Amplifikasi gen pup1 dan uji morfologi perakaran tanaman padi pada kondisi defisiensi fosfor
AMPLIFIKASI GEN Pup1 DAN UJI MORFOLOGI PERAKARAN
TANAMAN PADI PADA KONDISI DEFISIENSI FOSFOR
TUHFAH AMALIAH
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Amplifikasi gen Pup1
dan Uji Morfologi Perakaran Tanaman Padi Pada Kondisi Defisiensi Fosfor
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2013
Tuhfah Amaliah
NIM G84090066
ABSTRAK
TUHFAH AMALIAH. Amplifikasi Gen Pup1 dan Uji Morfologi Tanaman Padi
Pada Kondisi Defisiensi Fosfor. Dibimbing oleh SURYANI dan JOKO
PRASETIYONO.
Kondisi lahan Indonesia yang sekitar 25% mengalami defisiensi fosfor
membuat tanaman padi di Indonesia mengalami defisiensi P. Pemetaan gen yang
terpaut dengan defisiensi P terdapat pada kromosom 12 pada tanaman padi yaitu
gen Pup1. Pada penelitian ini telah dilakukan amplifikasi gen Pup1 pada galur
padi BC2F6 hasil persilangan antara Batur dan Situ Bagendit dengan Kasalath dan
NIL. Serta dilakukan uji morfologi perakaran untuk melihat keefektifan hasil
persilangan. Hasil uji morfologi perakaran dilakukan dengan menggunakan
larutan Yoshida dengan 4 perlakuan berbeda (0.5 P, 10 P, 0.5 P+45 ppm Al dan
10 P+ 45 ppm Al). Hasilnya diuji dengan uji ANOVA dan uji Dunnet.
Berdasarkan hasil analisis molekuler dengan menggunakan primer K29-1
menunjukkan keseluruhan tanaman hasil persilangan memiliki kemiripan dengan
tetua Kasalath dan NIL-C443 sebagai donor Pup1. Hasil uji ANOVA dan uji
Dunnet menunjukkan adanya perbedaan morfologi akar antara tanaman hasil
persilangan dengan tetua tidak toleran defisiensi P yakni Batur dan Situ Bagendit.
Kata kunci: Kasalath, NIL-C443, defisiensi fosfor, gen Pup1, morfologi perakaran
ABSTRACT
TUHFAH AMALIAH. Amplification Pup1 and Test Root Morphology of Rice
With Alumunium Stress. Supervised by SURYANI and JOKO PRASETIYONO.
About 25% of Indonesia's land conditions has phosphorus deficiency. Its
makes rice plants in Indonesia deficient of phosphorus. Genes mapping are adrift
with P deficiency on chromosome 12 at the gene Pup1 rice. This research has
been conducted on gene amplification of BC2F6 Pup1 on rice lines from backcross
between Batur and Situ Bagendit with Kasalath and NIL-C443. The root
morphology has been done observe the effectiveness of the cross. Root
morphology test results by using a solution of Yoshida with 4 different treatment
(0.5 P, 10 P, 0.5 P+45 ppm Al. dan 10 P+ 45 ppm Al). The results are tested by
ANOVA test and Dunnet test. Based on the results of molecular analysis using
primers K29-1 shows the overall results of crossbreeding plants have similarities
with elders Kasalath and NIL-C443 as Pup1 donor. The ANOVA test and
Dunnet’s results indicate the presence of root morphological differences between
plants from crosses with P deficiency intolerant inheritence, Batur and Situ
Bagendit.
Keywords : Kasalath, NIL-C443, phosphor deficiency, gene Pup1, root morfology
AMPLIFIKASI GEN Pup1 DAN UJI MORFOLOGI PERAKARAN
TANAMAN PADI PADA KONDISI DEFISENSI FOSFOR
TUHFAH AMALIAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul :
Amplifikasi Gen Pup1 dan Uji Morfologi Perakaran Tanaman Padi
Pada Kondisi Defisiensi Fosfor
Nama
NIM
: Tuhfah Amaliah
: G84090066
Disetujui oleh
Dr. Suryani, S.P,M.Sc
Pembimbing I
Dr. Joko Prasetiyono, M.Si
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Judul
Nama
NIM
Amplifikasi Gen Pupl dan Uji Morfologi Perakaran Tanaman Padi
Pada Kondisi Defisiensi Fosfor
Tuhfah Amaliah
G84090066
Disetujui oleh
Dr. Suryani, S.P,M.Sc
Pembimbing I
Dr. Joko Prasetiyono, M.Si
Pembimbing II
.Sc
Tanggal Lulus:1
8 DEC 201 3
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga
penulis dapat menyelesaikan penelitian dan menyusun karya ilmiah ini, serta
shalawat dan salam semoga tercurahkan pada Rasulullah SAW. Ucapan terima
kasih penulis sampaikan kepada Dr. Suryani S.P.,M.Sc dan Dr. Joko Prasetiyono
M.Si, selaku ketua dan anggota pembimbing skripsi yang telah dilaksanakan di
laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Cimanggu-Bogor. Penulis juga
menyampaikan terima kasih kepada orang tua, keluarga atas segala doa, kasih
sayang, dan motivasinya. Serta kepada Kiki, Vita, Hilda, Sisca, Siska, dan temanteman Biokimia 46 yang senantiasa memberikan bimbingan, doa, dan bantuannya
sehingga penelitian ini dapat diselesaikan dengan baik.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam karya ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan
khususnya bidang biokimia.
Bogor, Agustus 2013
Tuhfah Amaliah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Analisis Data
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN
5
5
10
11
Simpulan
12
Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
12
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
21
DAFTAR TABEL
1.
2.
3.
Komposisi larutan Yoshida
Hasil spektrofotometer DNA hasil isolasi
Hasil uji Anova terhadap masing-masing persilangan
5
6
9
DAFTAR GAMBAR
1.
2.
