20
BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Metodologi penelitian meliputi pengambilan bahan tanaman, identifikasi bahan tanaman,
pengolahan bahan tanaman, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak etanol dan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH sebagai sumber
radikal bebas dan absorbansi DPPH diukur menggunakan alat spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 516 nm.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan terdiri dari alat-alat gelas laboratorium, aluminium foil, blender National, cawan berdasar rata, desikator, kaca objek,
kaca penutup, kertas saring, krus porselin, mikroskop Olympus, neraca analitis Vibra, neraca kasar O’haus, oven listrik Stork, penangas air Yenaco,
rotary evaporator
Stuart, spektofotometer
UVVis Shimadzu,
dan tanur
Gallenkamp.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan adalah buah terong lalap ungu. Bahan-bahan kimia berkualitas pro analisis poduksi Sigma:
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
DPPH Aldrich, produksi E-Merck: amil alkohol, asam asetat anhidrida, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida,
bismuth III nitrat, iodium, isopropanol, kalium iodide, kloral hidrat, kloroform, metanol, n-heksan, natrium hidroksida, raksa II klorida, serbuk magnesium
Universitas Sumatera Utara
21 Mg, timbal II asetat, toluen, α-naftol. Bahan kimia berkualitas teknis: air suling
dan etanol 96.
3.3 Penyiapan Bahan Tanaman
Penyiapan bahan tanaman meliputi pengumpulan bahan tanaman, identifikasi tanaman dan pembutan simplisia.
3.3.1 Pengumpulan bahan tanaman
Pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan bahan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Tumbuhan
yang digunakan adalah buah terong lalap ungu yang diperoleh dari Desa Tandem Hulu, Kecamatan Hamparan Perak, Kabupaten Deli Serdang, Provinsi Sumatera
Utara.
3.3.2 Identifikasi bahan tanaman
Identifikasi tumbuhan dilakukan di
Herbarium Bogoriense,
Bidang Botani Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi LIPI di Bogor. Hasil
identifikasi tanaman dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 44.
Pembuatan simplisia
Buah terong lalap ungu yang telah dikumpulkan, dipisahkan dari tangkainya 5 kg, dicuci, ditiriskan, dirajang dengan ketebalan ± 0,3 cm,
ditimbang sebagai berat basah 4,7 kg, dikeringkan dilemari pengering hingga kering bila diremas rapuh, ditimbang sebagai berat kering 430 kg, diserbuk
menggunakan blender. Bagan kerja pembuatan simplisia dapat dilihat pada Lampiran 5, halaman 49.
Universitas Sumatera Utara
22
3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.2 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida sebanyak 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.3 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dengan air suling
sebanyak 100 ml Depkes RI, 1995. 3.4.4 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.5 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,5 ml larutan asam sulfat pekat ditambahkan air suling sampai 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.6 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Depkes RI, 1995.
3.4.7 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,4 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10
ml air suling, kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
23
3.4.8 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI,1995.
3.4.9 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,8 g bismut III nitrat ditimbang, dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat, pada wadah lain ditimbang sebanyak 27,2 g kalium iodida, dilarutkan
dalam 50 ml air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan
air suling hingga volume larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.10 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium kemudian ditambahkan air suling
hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.11 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 5 bagian volume asam sulfat pekat dicampurkan dengan 50 bagian volume etanol 95. Kemudian ditambahkan dengan hati-hati 5 bagian
volume asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut dan dinginkan Depkes RI, 1995.
3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air,
penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam.
Universitas Sumatera Utara
24
3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap buah terong lalap ungu dengan mengamati bentuk, warna, bau, rasa dan ukuran simplisia. Gambar
tanaman dan buah terong lalap ungu dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 46, dan gambar simplisia dan serbuk simplisia dapat dilihat pada Lampiran 3,
halaman 47.
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia buah terong lalap ungu. Serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah
ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Hasil pemeriksaan mikroskopik dapat dilihat pada
Lampiran 4, halaman 48.
