimurnikan dalam bentuk yang stabil, sifat imunogenik dari virion yang lemah,
homologi protein selubung terutama bagi virus-virus yang ditularkan oleh B.
tabaci (Roberts et al. 1984). Teknik deteksi geminivirus berbasis asam nukleat
dengan prinsip hibridisasi menggunakan pelacak DNA telah banyak digunakan
untuk menjawab kelemahan dari teknik deteksi PCR maupun ELISA. Prinsip
teknik deteksi ini yaitu terjadinya komplementasi asam nukleat antara asam
nukleat pelacak dengan genom virus. Beberapa kelebihan teknik deteksi ini
dibandingkan dengan teknik deteksi geminivirus lainnya yaitu tingkat spesifisitas
yang tinggi, relatif mudah dan pelaksanaannya cepat dengan jumlah sampel yang
banyak (Aidawati 2006; Rubio et al. 2003). Selain spesifisitas yang tinggi, teknik
ini mampu menunjukkan korelasi positif antara akumulasi DNA virus yang
dideteksi dengan intensitas gejala (Rom et al. 1993; Rubio et al. 2003).
Pelacak DNA yang digunakan dalam teknik deteksi hibridisasi dapat
bersifat universal maupun spesifik terhadap Geminivirus. Spesifisitas pelacak
DNA memegang peranan sangat penting dalam pengembangannya sebagai alat
deteksi yang efektif dan efisien. Semakin spesifik pelacak DNA yang digunakan
akan menambah keakuratan hasil deteksi (Keller & Manak 1992).
Aidawati
(2006) telah menggunakan teknik deteksi hibridisasi dot-blot menggunakan
pelacak DNA yaitu klon partial DNA Tobacco Leaf Curl Virus (TobLCV), yang
20
mencakup sebagian daerah ORF V1 yang menyandikan protein selubung dan
ORF C1 yang menyandikan gen replikasi, yang dilabel dengan digoxigenin, yang
bersifat universal terhadap geminivirus dan mampu mendeteksi keberadaan
geminivirus pada sap tanaman hingga faktor pengenceran 10-2. Untuk menjawab
kebutuhan akan teknik deteksi berbasis pada uji asam nukleat dengan teknik
hibridisasi Dot-Blot yang efektif dan efisien, maka dalam penelitian ini telah
dikonstruksi suatu pelacak DNA yang bersifat spesifik terhadap Begomovirus
dengan memanfaatkan gen protein selubung Begomovirus.
Gen protein selubung Begomovirus yang disandikan oleh ORF AV1 pada
DNA A Begomovirus merupakan daerah genom yang berfungsi sebagai
pembentuk selubung protein, penularan dengan vektor serta untuk pergerakan
virus. Selain itu gen protein selubung memiliki daerah genom yang mempunyai
runutan susunan DNA dengan derajat kesamaan yang tinggi (conserved) antar
anggota geminivirus. Oleh karena sifatnya tersebut, daerah genom tersebut banyak
digunakan sebagai dasar pemilihan primer untuk mengamplifikasi DNA
geminivirus dalam pengembangan teknik deteksi dan identifikasi Begomovirus
(Morin et al. 2000; Astier et al. 2001; Fraquet et al. 2005; Santoso 2008). Teknik
deteksi yang dikembangkan dalam penelitian ini diharapkan kelak bermanfaat
sebagai alat deteksi penyakit yang disebabkan oleh geminivirus khususnya
Begomovirus sekaligus juga bermanfaat untuk menyeleksi genotipe tanaman yang
rentan, resisten maupun toleran terhadap Begomovirus.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan
memperoleh klon rekombinan gen protein selubung (coat protein) Begomovirus
yang akan digunakan sebagai pelacak DNA pada pengembangan sistem deteksi
penyakit tanaman yang disebabkan oleh Begomovirus.
21
TINJAUAN PUSTAKA
Karakter Molekuler Begomovirus
Begomovirus merupakan anggota geminivirus dengan jumlah spesies yang
paling melimpah yaitu lebih dari seratus spesies dengan tanaman dikotil sebagai
inangnya.