3.
Elektroforegram beberapa DNA templat hasil isolasi DNA
Elektroforegram PAGE 8% persilangan NIL C-443 dan Batur
Elektroforegram PAGE 8% persilangan Kasalath dan Batur
6
6
7
DAFTAR LAMPIRAN
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Komposisi larutan yang digunakan dalam penelitian
Elektroforegam persilangan Situ Bagendit dan Kasalath dan NIL-C443
Hasil uji Dunnet hasil persilangan Batur dengan Kasalath
Hasil uji Dunnet hasil persilangan Batur dengan NIL-C443
Hasil uji Dunnet hasil persilangan Situ Bagendit dengan Kasalath
Hasil uji Dunnet hasil persilangan Situ Bagendit dengan NIL-C443
15
16
17
18
19
20
PENDAHULUAN
Beras merupakan komoditas pangan yang sangat strategis karena merupakan
makanan pokok utama bagi masyarakat. Konsumsi beras per kapita per tahun
pada tahun 2010 adalah sebesar 139,15 Kg dan tahun 2014 akan mencapai angka
33.013.214 ton. Untuk itu diperlukan upaya khusus dalam peningkatan
produktivitas dan perluasan areal tanam maupun perluasan baku lahan (BPS 2008).
Indonesia memiliki luas daratan sekitar 191.093.132 ha (BPS 2008) dan sekitar
25% dari keseluruhan daratannya didominasi oleh tanah ultisol (Subagyo et al.
2004 dalam Prasetyo dan Suriadikarta 2006). Umumnya tanah ini mempunyai
potensi keracunan Alumunium (Al) dan miskin kandungan bahan organik
(Prasetyo dan Suriadikarta 2006). Al pada tanah ultisol ini akan mengikat fosfor
pada tanah sehingga sulit untuk diserap oleh tanaman.
Fosfor (P) sendiri ditemukan pada tanaman sebagai pembentuk asam
nukleat, fosfolipid, koenzim NAD dan NADP dan yang paling penting sebagai
konstituen pembentuk ATP. Unsur P diambil tanaman dalam bentuk ion ortofosfat
primer dan sekunder (H2PO4-atau HPO42-) (Chesworth et al. 1998). Tanaman yang
mengalami defiensi P daunnya tidak akan tumbuh baik dan akan ditemukan
pigmentasi antosianin berwarna ungu atau merah. Selain itu pertumbuhan
tanaman akan terhambat dan mengurangi pertumbuhan biji dan mengurangi
jumlah anakan (pada tanaman padi) (Chesworth et al. 1998).
Pup1 (P uptake1) merupakan gen yang mengendalikan pengambilan P dari
tanah dengan cara mengatur perpanjangan akar pada tanaman. Selain Pup1
ditemukan juga gen-gen lain yang mengatur transportasi P, penyimpanan P, dan
efisiensi penggunaan P (Ismail et al. 2007). Masing-masing mekanisme tersebut
melibatkan banyak gen. Kerja gen-gen tersebut dipengaruhi oleh gen-gen lainnya.
Seperti gen yang mengatur cekaman terhadap alumunium, besi, dan keracunan
garam.
Penelitian yang mengeksplorasi keberadaan gen-gen yang mengatur
toleransi terhadap defisiensi P sudah dimulai pada satu dekade terakhir. Menurut
Wissuwa et al (1998) marka yang terpaut dengan sifat defisiensi P pada
persilangan Nipponbare (sensitif) dan Kasalath (toleran) diperoleh dengan
menggunakan marka RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Ni et
al (1998), Wissuwa et al (2001, 2002) melanjutkan studi toleransi terhadap
defisiensi P dengan mempersempit posisi Pup1 pada kromosom 12.
Oleh karena itu, dilakukan persilangan antara tanaman padi yang toleran
terhadap defisiensi P dengan tanaman padi yang tidak toleran untuk mendapatkan
suatu varietas unggul. Diharapkan persilangan akan menghasilkan varietas baru
yang memiliki tingkat produksi tinggi dan peka terhadap defisiensi P. Salah satu
padi tidak toleran yang dipilih untuk proses penyilangan adalah varietas Situ
Bagendit dan Batur. Padi varietas Situ Bagendit adalah salah satu varietas padi
gogo, tetapi mampu tumbuh baik pada lingkungan lahan sawah. Varietas ini
menghasilkan tekstur nasi pulen dan dapat memberikan kontribusi nyata terhadap
peningkatan produksi padi nasional, ketahanan pangan, dan pendapatan petani.
Demikianpula dengan padi varietas Batur yang banyak digunkan oleh petani dan
merupakan varietas unggul (Prasetiyono 2011). Kasalath (padi lokal India)
diketahui sebagai salah satu varietas padi yang toleran terhadap defisiensi P.
2
Ketika disilangkan dengan tanaman padi yang tidak toleran defisiensi P
(Nipponbare), hasilnya memberikan peningkatan penangkapan P (P-uptake)
sebesar 170% dan peningkatan hasil jumlah bulir sebesar 250% pada kondisi
kurang P dengan memanfaatkan sifat toleran defisiensi P dari Kasalath tersebut
(Wissuwa dan Ae 2000).
Penelitian ini selain bertujuan untuk melihat keberadaan gen Pup1 pada
tanaman padi juga untuk melihat keefektifan keberadaan gen ini pada tanaman
padi hasil persilangan antara Batur dengan Kasalath, Batur dengan NIL-C443,
Situ Bagendit dengan Kasalath, dan Situ Bagendit dengan NIL-C443 generasi
BC2F6 dengan melihat morfologi perakarannya. Keberadaan gen Pup1 diketahui
dengan menggunakan marka mikrosatelit. Marka mikrosatelit atau dikenal dengan
nama simple sequence repeat/SSR mempunyai derajat polimorfisme yang tinggi
(Highly polymophic). Selain itu SSR dapat digunakan untuk mempelajari genotip
individu, dengan mendeteksi suatu segmen DNA yang mengandung pola
perulangan sederhana dari basa nitrogen (Mullis dan Faloona 1987). Sehingga
dapat digunakan untuk menentukan keberadaan Pup1 pada tanaman padi.