3.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung, tabung
penerima 5 ml berskala 0,05 ml, alat penampung dan pemanas listrik. Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu
alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume
air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan
ke dalam labu yang berisi toluen yang telah dijenuhkan, kemudian labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan
siatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian
Universitas Sumatera Utara
25 kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air
terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu
kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan
air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1998. Perhitungan kadar air dapat dilihat pada Lampiran 7, halaman 51.
3.5.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu
bersumbat, dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam
cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105ºC sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang
larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995. Perhitungan kadar sari yang larut dalam air dapat dilihat pada Lampiran 7,
halaman 51.
3.5.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama,
kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 ºC sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam
Universitas Sumatera Utara
26 etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
Perhitungan kadar sari yang larut dalam etanol dapat dilihat pada Lampiran 7, halaman 52.
3.5.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600 ºC selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh
bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995. Perhitungan kadar abu total dapat dilihat pada Lampiran 7,
halaman 52.
3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas, lalu dipijar sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu
yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995. Perhitungan kadar abu yang tidak larut dalam asam dapat
dilihat pada Lampiran 7, halaman 53.
3.6 Skrining Fitokimia 3.6.1 Pemeriksaan steroidatriterpenoida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan
Universitas Sumatera Utara
27 penguap. Pada sisa ditambahkan beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard.
Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida, sedangkan warna merah, merah muda atau ungu meunjukkan adanya triterpenoida
Harborne, 1987.
3.6.2 Pemeriksaan alkaloid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit,
didinginkan dan disaring, filtrat dipakai untuk uji alkaloida. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan 0,5 ml filtrat.
Pada tabung I : ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan
menggumpal berwarna putih atau kuning. Pada tabung II
: ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan berwarna coklat atau jingga kecoklatan.
Pada tabung III : ditambahkan 2 tetes pereaksi Bourchardat, akan terbentuk
endapan berwarna coklat sampai kehitaman. Alkaloid disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua atau
tiga dari percobaan di atas Depkes RI, 1995.
3.6.3 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol 96 dan 3 bagian volum air suling ditambah
dengan 10 ml asam klorida 2 N. Direfluks selama 30 menit, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II
asetat 0,4 M lalu dikocok selama 5 menit dan disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2 isopropanol dilakukan berulang sebanyak tiga
Universitas Sumatera Utara
28 kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut,
yaitu 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diuapkan di penangas air. Sisa dilarutkan dalam 2 ml air suling dan 5 tetes pereaksi Molish
kemudian secara perlahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat. Glikosida positif jika terbentuk cincin ungu Depkes, 1995.
3.6.4 Pemeriksaan flavonoid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 10 g, ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml
filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna
merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966. 3.6.5 Pemeriksaan saponin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok
kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes
asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1995.
3.6.6 Pemeriksaan tanin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan
diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin
Farnsworth, 1966.
Universitas Sumatera Utara
29
3.7 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak etanol buah terong lalap ungu dilakukan dengan cara perkolasi. Prosedur pembuatan ekstrak sebanyak 100 g serbuk simplisia dibasahi
dengan etanol 96 dan dibiarkan selama 3 jam. Kemudian dimasukkan ke dalam alat perkolator, lalu dituang cairan penyari etanol sampai semua simplisia
terendam dan terdapat selapis cairan penyari diatasnya, mulut tabung perkolator ditutup dengan alumunium foil dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran
dibuka dan dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan kecepatan 1 mlmenit, perkolat ditampung. Cairan penyari ditambahkan berulang-ulang secukupnya
sehingga selalu terdapat cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan jika cairan perkolat yang terakhir keluar tidak berwarna, lalu pekatkan dengan alat
penguap vakum putar hingga diperoleh ekstrak kental Depkes RI, 1979. Bagan kerja pembuatan ekstrak etanol dapat dilihat pada Lampiran 6, halaman 50.
3.8 Pengujian Aktivitas Antioksidan 3.8.1 Prinsip metode pemerangkapan radikal bebas DPPH
Kategori