International
Committee
on
Taxonomy
of
Viruses
(ICTV)
mengklasifikasikan Begomovirus ke dalam Famili Geminiviridae yaitu pada
Subkelompok III (ICTVdB 2006). Secara morfologi, Begomovirus memiliki
partikel yang tidak beramplop dengan bentuk partikel yang memanjang dan
ikosahedral simetris. Partikel virus ditemukan selalu berpasangan atau geminate
(kembar) sebagai ciri khas famili geminiviridae sehingga disebut geminivirus,
dengan ukuran partikel masing-masing sekitar 15-30 nm (Fauquet 2005).
Asam nukleat Begomovirus berupa utas tunggal DNA (ssDNA). Genom
Begomovirus berbentuk sirkuler. Ditemukan dalam bentuk monopartit (terdiri dari
satu genom) maupun bipartit (terdiri dari dua genom). Umumnya Begomovirus
ditemukan dalam bentuk bipartit, dengan ukuran masing-masing genom yang
disebut DNA-A dan DNA-B sekitar 2,5-3,0 kb, sehingga total ukuran genom
mencapai 5,5 kb (ICVdB 2006; Van Regenmortel et al. 2000; Voyles 2002).
Bipartit
Monopartit
Gambar 1 Struktur genom Begomovirus Bipartit dan Monopartit
Genom bipartit Begomovirus terdiri dari DNA A dan DNA B. Keduanya
memiliki daerah intergenik (IR = Intergenic Region) yang mencakup daerah
common region (CR) dengan fungsi pengaturan (regulatory function) yang terdiri
dari beberapa ORF (Open Reading Frame). Pada IR/CR terdapat promotor dan
urutan basanya sebagai awal terjadi transkripsi.
22
Pada DNA A, terdapat protein selubung yang disandikan oleh Coat Protein
gene (ORF AV1) berfungsi sebagai pembentuk selubung protein, penularan
dengan vektor serta untuk pergerakan virus. Gen penyandi selubung protein
merupakan daerah genom yang mempunyai runutan susunan DNA dengan derajat
kesamaan yang tinggi (conserved) antar anggota geminivirus. Oleh karena
sifatnya tersebut, daerah genom tersebut banyak digunakan sebagai dasar
pemilihan primer untuk mengamplifikasi DNA geminivirus. Komponen AV1 juga
berperan dalam melindungi ssDNA virus dan penularan oleh vektor ketika virus
masuk ke dalam sistem pencernaan serangga vektor dengan melindungi partikel
virus dari degradasi (Morin et al. 2000; Astier et al. 2001; Fauquet et al. 2005).
CP dan Pre CP (BV1) berperan untuk pergerakan keluar masuk genom virus dari
inti sel inang (Briddon et al. 1989). Replikasi Begomovirus diatur oleh Rep gene
pada ORF AC1. Adapun transkripsi Begomovirus diaktivasi oleh TrAP gene pada
ORF AC2 yang merupakan protein aktivator transkripsi. Pada ORF AC3 terdapat
Ren gene yang berfungsi sebagai pembentukan protein untuk penginduksi
replikasi (replication enhancer). Ekspresi gejala penyakit diatur regulasinya oleh
C4 pada DNA A. Pada DNA B dapat ditemukan adanya Nuclear Shuttle Protein
(NSP) gene pada ORF BV1 yang berfungsi sebagai penyandi virion DNA B dan
membentuk nuclear shuttle protein. Selain itu pada DNA B, terdapat Movement
Protein (MP) gene (ORF BC1) yang berfungsi sebagai protein yang
bertanggungjawab untuk perpindahan dari satu sel ke sel lain dalam
plasmodesmata inang (Fauquet et al. 2005; Hull 2002; Van Regenmortel et al.
2000). Genom monopartit merupakan kombinasi antara DNA A dan DNA B pada
genom bipartit yang dikemas dalam satu partikel dengan fungsi yang sama
(Fauquet et al. 2005; Hull 2002).
