Validasi metode ekstraksi DNA pada analisis DNA babi dalam produk bakso

 
 

VALIDASI METODE EKSTRAKSI DNA
PADA ANALISIS DNA BABI DALAM PRODUK BAKSO

ANDIKA ARDI

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
 
 

 
 

ABSTRAK
ANDIKA ARDI. Validasi Metode Ekstraksi DNA pada Analisis DNA Babi dalam

Produk Bakso. Dibimbing oleh PURWANTININGSIH SUGITA dan HENNY
NURAINI.
Banyak kasus pemalsuan produk pangan berbahan dasar daging yang dijumpai
di masyarakat. Reaksi rantai polimerase (PCR) telah dikembangkan sebagai
metode yang tepat dan cepat untuk mengidentifikasi spesies daging baik dari
daging mentah maupun produk makanan olahan daging. Ekstraksi merupakan titik
kritis pada analisis PCR karena sangat berkaitan dengan mutu DNA yang diisolasi.
Oleh karena itu, validasi metode ekstraksi dilakukan dalam penelitian ini untuk
memastikan bahwa hasil ekstraksi memiliki mutu DNA yang baik. Metode
ekstraksi DNA yang telah divalidasi selanjutnya diuji sensitivitasnya untuk
mendeteksi kontaminasi daging babi dalam produk bakso yang diberi variasi
cemaran daging babi serta dalam produk bakso yang dijual di Kota Bogor. Hasil
validasi menunjukkan bahwa metode ekstraksi DNA memiliki limit deteksi
kemurnian DNA sebesar 0.117, limit kuantitasi kemurnian DNA sebesar 0.389,
persen simpangan baku relatif sebesar 2.31%, dan ketidakpastian kemurnian DNA
sebesar (1.93 ± 0.04). Cemaran babi masih dapat terdeteksi hingga tingkat
cemaran 0.5% (b/b), dan tidak ditemukan cemaran daging babi pada sampel bakso
dari 3 pasar di Kota Bogor (Pasar Anyar, Pasar Bogor, dan Pasar Warung Jambu)

ABSTRACT

ANDIKA ARDI. Validation of DNA Extraction Methods on DNA Analysis of
Pork in Meatball Products. Supervised by PURWANTININGSIH SUGITA and
HENNY NURAINI.
There are many cases of fraud meat-based food products found in our society.
Polymerase chain reaction (PCR) technique has been developed as a precise and
quick method to identify meat species both from raw meat and from meat
products. Extraction is the critical level on PCR analysis because it was very
related with the quality of the isolated DNA. Therefore, validation of extraction
method was carried out in this research to ensure that the extraction results had
good DNA qualities. The validated extraction method was then tested for its
sensitivity to detect the contamination of pork meat in meatball products made
with various pork contamination and also in meatball products sold in Bogor. The
validation results showed that the DNA extraction method had detection limit of
DNA purity of 0.117, quantitation limit of DNA purity of 0.389, relative standard
deviation of 2.31%, and uncertainty of DNA purity of (1.93 ± 0.04). The pork
contamination could still be detected up to 0.5% (w/w) contamination and no pork
contamination found in meatball samples from 3 market in Bogor (Pasar Anyar,
Pasar Bogor, and Pasar Warung Jambu)

 

 

 
 

VALIDASI METODE EKSTRAKSI DNA
PADA ANALISIS DNA BABI DALAM PRODUK BAKSO

ANDIKA ARDI

Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

 
 

 
 

Judul Skripsi
Nama
NIM

: Validasi Metode Ekstraksi DNA pada Analisis DNA Babi
dalam Produk Bakso
: Andika Ardi
: G44096021

Disetujui

Pembimbing I

Pembimbing II

Prof Dr Purwantiningsih Sugita, MS
NIP 19631217 198803 2 002

Dr Ir Henny Nuraini, MSi
NIP 19640202 198903 2 001

Diketahui
Ketua Departemen Kimia

Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
NIP 19501227 197603 2 002

Tanggal Lulus:

 
 

 
 

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas berkat limpahan
rahmat dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan judul
Validasi Metode Ekstraksi DNA pada Analisis DNA Babi dalam Produk Bakso.
Salawat serta salam semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW,
keluarganya, dan semoga kita semua menjadi pengikutnya hingga akhir zaman.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr Purwantiningsih Sugita,
MS dan Dr Ir Henny Nuraini, MSi selaku pembimbing yang senantiasa
memberikan arahan, dorongan semangat, dan doa kepada penulis selama
melaksanakan penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Kepala
Laboratorium Genetika Molekuler Prof Dr Ir Muladno, MSA, koordinator
laboratorium Eryk Andreas, SPt, MSi dan rekan-rekan di laboratorium atas
bantuan serta masukan selama penelitian berlangsung.
Terima kasih tak terhingga penulis ucapkan kepada Ayah, Ibu, serta seluruh
keluarga, atas doa dan kasih sayangnya. Kepada Eris, Mas Yana, Gina, Idis, Mbak
Ana, dan teman-teman Ekstensi Kimia angkatan 2009 yang telah banyak
membantu, memberikan saran, semangat, motivasi, dan dorongan selama
penelitian, penulis ucapkan terima kasih.
Penulis berharap karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu

pengetahuan.

Bogor, Februari 2012

Andika Ardi

 
 

 
 

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 22 Desember 1987 sebagai putra
pertama dari Bapak H Mawardi dan Ibu Hj Syamsidar. Penulis lulus dari SMA
Negeri 2 Bogor pada tahun 2006 dan pada tahun yang sama diterima di Akademi
Kimia Analisis (AKA) Bogor melalui jalur seleksi tes tulis. Penulis lulus dari
AKA Bogor dengan predikat sangat memuaskan pada tahun 2009 dan
melanjutkan pendidikan S1 melalui Program Penyelenggaraan Khusus
Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut

Pertanian Bogor (IPB) pada tahun yang sama.
Selama menjalani masa perkuliahan di AKA Bogor, Penulis pernah
mengikuti kegiatan Pelatihan Pengantar Sistem Manajemen Lingkungan (ISO
14001), Pelatihan Pengantar Sistem Manajemen Mutu (ISO 9001:2001), dan
Pelatihan Sistem Manajemen Keselamatan dan Kesehatan Kerja – OHSAS
18001:2007. Penulis melakukan praktik kerja lapangan di PT Indonesia Power
Suralaya pada tahun 2009 dengan judul laporan Pengujian Air pada
Pengoperasian Ketel Uap Tekanan Tinggi di Unit Bisnis Pembangkitan Suralaya
PT Indonesia Power. 

