Verifikasi Metode Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi DNA pada Daging dan Produk Olahan
VERIFIKASI METODE EKSTRAKSI FENOL KLOROFORM
UNTUK ISOLASI DNA PADA DAGING
DAN PRODUK OLAHAN
ISHFI ARYAHIYYAH
ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi penelitian berjudul Verifikasi Metode
Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi DNA pada Daging dan Produk Olahan adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam daftar pustaka.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Ishfi Aryahiyyah
NIM D14100101
.
ABSTRAK
ISHFI ARYAHIYYAH. Verifikasi Metode Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi
DNA pada Daging dan Produk Olahan. Dibimbing oleh HENNY NURAINI dan
KOMAR SUTRIAH.
Ekstraksi DNA yang merupakan prosedur rutin dalam analisis molekular
menjadi titik kritis dan sangat mempengaruhi hasil analisis. Salah satu metode
ekstraksi yang banyak digunakan adalah metode fenol kloroform. Verifikasi
terhadap metode ini sangat diperlukan untuk membuktikan bahwa laboratorium yang
bersangkutan mampu melakukan pengujian menggunakan metode tersebut dengan
hasil yang valid. Penelitian ini bertujuan memverifikasi metode ekstraksi DNA
metode fenol kloroform pada daging segar dan daging olahan dengan menggunakan
presisi ketertiruan (repeatibility), keseksamaan (reproducibility), dan ketangguhan
metode (ruggedness). Tolak ukur analisis ini adalah kemurnian DNA yang diukur
menggunakan spektrofotometer nanodrop. Berdasarkan hasil penelitian, uji presesi
ketertiruan (repeatibility) yang dilakukan oleh seorang laboran dan uji presisi
keseksamaan (reproducibility) yang dilakukan tiga analis yang berbeda menunjukkan
nilai simpangan baku relatif (SBR) di bawah 5% pada tiap sampel yang diuji. Hal
ini menunjukkan bahwa metode ekstraksi yang digunakan memiliki nilai presisi yang
baik, sehingga hasil yang didapat akan sama walaupun dilakukan berulang dan oleh
analis yang berbeda. Berdasarkan uji ketangguhan yang dilakukan menunjukkan
bahwa volume fenol dan klororform isoamil alkohol (CIAA) optimal yang diberikan
yaitu masing-masing 400 µL, serta bobot sampel yang digunakan yaitu 0.075 g untuk
meningkatkan efisiensi metode.
Kata kunci: ekstraksi DNA, fenol kloroform, ketangguhan, presisi, verifikasi
ABSTRACT
ISHFI ARYAHIYYAH. Verification of Fenol Chloroform Extraction Method for
DNA Isolation in Meat and Meat Products. Supervised by HENNY NURAINI and
KOMAR SUTRIAH.
DNA extraction which is routine procedure in molecular analysis to get DNA
isolate became critical point that can influence analysis result. One of extraction
method that common used is phenol chloroform. Verification of this method is
really needed for explain that laboratory can use the method and get a valid result.
This research was to verificate DNA extraction method which is phenol chloroform
in meat and meat products with precision of repeatability and reproducibility also
ruggedness. The measure of this research is DNA purification from sample which
measured by nanodrop spectrophotometer. Result showed that precision of
repeatability that has been done by one analyst and the precision of reproducibility
that has been done by three different analyst had standard deviation above 5%. It
means that extraction method that used in the laboratory was good because it had
good precision. So the result of extraction will give same result even though it has
done repeatedly by different analyst. The most efficient volume of phenol and CIAA
that added in this method is 400 µL and the most efficient sample weight used in this
method is 0.075 g.
Key words : DNA extraction, phenol chloroform, precision, ruggedness,
verification
VERIFIKASI METODE EKSTRAKSI FENOL KLOROFORM
UNTUK ISOLASI DNA PADA DAGING
DAN PRODUK OLAHAN
ISHFI ARYAHIYYAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi :Verifikasi Metode Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi DNA
pada Daging dan Produk Olahan
Nama
: Ishfi Aryahiyyah
NIM
: D14100101
Disetujui oleh
Dr Ir Henny Nurani, MSi
Pembimbing I
Drs Komar Sutriah, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Muladno, MSA
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan kemurahan
hati-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan judul Verifikasi
Metode Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi DNA pada Daging dan Produk
Olahan.
Shalawat serta salam senantiasa tercurahkan kepada junjungan Nabi
Muhammad SAW, keluarga, para sahabat dan umatnya hingga akhir zaman.
Penyusunan skripsi ini dilakukan untuk memverifikasi metode ekstraksi DNA
yang dilakukan pada laboratorium menggunakan metode fenol kloroform. Tahapan
ekstraksi merupakan tahapan yang cukup kritis karena dilakukan untuk mengisolasi
DNA. Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat bagi berbagai pihak.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Ir Henny Nuraini, MSi dan Drs Komar
Sutriah MSi selaku dosen pembimbing yang banyak memberi ilmu baru dan
membimbing penulis dari awal hingga akhir penelitian. Di samping itu penghargaan
penulis sampaikan kepada Eryk Andreas, SPt Msi; Shelvi, Ssi; Isyana Khaerunisa, SPt;
dan Ahmad Furqon, SPt serta semua teman-teman dari Laboratorium Pemuliaan dan
Genetika Ternak yang telah membantu selama penelitian berlangsung dan memberi
banyak ilmu baru. Ungkapan terima kasih setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada
Ayah Masruhan, Ibu Teti Sugiarti dan seluruh keluarga besar atas dukungan dan kasih
sayangnya. Terima kasih pula kepada teman-teman IPTP angkatan 47, terutama Anita
Rahman, Laras S Fauziah, Annisa K Suwasandasari, Ria P Rahmadani, Fredy Fender,
M. Jafar, Angga B Prasetya, Nenik T Wahyuni, Nurul Khikmah, Sela Pratiwi,
Cahyatina T Rahayu, dan Jannaatin Alfaafa. Tak lupa juga apresiasi diberikan kepada
seluruh keluarga besar Etos Bogor. Ucapan terima kasih yang tiada putus juga
diberikan kepada semua sahabat penulis yang tak bisa disebutkan satu persatu yang
telah mendukung penulis secara moril. Semoga hasil penelitian ini bermanfaat bagi
semua pihak yang membutuhkannya.
Bogor, September 2014
Ishfi Aryahiyyah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR LAMPIRAN
vii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan
1
Ruang Lingkup Penelitian
1
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Materi
2
Sampel
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur
2
Ekstraksi DNA Total
2
Uji Kemurnian DNA
3
Verifikasi Metode Ekstraksi dan Rancangan Analisis Data
3
Uji Presisi
3
Uji Ketangguhan (Ruggedness)
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
5
Uji Presisi
5
Uji Ketangguhan (Ruggedness)
6
Uji Ketangguhan Fenol
7
Uji Ketangguhan Kloroform Isoamil Alkohol (CIAA)
7
Uji Ketangguhan Bobot Sampel
8
SIMPULAN DAN SARAN
9
DAFTAR PUSTAKA
9
LAMPIRAN
11
RIWAYAT HIDUP
13
DAFTAR TABEL
1 Uji presisi keterulangan (repeatibility)
2 Uji presisi ketertiruan (reproducibility)
3 Kemurnian DNA dengan volume fenol berbeda pada sampel daging sapi
dan sosis sapi
4 Kemurnian DNA dengan volume CIAA berbeda pada sampel daging sapi
dan sosis sapi
5 Kemurnian DNA dengan bobot sampel berbeda pada daging sapi dan sosis
sapi
5
6
7
7
8
DAFTAR LAMPIRAN
1 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan fenol
pada ekstraksi DNA daging sapi
2 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan CIAA
pada ekstraksi DNA daging sapi
3 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan bobot sampel pada
ekstraksi DNA daging sapi
4 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan fenol
pada ekstraksi DNA sosis sapi
5 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan CIAA
pada ekstraksi DNA sosis sapi
6 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan bobot sampel pada
ekstraksi DNA sosis sapi
11
11
11
12
12
12
PENDAHULUAN
Latar Belakang
DNA yang merupakan unit keturunan terkecil dapat diperoleh dengan cara
mengisolasi atau mengekstraksi bahan yang ingin diketahui (Muladno 2010).