Penyakit Tanaman yang Disebabkan Begomovirus
Begomovirus adalah virus tanaman dengan kisaran inang yang sangat luas,
terutama tanaman dikotil dari famili: Asclepiadaceae, Asteraceae, Apiaceae,
Fabaceae, Malvaceae dan Solanaceae. Begomovirus adalah anggota kelompok
geminiviridae dengan anggota yang paling banyak yaitu lebih dari 80 anggota, di
antaranya adalah: Abutilon mosaic virus, Acalypha yellow mosaic virus, African
cassava mosaic virus, Ageratum yellow vein virus, Bean calico mosaic virus,Bean
23
dwarf mosaic virus, Bean golden mosaic virus, Bean golden yellow mosaic virus,
Tomato golden mosaic virus, Watermelon chlorotic stunt virus, Watermelon curly
mottle virus (Fauquet et al. 2005). Sebagian besar dari tanaman inang tersebut
merupakan tanaman dengan nilai ekonomi tinggi.
Infeksi Begomovirus pada tanaman menunjukkan gejala yang bervariasi.
Namun secara umum gejala berupa perubahan warna dan bentuk daun yaitu: daun
mengeriting dan berwarna kuning, diikuti dengan ukuran daun yang mengecil,
tanaman menjadi kerdil (Gambar 2), ukuran buah yang menjadi kecil sehingga
pada akhirnya menyebabkan penurunan hasil mencapai 100%. Keberagaman
gejala tersebut disebabkan oleh beberapa faktor antara lain: strain virus, kultivar
dan umur tanaman pada waktu terinfeksi serta kondisi lingkungan (Polston &
Anderson 1997).
A
B
Gambar 2 Gejala infeksi Begomovirus pada tanaman tomat (A) dan
tembakau (B)
Begomovirus hanya dapat ditularkan melalui serangga vektor. Vektor
Begomovirus adalah serangga ordo Hemiptera, family Aleyrodidae, yaitu: kutu
kebul (Bemisia tabaci Gennadius). Vektor B. tabaci memiliki sifat penularan yang
persisten, dengan periode akuisisi yaitu fase pengambilan virus melalui proses
makan (sekitar 10 menit), periode laten yaitu fase virus tertahan pada vektor
sebelum periode inokulasi (sekitar 4-21 jam) dan periode inokulasi yaitu fase
makan inokulasi (12-24 jam) (Fauquet et al. 2005).
Keragaman Genetik Begomovirus
Keragaman genetik Begomovirus yang tinggi merupakan salah satu kendala
dalam pengendalian penyakit dan kerusakan yang ditimbulkan. Rekombinasi
genetik pada Begomovirus adalah kunci utama yang berperan dalam keragaman
diversifikasi dan evolusi Begomovirus, dengan frekuensi rekombinasi tertinggi
24
pada N-terminal dari ORF C1/AC1 yang menyandikan gen Replication-associated
protein yang berperan dalam proses replikasi virus (Prasana & Rai 2007).
Keragaman genetik Begomovirus yang tinggi berasosiasi dengan tanaman
inangnya dimana terjadi transfer genetik Begomovirus dari tanaman inang aslinya
yang liar ke tanaman budidaya yang menyebabkan rekombinasi genetik
Begomovirus (Ambrozevicius et al. 2005). Selain itu, Ala-Poikela et al. (2005)
menyatakan bahwa infeksi ganda Begomovirus pada suatu tanaman inang
menyebabkan terjadinya rekombinasi genetik dan memberi peluang bagi
munculnya strain baru Begomovirus. Rekombinasi antara geminivirus dapat
berimplikasi pada lahirnya strain baru yang sangat patogenik yang mampu
mematahkan ketahanan tanaman inangnya seperti yang dilaporkan oleh Monci et
al. (2002) yang menemukan adanya rekombinasi alami antara Tomato yellow leaf
curl Sardinia virus dan Tomato yellow leaf curl virus yang menghasilkan suatu
fenotip baru yang bersifat patogenik dan menyebabkan epidemi penyakit di
Spanyol. Keragaman genetik Begomovirus turut dipengaruhi oleh vektornya yaitu
B. tabaci sebagai satu-satunya agen penularan Begomovirus yang juga memiliki
keragaman genetik yang tinggi seperti yang telah dilaporkan oleh Aidawati
(2006).