 
 

 
 

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ................................................................................................. vii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... vii
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
METODE
Bahan dan Alat .............................................................................................. 1
Lingkup Kerja ................................................................................................ 2
Proses Pembuatan Bakso ............................................................................... 2
Ekstraksi DNA ............................................................................................... 2
Pengujian DNA Total .................................................................................... 2
Penentuan Konsentrasi dan Indeks Kemurnian DNA .. ................................ 3
Pengujian DNA dengan PCR ........................................................................ 3
Validasi Metode Ekstraksi ............................................................................. 3
Identifikasi Sampel Pasaran........................................................................... 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Validasi Metode Ekstraksi DNA ................................................................... 4
Identifikasi Bakso .......................................................................................... 6
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ...................................................................................................... 10
Saran ............................................................................................................ 10
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 10
LAMPIRAN .......................................................................................................... 11

 

vi 

 

 
 

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Hasil uji limit deteksi dan limit kuantitasi metode ekstraksi DNA pada sampel
bakso dengan cemaran ...................................................................................... 5
2 Hasil uji presisi dan keterulangan metode ekstraksi DNA pada sampel bakso
dengan cemaran ................................................................................................. 5
3 Hasil uji ketidakpastian kemurnian metode ekstraksi DNA pada sampel bakso
dengan cemaran ................................................................................................. 6
4 Sekuens primer reverse spesifik fragmen DNA sapi dan babi ......................... 6
5 Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA bakso dengan 7 variasi cemaran ........ 8
6 Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA bakso dari pasar ................................. 9 

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Fase yang terbentuk sesudah proses ekstraksi fenol-kloroform ........................ 5
2 Visualisasi DNA hasil ekstraksi pada gel agarosa 1%: sampel bakso dengan
berbagai macam variasi cemaran (1–7) (a); sampel bakso pasar (1–10) (b)..... 6
3 Interaksi antara etidium bromida (EtBr) dan DNA .......................................... 6
4 Proses reaksi PCR ............................................................................................. 8
5 Visualisasi hasil amplifikasi DNA sampel bakso dengan berbagai macam
variasi cemaran pada gel agarosa 2%................................................................ 8
6 Visualisasi hasil amplifikasi DNA sampel bakso dari pasar pada gel agarosa
2% ..................................................................................................................... 9 

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Bagan tahapan penelitian ................................................................................ 12
2 Pengolahan data uji limit deteksi, limit kuantitasi, dan presisi ....................... 13
3 Pengolahan data ketidakpastian kemurnian DNA........................................... 14
4 Data pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel bakso dengan
variasi cemaran dan bakso pasar ..................................................................... 15 

vii 

 

 
 

PENDAHULUAN
Produk makanan olahan pada saat ini
sedang berkembang di Indonesia. Banyaknya
variasi bentuk produk makanan olahan,
terutama berbahan dasar daging, yang beredar
di masyarakat harus diperhatikan. Pemalsuan
produk makanan olahan berbahan dasar
daging sering ditemui di lingkungan
masyarakat secara luas dan semakin
mengkhawatirkan. Akhir-akhir ini sering
diberitakan di media massa, adanya campuran
lain pada bahan baku produk tersebut, seperti
daging dari jenis (spesies) yang menjadi
bahan utamanya, yaitu daging sapi
(Margawati & Ridwan 2010).
Beberapa produk makanan olahan daging
seperti abon, sosis, dan bakso diduga telah
tercemar oleh kontaminan daging babi. Bakso
merupakan salah satu produk makanan olahan
daging yang sangat populer dan disukai
masyarakat Indonesia. Hal ini tentu saja
merugikan konsumen produk makanan olahan
tersebut karena menyangkut kehalalan dari
suatu produk. Kehalalan produk merupakan
hal yang penting dari suatu produk yang
dijual kepada masyarakat. Lebih dari 70%
masyarakat muslim seluruh dunia mengacu
pada produk makanan berstandar halal
(Hayyan et al. 2009). Di Indonesia pada tahun
1989, Majelis Ulama Indonesia (MUI)
membentuk suatu departemen, yaitu Lembaga
Pengkajian Pangan, Obat-obatan, dan
Kosmetika Majelis Ulama Indonesia (LP
POM MUI) untuk membuat regulasi atas
kehalalan produk yang ada di masyarakat.
Masalah cemaran daging babi dalam suatu
produk makanan halal sedang menjadi
perhatian khusus LP POM MUI saat ini. Oleh
sebab itu, diperlukan penelitian-penelitian
tentang validasi ataupun verifikasi mengenai
metode-metode analisis yang dapat diterapkan
pada permasalahan ini.
Identifikasi DNA suatu spesies dapat
membantu untuk mengetahui apakah suatu
produk telah tercemar oleh bahan yang bukan
seharusnya. Telah banyak pengembangan
metode analisis DNA untuk menemukan
adanya indikasi cemaran babi dalam suatu
produk makanan olahan. Salah satunya adalah
dengan metode reaksi rantai polimerase
(PCR) (Matsunaga et al. 1999) yang
berdasarkan identifikasi sidik jari (Saez et al.
2004). Salah satu faktor penting dalam
analisis DNA dengan metode PCR adalah
isolasi DNA yang antara lain meliputi proses
ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA merupakan
prosedur rutin dalam analisis molekular dan

menjadi titik kritis yang sangat memengaruhi
hasil analisis. Jumlah dan mutu DNA hasil
ekstraksi akan memengaruhi analisis lebih
lanjut dengan PCR.
Validasi adalah suatu tindakan penilaian
terhadap parameter tertentu, berdasarkan
percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut telah memenuhi
persyaratan untuk digunakan. Validasi metode
dilakukan untuk menentukan apakah hasil
analisis suatu metode telah sahih dan dapat
dipertanggungjawabkan. Validasi metode
ekstraksi DNA berguna untuk memastikan
bahwa hasil ekstraksi yang dihasilkan sahih
terhadap parameter-parameter uji validasi
yang dilakukan, sehingga didapatkan mutu
DNA yang baik serta hasil analisis DNA yang
baik dan sahih.
Penelitian ini bertujuan memvalidasi
metode ekstraksi DNA dalam produk bakso
sehingga setiap parameter yang diujikan akan
memberikan hasil yang sahih. Selain itu,
dapat diketahui jumlah cemaran terkecil yang
masih dapat diidentifikasi secara PCR.
Metode yang telah divalidasi selanjutnya
digunakan untuk mengidentifikasi sampel di
pasaran.