Morfologi akar dilihat dengan memberikan perlakuan cekaman alumunium pada
tanaman padi tersebut. Manfaat penelitian ini adalah untuk mempermudah melihat
keberadaan gen Pup1 pada tanaman padi. Uji morfologi perakaran dapat
digunakan sebagai salah satu indikator ekspresi gen Pup1 secara fenotip.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Februari hingga Juni 2013. Bertempat
di laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Jalan Tentara Pelajar No.3A,
Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah daun padi hasil
persilangan antara Batur dengan Kasalath (BK), Batur NIL-C443 (BN), Situ
Bagendit Kasalah (SK) dan Situ Bagendit NIL-C443 (SN), nitrogen cair, bufer
ekstraksi, Chisam (kloroform : isoamil alkohol dengan perbandingan 24 : 1, etanol
absolut dan etanol 70%. Bahan-bahan yang digunakan untuk PCR adalah DNA
padi hasil isolasi, akuades, Polymerase Chain Reaction (PCR) master mix, 5µM
primer mix, Taq polimerase, GC Rich, dan mineral oil. Bahan-bahan yang
digunakan untuk elektroforesis hasil PCR adalah larutan agarosa, 0.5x TBE, DNA
hasil PCR, dan DNA marker. Bahan-bahan yang digunakan untuk pewarna gen
Pup1 adalah perak nitrat, formaldehid, dan natrium hidroksida (NaOH). Bahan
yang digunakan untuk perlakuan padi (uji morfologi perakaran) adalah larutan
Yoshida yang terdiri atas larutan yang mengandung unsur alumunium (Al),
nitrogen (N), magnesium (Mg), kalium (K), kalsium (Ca) dan unsur mikro lain
yang dibutuhkan tanaman.
3
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah penangas air, inkubator, pipet mikro,
oven, microfuge Beckman, neraca analitik, autoklaf, vorteks, perangkat
elektroforesis, ice maker, kertas aluminium, bak tumbuh padi, infraboard, kertas
saring, alat-alat gelas, plate PCR, mesin pendingin dan mesin PCR PTC-100.
Prosedur Analisis Data
Isolasi DNA Padi (Dellaporta et al. 1983)
Isolasi diawali dengan pengambilan sampel daun padi yang masih muda.
Pengambilan daun padi dilakukan dengan memotong bagian daun padi.
Selanjutnya daun yang telah dipotong dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf
yang telah diberi label berdasarkan nomor pada pot. Tabung Eppendorf yang telah
berisi daun disimpan di dalam freezer untuk selanjutnya dibekukan dengan
nitrogen cair.
Selanjutnya daun padi digerus dan ditambahkan 750 µL bufer ekstraksi.
Bufer ekstraksi terdiri atas 100 mL Tris-HCl (pH 8), 100 mL NaCl, 100 mL
EDTA (pH 8,0), SDS 12,5 g dan ditambahkan akuades (dH2O) hingga volume
akhir mencapai 1000 mL. Setelah itu dipanaskan di dalam water bath selama 20
menit dengan suhu 650C.
Campuran kloroform : isoamilalkohol sebanyak 750 µL dengan
perbandingan 24:1 v/v ditambahkan setelah inkubasi 20 menit. Tabung Eppendorf
selanjutnya dikocok hingga homogen dan dilakukan sentrifus dengan kecepatan
12.000 rpm selama 15 menit. Lapisan atas dipipet dengan hati-hati dan
dipindahkan kedalam tabung Eppendorf yang baru dan ditambahkan etanol
absolut sebanyak 750 µL. Selanjutnya diinkubasi dalam freezer selama 1 jam.
Larutan DNA dan etanol absolut yang telah diinkubasi selanjutnya disentrifus
selama 15 menit 12.000 rpm. Hasil sentrifus berupa pelet dicuci dengan etanol
70% sebanyak 750 µL dan disentrifus kembali dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 10 menit. Supernatan dibuang dan tabung yang berisi pelet dikeringkan
selama 1 hari. Pelet yang telah kering dilarutkan dengan 50 µL air ultrapure untuk
selanjutnya dianalisis.
Analisis Kualitatif dan Kuantitatif DNA Padi (Sambrook et al. 2001)
Kualitas DNA padi diuji dengan menggunakan teknik elektroforesis gel
agarosa 1%. Agarosa 1% dibuat dengan menambahkan 1 gram agarosa dengan
100 ml 10 x TBE dan dipanaskan dalam microwave sampai agarosa larut.
Selanjutnya larutan agarosa dituang dalam cetakan sampai mengeras. Sebanyak
3µL DNA padi hasil isolasi ditambahkan dengan loading dye sebanyak 5µL.
Kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Elektroforesis dilakukan
selama 1 jam dengan menggunakan bufer 0.5 x TBE. Deteksi pita DNA dengan
merendam agarosa selama 10 menit dalam EtBr dan direndam air selama 10 menit.
Selanjutnya hasil isolasi DNA dilihat dengan menggunakan mesin ChemiDoc.
Analisis kuantitatif DNA dilakukan dengan mengencerkan DNA sebanyak
100 kali. Pengenceran dilakukan dengan menambahkan sebanyak 2 µ L DNA
dengan 200 µL akuades. Selanjutnya dimasukkan ke dalam kuvet dan dihitung
absorbansinya pada 260 dan 280.