Ekstraksi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekular dan menjadi titik
kritis yang sangat mempengaruhi hasil analisis. Jumlah dan mutu DNA hasil
ekstraksi akan mempengaruhi analisis lebih lanjut dengan PCR (Ardi 2012).
Ekstraksi DNA bertujuan untuk memisahkan asam nukleat dari komponen sel
lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dan lain-lain) sehingga asam nukleat yang
diperoleh dapat dianalisis (Muladno 2010). Salah satu metode ekstraksi yang banyak
digunakan adalah metode fenol kloroform. Selain biaya yang digunakan cukup
murah, metode ini sangat bermanfaat untuk mendapatkan isolat DNA dengan
kemurnian yang tinggi, sehingga tidak ada pengotor atau kontaminan yang
menghalangi proses selanjutnya.
Verifikasi terhadap metode ekstraksi ini perlu dilakukan untuk membuktikan
bahwa laboratorium yang bersangkutan mampu melakukan pengujian dengan metode
tersebut dengan hasil yang valid, selain itu juga membuktikan bahwa laboratorium
memiliki data kinerja (Saputra 2009). Uji verifikasi yang dilakukan lebih
dititikberatkan pada ekstraksi daging dan pangan olahan, mengingat pentingnya
identifikasi objek tersebut pada masa ini. Pesatnya perkembangan produk makanan
di lingkungan masyarakat Indonesia membuat para konsumen harus lebih berhatihati terhadap berbagai jenis pangan olahan yang dikonsumsi. Hal ini dikarenakan
tidak semua pangan olahan mengandung bahan makanan yang sesuai. Banyak
pemalsuan yang kerap dilakukan oleh produsen untuk meminimalkan biaya produksi.
Salah satu cara yang dilakukan untuk mengidentifikasi bahan apa yang terkandung
dalam produk tersebut adalah identifikasi DNA dengan metode PCR, dengan cara ini
pula dapat diketahui apakah suatu produk telah tercampur oleh bahan yang bukan
seharusnya. Diharapkan proses ekstraksi DNA yang valid dapat mempermudah
proses identifikasi berbagai produk yang dilakukan oleh laboratorium.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan melakukan verifikasi terhadap metode ekstraksi fenol
kloroform untuk isolasi DNA pada daging dan produk olahan dengan uji presisi
ketertiruan (repeatibility), keseksamaan (reproducibility), dan ketangguhan metode
(ruggedness).
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini merupakan salah satu usaha untuk menguji validitas metode
ekstraksi DNA yang biasa digunakan pada Laboratorium Pemuliaan dan Genetika
Ternak, Fakultas Peternakan IPB. Ekstraksi DNA dilakukan untuk mendapatkan
isolat DNA yang akan mempengaruhi tahapan selanjutnya. Verifikasi yang
dilakukan mencakup uji presisi ketertiruan (repeatibility), presisi keseksamaan
2
(reproducibility), dan ketangguhan metode (ruggedness). Tolak ukur evaluasi adalah
kemurnian DNA yang dihasilkan dari masing-masing perlakuan dan diukur
menggunakan spektrofotometer nanodrop. Proses ekstraksi yang baik dan sesuai
prosedur akan menghasilkan DNA dengan kemurnian yang tinggi. Kemurnian DNA
akan sangat memengaruhi hasil analisis selanjutnya.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama 5 bulan, yakni dari bulan Desember 2013
hingga April 2014. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pemuliaan dan
Genetika Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Uji kemurnian
DNA menggunakan spektrofotometer nanodrop dilakukan di Laboratorium Institut
Pertanian Bogor Culture Collection (IPBCC).
Materi
Sampel
Sampel yang diekstraksi terdiri atas daging sapi, daging babi, bakso sapi, sosis
sapi, bakso sapi, nugget ayam, dan kornet sapi. Sampel produk olahan didapat dari
toko di sekitar Darmaga, Bogor, Jawa Barat.
Bahan dan Alat
Bahan dan alat yang digunakan pada penelitian ini berdasarkan prosedur baku
operasional yang ditetapkan oleh Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak,
Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Bahan-bahan yang akan digunakan
untuk ekstraksi DNA dari sampel produk adalah destilation water (DW), 1x sodium
tris EDTA (STE), sodium dodesil sulfat (SDS) 10%, fenol, proteinase K 5 mg mL-1,
kloroform isoamil alkohol (CIAA), NaCl 5M, EtOH (etanol) absolut, EtOH 70% dan
tris EDTA (TE) 80%.
Alat-alat yang akan digunakan untuk ekstraksi DNA adalah tabung 1.5 mL, rak
tabung, alat penggerus, gunting, timbangan, cawan petri, satu set micropippet beserta
tipnya, tilter, vortex, sentrifuge, frezeer dan inkubator. Kemurnian DNA diukur
menggunakan spektrofotometer nanodrop.
Prosedur
Ekstraksi DNA Total
Ekstraksi DNA dilakukan dengan acuan metode Sambrook et al. (1989) yang
telah dimodifikasi oleh Andreas et al. (2010). Sampel diambil dan ditimbang dengan
alat timbang analitik merk Sartoris sebanyak 0.075 g. Masing-masing sampel
dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL, kemudian digerus hingga halus
dengan alat penggerus. Setelah itu ditambahkan 40 µL SDS 10%, 20 µL proteinase K,
dan 350 µL STE untuk menghancurkan membrane sel dan mengeluarkan isi sel.
Sampel digoyang pelan pada inkubator di suhu 55 oC selama dua jam. Setelah dua
jam ditambahkan 400 µL larutan fenol, 400 µL CIAA, dan 40 µL NaCl 5 M untuk
3
memisahkan bahan organik dari asam nukleat, lalu digoyang kembali pada suhu
ruang selama satu jam. Selanjutnya disentrfuge degan kecepatan 12 000 rpm di suhu
200 C selama lima menit. Bagian DNA (supernatant yang bening) dipindahkan
menggunakan pipet sebanyak 400 µL ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL yang baru
dan telah diberi label. Setelah itu ditambahkan 800 µ L larutan EtOH absolut dan 40
µL NaCl 5 M, lalu dibekukan pada suhu -20 oC over night untk memaksimalkan
proses presipitasi DNA.
Larutan yang telah didiamkan semalaman kemudian disentrifuge pada
kecepatan 12 000 rpm di suhu 20 oC selama lima menit, lalu dibuang bagian
supernatannya dan ditambahkan 800 µL EtOH 70%. Cairan tanpa supernatant
tersebut kembali disentrifugasi lagi pada kecepatan 12 000 rpm di suhu 20 oC selama
lima menit. Langkah selanjutnya yakni didiamkan dalam keadaan terbuka sampai
alkohol hilang dan sampel mengering. Setelah kering maka ditambahkan 100 µL TE
80% atau Elution Buffer. Hasil ekstraksi DNA yang sudah didapat bisa langsung
digunakan.
Uji Kemurnian DNA
Uji kualitas DNA dapat dilakukan dengan mengukur konsentrasi kemurnian
DNA sampel yang didapat dari proses ekstraksi menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 260 dan 280 nm. DNA dikatakan murni bila memiliki indeks
kemurniaan 1.8-2.0 (Muladno 2010):
Keterangan :
A260 = absorbans pada 260 nm
A280 = absorbans pada 280 nm
Verifikasi Metode Ekstraksi dan Analisis Data
Uji Presisi
DNA diekstrak dari masing-masing sampel yang berupa daging sapi, daging
babi, kornet, sosis sapi, nugget, daging sapi giling dan bakso sapi. Hali ini mengacu
pada Harmita (2004) yang menyatakan bahwa uji presisi dilakukan terhadap paling
sedikit enam replika sampel. Setiap ekstraksi yang dilakukan diulang sebanyak 7
kali. Data yang diambil untuk uji presisi yaitu kemurnian DNA masing-masing
sampel.
Perhitungan presisi, baik ripitabilitas dan reprodusibilitas dapat dihitung dengan
cara sebagai berikut:
1. Hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,.........xn maka simpangan bakunya adalah
√
2.
∑
̅
Simpangan baku relatif (SBR) adalah
̅
4
Jika hasil simpangan baku relatif (SBR) kemurnian DNA kurang dari 5%,
maka dapat dinyatakan bahwa metode tersebut memiliki presisi yang tinggi dan valid
untuk digunakan (Ermer 2005).