METODE
Bahan dan Alat
Alat-alat yang digunakan antara lain alatalat kaca, tabung eppendorf, mikropipet,
vorteks,
inkubator,
spektrofotometer
GeneQuant 1300, mesin PCR GeneAmp®
PCR system 9700 (Applied BiosystemsTM),
satu set alat elektroforesis gel agarosa
(MUPID), dan kamera Polaroid (MP 4
Polaroid camera + UV transluminator).
Bahan uji yang digunakan adalah sampel
produk makanan olahan bakso dengan
berbagai tingkat cemaran yang telah
ditentukan serta sampel bakso yang diambil
dari 3 pasar di Kota Bogor, yaitu Pasar Anyar
(A), Pasar Bogor (B), dan Pasar Warung
Jambu (J). Bahan kimia yang digunakan
antara lain bufer 1× natrium tris EDTA (STE),
natrium dodesil sulfat (SDS), CIAA
(klorofom-isoamil alkohol 24:1), fenol, etanol
70%, etanol absolut (EtOH), NaCl 5 M, bufer
tris EDTA (TE), akuades, 10× Dream Tag
Buffer (Fermetas), primer forward 5’-GAC
CTC CCA GCT CCA TCA AAC ATC TCA
TCT TGA TGA AA-3’, primer reverse 5’CTA GAA AAG TGT AAG ACC CGT AAT
ATA AG-3’ (spesifik sapi) dan 5’-GTC GAT
AGT AGA TTT GTG ATG ACC GTA-3’

 
 

2 

 
(spesifik babi), dNTP, agarosa, etidium
bromida (EtBr), bufer 0.5× tris borat EDTA
(TBE), loading dye (biru bromtimol), DNA
marker (100 bp). Enzim yang digunakan ialah
proteinase-K 5 mg/mL dan Tag DNA
polymerase (Fermetas).
Lingkup Kerja
Lingkup kerja penelitian ini diringkaskan
dalam bagan tahapan penelitian di Lampiran 1.
Tahapan yang dilakukan meliputi validasi
metode ekstraksi berdasarkan parameter
validasi yang diuji, penentuan tingkat cemaran
terkecil, dan pengujian sampel dari pasar.
Proses Pembuatan Bakso
Daging sapi segar yang sudah dibersihkan
lemaknya dipotong kecil-kecil, kemudian
ditambahkan daging babi (0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15,
dan 20% b/b) dan dimasukkan ke dalam food
processor. Setelah itu, dimasukkan bahan
tambahan seperti es batu, tepung tapioka,
garam, bawang putih, natrium tripolifosfat
(STPP), dan merica dengan komposisi
masing-masing 40, 20, 15, 10, 5, dan 0.5%
dari total bobot daging. Adonan selanjutnya
dicetak berbentuk bulatan-bulatan bakso dan
dimasukkan ke dalam panci yang berisi air
mendidih (80 oC) selama 15 menit. Bulatanbulatan bakso dimasak kembali pada air
mendidih (100 oC), lalu diangkat dan
ditiriskan selama 15 menit. Bakso dikemas
dalam plastik untuk selanjutnya diekstraksi.
Ekstraksi DNA
Sampel yang digunakan merupakan
produk olahan daging yang tercemar daging
babi. Ekstraksi DNA pada sampel dilakukan
dengan menggunakan metode standar fenolkloroform (Sambrook et al. 1989) yang telah
dimodifikasi untuk produk tercemar daging
babi.
Preparasi Sampel
Sebanyak 75 mg sampel bakso diambil
dari 5 titik yang tersebar pada sampel.
Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam
tabung eppendorf 1.5 mL.
Degradasi Protein
Sampel dalam tabung ditambahkan 1×
STE sampai volume 340 µL, 40 µL SDS 10%,
dan 20 µL protein kinase K 5 mg/mL.
Campuran diinkubasi pada suhu 55 oC selama
2 jam sambil digoyang perlahan.

 

Degradasi Bahan Organik
Sampel
yang
telah
diinkubasi
ditambahkan 400 µL larutan fenol, 400 µL
kloroform-isoamil alkohol (24:1), dan 40 µL
NaCl 5 M. Campuran digoyang dalam suhu
kamar selama 1 jam.
Presipitasi DNA
Sampel hasil ekstraksi selanjutnya
disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm
selama 5 menit hingga fase air terpisah
dengan fase fenol. Fase air dipindahkan ke
dalam tabung baru dengan volume terukur
(± 400 µL). Molekul DNA diendapkan
dengan cara menambahkan 800 µL alkohol
absolut dan 40 µL NaCl 5 M. Campuran
kemudian diinkubasi pada suhu -20 oC selama
semalam, dan selanjutnya disentrifugasi pada
kecepatan 12 000 rpm selama 1 menit.
Endapan DNA yang diperoleh dicuci dengan
alkohol 70% kemudian diendapkan lagi.
Endapan DNA yang telah bersih dari alkohol
dipulihkan dengan menambahkan 100 µL TE.
Sampel DNA disimpan pada suhu -20 oC dan
siap digunakan.
Pengujian DNA Total
Pengujian DNA hasil ekstraksi secara
kualitatif dilakukan dengan elektroforesis
pada gel agarosa 1%. Gel dibuat dari 0.3 g
agarosa dan 30 mL larutan bufer (0.5 × TBE)
yang dipanaskan. Larutan agarosa dibiarkan
agak dingin sambil diaduk dengan pengaduk
magnet, lalu ditambahkan 1.25 μL pewarna
etidium bromida. Sebanyak 5 μL sampel DNA
dilarutkan dalam 1 μL loading dye, lalu
elektroforesis dilakukan selama 40 menit pada
tegangan konstan 100 volt sampai pewarna
mencapai bagian bawah gel.
Pengujian DNA hasil ekstraksi secara
kuantitatif dilakukan dengan spektrofotometer
GeneQuant 1300. Sampel DNA 3 μL
dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5
mL dan ditambahkan akuades 597 μL.
Larutan TE digunakan sebagai blangko,
dibuat dengan cara yang sama, yaitu sebanyak
3 μL larutan TE ditambah 597 µL akuades,
lalu dimasukkan ke dalam tabung eppendorf
1.5 mL. Sampel dan blangko di-spin down
selama 0.5 menit, kemudian dilakukan
pengujian dengan spektrofotometer.

3 

 
Penentuan Konsentrasi dan Indeks
Kemurnian DNA (Muladno 2010)
Konsentrasi DNA sampel yang didapat
dari isolasi diukur dengan menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 260 dan 280 nm. Apabila
kerapatan optis (optical density) pada 260 nm
atau OD260 sama dengan satu, maka
konsentrasi DNA setara 50 µg/mL.
Kemurnian DNA ditentukan dengan indeks
kemurnian (nisbah A260/A280). DNA dikatakan
murni bila memiliki indeks kemurnian 1.8_2.0.
× fp × 50 μg/mL
[DNA] (µg/mL) = A
260
A
Indeks Kemurnian DNA = 260
A
260
Keterangan:
[DNA] = konsentrasi DNA
fp
= faktor pengenceran
= absorbans pada 260 nm
A260
= absorbans pada 280 nm
A280

biru bromtimol mencapai bagian bawah gel.
Setelah elektroforesis selesai, gel diambil
untuk dilakukan pemotretan menggunakan
UV.
Validasi Metode Ekstraksi
Limit Deteksi (LD) dan Limit Kuantitasi
(LK)
Penentuan limit deteksi dan limit
kuantitasi dilakukan dengan mengukur
kemurnian DNA hasil ekstraksi sebanyak 7
kali ulangan dengan spektrofotometer. Nilai
limit deteksi dan limit kuantitasi diperoleh
dari persamaan berikut:
LD = 3 × SB
LK = K × SB
Keterangan :
LD
= limit deteksi
LK
= limit kuantitasi
SB
= Simpangan baku kemurnian
DNA
K
= koefisien
limit
kuantitasi
(K=10)
Presisi