4
Amplifikasi gen Pup1 dengan PCR
Amplifikasi gen Pup1 dengan menggunakan primer SSR yaitu primer K291. Sampel DNA yang diamplifikasi sebanyak 98 buah yaitu DNA hasil
persilangan Batur x Kasalath (BK), Batur x NIL-C443 (BN). Situ Bagendit x
Kasalath (SK), dan Situ bagendit x NIL-C443 (SN), Campuran reaksi PCR (untuk
1 x reaksi) terdiri atas 10 x bufer PCR dengan MgCl sebanyak 2 µL, dNTPs
sebanyak 2 µL, GC Rich sebanyak 1 µl, ddH2O sebanyak 9 µL, dan Taq
polimerase sebanyak 1 µL. Ke dalam plate PCR dimasukkan 3 µL DNA template
dan 2 µL primer. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR. Tahapan pada
program tersebut diawali dengan denaturasi dengan suhu 94oC selama 5 menit..
Tahap pertama pada suhu 94oC selama 1 menit. Tahap kedua berlangsung selama
1 menit dengan suhu 55oC. Tahap terakhir dengan suhu 72oC selama 2 menit.
Tahap selanjutnya adalah ekstensi akhir. Tahap ini berlangsung selama 7 menit
dengan suhu 72oC. Hasil PCR ini disimpan dalam suhu 40C sampai siap
digunakan untuk elektroforesis.
Elektroforesis Hasil Ampilifikasi Gen Pup1 (Sambrook et al. 2001)
Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan Poliakrilamid Gel
Elektroforesis (PAGE). Gel dibuat dari 60 mL larutan PAGE 8%, 600 µL APS
dan 60 µL TEMED. Larutan dikocok dan dimasukkan kedalam pelat kaca yang
telah disusun terlebih dahulu. Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam
tangki elektroforesis yang berisi 0.5 X TBE. Hasil PCR diinjeksikan ke dalam
sumur sebanyak 4.5 µL dan dilakukan elektroforesis selama 110 menit dengan
tegangan sebesar 80 V. Ke dalam sumur dimasukkan juga DNA marker yang
berguna untuk penentuan ukuran DNA. Untuk mendeteksi gen Pup1 dilakukan
pewarnaan dengan pewarna perak.
Pewarnaan dilakukan dengan merendam gel yang telah dilepas dari kaca
dengan larutan perak yang terdiri atas 0.4 g Perak Nitrat dalam 300 mL ddH2O
selama 8 menit. Selanjutnya gel direndam dalam larutan NaOH dan formaldehid
(4 gr NaOH dalam 300 mL ddH2O ditambahkan 2 mL formaldehid). Perendaman
dilakukan sampai pita pada gel dapat diamati.
Uji Morfologi Perakaran Dengan Cekaman Alumunium (Yoshida et al. 1976)
Tanaman padi hasil persilangan yaitu BC2F6, yang diuji dikecambahkan
terlebih dahulu dalam cawan Petri, sampai tumbuh akar. Selanjutnya ditempatkan
dalam infraboard dan ditutup dengan kertas saring. Kemudian infraboard yang
telah berisi padi ditempatkan dalam bak yang telah berisi larutan Yoshida. Laruan
ini berisi larutan P, Mg, Ca, N dan K. Larutan Yoshida ini terdiri atas konsentrasi
yang berbeda-beda. Seperti yang terlihat pada Tabel 1. Perlakuan ini diulang
sebanyak tiga kali. Sehingga banyaknya bak yang berisi padi berjumlah 12 buah
bak. Tanaman akan dibiarkan tumbuh selama tiga minggu. Setelah itu dilakukan
pengamatan terhadap panjang akar, jumlah akar, dan bobot kering akar serta
jumlah akar. Pengukuran panjang akar dan panjang tajuk dilakukan dengan
menggunkan mistar. Sedangkan sebelum dilakukan pengukuran bobot kering akar
dan tajuk, padi hasil perlakuan dimasukkan kedalam oven sampai kering.
Selanjutnya dilakukan penimbangan bobot kering akar dan tajuk. Data hasil
pengamatan dianalisis menggunakan rancangan acak lengkap.
5
Tabel 1. Komposisi larutan Yoshida
Kondisi
Normal
Cekaman
Al
Mg
(mL)
Perlakuan
0.5 P
10 P
0.5 P + 45 ppm
Al
10 P + 45 ppm
Al
Komposisi larutan Yoshida (dalam 2 liter dH2O)
N
P
Ca
K
Unsur mikro
(mL)
(mL)
(mL)
(mL)
(mL)
2.5
2.5
2.5
2.5
0.125
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
0.125
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
Analisis Data Hasil Pengamatan
Analisis hasil pengamatan dilakukan dengan menggunakan rancangan acak
lengkap. Data yang diperoleh berasal dari 3 kali ulangan dan 4 perlakuan, yaitu
kondisi normal 0.5 P dan 10 P serta kondisi cekaman Al 0.5 + 45 ppm Al dan 10 P
+ 45 ppm Al, maka unit percobaan akan ada sebanyak 12 unit percobaan. Bentuk
model linear dapat dituliskan sebagai berikut :
Yij = µ + τi + εij
dimana : i = 1, 2, 3, dan 4 (jumlah perlakuan)
j = 1, 2, dan 3 (jumlah ulangan)
µ = rataan umum
τi = pengaruh perlakuan ke-i
εij = pengaru perlakuan ke-i ulangan ke-j
Dilanjutkan dengan menggunakan uji ANOVA dan uji Dunnet. Uji Anova
digunakan untuk melihat dalam perlakuan yang diberikan terdapat perbedaan atau
tidak. Sedangkan untuk uji lanjutan dilakukan uji Dunnet. Uji Dunnet biasa
dilakukan untuk membandingkan antara sampel dengan kontrol.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Hasil Isolasi DNA Padi
Hasil isolasi DNA padi persilangan diuji keberadaannya dengan
menggunakan agarosa 1% dan divisualisasikan dengan menggunakan EtBr. Hasil
analisis kualitatif DNA padi hasil persilangan terlihat pada Gambar 1. DNA padi
pada gambar merupakan padi persilangan antara Batur dan NIL-C443 (BN).