Uji Ketangguhan (Ruggedness)
Rancangan yang digunakan untuk uji ketangguhan ini adalah rancangan acak
lengkap (RAL) dan dihitung menggunakan ANOVA (Harmita 2004). Jika hasil yang
diperoleh berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan.
Uji
ketangguhan ini dilakukan untuk menguji seberapa tangguh jumlah volume fenol,
jumlah kloroform isoamil alkohol (CIAA), dan bobot sampel yang digunakan pada
metode ekstraksi fenol kloroform. Sampel yang digunakan dalam uji ini yaitu daging
sapi dan sosis sapi.
Uji terhadap pemberian fenol diteliti dengan 3 perlakuan, yakni 200 µL, 400
µL dan 600 µL dengan kondisi tidak ada perubahan volume pada bahan-bahan lain.
Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Berikut adalah model
rancangan percobaan yang digunakan:
Yij = μ + Pi + εij
Keterangan
Yi : Kemurnian DNA dengan volume fenol (200 µL, 400 µL dan 600 µL) dan ulangan ke-j (1, 2
dan 3)
µ
: Nilai tengah kemurnian DNA
Pi : Pengaruh pemberian volume fenol ke-i (200 µL, 400 µL dan 600 µL) terhadap kemurnian DNA
εij : Pengaruh galat percobaan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j pada tingkat kemurnian DNA.
Uji terhadap pemberian kadar CIAA pada proses ekstraksi dilakukan dengan 3
perlakuan, yakni 200 µL, 400 µL dan 600 µL dengan kondisi tidak ada perubahan
volume pada bahan-bahan lain. Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali
ulangan. Berikut adalah model rancangan percobaan yang digunakan:
Yij = μ + Pi + εij
Keterangan
Yij : Kemurnian DNA dengan volume CIAA taraf ke-i (200 µL, 400 µL dan 600 µL) dan ulangan
ke-j (1, 2 dan 3)
μ
: Nilai tengah kemurnian DNA
Pi : Pengaruh pemberian CIAA taraf ke-i (200 µL, 400 µL dan 600 µL) terhadap kemurnian DNA
εij : Pengaruh galat percobaan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j pada tingkatat kemurnian DNA.
Uji terhadap pemberian bobot sampel pada proses ekstraksi dilakukan dengan 3
perlakuan, yakni 0.025 g, 0.075 g dan 0.125 g dengan kondisi tidak ada perubahan
volume pada bahan-bahan lain. Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali
ulangan. Berikut adalah model rancangan percobaan yang digunakan:
Yij = μ + Pi + εij
Keterangan
Yij : Kemurnian DNA dengan perbedaan bobot sampel taraf ke-i (0.025 g, 0.075 g dan 0.125 g) dan
ulangan ke-j (1,2 dan 3)
μ
: Nilai tengah kemurnian DNA
Pi : Pengaruh perbedaan bobot sampel ke-i (0.025 g, 0.075g dan 0.125 g) terhadap kemurnian DNA
εij : Pengaruh galat percobaan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j pada tingkat kemurnian DNA.
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Presisi
Presisi yang dilakukan dalam penelitian ini yakni presisi keterulangan
(repeatibility) dan presisi ketertiruan (reproducibility). Valcarcél (2000) menyatakan
bahwa uji presisi dilakukan untuk mengetahui nilai konsistensi antara hasil yang
diperoleh pada suatu sampel yang diuji.
Presisi keterulangan (repeatibility) dilakukan oleh satu orang analis dalam satu
periode tertentu, menggunakan pereaksi dan
peralatan yang sama dalam
laboratorium yang sama (Harvey 2000) serta dilakukan dalam interval yang pendek
(Chan 2004). Presisi keterulangan dilakukan untuk mengukur perbedaan internal
dalam sebuah metode (Valcarcél 2000). Hasil uji presisi keterulangan (repeatibility)
dapat dilihat pada Tabel 1
Ulangan
1
2
3
4
5
6
7
̅
SB
SBR
Db
2.205
2.010
2.135
2.010
2.105
2.095
1.995
2.079
0.078
3.752
Tabel 1 Uji presisi keterulangan (repeatibility)
Ds
Sos
Bs
Na
Sg
1.960
1.860
1.910
2.010
2.015
1.995
1.865
1.935
2.015
2.000
1.985
1.890
1.920
1.960
1.990
1.985
1.870
1.900
1.990
2.000
1.950
1.890
1.925
1.975
1.985
1.995
1.910
1.910
2.015
2.010
2.000
1.875
1.900
1.950
1.970
1.981
1.880
1.914
1.988
1.996
0.019
0.017
0.013
0.027
0.015
0.963
0.934
0.682
1.353
0.771
Ks
1.885
1.865
1.890
1.905
1.915
1.890
1.875
1.889
0.017
0.897
Keterangan : Db = Daging babi, Ds = Daging Sapi, Sos = Sosis sapi, Bs = Bakso sapi, Na = Nugget
ayam, Sg = Sapi giling, Ks = Kornet Sapi
Tabel 1 menunjukkan hampir semua sampel, yakni daging sapi, sosis sapi,
bakso sapi, nugget, daging sapi giling, dan kornet sapi memiliki rata-rata tingkat
kemurnian DNA tinggi yakni berada dalam rentang nilai 1.8-2.0 (Muladno 2010).
Akan tetapi rata-rata kermunian DNA yang diperoleh daging babi yaitu 2.079.
Kemurnian DNA yang bernilai lebih besar dari dua menunjukkan bahwa DNA
tersebut terkontaminasi oleh RNA (Khosravinia et al. 2007; Santella 2006).
Nilai presisi keterulangan (repeatibility) yang diperoleh semua sampel yakni
berada di bawah 5%. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan valid.
Menurut Ermer (2005), nilai presisi yang diterima untuk ketidakmurnian yaitu 0.05). Pemberian fenol sebanyak 200-600 µL
pada ekstraksi sampel daging sapi dan sosis sapi memberikan nilai kemurnian DNA
yang sama-sama tinggi. Akan tetapi tahapan ini akan lebih efisien jika fenol yang
diberikan sebanyak 400 µL. Hasilnya sama-sama memberikan kemurnian DNA
yang tinggi, namun pemberian fenol dengan jumlah sedikit akan mempersulit
pengambilan DNA pada fase air yang berada pada bagian atas setelah dilakukan
pemisahan dengan cara sentrifugasi. Pengambilan DNA pada fase cair harus
dilakukan dengan sangat hati-hati oleh analis terlatih agar kontaminan pengotor tidak
ikut terbawa. Sebaliknya pemberian fenol yang melebihi standar akan menghabiskan
biaya lebih besar.
Uji Ketangguhan Kloroform Isoamil Alkohol (CIAA)
Hasil rata-rata kemurnian DNA dengan volume CIAA berbeda pada sampel
daging sapi dan sosis sapi disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4 Kemurnian DNA dengan volume CIAA berbeda pada sampel daging sapi
dan sosis sapi
Sampel
Volume CIAA
200 µL
400 µL
600 µL
Daging sapi
1.973 ± 0.016
1.965 ± 0.000
1.963 ± 0.013
Sosis sapi
1.882 ± 0.016a
1.848 ± 0.008ab
1.862 ± 0.013b
Keterangan : angka-angka pada baris sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata
pada taraf uji 5%
8
Tabel 4 menunjukkan nilai rata-rata kemurnian DNA dengan volume CIAA
berbeda pada daging sapi menghasilkan nilai tidak nyata (P>0.05), sedangkan uji
ketanggguhan pada sampel sosis sapi memberikan hasil yang berbeda nyata (P0.05). Hal ini menunjukkan bobot sampel yang
digunakan dalam rentang 0.025 g hingga 0.125 g menghasilkan DNA dengan nilai
kemurnian yang sama-sama tinggi. Akan tetapi tahapan ini lebih efisien jika bobot
sampel yang digunakan sesuai standar, yakni 0.075 g. Bobot sampel yang terlalu
besar akan mempersulit proses penghancuran sampel di dalam tabung eppendorf,
sedangkan jika bobot sampel yang digunakan terlalu sedikit maka akan sedikit
konsentrasi DNA yang dihasilkan.