Pengujian DNA dengan PCR
Amplifikasi Fragmen DNA Spesifik Sapi
dan Babi
Amplifikasi fragmen DNA spesifik
dilakukan dengan metode PCR. Komponen
reaksi yang digunakan sebanyak 25 µL, terdiri
atas 50 µg sampel DNA, primer forward 15
pmol, primer reverse 5 pmol, campuran dNTP
200 µM, MgCl2 1 mM, dan Taq polymerase
0.5 unit beserta bufernya. Proses amplifikasi
dijalankan dengan kondisi denaturasi awal
pada suhu 95 oC selama 5 menit, kemudian
dilakukan 35 siklus yang terdiri atas
denaturasi pada suhu 95 oC selama 45 detik,
penempelan primer pada suhu 60 oC selama
45 detik, dan pemanjangan DNA baru pada
suhu 72 oC selama 1 menit. Setelah itu,
pemanjangan akhir dilakukan pada suhu 72 oC
selama 5 menit.
Elektroforesis dan Visualisasi Produk PCR
Produk PCR divisualisasikan dengan
teknik elektroforesis gel agarosa 2%. Gel
dibuat dari 0.6 g agarosa dan 30 mL larutan
bufer (0.5 × TBE) yang dipanaskan. Larutan
agarosa dibiarkan agak dingin sambil diaduk
dengan pengaduk magnet, lalu ditambahkan
2.5 μL pewarna etidium. Sebanyak 5 μL
produk PCR dilarutkan dalam 1 μL loading
dye. Elektroforesis dilakukan selama 40 menit
pada tegangan 100 volt atau sampai pewarna

 

Uji presisi dilakukan dengan mengukur
kemurnian DNA hasil ekstraksi sebanyak 7
kali ulangan dengan spektrofotometer. Nilai
persen simpangan baku relatif (SBR) dari 7
ulangan tersebut berdasarkan rekomendasi
IUPAC dengan persamaan
n
2
∑ ( x - x)
i
i =1
SB =
n −1

SBR (%) =
Keterangan:
SB
=

SB

x

× 100%

xi

=

x

=

simpangan baku kemurnian
DNA
konsentrasi DNA pada setiap
ulangan
konsentrasi DNA rata-rata

n
SBR

=
=

jumlah pengulangan
simpangan baku relatif

Ketidakpastian
Kemurnian
(Uncertainty for Purity)

DNA

Ketidakpastian kemurnian DNA juga
ditentukan dari hasil pengukuran kemurnian
dengan spektrofotometer terhadap 7 ulangan
hasil ekstraksi DNA. Nilai ketidakpastian
ditentukan mengikuti persamaan-persamaan
sebagai berikut:

 
 
Ketidakpastian presisi:

u ( p) =

n
2
∑ (x - x )
m
i =1 i
n -1

Ketidakpastian baku rata-rata:

um =

u (x )
m
n

Ketidakpastian gabungan:

⎛u
⎜ m
⎜x
⎝ m

uc =

⎞
⎟
⎟
⎠

2

Ketidakpastian diperluas:
ue = k × uc

Pelaporan ketidakpastian kemurnian DNA:

[

]

Kemurnian DNA = Kemurnian DNA ± u e

Keterangan:
rerata kemurnian DNA
xm =
n
=
banyaknya sampel
k
=
faktor ketidakpastian dimana k
adalah 2 untuk n-1 > 6 untuk
selang
kepercayaan
95%
(IUPAC 2002)
Identifikasi Sampel Pasaran

Sampel diambil dari 3 pasar di Kota Bogor,
yaitu Pasar Anyar, Pasar Bogor, dan Pasar
Jambu Dua. Pengambilan sampel ditujukan
pada pedagang-pedagang bakso
yang
membuat sendiri bakso yang dijualnya. Total
sampel yang diambil sebanyak 2 butir per
pedagang dengan rincian jumlah pedagang per
pasar sebagai berikut: 3 pedagang dari Pasar
Anyar (A1, A2, dan A3), 1 pedagang dari
Pasar Bogor (B1), dan 1 pedagang dari Pasar
Warung Jambu (J1). Tahapan pengujian sama
seperti pada bakso yang dibuat dengan
campuran daging babi.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Teknik analisis berdasarkan DNA telah
banyak digunakan dalam berbagai bidang.
Sektor pangan merupakan salah satunya, yang
memfokuskan pada pengujian keamanan
bahan
pangan
untuk
dikonsumsi.

Berkembangnya industri pangan menuntut
masyarakat untuk lebih waspada terhadap
keamanan bahan pangan yang dikonsumsi.
Keamanan pangan didefinisikan sebagai
kondisi dan upaya yang diperlukan untuk
mencegah bahan pangan dari kemungkinan
tercemari bahan biologis, kimia, dan bahan
lain yang dapat mengganggu, merugikan, dan
membahayakan kesehatan manusia (Peraturan
Pemerintah Nomor 28 Tahun 2004).
Maraknya pemalsuan produk makanan olahan
saat ini membuat konsumen sangat dirugikan.
Masalah kehalalan produk pangan sering
ditemui, seperti adanya cemaran selain daging
sapi, khususnya cemaran daging babi, pada
produk makanan olahan bakso.
Identifikasi DNA secara PCR merupakan
salah satu solusi untuk menyelesaikan
masalah pemalsuan produk pangan. Teknik
analisis PCR merupakan salah satu teknik
deteksi dan identifikasi jenis hewan yang
terkandung dalam suatu produk pangan yang
sangat praktis diaplikasikan, akurat, dan
mempunyai kelebihan dapat mendeteksi
protein yang sudah terdegradasi (matang atau
produk olahan) dalam kandungan yang sangat
sedikit (μg) (Nuraini 2004). Ada beberapa
tahapan pada analisis DNA dengan teknik
PCR, salah satunya ialah isolasi DNA, yaitu
proses ekstraksi dan amplifikasi DNA.
Validasi Metode Ekstraksi DNA