Smear terlihat pada sumur 1-16, sedangkan pada sumur 2 tidak terdapat smear.
Smear dapat diakibatkan karena masih adanya zat pengotor seperti protein
atau RNA dan terdegradasinya sebagian DNA hasil ekstraksi. Selain dilakukan uji
kualitatif, dilakukan pula uji kuantitatif. Hal ini untuk memastikan ada tidaknya
pengotor pada sampel DNA dan melihat konsentrasi pada masing-masing sampel.
Berdasarkan hasil pengukuran pada 260 : 280, kemurnian sampel DNA hasil
ekstraksi, terdapat beberapa sampel masih memiliki kemurnian yang rendah, yaitu
masih di bawah 1.8 (Tabel 2). Sedangkan kemurnian yang baik terlihat pada
sampel BN 3 dengan besar absorbansi
260 :
280 yaitu 1.981 (Tabel 2).
Kemurnian sampel dikatakan baik bila nilai absorban 260 : 280 berada pada
kisaran 1.8-2.0.
6
Gambar 1 Elektroforegram beberapa DNA daun padi persilangan Batur
dan NIL C-443 hasil isolasi (lajur 1-16 ).
Tabel 2 Konsentrasi DNA hasil isolasi
Sampel
260
280
BN1
BN3
BN4
BN5
BN6
BN7
BN8
BN14
BN15
BN16
0.164
0.088
0.065
0.075
0.041
0.151
0.026
0.116
0.059
0.026
0.155
0.044
0.051
0.053
0.036
0.083
0.023
0.081
0.039
0.024
260μ 280
1.032
1.981
1.266
1.419
1.140
1.821
1.151
1.421
1.534
1.054
Konsentrasi ( g/mL)
801.327
438.114
324.133
373.002
203.159
753.192
129.542
578.354
298.548
128.603
Amplifikasi Gen Pup1
Amplifikasi gen Pup1 dilakukan untuk mengkonfirmasi keberadaan gen
Pup1 pada DNA padi hasil persilangan. Hasil amplifikasi kemudian diseparasi
dengan teknik elektroforesis vertikal dengan menggunakan gel poliakrilamid 8%.
Hasil elektroforesis diwarnai dengan menggunakan pewarna nitrat perak (Gambar
2 dan 3).
Gen
Pup1
Gambar 2 Elektroforegam persilangan NIL-C443 dan Batur. Marker:
DNA 100 bp, lajur 1 (BT) padi Batur; lajur 2 (kas): padi
Kasalath; lajur 3 (NIL) padi NIL C-443, lajur 4 (NIP) padi
Nipponbare; lajur 5-28 (1-23) padi persilangan NIL-C443
dan Batur.
7
Gen
Pup1
Gambar 3 Elektroforegam persilangan NIL-C443 dan Batur. Marker: DNA 100 bp,
lajur 1 (BT) padi Batur; lajur 2 (kas): padi Kasalath; lajur 3 (NIL) padi
NIL C-443, lajur 4 (NIP) padi Nipponbare; lajur 5-27 (1-22) padi
persilangan Kasalath dan Batur.
Hasil amplifikasi gen Pup1 pada persilangan Batur dengan NIL-C443
(BN) disajikan pada Gambar 2. Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa
keseluruhan sampel mengikuti tetua Kasalath. Pita pada sampel (BN) sebanyak 23
pita menunjukkan kesamaan dengan pita pada padi Kasalath. Hal yang sama
ditunjukkan oleh hasil persilangan Batur dengan Kasalath (BK). Keseluruhan
sampel menunjukkan kemiripan dengan padi Kasalath.
Morfologi perakaran tanaman padi hasil persilangan dengan cekaman
Alumunium
Pengamatan terhadap morfologi perakaran tanaman padi hasil persilangan
dilakukan untuk melihat keefektifan persilangan. Masing-masing padi hasil
persilangan diberi perlakuan dengan kondisi yang sama. Tanaman padi
ditumbuhkan dalam bak berisi larutan Yoshida dengan konsentrasi yang berbedabeda, yaitu 0.5 P, 10 P, 0.5 P+45 ppm Al. dan 10 P+45 ppm Al. Tetua yang
digunakan sebagai pembanding adalah tetua yang tidak toleran terhadap defisiensi
P, yaitu Batur dan Situ Bagendit. Perbedaan nyata terlihat pada tabel jika nilai uji
F < 0.005, sedangkan bila nilai uji F >0.005 sampel dikatakan tidak berbeda nyata.
Perbedaan dilihat dengan membandingkan antara masing-masing galur hasil
persilangan dalam satu perlakuan dan masing-masing galur hasil persilangan
dengan perlakuan yang berbeda.
Hasil Uji F terhadap hasil persilangan Batur dengan Kasalath berdasarkan
panjang akar tidak berbeda nyata (Tabel 2). Begitu pula berdasarkan panjang tajuk
dan jumlah akar. Hal berbeda ditunjukkan pada bobot kering akar dan bobot
kering tajuk. Hasil uji F menunjukkan bahwa pada bobot kering akar, terdapat
perbedaan nyata antara masing-masing galur (0.023). Selain itu dilakukan uji
lanjutan yaitu uji Dunnet. Hasil uji Dunnet untuk persilangan Batur dengan
Kasalath dilampirkan pada Lampiran 3. Uji Dunnet dilakukan dengan
membandingkan antara galur hasil persilangan dengan tetua Batur. Hasil uji
Dunnet menunjukkan perbedaan nyata terlihat pada galur BK nomor 10 dengan
nilai uji Dunnet 23.361 berdasarkan bobot kering akar.