Keragaman genetik Begomovirus memiliki berbagai implikasi. Diantaranya
bagi para pemulia tanaman informasi keragaman genetik dapat digunakan sebagai
acuan dalam pendekatan perakitan varietas tahan, untuk merakit varietas yang
tahan, untuk isolat-isolat Begomovirus tertentu saja. Informasi keragaman genetik
bermanfaat dalam perakitan suatu teknik deteksi, dengan melihat suatu bagian
yang memiliki konservasi tinggi pada genom Begomovirus dan peluang terendah
untuk terjadinya rekombinasi.
Deteksi Begomovirus
Secara konvensional deteksi Begomovirus dapat dilakukan dengan
pengamatan gejala penyakit, uji penularan melalui vektor dan pengamatan partikel
di bawah mikroskop elektron (Bos 1990). Kemajuan di bidang biologi molekuler
telah menghasilkan berbagai metode deteksi yang lebih akurat, efektif dan efisien.
Beberapa metode deteksi tersebut antara lain: teknik PCR (Polymerase Chain
Reaction) dan RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR), uji
25
serologi dengan metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), teknik
hibridisasi DNA dengan menggunakan pelacak DNA (DNA probe). Selain teknik
PCR, metode deteksi hibridisasi Dot-Blot dengan menggunakan pelacak DNA
merupakan metode yang telah umum digunakan untuk mendeteksi keberadaan
Begomovirus. Keberhasilan teknik deteksi ini sangat bergantung pada spesifisitas
pelacak (probe) yang digunakan (Keller & Mark 1992). Teknik hibridisasi ini
mampu menjawab kekurangan teknik deteksi lainnya (PCR dan ELISA) yaitu:
tingkat spesifisitas yang tinggi, mudah dan cepat dilakukan dengan jumlah sampel
yang banyak, seperti yang dilaporkan oleh Rom et al. (1993), Pico et al. (1999)
dan Rubio et al. (2003) yang mendeteksi TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl
Virus) dengan teknik hibridisasi menggunakan pelacak DNA TYLCV yang
dilabel dengan digoxigenin.
Tingkat spesifisitas yang tinggi dicerminkan oleh kemampuan teknik
deteksi ini untuk mendeteksi keberadaan DNA virus dalam titer virus yang
rendah. Dilaporkan oleh Aidawati (2006) bahwa pelacak DNA yang dilabel
dengan digoksigenin berhasil mendeteksi cairan perasan tanaman yang terinfeksi
Begomovirus hingga pengenceran 10-2.
Rubio et al. (2003) menyatakan bahwa teknik deteksi hibridisasi mampu
memberikan informasi terkait adanya korelasi yang positif antara gejala dan titer
virus pada tanaman terinfeksi. Hal yang sama juga dilaporkan oleh Rom et al.
(1993) yang menunjukkan bahwa akumulasi DNA virus yang dideteksi dengan
teknik hibridisasi berkorelasi positif dengan intensitas gejala. Oleh karena itu
selain bermanfaat sebagai alat deteksi penyakit yang disebabkan oleh
Begomovirus, teknik ini juga bermanfaat untuk menyeleksi genotipe tanaman
yang rentan, resisten maupun toleran terhadap Begomovirus. Maka untuk tujuan
tersebut teknik hibridisasi lebih baik dibandingkan dengan teknik PCR, seperti
yang dilaporkan oleh Pico et al. (1999).
26
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Kegiatan penelitian dilakukan di Laboratorium Virologi, Departemen
Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium
Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan
Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN), Cimanggu-Bogor, sejak Juni 2008
hingga Februari 2010.