Isolasi
DNA
merupakan
tahapan
terpenting dalam analisis DNA. Ekstraksi
merupakan proses yang sangat kritis dalam
isolasi DNA dan memengaruhi mutu DNA
yang diisolasi. Mutu DNA lebih lanjut akan
mempengaruhi hasil amplifikasi DNA yang
dilakukan.
Proses ekstraksi DNA dilakukan dalam
beberapa tahap, yaitu preparasi sampel, lisis,
degradasi protein, degradasi bahan organik,
dan presipitasi DNA. Preparasi sampel
merupakan tahapan penimbangan sejumlah
sampel yang akan diekstraksi. Proses lisis
dilakukan dengan penambahan detergen SDS
yang digunakan untuk merusak membran.
Penambahan protein kinase K dimaksudkan
untuk mendegradasi protein dalam sampel.
Selanjutnya penambahan fenol, klorofom, dan
isoamil
alkohol
dilakukan
untuk
mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol
merupakan pelarut organik yang dapat
melarutkan protein sisa atau hasil degradasi
dan sebagian kecil RNA. Kloroform berfungsi
membersihkan protein dan molekul lain
seperti polisakarida, hingga didapatkan
supernatan yang berisi DNA bebas

 
 

5 

 
kontaminan. Isoamil alkohol meencegah
terjadinya fooaming.
Ekstrakssi dengan feenol dan klooroform
akan menghhasilkan 3 fasee larutan (Gam
mbar 1).
Lapisan takbberwarna yanng mengandunng DNA
(fase air) terbentuk
t
di atas lapisann fenol.
Presipitasi DNA dalam fase air diilakukan
a
dan NaCl.
dengan peenambahan alkohol
Setelah didiiamkan 1 malam, DNA dippulihkan
dengan TE.

Gambar 1

Fase yangg terbentuk sesudah
proses
fenolekstraksi
kloroform

Validasii metode ekstrraksi DNA diilakukan
untuk mem
mastikan hasil ekstraksi bermutu
b
baik sehinggga didapatkaan hasil PCR
R yang
akurat. Valiidasi dilakukaan mengikuti metode
Sambrook et
e al (1989). Parameter-paarameter
yang diuji meliputi limit
l
deteksii, limit
d
ketidakkpastian
kuantitasi, presisi, dan
kemurnian DNA. Penillaian parameeter uji
d
melihat indeks kem
murnian
dilakukan dengan
DNA yang diperoleh
d
(Anntonia et al. 20008)
Kemurnian DNA diperoleh dengan
k
h
hasil
ekstrakssi DNA
mengukur konsentrasi
dengan speektofotometer. Indeks kem
murnian
DNA berkkorelasi denngan mutu DNA.
Kemurnian diperoleh deengan melihatt nisbah
serapan padda panjang gellombang 260 nm dan
280 nm (A2660/A280).
Limit Deteeksi (LD) daan Limit Ku
uantitasi
(LK)
Limit deeteksi merupaakan jumlah terkecil
analit yangg dapat diddeteksi dan masih
memberikann respons signnifikan dibandingkan
dengan blanngko, sedanggkan limit kuuantitasi
diartikan sebbagai jumlah terkecil analiit dalam
sampel yangg masih mem
menuhi kriteriaa cermat
dan saksam
ma (Harmita 2004).
2
Limit deteksi
dan limit kuantitasi
k
diujji dengan meengukur
kemurnian DNA hasil ekstraksi
e
sebaanyak 7
d
pada Taabel 1.
ulangan. Haasilnya dapat dilihat

 

 

Hasil uji limitt deteksi dan
n limit
kuuantitasi metoode ekstraksi DNA
paada sampel bakso dengan
d
ceemaran
Ulangann
Indeks
sampell
kem
murnian DNA
1
1.903
2
1.842
3
1.857
4
1.938
5
1.923
6
1.850
7
1.913
Rerataa
1.889
SB
0.039
LD
0.117
LK
0.389

Tabel 1

Tabel 1 memperlihatkkan bahwa metode
m
D
memiliiki limit deteksi
d
ekstraksi DNA
kemurnian DNA
D
sebesarr 0.117 dan
n limit
kuantitasi seebesar 0.389. Perhitungan
n limit
deteksi dan liimit kuantitassi dapat dilihaat pada
Lampiran 2.
Presisi
Presisi menunjukkan
m
kesesuaian antara
beberapa haasil pengukuuran yang diukur
dengan caraa yang samaa (Sumardi 2002).
Presisi mennggambarkan galat acak
k dan
variabilitas
analisis
hasil-hasil
yang
bersangkutann. Presisi metoode ekstraksii DNA
ditentukan deengan mengukkur simpangan
n baku
relatif kem
murnian DNA
A dari 7 kali
pengulangan sampel. Hasiil uji presisi metode
m
A dapat dilihaat pada Tabel 2.
ekstraksi DNA
Haasil uji presissi dan keterulangan
meetode ekstrakssi DNA pada sampel
s
bakkso dengan ceemaran
Ulangann
Indeks
sampell
kem
murnian DNA
1
1.938
2
1.875
3
1.857
4
1.950
5
1.938
6
1.923
7
2.000
Rerataa
1.925
SB
0.044
%)
SBR(%
2.31

Tabel 2

6 

 
Hasil pengukuran menunjukkan bahwa
metode ekstraksi DNA yang dilakukan
mempunyai persen SBR sebesar 2.31%. Nilai
tersebut menunjukkan bahwa metode
ekstraksi yang digunakan memiliki ketelitian
sedang (2% < %SBR < 5%) dan metode ini
sesuai digunakan dengan kondisi laboratorium.
Perhitungan uji presisi dapat dilihat pada
Lampiran 2.
Ketidakpastian Kemurnian DNA

Ketidakpastian merupakan gambaran
rentang hasil pengukuran yang akan
didapatkan (Harvey 2000). Ketidakpastian
kemurnian DNA ditentukan untuk melihat
kisaran galat yang masih dapat diterima dalam
ekstraksi DNA serta melihat mutu DNA yang
didapat. Ketidakpastian kemurnian DNA
ditentukan dari hasil pengukuran indeks
kemurnian DNA dengan spektrofotometer
terhadap hasil 7 kali ulangan ekstraksi. Hasil
uji ketidakpastian kemurnian DNA dapat
dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Hasil uji ketidakpastian kemurnian
metode ekstraksi DNA pada sampel
bakso dengan cemaran
Ulangan
Indeks
sampel
kemurnian DNA
1
1.812
2
1.842
3
2.067
4
1.847
5
2.071
6
2.020
7
1.857
Rerata
1.930
Perhitungan ketidakpastian kemurnian
DNA selengkapnya diberikan pada Lampiran
3. Didapat nilai ketidakpastian sebesar
(1.93±0.04). Nilai tersebut masih sesuai
dengan kemurnian DNA optimum yaitu
1.80_2.00 (Sambrook & Russel 2001).
Identifikasi Bakso