9
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Proses ekstraksi DNA menggunakan metode fenol kloroform di Laboratorium
Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan IPB sudah memenuhi standar
verifikasi. Hal ini ditunjukkan dengan nilai presisi yang baik dengan nilai simpangan
baku relatif (SBR) di bawah 5% pada tiap sampel yang diuji. Volume fenol dan
Kloroform Isoamil Alkohol (CIAA) optimal yang digunakan sebagai campuran
larutan pengekstrak sebanyak 400 µL, sedangkan bobot sampel optimal yang
digunakan sebanyak 0.075 g.
Saran
Perlu diadakan verifikasi lanjutan dengan beberapa uji lainnya.
Uji
ketangguhan (ruggedness) dapat terus dilakukan terhadap berbagai faktor analisis
lainnya pada metode ekstraksi fenol kloroform ini, misalnya pada suhu dan waktu
inkubasi, kecepatan sentrifugasi, perbedaan volume bahan-bahan lain yang
digunakan.
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2006. Presidential Task Force
on Best Practices for Microbiological Methodology. Gaithersburg (US).
Andreas E, Sumantri C, Nurani H, Farajallah A, Anggraeni A. 2010. Identification
of GH|AluI genes polymorphisms in indonesian buffalo. Indonesian Trop
Anim Agric 35:25-221.
Ardi A. 2012. Validasi metode ekstraksi DNA pada analisis DNA babi dalam
produk bakso [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor
Chan CC, Herman L, Lee YC, Xue MZ. 2004. Analytical Method Validation and
Instrument Performan Verification. Canada (CA): John Wiley & Sons, Inc.
Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya.
Majalah Ilmu Kefarmasian. 1(3):117-135.
Ermer J, John HM. 2005. Method Validation in Pharmaceutical Analysis. A Guide
to Best Practice. Weinheim (DE): WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA
Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York (US): The Mc Graw Hill
Companies, Inc.
Khosravinia H, Murthy NN, Parasad DT, Pirany N. 2007. Optimazing factors
influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. African Journal of
Biotechnology. 6(4):481-486.
Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed ke-2. Bogor (ID): IPB Pr.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. New York (US): CSH Laboratory Press.
10
Santella RM. 2006. Approaches to DNA/RNA extraction and whole genome
amplification. Cancer Epidemiology Biomarkers. 15(9): 1585-1587.
Saputra YE. 2009. Verifikasi dan Validasi Metode di Laboratorium [Internet].
[diunduh 2013 Des 10]. Tersedia pada:http//www.chemistry.org/artikel_kimia/
kimia_analisis/verifikasi-dan validasi-metoda-di-laboratorium/.
Surzycki S. 2003. Laboratory Manual Human Molecular Biology. New York
(US): Blackwell Publishing
Valcarcél M. 2000. Principles of Analytical Chemistry. Berlin (DE): Springer
11
LAMPIRAN
Lampiran 1 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan
fenol pada ekstraksi DNAdaging sapi
Ulangan
1
2
3
Sumber Keragaman
Perlakuan
Galat
Total
Fa (200 µL)
1.980
1.985
1.945
DB
2
6
8
JK
0.0009556
0.0020667
0.0030222
Fb (400 µL)
1.970
1.950
1.930
KT
0.0004778
0.0003444
Fc (600 µL)
1.960
1.935
1.945
F
1.39
P
0.320
Keterangan : P > 0.05 = Tidak nyata
Lampiran 2 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan
CIAA pada ekstraksi DNA daging sapi
Ulangan
1
2
3
Sumber Keragaman
Perlakuan
Galat
Total
Keterangan : P > 0.05
Ca (200 µL)
1.985
1.980
1.955
DB
2
6
8
JK
0.0001722
0.0008333
0.0010056
Cb (400 µL)
1.965
1.965
1.965
KT
0.0000861
0.0001389
Cc (600 µL)
1.965
1.975
1.950
F
0.62
P
0.569
= tidak nyata
Lampiran 3 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan bobot sampel
pada ekstraksi DNA daging sapi
Ulangan
1
2
3
Sumber Keragaman
Perlakuan
Galat
Total
Na (0.025 g)
1.915
1.935
1.625
DB
2
6
8
Keterangan : P > 0.05 = tidak nyata
JK
0.02282
0.06148
0.08430
Nb (0.075 g)
1.925
1.950
1.965
KT
0.01141
0.01025
Nc (1.025 g)
1.920
1.900
1.890
F
1.11
P
0.388
12
Lampiran 4 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan fenol
pada ekstraksi DNA sosis sapi
Ulangan
1
2
3
sFa (200 µL)
1.905
1.905
1.865
sFb (400 µL)
1.845
1.875
1.845
Sumber Keragaman
DB
JK
Perlakuan
2
0.0023722
Galat
6
0.0022667
Total
8
0.0046389
Keterangan : P > 0.05 = tidak nyata
sFc (600 µL)
1.840
1.870
1.870
KT
0.0011861
0.0003778
F
3.14
P
0.117
Lampiran 5 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan
CIAA pada ekstraksi DNA sosis sapi
Ulangan
1
2
3
Sumber Keragaman
Perlakuan
Galat
Total
sCa (200 µL)
1.900
1.875
1.870
DB
2
6
8
sCb (400 µL)
1.850
1.840
1.855
JK
0.0016889
0.0009500
0.0026389
sCc (600 µL)
1.860
1.850
1.875
KT
0.0008444
0.0001583
F
5.33
P
0.047
Keterangan : P< 0.05 = berbeda nyata
Hasil uji Duncan
Grup Duncan
B
B
B
A
A
A
Rata-rata
N
Perlakuan
1.88167
3
A
1.86167
3
C
1.84833
3
B
Lampiran 6. Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan bobot sampel
pada ekstraksi DNA sosis sapi
Ulangan
1
2
3
Sumber Keragaman
Perlakuan
Galat
Total
sNa (0.025 g)
1.895
1.845
1.940
DB
2
6
8
Keterangan : P > 0.05 = tidak nyata
JK
0.0022167
0.0051833
0.0074000
sNb (0.025 g)
1.900
1.900
1.905
KT
0.0011083
0.0008639
sNc (0.025 g)
1.870
1.845
1.880
F
1.28
P
0.344
13
RIWAYAT HIDUP
Penulis bernama Ishfi Aryahiyyah dilahirkan di Karawang pada tanggal 3
Oktober 1992 dari pasangan ayah Masruhan dan ibu Teti Sugiarti. Penulis
merupakan anak pertama dari 4 bersaudara dengan adik Shofia Andari, Kayla
Mazaya dan Muhammad Arkarozi. Penulis menyelesaikan pendidikan di TK
Kharisma tahun 1998, SDN Margajaya IV tahun 2004, MDA Annajahul Islami tahun
2005, SMPN 1 Bekasi tahun 2007, MAN 1 Bekasi tahun 2010. Penulis diterima di
Institut Pertanian Bogor melalui jalur SNMPTN tulis pada program studi Ilmu
Produksi dan Teknologi Peternakan (IPTP).
Selama menjadi mahasiswa penulis memperoleh beastudi Etos Dompet Dhuafa
selama 6 semester, beasiswa Program Prestasi Akademik (PPA) IPB, beasiswa
Yayasan Amanah IPB dan beasiswa Karya Salemba Empat. Kegiatan penulis di
luar akademik yaitu menjadi anggota aktif UKM Karate IPB tahun 2010/2013, divisi
sosial pada Sekolah Desa Produktif Bestudi Etos Bogor tahun 2010/2011, anggota
rohis kelas IPTP 47 tahun 2011/2014, divisi Islamic Student Center (ISC) Lembaga
Dakwah Fakultas FAMM Al-An’aam Fapet IPB 2011/2013 dan divisi Forum Rohis
Kelas IPB (FRKI) pada Forum Silaturahim Lembaga Dakwah Fakultas IPB
(FSLDKI) tahun 2012/2013 serta serangkaian kepanitiaan kegiatan di dalam dan luar
kampus. Penulis juga menjadi asisten praktikum Pendidikan Agama Islam (PAI)
pada tahun 2013/2014.
Prestasi yang pernah diraih oleh penulis selama kuliah yakni, juara favorit
senam aerobik kelas A04 pada tahun 2010, PKM kewirausahaan didanai DIKTI
tahun 2010 dan 2012, seminar dan publikasi karya tulis pada prosiding internasional
AISC Taiwan pada tahun 2013 serta PKM penelitian didanai DIKTI tahun 2014.
.