8
Sedangkan pada persilangan Batur dengan NIL-C443 (BN). Berbeda
dengan persilangan Batur dengan Kasalath, perbedaan nyata terlihat pada panjang
akar. Perbedaan nyata terlihat pada sumber keragaman dengan perlakuan dengan
fosfor (P) dengan nilai F sebesar 0.009 pada panjang akar. Hasil uji Dunnet pada
persilangan Batur dengan NIL-C443 (Lampiran 4) menunjukkan adanya
perbedaan nyata pada panjang akar antara tetua Batur dengan BN nomor 7
(10.884) dan BN nomor 18 (11.654). Sedangkan pada persilangan Batur dengan
NIL-C443 (BN). Berbeda dengan persilangan Batur dengan Kasalath, perbedaan
nyata terlihat pada panjang akar. Perbedaan nyata terlihat pada sumber keragaman
dengan perlakuan dengan fosfor (P) dengan nilai F sebesar 0.009 pada panjang
akar. Hasil uji Dunnet pada persilangan Batur dengan NIL-C443 (Lampiran 4)
menunjukkan adanya perbedaan nyata pada panjang akar antara tetua Batur
dengan BN nomor 7 (10.884) dan BN nomor 18 (11.654).
Sedangkan pada persilangan Batur dengan NIL-C443 (BN). Berbeda
dengan persilangan Batur dengan Kasalath, perbedaan nyata terlihat pada panjang
akar. Perbedaan nyata terlihat pada sumber keragaman dengan perlakuan dengan
fosfor (P) dengan nilai F sebesar 0.009 pada panjang akar. Hasil uji Dunnet pada
persilangan Batur dengan NIL-C443 (Lampiran 4) menunjukkan adanya
perbedaan nyata pada panjang akar antara tetua Batur dengan BN nomor 7
(10.884) dan BN nomor 18 (11.654).
Uji Anova di Tabel 2 juga menunjukkan hasil pengamatan pada
persilangan Situ Bagendit dengan Kasalath (SK). Didalam uji ini terlihat
perbedaan nyata terlihat pada panjang akar dengan sumber keragaman perlakuan
P dan dengan sumber keragaman perbandingan anatara perlakuan fosfor dengan
perlakuan cekaman alumunium. Perbedaan nyata lain terlihat pada bobot kering
akar dengan sumber keragaman pada galur hasil persilangan (G) dengan nilai uji F
sebesar 0.0190 . Jumlah akar juga terlihat berbeda nyata pada sumber keragaman
antar perlakuan P (0.020), antara perlakuan fosfor dengan cekaman alumunium
(0.001) dan antar semua perlakuan dengan galur hasil persilangan (0.010). Hasil
uji Dunnet pada Lampiran 5 menunjukkan bahwa pada bobot akar perbedaan
nyata terlihat antara SK nomor 23 (22.560) dengan tetua Situ Bagendit.
Sedangkan pada bobot kering tajuk antara SK 14 (30.472) berbeda nyata dengan
tetua.
Hasil uji Anova terhadap persilangan Situ Bagendit dengan NIL-C443
(SN) terlihat juga pada Tabel 2. Perbedaan nyata terlihat pada panjang akar
dengan sumber keragaman adalah galur hasil persilangan dengan nilai uji F adalah
0.0074. Hal yang sama ditunjukkan pada panjang tajuk dengan sumber keragaman
adalah perlakuan cekaman alumunium (0.030) dan galur hasil persilangan
(
TANAMAN PADI PADA KONDISI DEFISIENSI FOSFOR
TUHFAH AMALIAH
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Amplifikasi gen Pup1
dan Uji Morfologi Perakaran Tanaman Padi Pada Kondisi Defisiensi Fosfor
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2013
Tuhfah Amaliah
NIM G84090066
ABSTRAK
TUHFAH AMALIAH. Amplifikasi Gen Pup1 dan Uji Morfologi Tanaman Padi
Pada Kondisi Defisiensi Fosfor. Dibimbing oleh SURYANI dan JOKO
PRASETIYONO.
Kondisi lahan Indonesia yang sekitar 25% mengalami defisiensi fosfor
membuat tanaman padi di Indonesia mengalami defisiensi P. Pemetaan gen yang
terpaut dengan defisiensi P terdapat pada kromosom 12 pada tanaman padi yaitu
gen Pup1. Pada penelitian ini telah dilakukan amplifikasi gen Pup1 pada galur
padi BC2F6 hasil persilangan antara Batur dan Situ Bagendit dengan Kasalath dan
NIL. Serta dilakukan uji morfologi perakaran untuk melihat keefektifan hasil
persilangan. Hasil uji morfologi perakaran dilakukan dengan menggunakan
larutan Yoshida dengan 4 perlakuan berbeda (0.5 P, 10 P, 0.5 P+45 ppm Al dan
10 P+ 45 ppm Al). Hasilnya diuji dengan uji ANOVA dan uji Dunnet.
Berdasarkan hasil analisis molekuler dengan menggunakan primer K29-1
menunjukkan keseluruhan tanaman hasil persilangan memiliki kemiripan dengan
tetua Kasalath dan NIL-C443 sebagai donor Pup1. Hasil uji ANOVA dan uji
Dunnet menunjukkan adanya perbedaan morfologi akar antara tanaman hasil
persilangan dengan tetua tidak toleran defisiensi P yakni Batur dan Situ Bagendit.
Kata kunci: Kasalath, NIL-C443, defisiensi fosfor, gen Pup1, morfologi perakaran
ABSTRACT
TUHFAH AMALIAH. Amplification Pup1 and Test Root Morphology of Rice
With Alumunium Stress. Supervised by SURYANI and JOKO PRASETIYONO.