Analisis PCR dilakukan pada penelitian ini
untuk mengetahui adanya cemaran daging
babi pada produk pangan olahan bakso.
Sampel yang diuji terdiri atas 2 jenis, yaitu
sampel bakso dengan variasi cemaran daging
babi dan sampel yang ada di pasaran.
Identifikasi terhadap sampel bakso dengan
variasi cemaran daging babi dimaksudkan
untuk mengetahui tingkat terendah cemaran

 

yang masih dapat dideteksi dengan analisis
PCR, sedangkan uji lapangan dilakukan untuk
mengetahui ada tidaknya cemaran daging babi
pada sampel bakso yang dijual di pasaran.
Sampel bakso dengan variasi tingkat
cemaran dibuat dengan cemaran sebanyak 0.1,
0.5, 1, 5, 10, 15, dan 20% (b/b). Bakso daging
sapi dengan cemaran daging babi 0.1% (b/b)
berarti dalam 99.9 g daging sapi ditambahkan
0.1 g daging babi. Bakso pasar yang diuji
diambil dari pedagang bakso kaki lima di 3
pasar, yaitu Pasar Anyar (A), Pasar Bogor (B),
dan dan Pasar Jambu Dua (J).
DNA Total

Isolasi DNA kedua jenis sampel dilakukan
dengan menggunakan metode ekstraksi DNA
Sambrook et al (1989). DNA hasil ekstraksi
kemudian diuji kualitatif maupun kuantitatif
untuk mengetahui mutunya. Pengujian
kuantitatif dengan spektrofotometer UV
dilakukan pada panjang gelombang 260 dan
280 nm untuk mengetahui kemurnian dan
konsentrasi DNA hasil isolasi (Muladno 2010).
Kemurnian DNA yang optimum ditunjukkan
oleh indeks kemurnian DNA antara 1.8 dan
2.0. Asam nukleat menyerap sinar UV 260 nm,
sedangkan protein kontaminan menyerap sinar
UV 280 nm. Oleh karena itu, nisbah
absorbans pada kedua panjang gelombang ini
akan
menunjukkan
kemurnian
DNA
(Sambrook & Russel 2001). Hasil pengukuran
kemurnian dan konsentrasi DNA sampel
bakso diberikan pada Lampiran 4.
Pengujian kualitatif dilakukan dengan
elektroforesis gel agarosa 1% yang diamati
pada UV transluminator. Hasil visualisasi
DNA bakso dengan variasi cemaran dan
bakso di pasaran dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2a menunjukkan bahwa DNA bakso
dengan variasi cemaran memiliki mutu yang
baik, terlihat dari pola fragmen yang jelas
terlihat. Sementara itu, hasil visualisasi DNA
bakso pasar pada Gambar 2b menunjukkan
pola pita yang memanjang (smear), hal ini
karena pemberian bahan tambahan pada
pembuatan bakso yang tidak diketahui
komposisinya. Menurut Nuraini (2004), bahan
lain dan bumbu-bumbu yang ditambahkan
menyebabkan DNA yang diekstraksi masih
tercampur dengan senyawa kontaminan
seperti oligopeptida, polisakarida, protein, dan
bahan-bahan organik lainya.

7

 

(a))

(b)

Gambar 2 V
Visualisasi DNA
D
hasil ekstraksi pada geel agarosa 1%
%: sampel bakkso dengan beerbagai
macam variassi cemaran (1––7) (a); sampeel bakso pasarr (1–10) (b).
Molekull DNA berssifat asam sehingga
akan bergerrak dari kutubb negatif (kattode) ke
kutub posittif (anode). Pergerakan
P
D
DNA
di
dalam gel bergantung pada bobott/ukuran
D
bentuk konformasi DNA,
molekul DNA,
konsentrasi agarosa, teggangan listrik yang
digunakan, dan kekuatann bufer elektrooforesis.
p
DNA dapaat divisualisaasi karena pewarna
etidium broomida (EtBr) dapat terperrangkap
(intercalatedd) di antaraa pasangan-pasangan
basa DNA (Gambar 3)), yang jika disinari
m
n cahaya
dengan radiasi UV akan memendarkan
sehingga daapat terdeteksi.

pada proses amplifikasi ddengan mesin
n PCR.
mpuran
Sampel dirreaksikan ddengan cam
komponen PCR
P
yang tterdiri atas primer
p
forward,
f
primer reverse,, campuran dNTP,
m tag polym
merase, dan bufer.
MgCl2, enzim
Amplikasi diijalankan pada suhu penem
mpelan
(annealing) 60
6 oC.
Primer yaang digunakann dalam ampllifikasi
fragmen DN
NA spesifikk sapi dan babi
mengikuti Matsunaga
M
et aal. (1999). Seekuens
primer forward keduanya ssama, yaitu 5’’-GAC
G
CCA TC
CA AAC ATC
C TCA
CTC CCA GCT
TCT TGA TGA AA-3’, sekuens primer
p
reverse ditunjjukan pada Taabel 4.
Tabel 4
Jenis
ternak
Sapi

Babi

Sekuens primeer reverse sp
pesifik
frragmen DNA sapi dan babi
R
Reverse
(5’-3’)
Targeet
hasil
amplifikasi
CTA GAA A
AAG
b
274 bp
TGT AAG ACC
(basee pair)
TA
CGT AAT AT
AG
GTC GAT AG
GT
AGA TTT GT
TG
ATG ACC GTA

b
398 bp

Sumber: Matsuunaga et al. (1999)

Gambar 3 Interaksi antaara etidium bromida
b
(
(EtBr)
dan DN
NA (Reha et al.
a 2003)
Amplifikasi DNA
DNA baakso hasil isoolasi yang telah diuji
kualitatif maupun kuantittatif selanjutnnya diuji
R. Identifikassi DNA dengaan PCR
dengan PCR
dilakukan dengan konssentrasi DNA
A hasil
L yang akan bereaksi
b
isolasi sebesar 50 μg/μL

Proses reeaksi PCR teerdiri atas 3 tahap
utama: denatturasi, penemppelan, dan ellongasi
(pemanjangann rantai DNA
A) (Gambar 4)). Tiga
tahapan terseebut akan terjaadi pada suhu
u yang
telah diatur. Pada
P
tahap peertama, akan terjadi
denaturasi potongan
p
DN
NA utama. Suhu
denaturasi yang digunakaan pada pen
nelitian
adalah 95 oC. Untai tuunggal DNA hasil
denaturasi sellanjutnya akann mengalami proses
penempelan oleh primerr forward maupun
m

 
 

8 

 
reverse padaa suhu 60 oC. Proses yang terakhir
adalah pemaanjangan rantaai DNA pada suhu 72
o
C sesuai dengan
d
panjanng basa target yang
telah ditentuukan. Produk DNA yang teerbentuk
pada ampllifikasi pertaama akan menjadi
m
cetakan padda siklus selanjjutnya.
Hasil amplifikasi
a
D
DNA
bakso dengan
variasi cemaran ditunjukkkan pada Gambar 5.
b
dengann variasi
Terlihat bahhwa sampel bakso
cemaran menghasilkan
m
fragmen DNA
A yang
beragam. Fragmen
F
DNA
A sapi akan muncul
pada 274 bpp dan babi padda 398 bp. Vissualisasi
DNA hasil reaksi PCR dilakukan pada
p
gel
agarosa 2%. Tingkat kebberhasilan ampplifikasi
p
olahann bakso
DNA yang berasal dari produk
dengan 7 tingkat cemaaran disajikaan pada
H
yang diiperoleh menuunjukan
Tabel 5. Hasil
bahwa fraggmen DNA teramplifikassi pada
setiap tingkat cemarann walaupun dengan
persentase keberhasilan
k
y
yang
beragam..