UNTUK ISOLASI DNA PADA DAGING
DAN PRODUK OLAHAN
ISHFI ARYAHIYYAH
ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi penelitian berjudul Verifikasi Metode
Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi DNA pada Daging dan Produk Olahan adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam daftar pustaka.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Ishfi Aryahiyyah
NIM D14100101
.
ABSTRAK
ISHFI ARYAHIYYAH. Verifikasi Metode Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi
DNA pada Daging dan Produk Olahan. Dibimbing oleh HENNY NURAINI dan
KOMAR SUTRIAH.
Ekstraksi DNA yang merupakan prosedur rutin dalam analisis molekular
menjadi titik kritis dan sangat mempengaruhi hasil analisis. Salah satu metode
ekstraksi yang banyak digunakan adalah metode fenol kloroform. Verifikasi
terhadap metode ini sangat diperlukan untuk membuktikan bahwa laboratorium yang
bersangkutan mampu melakukan pengujian menggunakan metode tersebut dengan
hasil yang valid. Penelitian ini bertujuan memverifikasi metode ekstraksi DNA
metode fenol kloroform pada daging segar dan daging olahan dengan menggunakan
presisi ketertiruan (repeatibility), keseksamaan (reproducibility), dan ketangguhan
metode (ruggedness). Tolak ukur analisis ini adalah kemurnian DNA yang diukur
menggunakan spektrofotometer nanodrop. Berdasarkan hasil penelitian, uji presesi
ketertiruan (repeatibility) yang dilakukan oleh seorang laboran dan uji presisi
keseksamaan (reproducibility) yang dilakukan tiga analis yang berbeda menunjukkan
nilai simpangan baku relatif (SBR) di bawah 5% pada tiap sampel yang diuji. Hal
ini menunjukkan bahwa metode ekstraksi yang digunakan memiliki nilai presisi yang
baik, sehingga hasil yang didapat akan sama walaupun dilakukan berulang dan oleh
analis yang berbeda. Berdasarkan uji ketangguhan yang dilakukan menunjukkan
bahwa volume fenol dan klororform isoamil alkohol (CIAA) optimal yang diberikan
yaitu masing-masing 400 µL, serta bobot sampel yang digunakan yaitu 0.075 g untuk
meningkatkan efisiensi metode.
Kata kunci: ekstraksi DNA, fenol kloroform, ketangguhan, presisi, verifikasi
ABSTRACT
ISHFI ARYAHIYYAH. Verification of Fenol Chloroform Extraction Method for
DNA Isolation in Meat and Meat Products. Supervised by HENNY NURAINI and
KOMAR SUTRIAH.
DNA extraction which is routine procedure in molecular analysis to get DNA
isolate became critical point that can influence analysis result. One of extraction
method that common used is phenol chloroform. Verification of this method is
really needed for explain that laboratory can use the method and get a valid result.
This research was to verificate DNA extraction method which is phenol chloroform
in meat and meat products with precision of repeatability and reproducibility also
ruggedness. The measure of this research is DNA purification from sample which
measured by nanodrop spectrophotometer. Result showed that precision of
repeatability that has been done by one analyst and the precision of reproducibility
that has been done by three different analyst had standard deviation above 5%. It
means that extraction method that used in the laboratory was good because it had
good precision. So the result of extraction will give same result even though it has
done repeatedly by different analyst. The most efficient volume of phenol and CIAA
that added in this method is 400 µL and the most efficient sample weight used in this
method is 0.075 g.
Key words : DNA extraction, phenol chloroform, precision, ruggedness,
verification
VERIFIKASI METODE EKSTRAKSI FENOL KLOROFORM
UNTUK ISOLASI DNA PADA DAGING
DAN PRODUK OLAHAN
ISHFI ARYAHIYYAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi :Verifikasi Metode Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi DNA
pada Daging dan Produk Olahan
Nama
: Ishfi Aryahiyyah
NIM
: D14100101
Disetujui oleh
Dr Ir Henny Nurani, MSi
Pembimbing I
Drs Komar Sutriah, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Muladno, MSA
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan kemurahan
hati-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan judul Verifikasi
Metode Ekstraksi Fenol Kloroform untuk Isolasi DNA pada Daging dan Produk
Olahan.
Shalawat serta salam senantiasa tercurahkan kepada junjungan Nabi
Muhammad SAW, keluarga, para sahabat dan umatnya hingga akhir zaman.
Penyusunan skripsi ini dilakukan untuk memverifikasi metode ekstraksi DNA
yang dilakukan pada laboratorium menggunakan metode fenol kloroform. Tahapan
ekstraksi merupakan tahapan yang cukup kritis karena dilakukan untuk mengisolasi
DNA. Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat bagi berbagai pihak.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Ir Henny Nuraini, MSi dan Drs Komar
Sutriah MSi selaku dosen pembimbing yang banyak memberi ilmu baru dan
membimbing penulis dari awal hingga akhir penelitian. Di samping itu penghargaan
penulis sampaikan kepada Eryk Andreas, SPt Msi; Shelvi, Ssi; Isyana Khaerunisa, SPt;
dan Ahmad Furqon, SPt serta semua teman-teman dari Laboratorium Pemuliaan dan
Genetika Ternak yang telah membantu selama penelitian berlangsung dan memberi
banyak ilmu baru. Ungkapan terima kasih setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada
Ayah Masruhan, Ibu Teti Sugiarti dan seluruh keluarga besar atas dukungan dan kasih
sayangnya. Terima kasih pula kepada teman-teman IPTP angkatan 47, terutama Anita
Rahman, Laras S Fauziah, Annisa K Suwasandasari, Ria P Rahmadani, Fredy Fender,
M. Jafar, Angga B Prasetya, Nenik T Wahyuni, Nurul Khikmah, Sela Pratiwi,
Cahyatina T Rahayu, dan Jannaatin Alfaafa. Tak lupa juga apresiasi diberikan kepada
seluruh keluarga besar Etos Bogor. Ucapan terima kasih yang tiada putus juga
diberikan kepada semua sahabat penulis yang tak bisa disebutkan satu persatu yang
telah mendukung penulis secara moril. Semoga hasil penelitian ini bermanfaat bagi
semua pihak yang membutuhkannya.
Bogor, September 2014
Ishfi Aryahiyyah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR LAMPIRAN
vii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan
1
Ruang Lingkup Penelitian
1
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Materi
2
Sampel
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur
2
Ekstraksi DNA Total
2
Uji Kemurnian DNA
3
Verifikasi Metode Ekstraksi dan Rancangan Analisis Data
3
Uji Presisi
3
Uji Ketangguhan (Ruggedness)
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
5
Uji Presisi
5
Uji Ketangguhan (Ruggedness)
6
Uji Ketangguhan Fenol
7
Uji Ketangguhan Kloroform Isoamil Alkohol (CIAA)
7
Uji Ketangguhan Bobot Sampel
8
SIMPULAN DAN SARAN
9
DAFTAR PUSTAKA
9
LAMPIRAN
11
RIWAYAT HIDUP
13
DAFTAR TABEL
1 Uji presisi keterulangan (repeatibility)
2 Uji presisi ketertiruan (reproducibility)
3 Kemurnian DNA dengan volume fenol berbeda pada sampel daging sapi
dan sosis sapi
4 Kemurnian DNA dengan volume CIAA berbeda pada sampel daging sapi
dan sosis sapi
5 Kemurnian DNA dengan bobot sampel berbeda pada daging sapi dan sosis
sapi
5
6
7
7
8
DAFTAR LAMPIRAN
1 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan fenol
pada ekstraksi DNA daging sapi
2 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan CIAA
pada ekstraksi DNA daging sapi
3 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan bobot sampel pada
ekstraksi DNA daging sapi
4 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan fenol
pada ekstraksi DNA sosis sapi
5 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan CIAA
pada ekstraksi DNA sosis sapi
6 ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan bobot sampel pada
ekstraksi DNA sosis sapi
11
11
11
12
12
12
PENDAHULUAN
Latar Belakang
DNA yang merupakan unit keturunan terkecil dapat diperoleh dengan cara
mengisolasi atau mengekstraksi bahan yang ingin diketahui (Muladno 2010).
Ekstraksi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekular dan menjadi titik
kritis yang sangat mempengaruhi hasil analisis. Jumlah dan mutu DNA hasil
ekstraksi akan mempengaruhi analisis lebih lanjut dengan PCR (Ardi 2012).