About 25% of Indonesia's land conditions has phosphorus deficiency. Its
makes rice plants in Indonesia deficient of phosphorus. Genes mapping are adrift
with P deficiency on chromosome 12 at the gene Pup1 rice. This research has
been conducted on gene amplification of BC2F6 Pup1 on rice lines from backcross
between Batur and Situ Bagendit with Kasalath and NIL-C443. The root
morphology has been done observe the effectiveness of the cross. Root
morphology test results by using a solution of Yoshida with 4 different treatment
(0.5 P, 10 P, 0.5 P+45 ppm Al. dan 10 P+ 45 ppm Al). The results are tested by
ANOVA test and Dunnet test. Based on the results of molecular analysis using
primers K29-1 shows the overall results of crossbreeding plants have similarities
with elders Kasalath and NIL-C443 as Pup1 donor. The ANOVA test and
Dunnet’s results indicate the presence of root morphological differences between
plants from crosses with P deficiency intolerant inheritence, Batur and Situ
Bagendit.
Keywords : Kasalath, NIL-C443, phosphor deficiency, gene Pup1, root morfology
AMPLIFIKASI GEN Pup1 DAN UJI MORFOLOGI PERAKARAN
TANAMAN PADI PADA KONDISI DEFISENSI FOSFOR
TUHFAH AMALIAH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul :
Amplifikasi Gen Pup1 dan Uji Morfologi Perakaran Tanaman Padi
Pada Kondisi Defisiensi Fosfor
Nama
NIM
: Tuhfah Amaliah
: G84090066
Disetujui oleh
Dr. Suryani, S.P,M.Sc
Pembimbing I
Dr. Joko Prasetiyono, M.Si
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Judul
Nama
NIM
Amplifikasi Gen Pupl dan Uji Morfologi Perakaran Tanaman Padi
Pada Kondisi Defisiensi Fosfor
Tuhfah Amaliah
G84090066
Disetujui oleh
Dr. Suryani, S.P,M.Sc
Pembimbing I
Dr. Joko Prasetiyono, M.Si
Pembimbing II
.Sc
Tanggal Lulus:1
8 DEC 201 3
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga
penulis dapat menyelesaikan penelitian dan menyusun karya ilmiah ini, serta
shalawat dan salam semoga tercurahkan pada Rasulullah SAW. Ucapan terima
kasih penulis sampaikan kepada Dr. Suryani S.P.,M.Sc dan Dr. Joko Prasetiyono
M.Si, selaku ketua dan anggota pembimbing skripsi yang telah dilaksanakan di
laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Cimanggu-Bogor. Penulis juga
menyampaikan terima kasih kepada orang tua, keluarga atas segala doa, kasih
sayang, dan motivasinya. Serta kepada Kiki, Vita, Hilda, Sisca, Siska, dan temanteman Biokimia 46 yang senantiasa memberikan bimbingan, doa, dan bantuannya
sehingga penelitian ini dapat diselesaikan dengan baik.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam karya ilmiah ini.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan
khususnya bidang biokimia.
Bogor, Agustus 2013
Tuhfah Amaliah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Analisis Data
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN
5
5
10
11
Simpulan
12
Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
12
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
21
DAFTAR TABEL
1.
2.
3.
Komposisi larutan Yoshida
Hasil spektrofotometer DNA hasil isolasi
Hasil uji Anova terhadap masing-masing persilangan
5
6
9
DAFTAR GAMBAR
1.
2.
3.
Elektroforegram beberapa DNA templat hasil isolasi DNA
Elektroforegram PAGE 8% persilangan NIL C-443 dan Batur
Elektroforegram PAGE 8% persilangan Kasalath dan Batur
6
6
7
DAFTAR LAMPIRAN
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Komposisi larutan yang digunakan dalam penelitian
Elektroforegam persilangan Situ Bagendit dan Kasalath dan NIL-C443
Hasil uji Dunnet hasil persilangan Batur dengan Kasalath
Hasil uji Dunnet hasil persilangan Batur dengan NIL-C443
Hasil uji Dunnet hasil persilangan Situ Bagendit dengan Kasalath
Hasil uji Dunnet hasil persilangan Situ Bagendit dengan NIL-C443
15
16
17
18
19
20
PENDAHULUAN
Beras merupakan komoditas pangan yang sangat strategis karena merupakan
makanan pokok utama bagi masyarakat. Konsumsi beras per kapita per tahun
pada tahun 2010 adalah sebesar 139,15 Kg dan tahun 2014 akan mencapai angka
33.013.214 ton. Untuk itu diperlukan upaya khusus dalam peningkatan
produktivitas dan perluasan areal tanam maupun perluasan baku lahan (BPS 2008).
Indonesia memiliki luas daratan sekitar 191.093.132 ha (BPS 2008) dan sekitar
25% dari keseluruhan daratannya didominasi oleh tanah ultisol (Subagyo et al.
2004 dalam Prasetyo dan Suriadikarta 2006). Umumnya tanah ini mempunyai
potensi keracunan Alumunium (Al) dan miskin kandungan bahan organik
(Prasetyo dan Suriadikarta 2006). Al pada tanah ultisol ini akan mengikat fosfor
pada tanah sehingga sulit untuk diserap oleh tanaman.
Fosfor (P) sendiri ditemukan pada tanaman sebagai pembentuk asam
nukleat, fosfolipid, koenzim NAD dan NADP dan yang paling penting sebagai
konstituen pembentuk ATP. Unsur P diambil tanaman dalam bentuk ion ortofosfat
primer dan sekunder (H2PO4-atau HPO42-) (Chesworth et al. 1998). Tanaman yang
mengalami defiensi P daunnya tidak akan tumbuh baik dan akan ditemukan
pigmentasi antosianin berwarna ungu atau merah. Selain itu pertumbuhan
tanaman akan terhambat dan mengurangi pertumbuhan biji dan mengurangi
jumlah anakan (pada tanaman padi) (Chesworth et al. 1998).
Pup1 (P uptake1) merupakan gen yang mengendalikan pengambilan P dari
tanah dengan cara mengatur perpanjangan akar pada tanaman. Selain Pup1
ditemukan juga gen-gen lain yang mengatur transportasi P, penyimpanan P, dan
efisiensi penggunaan P (Ismail et al. 2007). Masing-masing mekanisme tersebut
melibatkan banyak gen. Kerja gen-gen tersebut dipengaruhi oleh gen-gen lainnya.