Gambar 4 Proses reakssi PCR (Barttlett &
Stirling 20033).

Gambar 5 Visualisasi hasil
h
amplifikkasi DNA saampel bakso dengan berbaagai macam variasi
v
cemaran padda gel agarosaa 2%. Keterang
gan Gambar 5 pada Tabel 55.

No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Taabel 5 Tingkaat keberhasilann amplifikasi DNA
D
bakso deengan 7 variasi cemaran
Keberhaasilan
PCR ke-3
PCR kee-1
PC
CR ke-2
amplifikasi//sampel
Sampel
(%)
Sapi
Babi
Sapi
Babi Sapi
S
Babi
Sapi
Babi
Sapi
+
+
+
100
0
Babi
+
+
+
0
100
S
Sapi+Babi
+
+
+
+
+
+
100
100
Baakso 0.1%
+
+
+
100
0
Baakso 0.5%
+
+
+
+
+
+
100
100
B
Bakso
1%
+
+
+
+
+
+
100
100
B
Bakso
5%
+
+
+
+
+
+
100
100
B
Bakso
10%
+
+
+
+
+
+
100
100
B
Bakso
15%
+
+
+
+
+
+
100
100
B
Bakso
20%
+
+
+
+
+
+
100
100
Kontrool negatif (Airr)
0
0

Keterangan: + DNA terampllifikasi; - DNA tidak terampliffikasi

 

9 

 

Persentase keberhasilan amplifikasi pada
Tabel 5 menunjukkan bahwa semua tingkat
cemaran teramplifikasi dengan baik, namun
pada cemaran 0.1% (b/b) hanya terdeteksi
fragmen DNA sapi pada 274 bp, sedangkan
fragmen DNA babi sudah tidak dapat
terdeteksi pada 398 bp. Hasil ini
mengindikasikan, tingkat cemaran terkecil
yang masih dapat terdeteksi pada sampel
bakso adalah 0.5% (b/b). Meskipun tipis,
fragmen yang terbentuk masih dapat
terdeteksi. Kontrol positif yang digunakan
pada pengujian ialah DNA sapi, babi, dan
campuran sapi dan babi yang diambil dari

DNA darah, sedangkan air digunakan sebagai
kontrol negatif.
Pengujian sampel dari pasar dilakukan 2
kali ulangan (duplo). Sampel Pasar Anyar
diambil ada 3 (A1, A2, dan A3), Pasar Bogor
1 sampel (B1), dan Pasar Warung Jambu 1
sampel (J1). Gambar 6 menunjukkan bahwa
seluruh sampel teramplifikasi dengan baik,
ditunjukkan dengan munculnya fragmen DNA
sapi pada 274 bp. Fragmen DNA babi tidak
muncul untuk semua sampel dan hanya
muncul pada kontrol positif. Persentase
keberhasilan amplifikasi sampel bakso di
pasaran dapat dilihat pada Tabel 6.

Gambar 6 Visualisasi hasil amplifikasi DNA sampel bakso dari pasar pada gel agarosa 2%.
Keterangan Gambar 6 pada Tabel 6.
Tabel 6 Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA bakso dari pasar
Sampel
PCR ke-1
PCR ke-2
PCR ke-3
Keberhasilan
amplifikasi/sampel
(%)
Sapi
Babi
Sapi
Babi Sapi Babi
Sapi
Babi
1
Sapi
+
+
+
100
0
2
Babi
+
+
+
0
100
3
Sapi+Babi
+
+
+
+
+
+
100
100
4
A11
+
+
+
100
0
5
A12
+
+
+
100
0
6
A21
+
+
+
100
0
7
A22
+
+
+
100
0
8
A31
+
+
+
100
0
9
A32
+
+
+
100
0
10
B11
+
+
+
100
0
11
B12
+
+
+
100
0
12
J11
+
+
+
100
0
13
J12
+
+
+
100
0
14
Kontrol negatif (Air)
0
0
Keterangan : + DNA teramplifikasi; - DNA tidak teramplifikasi.

No

 

 
 
Persentase keberhasilan mencapai 100%
untuk setiap sampel yang diujikan dan hanya
DNA sapi yang teramplifikasi pada setiap
sampel uji. Hasil tersebut menunjukkan
bahwa pada sampel bakso yang diambil dari 3
pasar di Kota Bogor tidak ditemukan adanya
cemaran babi.

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan

Validasi
metode
ekstraksi
DNA
menghasilkan limit deteksi kemurnian DNA
sebesar 0.117, limit kuantitasi kemurnian
DNA sebesar 0.389, persen SBR 2.31%, dan
ketidakpastian kemurnian DNA sebesar 1.93
± 0.04. Berdasarkan hasil tersebut, metode
ekstraksi DNA telah memiliki kelayakan yang
baik untuk analisis PCR.
Teknik PCR yang dilakukan mampu
mengidentifikasi cemaran daging babi dalam
sampel bakso hingga tingkat cemaran 0.5%
(b/b). Pengujian terhadap sampel bakso dari 3
pasar berbeda di kota Bogor (Pasar Anyar,
Pasar Bogor dan Pasar Jambu Dua) dengan
teknik PCR tersebut tidak menunjukkan
adanya cemaran daging babi.
Saran

Perlu dilakukan pengujian parameter
validasi yang lain seperti ketertiruan
(reproducibility) dan ketangguhan metode
(ruggedness). Pengujian juga perlu dilakukan
pada jenis sampel yang lain seperti dendeng
dan abon.

DAFTAR PUSTAKA
 
Antonia et al. 2008. The validation of the
DNA extraction method from Apis
mallifera L. Animal Sci Biotech 65:387390.
Bartlett JMS, Stirling D. 2003. A Short
History of the Polymerase Chain Reaction.
New Jersey: Humana Pr.
Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi
metode dan cara perhitungannya. Maj Ilmu
Kefarmasian 3:117-135.
Harvey D. 2000. Modern Analytical
Chemistry. New York: McGraw-Hill.