Metode Penelitian
Kegiatan penelitian ini meliputi lima tahapan utama yaitu: (1) isolasi DNA
total Begomovirus, (2) amplifikasi DNA Begomovirus, (3) kloning DNA
Begomovirus hasil amplifikasi dan konfirmasi klon rekombinan, (4) karakterisasi
gen Begomovirus dan (5) hibridisasi DNA dengan pelabelan digoxigenin
menggunakan DIG-High Prime DNA labeling and Detection Starter Kit I (Roche
2004).
Isolasi DNA Total Begomovirus
Isolat Begomovirus dalam penelitian ini berasal dari tanaman tomat yang
terinfeksi oleh Begomovirus yang diperoleh dari Segunung-Cianjur, SeyeganSleman, Ngluwar-Magelang dan Sedan-Rembang. DNA total diperoleh dengan
teknik isolasi DNA metode CTAB (Doyle & Doyle 1990).
Tahapan isolasi DNA total diawali dengan memanaskan 10 ml bufer
ekstraksi (2% CTAB, 100 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1%
2-β-merkaptoetanol) dalam penangas air pada suhu 65°C. Sampel daun tanaman
sakit (seberat 0,1 gram) digerus sampai lembut dengan menggunakan mortar
dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro
berukuran 1,5 ml dan ditambahkan 500 μl bufer ekstraksi yang sudah dipanaskan
kemudian dicampur dengan baik. Campuran hasil gerusan dan bufer ekstraksi
diinkubasi pada suhu 65 °C selama 60 menit dan setiap 10 menit tabung mikro
dibolak-balik untuk membantu proses lisis. Setelah 60 menit, campuran tersebut
diambil dari penangas air dan didiamkan sebentar (2 menit) pada suhu ruang,
kemudian ditambahkan 500 μl campuran Kloroform:Isoamilalkohol (CI) dengan
perbandingan 24:1. Agar tercampur dengan baik, tabung divorteks selama 5 menit
27
kemudian disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 12.000 rpm. Supernatan
yang terbentuk diambil secara hati-hati dan dipindahkan ke tabung mikro yang
baru, lalu ditambahkan 0,1 volume sodium asetat 3 M CH3COONa, pH 5,2 (408,1
g Na-asetat.3H2O di dalam 800 ml H2O) dan dicampur dengan baik. Setelah itu,
ditambahkan lagi dengan 2/3 x volume isopropanol atau 2,5 x volume etanol
absolut yang bertujuan untuk mengendapkan DNA dengan membolak-balik
tabung perlahan. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu -20°C selama 60
menit atau semalam, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama
10 menit untuk mengendapkan DNA. Endapan DNA yang diperoleh kemudian
dikeringanginkan.
Sebagai tahap akhir dari isolasi DNA adalah pencucian dan suspensi DNA.
Pencucian DNA dilakukan dengan etanol 70% yang berfungsi untuk
membersihkan sisa-sisa garam maupun kontaminan lainnya yang mengendap.
Selanjutnya endapan dilarutkan dengan bufer TE 1x (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1
mM EDTA) sebanyak 50-100 μl.
Amplifikasi DNA Begomovirus
Amplifikasi DNA Begomovirus dilakukan dengan teknik PCR yang
dilakukan mengikuti prosedur Rojas et al. (1993) dengan primer spesifik untuk
gen AV1 Begomovirus yaitu: CPPROTEIN-V1 dan CPPROTEIN-C1 yang akan
mengamplifikasi bagian gen protein selubung (coat protein). Sekuen nukleotida
primer
CPPROTEIN-V1
TCGAAGCGACCCGCCGA-3’
yaitu:
sedangkan
5’TAATTCTAGATG
CPPROTEIN-C1
yaitu:
5’-
GGCCGAATTCTTAATTTTGAACAGAATCA-3’ (AVRDC, Taiwan). Program
amplifikasi terdiri atas 30 siklus dengan tahapan: predenaturasi pada suhu 940C
selama 4 menit, denaturasi (fase pemisahan utas DNA) pada suhu 940C selama 1
menit, annealing (pengintegrasian primer) pada suhu 500C
selama 2 menit,
amplifikasi (sintesis untaian DNA baru) pada suhu 720C selama 3 menit dan
tahapan pasca extention pada suhu DNA 720C selama 5 menit. DNA hasil
amplifikasi dielektroforesis pada gel agarosa 1% dan divisualisasi di bawah UV
transiluminator. Untuk memperoleh fragmen tunggal DNA yang tidak tercampur
dari fragmen DNA lainnya, fragmen DNA yang teramplifikasi dielusi dengan
menggunakan QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Selanjutnya fragmen DNA
28
dikonfirmasi dengan perunutan nukleotida dan digunakan sebagai DNA sisipan
(insert) dalam proses ligasi.