Ekstraksi DNA bertujuan untuk memisahkan asam nukleat dari komponen sel
lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dan lain-lain) sehingga asam nukleat yang
diperoleh dapat dianalisis (Muladno 2010). Salah satu metode ekstraksi yang banyak
digunakan adalah metode fenol kloroform. Selain biaya yang digunakan cukup
murah, metode ini sangat bermanfaat untuk mendapatkan isolat DNA dengan
kemurnian yang tinggi, sehingga tidak ada pengotor atau kontaminan yang
menghalangi proses selanjutnya.
Verifikasi terhadap metode ekstraksi ini perlu dilakukan untuk membuktikan
bahwa laboratorium yang bersangkutan mampu melakukan pengujian dengan metode
tersebut dengan hasil yang valid, selain itu juga membuktikan bahwa laboratorium
memiliki data kinerja (Saputra 2009). Uji verifikasi yang dilakukan lebih
dititikberatkan pada ekstraksi daging dan pangan olahan, mengingat pentingnya
identifikasi objek tersebut pada masa ini. Pesatnya perkembangan produk makanan
di lingkungan masyarakat Indonesia membuat para konsumen harus lebih berhatihati terhadap berbagai jenis pangan olahan yang dikonsumsi. Hal ini dikarenakan
tidak semua pangan olahan mengandung bahan makanan yang sesuai. Banyak
pemalsuan yang kerap dilakukan oleh produsen untuk meminimalkan biaya produksi.
Salah satu cara yang dilakukan untuk mengidentifikasi bahan apa yang terkandung
dalam produk tersebut adalah identifikasi DNA dengan metode PCR, dengan cara ini
pula dapat diketahui apakah suatu produk telah tercampur oleh bahan yang bukan
seharusnya. Diharapkan proses ekstraksi DNA yang valid dapat mempermudah
proses identifikasi berbagai produk yang dilakukan oleh laboratorium.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan melakukan verifikasi terhadap metode ekstraksi fenol
kloroform untuk isolasi DNA pada daging dan produk olahan dengan uji presisi
ketertiruan (repeatibility), keseksamaan (reproducibility), dan ketangguhan metode
(ruggedness).
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini merupakan salah satu usaha untuk menguji validitas metode
ekstraksi DNA yang biasa digunakan pada Laboratorium Pemuliaan dan Genetika
Ternak, Fakultas Peternakan IPB. Ekstraksi DNA dilakukan untuk mendapatkan
isolat DNA yang akan mempengaruhi tahapan selanjutnya. Verifikasi yang
dilakukan mencakup uji presisi ketertiruan (repeatibility), presisi keseksamaan
2
(reproducibility), dan ketangguhan metode (ruggedness). Tolak ukur evaluasi adalah
kemurnian DNA yang dihasilkan dari masing-masing perlakuan dan diukur
menggunakan spektrofotometer nanodrop. Proses ekstraksi yang baik dan sesuai
prosedur akan menghasilkan DNA dengan kemurnian yang tinggi. Kemurnian DNA
akan sangat memengaruhi hasil analisis selanjutnya.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama 5 bulan, yakni dari bulan Desember 2013
hingga April 2014. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pemuliaan dan
Genetika Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Uji kemurnian
DNA menggunakan spektrofotometer nanodrop dilakukan di Laboratorium Institut
Pertanian Bogor Culture Collection (IPBCC).
Materi
Sampel
Sampel yang diekstraksi terdiri atas daging sapi, daging babi, bakso sapi, sosis
sapi, bakso sapi, nugget ayam, dan kornet sapi. Sampel produk olahan didapat dari
toko di sekitar Darmaga, Bogor, Jawa Barat.
Bahan dan Alat
Bahan dan alat yang digunakan pada penelitian ini berdasarkan prosedur baku
operasional yang ditetapkan oleh Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak,
Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Bahan-bahan yang akan digunakan
untuk ekstraksi DNA dari sampel produk adalah destilation water (DW), 1x sodium
tris EDTA (STE), sodium dodesil sulfat (SDS) 10%, fenol, proteinase K 5 mg mL-1,
kloroform isoamil alkohol (CIAA), NaCl 5M, EtOH (etanol) absolut, EtOH 70% dan
tris EDTA (TE) 80%.
Alat-alat yang akan digunakan untuk ekstraksi DNA adalah tabung 1.5 mL, rak
tabung, alat penggerus, gunting, timbangan, cawan petri, satu set micropippet beserta
tipnya, tilter, vortex, sentrifuge, frezeer dan inkubator. Kemurnian DNA diukur
menggunakan spektrofotometer nanodrop.
Prosedur
Ekstraksi DNA Total
Ekstraksi DNA dilakukan dengan acuan metode Sambrook et al. (1989) yang
telah dimodifikasi oleh Andreas et al. (2010). Sampel diambil dan ditimbang dengan
alat timbang analitik merk Sartoris sebanyak 0.075 g. Masing-masing sampel
dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL, kemudian digerus hingga halus
dengan alat penggerus. Setelah itu ditambahkan 40 µL SDS 10%, 20 µL proteinase K,
dan 350 µL STE untuk menghancurkan membrane sel dan mengeluarkan isi sel.
Sampel digoyang pelan pada inkubator di suhu 55 oC selama dua jam. Setelah dua
jam ditambahkan 400 µL larutan fenol, 400 µL CIAA, dan 40 µL NaCl 5 M untuk
3
memisahkan bahan organik dari asam nukleat, lalu digoyang kembali pada suhu
ruang selama satu jam. Selanjutnya disentrfuge degan kecepatan 12 000 rpm di suhu
200 C selama lima menit. Bagian DNA (supernatant yang bening) dipindahkan
menggunakan pipet sebanyak 400 µL ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL yang baru
dan telah diberi label. Setelah itu ditambahkan 800 µ L larutan EtOH absolut dan 40
µL NaCl 5 M, lalu dibekukan pada suhu -20 oC over night untk memaksimalkan
proses presipitasi DNA.
Larutan yang telah didiamkan semalaman kemudian disentrifuge pada
kecepatan 12 000 rpm di suhu 20 oC selama lima menit, lalu dibuang bagian
supernatannya dan ditambahkan 800 µL EtOH 70%. Cairan tanpa supernatant
tersebut kembali disentrifugasi lagi pada kecepatan 12 000 rpm di suhu 20 oC selama
lima menit. Langkah selanjutnya yakni didiamkan dalam keadaan terbuka sampai
alkohol hilang dan sampel mengering. Setelah kering maka ditambahkan 100 µL TE
80% atau Elution Buffer. Hasil ekstraksi DNA yang sudah didapat bisa langsung
digunakan.
Uji Kemurnian DNA
Uji kualitas DNA dapat dilakukan dengan mengukur konsentrasi kemurnian
DNA sampel yang didapat dari proses ekstraksi menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 260 dan 280 nm. DNA dikatakan murni bila memiliki indeks
kemurniaan 1.8-2.0 (Muladno 2010):
Keterangan :
A260 = absorbans pada 260 nm
A280 = absorbans pada 280 nm
Verifikasi Metode Ekstraksi dan Analisis Data
Uji Presisi
DNA diekstrak dari masing-masing sampel yang berupa daging sapi, daging
babi, kornet, sosis sapi, nugget, daging sapi giling dan bakso sapi. Hali ini mengacu
pada Harmita (2004) yang menyatakan bahwa uji presisi dilakukan terhadap paling
sedikit enam replika sampel. Setiap ekstraksi yang dilakukan diulang sebanyak 7
kali. Data yang diambil untuk uji presisi yaitu kemurnian DNA masing-masing
sampel.
Perhitungan presisi, baik ripitabilitas dan reprodusibilitas dapat dihitung dengan
cara sebagai berikut:
1. Hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,.........xn maka simpangan bakunya adalah
√
2.
∑
̅
Simpangan baku relatif (SBR) adalah
̅
4
Jika hasil simpangan baku relatif (SBR) kemurnian DNA kurang dari 5%,
maka dapat dinyatakan bahwa metode tersebut memiliki presisi yang tinggi dan valid
untuk digunakan (Ermer 2005).
Uji Ketangguhan (Ruggedness)
Rancangan yang digunakan untuk uji ketangguhan ini adalah rancangan acak
lengkap (RAL) dan dihitung menggunakan ANOVA (Harmita 2004). Jika hasil yang
diperoleh berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan.