 

Hayyan et al. 2009. Identifying of fats of halal
and non halal animals using a geometric
method. Halal Sci 3:43-51.
[IUPAC] International Union of Pure and
Applied Chemistry. 2002. Harmonized
Guidelines
for
Single-Laboratory
Validation of Method of Analysis (IUPAC
Technical Report). London: IUPAC.
Margawati ET, Ridwan M. 2010. Analysis of
porcine contamination by using PCR
technology in several meat ball products:
to find an effective assessment system.
Berita Biol 10:93-98.
Matsunaga T et al. 1999. A quick and simple
method for the identifcation of meat
species and meat products by PCR assay.
Meat Sci 51:143-148.
Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika.
Ed ke-2. Bogor: IPB Pr.
Nuraini H. 2004. Pengembangan sekuen
Porcine Repetitive Element (PRE-1)
sebagai
penanda
molekuler
untuk
mendeteksi material babi pada produk
daging olahan [disertasi]. Bogor: Sekolah
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Peraturan Pemerintah Republik Indonesia
Nomor 28 Tahun 2004 tentang Keamanan,
Mutu, dan Gizi Pangan. Jakarta.
Reha D et al. 2003. Nature of stacking
interactions
between
intercalators
(ethidium, daunomycin, ellipticine, and
4′,6-diaminide-2-phenylindole) and DNA
base pairs. Chem Soc 124:3366-3376.
Saez R, Sanz Y, Toldra F. 2003. PCR-based
fingerprinting
technique
for
rapid
detection of animal species in meat
product. Meat Sci 66:659-665.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989.
Molecular Cloning. A Laboratory Manual.
New York: Cold Spring Harbour Lab.
Sambrook J, Russel. 2001. Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. Ed ke-3.
New York: Cold Spring Harbour Lab.
Sumardi. 2002. Validasi Metode Pengujian.
Jakarta: Pusat Standardisasi dan Akreditasi
Sekretariat Jenderal Departemen Pertanian.

 
 

 
 

LAMPIRAN
 

 
 

12

Lampiran 1 Bagan tahapan penelitian

Sampel

Preparasi Sampel

Degradasi Protein

Degradasi Bahan Organik

Ekstraksi DNA

Presipitasi DNA

Penentuan Kemurnian DNA

Validasi Metode Ekstraksi
DNA

Visualisasi Fragmen DNA

Pengujian DNA dengan PCR
Identifikasi Cemaran Daging
Babi pada Sampel Bakso
Visualisasi Fragmen DNA
Hasil PCR

 

13

Lampiran 2 Pengolahan data uji limit deteksi, limit kuantitasi, dan presisi
No
1
2
3
4
5
6
7

•

•

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi 7 ulangan sampel bakso dengan cemaran
A280
A260/A280
μg/μL
Sampel
A260
1
0.059
0.031
1.903
590
2
0.035
0.019
1.842
350
3
0.039
0.021
1.857
390
4
0.031
0.016
1.938
310
5
0.027
0.014
1.923
310
6
0.074
0.040
1.850
740
7
0.044
0.023
1.913
440
Rerata
1.889
SB
0.039

Limit deteksi
LD = 3×SB
LD = 0.117% kemurnian DNA
 
Limit kuantitasi
LQ = 10 x SB
LQ = 0.389% kemurnian DNA

No
1
2
3
4
5
6
7

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi 7 ulangan sampel bakso dengan cemaran
A280
A260/A280
μg/μL
Sampel
A260
1
0.031
0.016
1.938
310
2
0.030
0.016
1.875
300
3
0.039
0.021
1.857
390
4
0.039
0.020
1.950
390
5
0.031
0.016
1.938
310
6
0.027
0.014
1.923
270
7
0.038
0.019
2.000
280
Rerata
1.925
SB
0.044
SBR(%)
2.31

 
•

Persisi
SB

× 100%
x
SBR (%) = 2.31%
 

SBR (%) =

 
 
 
 
 
 
 

 

14

Lampiran 3 Pengolahan data ketidakpastian kemurnian DNA
Pengukuran kemurnian dan konsentrasi 7 ulangan sampel bakso dengan cemaran
A280
A260/A280
μg/μL
No
Sampel
A260
1
1
0.029
0.016
1.812
290
2
2
0.035
0.019
1.842
350
3
3
0.031
0.015
2.067
390
4
4
0.242
0.131
1.847
2420
5
5
0.029
0.014
2.071
290
6
6
0.101
0.050
2.020
1010
7
7
0.039
0.021
1.857
390

 
Ulangan
sampel
1
2
3
4
5
6
7
Rerata

Indeks
Kemurnian DNA
1.812
1.842
2.067
1.847
2.071
2.020
1.857
1.930

(x - x )

-0.118
-0.088
0.137
-0.083
0.141
0.090
-0.073

0.0139
0.0077
0.0187
0.0068
0.0198
0.0081
0.0053

uc =

Ketidakpastian baku rata-rata:
u (x )
m
um =
n
0.11592

Ketidakpastian diperluas:
ue = k × uc
u e = 0,045

[

]

Kemurnian DNA = Pengukuran Kemurnian DNA ± u e

[

]

Kemurnian DNA = 1.93 ± 0,04

 
 

2

u c = 0.0227

Ketidakpastian pengukuran kemurnian DNA

 

⎛ 0.04382 ⎞
⎟
⎜
⎝ 1.930 ⎠

u e = 2 × 0.0227

7

u m = 0,04382

 

2

i

Ketidakpastian gabungan:
2
⎛ um ⎞
uc = ⎜
⎟
⎝ Xm ⎠

Ketidak pastian presisi:
n
2
∑ (x -x )
i =1 i m
u (p) =
n-1
u (p) = 0.11592

um =

xi - x

15

Lampiran 4 Data pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel bakso
dengan variasi cemaran dan bakso pasar
Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel baksodengan variasi cemaran 
No
Sampel
A260
A280
A260/A280
μg/μL
1
Bakso 0.1%
0.008
0.007
1.143
80
2
Bakso 0.5%
0.013
0.004
3.250
210
3
Bakso 1%
0.029
0.014
2.071
290
4
Bakso 5%
0.061
0.027
2.259
610
5
Bakso 10%
0.040
0.015
2.667
400
6
Bakso 15%
0.016
0.007
2.286
160
7
Bakso 20%
0.101
0.050
2.020
1010
 

No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

 

Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA sampel bakso pasar
A280
A260/A280
Sampel
A260
A11
0.092
0.051
1.804
A12
0.059
0.031
1.903
A21
0.055
0.028
1.964
A22
0.044
0.023
1.913
A31
0.028
0.016
1.750
A32
0.027
0.015
1.800
B11
0.044
0.039
1.641
B12
0.074
0.040
1.850
J11
0.049
0.023
2.130
J12
0.040
0.019
2.105

μg/μL
920
590
550
440
280
270
640
740
490
400