Pengklonan DNA Begomovirus Hasil Amplifikasi
Tahapan pengklonan meliputi 3 kegiatan yaitu: Ligasi, Transformasi dan
Konfirmasi klon rekombinan.
Ligasi
Ligasi merupakan proses penyambungan antara vektor dan DNA sisipan
dengan bantuan enzim ligase. Ligasi dilakukan mengikuti metode Promega
(2007). Fragmen DNA hasil amplifikasi PCR disisipkan pada plasmid pGEM -T
Easy dengan bantuan enzim ligase. Reaksi ligasi terdiri atas 60 ng fragmen DNA,
50 ng DNA vektor pGEM-T Easy, 5 μl 2x bufer ligasi T4 DNA ligase, 1 μl T4
DNA Ligase (3 Weiss Unit/μl) dan ditambahkan ddH2O sampai mencapai volume
akhir 10 μl. Bahan-bahan yang sudah dicampur dalam tabung mikro kemudian
diinkubasi pada suhu 4oC selama 16 jam.
Transformasi
Tahapan ligasi dilanjutkan dengan proses introduksi rekombinan yang
dilakukan mengikuti metode Sambrook (1989). Hasil ligasi diintroduksi ke dalam
sel E. coli DH5α yang kompeten sebagai inang, kemudian ditumbuhkan dalam
media yang mengandung agen seleksi untuk mengetahui adanya sisipan di dalam
plasmid.
Penyiapan Bakteri Kompeten. Bakteri E. coli DH5α yang akan digunakan dalam
tahapan transformasi harus berada dalam kondisi kompeten. Penyiapan bakteri
kompeten dilakukan mengikuti metode Sambrook (1989). Sebuah koloni bakteri
E. coli DH5α dari biakan media LB agar (1% Bacto tryptone, 0,5% yeast extract,
0,5% NaCl, pH 7) diambil dan dikulturkan dalam 50 ml medium LB cair pada
suhu 37oC di dalam penggoyang (shaker) pada 200-250 rpm selama 16-18 jam.
Kultur E. coli DH5α tersebut diambil sebanyak 1 ml, diinokulasi pada 10 ml
media LB cair, serta diinkubasi pada kondisi yang sama dengan sebelumnya
sampai diperoleh kerapatan optik A600=0,4-0,5. Selanjutnya kultur bakteri
diinkubasi dalam es selama 10 menit dan dilanjutkan dengan proses pengendapan
dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4oC selama 1 menit.
29
Endapan yang diperoleh disuspensi dengan menambahkan 1 ml 0,1 M CaCl2,
divortex secara perlahan-lahan dan dibiarkan di dalam es selama 10 menit. Setelah
itu suspensi bakteri disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4oC selama
1 menit. Endapan yang diperoleh kemudian disuspensi dengan hati-hati ke dalam
200 l LB cair dan dibiarkan dalam es selama 15 menit. Bakteri yang kompeten
tersebut siap untuk digunakan dalam tahapan transformasi.