Uji
ketangguhan ini dilakukan untuk menguji seberapa tangguh jumlah volume fenol,
jumlah kloroform isoamil alkohol (CIAA), dan bobot sampel yang digunakan pada
metode ekstraksi fenol kloroform. Sampel yang digunakan dalam uji ini yaitu daging
sapi dan sosis sapi.
Uji terhadap pemberian fenol diteliti dengan 3 perlakuan, yakni 200 µL, 400
µL dan 600 µL dengan kondisi tidak ada perubahan volume pada bahan-bahan lain.
Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Berikut adalah model
rancangan percobaan yang digunakan:
Yij = μ + Pi + εij
Keterangan
Yi : Kemurnian DNA dengan volume fenol (200 µL, 400 µL dan 600 µL) dan ulangan ke-j (1, 2
dan 3)
µ
: Nilai tengah kemurnian DNA
Pi : Pengaruh pemberian volume fenol ke-i (200 µL, 400 µL dan 600 µL) terhadap kemurnian DNA
εij : Pengaruh galat percobaan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j pada tingkat kemurnian DNA.
Uji terhadap pemberian kadar CIAA pada proses ekstraksi dilakukan dengan 3
perlakuan, yakni 200 µL, 400 µL dan 600 µL dengan kondisi tidak ada perubahan
volume pada bahan-bahan lain. Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali
ulangan. Berikut adalah model rancangan percobaan yang digunakan:
Yij = μ + Pi + εij
Keterangan
Yij : Kemurnian DNA dengan volume CIAA taraf ke-i (200 µL, 400 µL dan 600 µL) dan ulangan
ke-j (1, 2 dan 3)
μ
: Nilai tengah kemurnian DNA
Pi : Pengaruh pemberian CIAA taraf ke-i (200 µL, 400 µL dan 600 µL) terhadap kemurnian DNA
εij : Pengaruh galat percobaan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j pada tingkatat kemurnian DNA.
Uji terhadap pemberian bobot sampel pada proses ekstraksi dilakukan dengan 3
perlakuan, yakni 0.025 g, 0.075 g dan 0.125 g dengan kondisi tidak ada perubahan
volume pada bahan-bahan lain. Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali
ulangan. Berikut adalah model rancangan percobaan yang digunakan:
Yij = μ + Pi + εij
Keterangan
Yij : Kemurnian DNA dengan perbedaan bobot sampel taraf ke-i (0.025 g, 0.075 g dan 0.125 g) dan
ulangan ke-j (1,2 dan 3)
μ
: Nilai tengah kemurnian DNA
Pi : Pengaruh perbedaan bobot sampel ke-i (0.025 g, 0.075g dan 0.125 g) terhadap kemurnian DNA
εij : Pengaruh galat percobaan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j pada tingkat kemurnian DNA.
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Presisi
Presisi yang dilakukan dalam penelitian ini yakni presisi keterulangan
(repeatibility) dan presisi ketertiruan (reproducibility). Valcarcél (2000) menyatakan
bahwa uji presisi dilakukan untuk mengetahui nilai konsistensi antara hasil yang
diperoleh pada suatu sampel yang diuji.
Presisi keterulangan (repeatibility) dilakukan oleh satu orang analis dalam satu
periode tertentu, menggunakan pereaksi dan
peralatan yang sama dalam
laboratorium yang sama (Harvey 2000) serta dilakukan dalam interval yang pendek
(Chan 2004). Presisi keterulangan dilakukan untuk mengukur perbedaan internal
dalam sebuah metode (Valcarcél 2000). Hasil uji presisi keterulangan (repeatibility)
dapat dilihat pada Tabel 1
Ulangan
1
2
3
4
5
6
7
̅
SB
SBR
Db
2.205
2.010
2.135
2.010
2.105
2.095
1.995
2.079
0.078
3.752
Tabel 1 Uji presisi keterulangan (repeatibility)
Ds
Sos
Bs
Na
Sg
1.960
1.860
1.910
2.010
2.015
1.995
1.865
1.935
2.015
2.000
1.985
1.890
1.920
1.960
1.990
1.985
1.870
1.900
1.990
2.000
1.950
1.890
1.925
1.975
1.985
1.995
1.910
1.910
2.015
2.010
2.000
1.875
1.900
1.950
1.970
1.981
1.880
1.914
1.988
1.996
0.019
0.017
0.013
0.027
0.015
0.963
0.934
0.682
1.353
0.771
Ks
1.885
1.865
1.890
1.905
1.915
1.890
1.875
1.889
0.017
0.897
Keterangan : Db = Daging babi, Ds = Daging Sapi, Sos = Sosis sapi, Bs = Bakso sapi, Na = Nugget
ayam, Sg = Sapi giling, Ks = Kornet Sapi
Tabel 1 menunjukkan hampir semua sampel, yakni daging sapi, sosis sapi,
bakso sapi, nugget, daging sapi giling, dan kornet sapi memiliki rata-rata tingkat
kemurnian DNA tinggi yakni berada dalam rentang nilai 1.8-2.0 (Muladno 2010).
Akan tetapi rata-rata kermunian DNA yang diperoleh daging babi yaitu 2.079.
Kemurnian DNA yang bernilai lebih besar dari dua menunjukkan bahwa DNA
tersebut terkontaminasi oleh RNA (Khosravinia et al. 2007; Santella 2006).
Nilai presisi keterulangan (repeatibility) yang diperoleh semua sampel yakni
berada di bawah 5%. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan valid.
Menurut Ermer (2005), nilai presisi yang diterima untuk ketidakmurnian yaitu 0.05). Pemberian fenol sebanyak 200-600 µL
pada ekstraksi sampel daging sapi dan sosis sapi memberikan nilai kemurnian DNA
yang sama-sama tinggi. Akan tetapi tahapan ini akan lebih efisien jika fenol yang
diberikan sebanyak 400 µL. Hasilnya sama-sama memberikan kemurnian DNA
yang tinggi, namun pemberian fenol dengan jumlah sedikit akan mempersulit
pengambilan DNA pada fase air yang berada pada bagian atas setelah dilakukan
pemisahan dengan cara sentrifugasi. Pengambilan DNA pada fase cair harus
dilakukan dengan sangat hati-hati oleh analis terlatih agar kontaminan pengotor tidak
ikut terbawa. Sebaliknya pemberian fenol yang melebihi standar akan menghabiskan
biaya lebih besar.
Uji Ketangguhan Kloroform Isoamil Alkohol (CIAA)
Hasil rata-rata kemurnian DNA dengan volume CIAA berbeda pada sampel
daging sapi dan sosis sapi disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4 Kemurnian DNA dengan volume CIAA berbeda pada sampel daging sapi
dan sosis sapi
Sampel
Volume CIAA
200 µL
400 µL
600 µL
Daging sapi
1.973 ± 0.016
1.965 ± 0.000
1.963 ± 0.013
Sosis sapi
1.882 ± 0.016a
1.848 ± 0.008ab
1.862 ± 0.013b
Keterangan : angka-angka pada baris sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata
pada taraf uji 5%
8
Tabel 4 menunjukkan nilai rata-rata kemurnian DNA dengan volume CIAA
berbeda pada daging sapi menghasilkan nilai tidak nyata (P>0.05), sedangkan uji
ketanggguhan pada sampel sosis sapi memberikan hasil yang berbeda nyata (P0.05). Hal ini menunjukkan bobot sampel yang
digunakan dalam rentang 0.025 g hingga 0.125 g menghasilkan DNA dengan nilai
kemurnian yang sama-sama tinggi. Akan tetapi tahapan ini lebih efisien jika bobot
sampel yang digunakan sesuai standar, yakni 0.075 g. Bobot sampel yang terlalu
besar akan mempersulit proses penghancuran sampel di dalam tabung eppendorf,
sedangkan jika bobot sampel yang digunakan terlalu sedikit maka akan sedikit
konsentrasi DNA yang dihasilkan.