Introduksi DNA Rekombinan. Introduksi DNA dilakukan dengan mencampurkan
10-50 ng plasmid hasil ligasi (volumenya kurang dari 10 μl) dengan 100-200 μl
bakteri kompeten dalam 1,5 ml tabung mikro dan setelah itu diinkubasi pada es
selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan perlakuan panas (heat shock) pada suhu
42oC selama 90 detik dan segera diinkubasi pada es selama 2 menit. Sebanyak
250 μl media LB diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit dengan kecepatan
250 rpm. Setelah itu bakteri disebar pada media LB padat yang telah mengandung
100 mg/l ampisilin. Pada media LB ditambahkan juga 0,1 M IPTG (10 μl/ cawan)
dan 2% X-Gal (50 μl/ cawan) untuk memudahkan seleksi koloni. Biakan tersebut
dinkubasi pada suhu 37oC semalam.
Konfirmasi Klon Rekombinan
Konfirmasi klon rekombinan dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu:
seleksi plasmid rekombinan dengan media selektif, isolasi plasmid rekombinan,
isolasi DNA sisipan melalui pemotongan dengan enzim restriksi EcoR1 dan
perunutan DNA (sequensing) terhadap fragmen sisipan dari klon tersebut
sehingga klon yang diperoleh dipastikan membawa fragmen DNA target
Begomovirus.
Seleksi Plasmid Rekombinan dengan Media Selektif. Seleksi plasmid
rekombinan dilakukan berdasarkan warna koloni yang tumbuh pada media selektif
(LB + Ampisilin + IPTG/X-Gal). Koloni berwarna putih akan dipilih dan
dikonfirmasi pada tahapan berikutnya.
Isolasi Plasmid Rekombinan. Isolasi plasmid dilakukan dengan menggunakan
GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas 2006). Koloni E. coli yang
mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam 2 ml media LB yang
mengandung 100 mg/l ampisilin dan diinkubasi di dalam shaker (250 rpm) pada
suhu 37oC selama semalam. Biakan bakteri dalam volume besar kemudian dibagi
30
kedalam tabung mikro yang pangkalnya meruncing (konical). Setelah itu bakteri
diendapkan dengan sentrifugasi pada 13.000 rpm, pada suhu 4oC selama 5 menit
dan hasil endapan bakteri disuspensi dalam 250 μl bufer resuspensi sel (50 mM
Tris HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA). Setelah tersuspensi dengan baik, yaitu ditandai
dengan tidak adanya endapan (atau gumpalan), bakteri dilisis dengan penambahan
250 μl bufer lisis (0,2 M NaOH; 1% SDS). Supaya bufer lisis tercampur rata,
tabung reaksi dibalik-balikkan sebanyak 4-6 x dan dibiarkan 1-2 menit. Bakteri
yang telah lisis ditambah 350 μl bufer netralisasi (1,32 M potasium asetat, pH 4,8)
dan tabung reaksi dibalik-balikkan 4-6 x hingga bufer netralisasi tercampur
merata. Campuran kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 2
menit. Cairan jernih dibagian atas diambil dan dipindahkan ke kolom tabung
reaksi yang bersih. Setelah itu ditambahkan 500 μl bufer pencuci dan
disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit, diulangi kembali
kemudian sentrifugasi kolom kosong (tanpa cairan) pada kecepatan 13.000 rpm
selama 1 menit. Langkah berikutnya adalah memindahkan kolom ke tabung mikro
baru dan steril, menambahkan 50 μl bufer elusi, inkubasi selama 2 menit di suhu
ruang dan sentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit.
Isolasi DNA Sisipan Melalui Pemotongan dengan Enzim Restriksi. DNA
sisipan dipisahkan dari plasmid pGEM-T menggunakan enzim restriksi EcoR1
(Gambar 3).
Gambar 3 Situs pemotongan EcoR1 pada plasmid pGEMT-Easy
31
Sebanyak 10 μl DNA plasmid rekombinan, 2,5 μl larutan penyangga 3NIB
dan 1,5 μl enzim restriksi EcoRI (10 unit/μl) dimasukkan ke dalam tabung mikro
yang kemudian ditambah H2O hingga volume akhir larutan menjadi 25 μl.
Larutan diinkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam. Visualisasi hasil pemotongan
dengan enzim restriksi dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1,5%
seperti diuraikan sebelumnya.
Perunutan DNA. Untuk memastikan bahwa fragmen DNA yang diperoleh dari
klon rekombinan tersebut adalah DNA Begomovirus maka perlu dilakukan
perunutan nukleotida dengan teknik perunutan. Perunutan dilakukan oleh PT.
Macrogen, Korea Selatan.
Karakterisasi Gen Protein Selubung Begomovirus
Gen protein selubung Begomovirus yang diperoleh dalam penelitian ini
selanjutnya akan dikarakterisasi melalui beberapa analisis yaitu analisis
kesejajaran urutan nukleotida gen protein selubung dengan program BLAST
(Basic Local Aligment Search Tools) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) dan
analisis spesifisitas gen protein selubung dilakukan dengan program multiple
alignment, Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/Clustal W). Melalui tahapan analisis
ini dipastikan bahwa fragmen DNA yang diperoleh adalah DNA Begomovirus dan
memiliki tingkat spesifisitas yang tinggi terhadap anggota Begomovirus lainnya
sebagai salah satu syarat utama dalam pengembangannya sebagai metode deteksi .
Hibridisasi DNA
Hibridisasi pelacak DNA sebagai metode deteksi Begomovirus meliputi
beberapa tahapan yaitu: persiapan sampel uji, persiapan membran, pelabelan
pelacak DNA, prehibridisasi, pencucian membran, hibridisasi dan deteksi.
Persiapan Sampel Uji
Pengujian spesifisitas pelacak DNA dilakukan dengan menggunakan
beberapa tanaman sampel yaitu: tanaman tomat sehat (bebas infeksi virus) sebagai
kontrol negatif, tanaman tomat terinfeksi Begomovirus sebagai kontrol positif,
tanaman target terdiri dari gulma Babadotan (Ageratum conyzoides) dan tanaman
tomat yang dikumpulkan dari lapangan yang menunjukkan gejala infeksi
Begomovirus, tanaman yang terinfeksi oleh virus lain terdiri atas tanaman tomat
32
yang terinfeksi ToCV (Tomatto Chlorosis Virus), tanaman cabai yang terinfeksi
ChiVMV (Chilli Veinal Mottle Virus) dan tanaman tembakau yang terinfeksi
TMV (Tobacco Mosaic Virus). Sampel yang akan digunakan terdiri dari 3 jenis
penyiapan: 1) DNA total tanaman yang diperoleh dengan metode ekstraksi
Doyle&Doyle yang dimodifikasi (1990), 2) Cairan perasan tanaman yang
diperoleh berdasarkan prosedur Gilbertson et al. (1991) yaitu 1 gr daun tanaman
dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, lalu ditambahkan 200 μl bufer TE (pH
7,5) kemudian digerus dengan pistil dan selanjutnya tabung tersebut disentrifugasi
pada 10000 rpm selama 10 menit, dan 3) DNA produk amplifikasi menggunakan
primer spesifik AV1 dengan teknik PCR (Rojas et al. 1993). Sebagai pembanding
digunakan plasmid rekombinan utuh, sisipan gen protein selubung Begomovirus
dan vektor pGEM-T Easy serta beberapa plasmid rekombinan Begomovirus yaitu:
plasmid rekombinan gen AV1 TYLCV (TJ Santoso, BB-Biogen), plasmid
rekombinan Full Length dan partial PYLCV (WS Tsai, AVRDC). Seluruh sampel
yang disiapkan dikuantifikasi (1µg/µl) melalui pengukuran nilai absorbansinya
dengan spektrofotometer. Pengujian sensitifitas teknik hibridisasi dilakukan
melalui pengenceran berseri terhadap seluruh sampel yaitu: 10, 10-1 , 10-2 ,10 -3 , 10
-4
,10
-5
-6
, 10 .
Persiapan Membran
Membran nilon Hybond-N (Roche) dipotong sesua