9
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Proses ekstraksi DNA menggunakan metode fenol kloroform di Laboratorium
Pemuliaan dan Genetika Ternak, Fakultas Peternakan IPB sudah memenuhi standar
verifikasi. Hal ini ditunjukkan dengan nilai presisi yang baik dengan nilai simpangan
baku relatif (SBR) di bawah 5% pada tiap sampel yang diuji. Volume fenol dan
Kloroform Isoamil Alkohol (CIAA) optimal yang digunakan sebagai campuran
larutan pengekstrak sebanyak 400 µL, sedangkan bobot sampel optimal yang
digunakan sebanyak 0.075 g.
Saran
Perlu diadakan verifikasi lanjutan dengan beberapa uji lainnya.
Uji
ketangguhan (ruggedness) dapat terus dilakukan terhadap berbagai faktor analisis
lainnya pada metode ekstraksi fenol kloroform ini, misalnya pada suhu dan waktu
inkubasi, kecepatan sentrifugasi, perbedaan volume bahan-bahan lain yang
digunakan.
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2006. Presidential Task Force
on Best Practices for Microbiological Methodology. Gaithersburg (US).
Andreas E, Sumantri C, Nurani H, Farajallah A, Anggraeni A. 2010. Identification
of GH|AluI genes polymorphisms in indonesian buffalo. Indonesian Trop
Anim Agric 35:25-221.
Ardi A. 2012. Validasi metode ekstraksi DNA pada analisis DNA babi dalam
produk bakso [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor
Chan CC, Herman L, Lee YC, Xue MZ. 2004. Analytical Method Validation and
Instrument Performan Verification. Canada (CA): John Wiley & Sons, Inc.
Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya.
Majalah Ilmu Kefarmasian. 1(3):117-135.
Ermer J, John HM. 2005. Method Validation in Pharmaceutical Analysis. A Guide
to Best Practice. Weinheim (DE): WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA
Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York (US): The Mc Graw Hill
Companies, Inc.
Khosravinia H, Murthy NN, Parasad DT, Pirany N. 2007. Optimazing factors
influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. African Journal of
Biotechnology. 6(4):481-486.
Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed ke-2. Bogor (ID): IPB Pr.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. New York (US): CSH Laboratory Press.
10
Santella RM. 2006. Approaches to DNA/RNA extraction and whole genome
amplification. Cancer Epidemiology Biomarkers. 15(9): 1585-1587.
Saputra YE. 2009. Verifikasi dan Validasi Metode di Laboratorium [Internet].
[diunduh 2013 Des 10]. Tersedia pada:http//www.chemistry.org/artikel_kimia/
kimia_analisis/verifikasi-dan validasi-metoda-di-laboratorium/.
Surzycki S. 2003. Laboratory Manual Human Molecular Biology. New York
(US): Blackwell Publishing
Valcarcél M. 2000. Principles of Analytical Chemistry. Berlin (DE): Springer
11
LAMPIRAN
Lampiran 1 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan
fenol pada ekstraksi DNAdaging sapi
Ulangan
1
2
3
Sumber Keragaman
Perlakuan
Galat
Total
Fa (200 µL)
1.980
1.985
1.945
DB
2
6
8
JK
0.0009556
0.0020667
0.0030222
Fb (400 µL)
1.970
1.950
1.930
KT
0.0004778
0.0003444
Fc (600 µL)
1.960
1.935
1.945
F
1.39
P
0.320
Keterangan : P > 0.05 = Tidak nyata
Lampiran 2 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan
CIAA pada ekstraksi DNA daging sapi
Ulangan
1
2
3
Sumber Keragaman
Perlakuan
Galat
Total
Keterangan : P > 0.05
Ca (200 µL)
1.985
1.980
1.955
DB
2
6
8
JK
0.0001722
0.0008333
0.0010056
Cb (400 µL)
1.965
1.965
1.965
KT
0.0000861
0.0001389
Cc (600 µL)
1.965
1.975
1.950
F
0.62
P
0.569
= tidak nyata
Lampiran 3 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan bobot sampel
pada ekstraksi DNA daging sapi
Ulangan
1
2
3
Sumber Keragaman
Perlakuan
Galat
Total
Na (0.025 g)
1.915
1.935
1.625
DB
2
6
8
Keterangan : P > 0.05 = tidak nyata
JK
0.02282
0.06148
0.08430
Nb (0.075 g)
1.925
1.950
1.965
KT
0.01141
0.01025
Nc (1.025 g)
1.920
1.900
1.890
F
1.11
P
0.388
12
Lampiran 4 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan fenol
pada ekstraksi DNA sosis sapi
Ulangan
1
2
3
sFa (200 µL)
1.905
1.905
1.865
sFb (400 µL)
1.845
1.875
1.845
Sumber Keragaman
DB
JK
Perlakuan
2
0.0023722
Galat
6
0.0022667
Total
8
0.0046389
Keterangan : P > 0.05 = tidak nyata
sFc (600 µL)
1.840
1.870
1.870
KT
0.0011861
0.0003778
F
3.14
P
0.117
Lampiran 5 Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan penambahan
CIAA pada ekstraksi DNA sosis sapi
Ulangan
1
2
3
Sumber Keragaman
Perlakuan
Galat
Total
sCa (200 µL)
1.900
1.875
1.870
DB
2
6
8
sCb (400 µL)
1.850
1.840
1.855
JK
0.0016889
0.0009500
0.0026389
sCc (600 µL)
1.860
1.850
1.875
KT
0.0008444
0.0001583
F
5.33
P
0.047
Keterangan : P< 0.05 = berbeda nyata
Hasil uji Duncan
Grup Duncan
B
B
B
A
A
A
Rata-rata
N
Perlakuan
1.88167
3
A
1.86167
3
C
1.84833
3
B
Lampiran 6. Hasil ANOVA menggunakan RAL pada uji ketangguhan bobot sampel
pada ekstraksi DNA sosis sapi
Ulangan
1
2
3
Sumber Keragaman
Perlakuan
Galat
Total
sNa (0.025 g)
1.895
1.845
1.940
DB
2
6
8
Keterangan : P > 0.05 = tidak nyata
JK
0.0022167
0.0051833
0.0074000
sNb (0.025 g)
1.900
1.900
1.905
KT
0.0011083
0.0008639
sNc (0.025 g)
1.870
1.845
1.880
F
1.28
P
0.344
13
RIWAYAT HIDUP
Penulis bernama Ishfi Aryahiyyah dilahirkan di Karawang pada tanggal 3
Oktober 1992 dari pasangan ayah Masruhan dan ibu Teti Sugiarti. Penulis
merupakan anak pertama dari 4 bersaudara dengan adik Shofia Andari, Kayla
Mazaya dan Muhammad Arkarozi. Penulis menyelesaikan pendidikan di TK
Kharisma tahun 1998, SDN Margajaya IV tahun 2004, MDA Annajahul Islami tahun
2005, SMPN 1 Bekasi tahun 2007, MAN 1 Bekasi tahun 2010. Penulis diterima di
Institut Pertanian Bogor melalui jalur SNMPTN tulis pada program studi Ilmu
Produksi dan Teknologi Peternakan (IPTP).
Selama menjadi mahasiswa penulis memperoleh beastudi Etos Dompet Dhuafa
selama 6 semester, beasiswa Program Prestasi Akademik (PPA) IPB, beasiswa
Yayasan Amanah IPB dan beasiswa Karya Salemba Empat. Kegiatan penulis di
luar akademik yaitu menjadi anggota aktif UKM Karate IPB tahun 2010/2013, divisi
sosial pada Sekolah Desa Produktif Bestudi Etos Bogor tahun 2010/2011, anggota
rohis kelas IPTP 47 tahun 2011/2014, divisi Islamic Student Center (ISC) Lembaga
Dakwah Fakultas FAMM Al-An’aam Fapet IPB 2011/2013 dan divisi Forum Rohis
Kelas IPB (FRKI) pada Forum Silaturahim Lembaga Dakwah Fakultas IPB
(FSLDKI) tahun 2012/2013 serta serangkaian kepanitiaan kegiatan di dalam dan luar
kampus. Penulis juga menjadi asisten praktikum Pendidikan Agama Islam (PAI)
pada tahun 2013/2014.
Prestasi yang pernah diraih oleh penulis selama kuliah yakni, juara favorit
senam aerobik kelas A04 pada tahun 2010, PKM kewirausahaan didanai DIKTI
tahun 2010 dan 2012, seminar dan publikasi karya tulis pada prosiding internasional
AISC Taiwan pada tahun 2013 serta PKM penelitian didanai DIKTI tahun 2014.
.