Seperti gen yang mengatur cekaman terhadap alumunium, besi, dan keracunan
garam.
Penelitian yang mengeksplorasi keberadaan gen-gen yang mengatur
toleransi terhadap defisiensi P sudah dimulai pada satu dekade terakhir. Menurut
Wissuwa et al (1998) marka yang terpaut dengan sifat defisiensi P pada
persilangan Nipponbare (sensitif) dan Kasalath (toleran) diperoleh dengan
menggunakan marka RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Ni et
al (1998), Wissuwa et al (2001, 2002) melanjutkan studi toleransi terhadap
defisiensi P dengan mempersempit posisi Pup1 pada kromosom 12.
Oleh karena itu, dilakukan persilangan antara tanaman padi yang toleran
terhadap defisiensi P dengan tanaman padi yang tidak toleran untuk mendapatkan
suatu varietas unggul. Diharapkan persilangan akan menghasilkan varietas baru
yang memiliki tingkat produksi tinggi dan peka terhadap defisiensi P. Salah satu
padi tidak toleran yang dipilih untuk proses penyilangan adalah varietas Situ
Bagendit dan Batur. Padi varietas Situ Bagendit adalah salah satu varietas padi
gogo, tetapi mampu tumbuh baik pada lingkungan lahan sawah. Varietas ini
menghasilkan tekstur nasi pulen dan dapat memberikan kontribusi nyata terhadap
peningkatan produksi padi nasional, ketahanan pangan, dan pendapatan petani.
Demikianpula dengan padi varietas Batur yang banyak digunkan oleh petani dan
merupakan varietas unggul (Prasetiyono 2011). Kasalath (padi lokal India)
diketahui sebagai salah satu varietas padi yang toleran terhadap defisiensi P.
2
Ketika disilangkan dengan tanaman padi yang tidak toleran defisiensi P
(Nipponbare), hasilnya memberikan peningkatan penangkapan P (P-uptake)
sebesar 170% dan peningkatan hasil jumlah bulir sebesar 250% pada kondisi
kurang P dengan memanfaatkan sifat toleran defisiensi P dari Kasalath tersebut
(Wissuwa dan Ae 2000).
Penelitian ini selain bertujuan untuk melihat keberadaan gen Pup1 pada
tanaman padi juga untuk melihat keefektifan keberadaan gen ini pada tanaman
padi hasil persilangan antara Batur dengan Kasalath, Batur dengan NIL-C443,
Situ Bagendit dengan Kasalath, dan Situ Bagendit dengan NIL-C443 generasi
BC2F6 dengan melihat morfologi perakarannya. Keberadaan gen Pup1 diketahui
dengan menggunakan marka mikrosatelit. Marka mikrosatelit atau dikenal dengan
nama simple sequence repeat/SSR mempunyai derajat polimorfisme yang tinggi
(Highly polymophic). Selain itu SSR dapat digunakan untuk mempelajari genotip
individu, dengan mendeteksi suatu segmen DNA yang mengandung pola
perulangan sederhana dari basa nitrogen (Mullis dan Faloona 1987). Sehingga
dapat digunakan untuk menentukan keberadaan Pup1 pada tanaman padi.
Morfologi akar dilihat dengan memberikan perlakuan cekaman alumunium pada
tanaman padi tersebut. Manfaat penelitian ini adalah untuk mempermudah melihat
keberadaan gen Pup1 pada tanaman padi. Uji morfologi perakaran dapat
digunakan sebagai salah satu indikator ekspresi gen Pup1 secara fenotip.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Februari hingga Juni 2013. Bertempat
di laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Jalan Tentara Pelajar No.3A,
Bogor.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah daun padi hasil
persilangan antara Batur dengan Kasalath (BK), Batur NIL-C443 (BN), Situ
Bagendit Kasalah (SK) dan Situ Bagendit NIL-C443 (SN), nitrogen cair, bufer
ekstraksi, Chisam (kloroform : isoamil alkohol dengan perbandingan 24 : 1, etanol
absolut dan etanol 70%. Bahan-bahan yang digunakan untuk PCR adalah DNA
padi hasil isolasi, akuades, Polymerase Chain Reaction (PCR) master mix, 5µM
primer mix, Taq polimerase, GC Rich, dan mineral oil. Bahan-bahan yang
digunakan untuk elektroforesis hasil PCR adalah larutan agarosa, 0.5x TBE, DNA
hasil PCR, dan DNA marker. Bahan-bahan yang digunakan untuk pewarna gen
Pup1 adalah perak nitrat, formaldehid, dan natrium hidroksida (NaOH). Bahan
yang digunakan untuk perlakuan padi (uji morfologi perakaran) adalah larutan
Yoshida yang terdiri atas larutan yang mengandung unsur alumunium (Al),
nitrogen (N), magnesium (Mg), kalium (K), kalsium (Ca) dan unsur mikro lain
yang dibutuhkan tanaman.
3
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah penangas air, inkubator, pipet mikro,
oven, microfuge Beckman, neraca analitik, autoklaf, vorteks, perangkat
elektroforesis, ice maker, kertas aluminium, bak tumbuh padi, infraboard, kertas
saring, alat-alat gelas, plate PCR, mesin pendingin dan mesin PCR PTC-100.
Prosedur Analisis Data
Isolasi DNA Padi (Dellaporta et al. 1983)
Isolasi diawali dengan pengambilan sampel daun padi yang masih muda.
Pengambilan daun padi dilakukan dengan memotong bagian daun padi.
Selanjutnya daun yang telah dipotong dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf
yang telah diberi label berdasarkan nomor pada pot. Tabung Eppendorf yang telah
berisi daun disimpan di dalam freezer untuk selanjutnya dibekukan dengan
nitrogen cair.
Selanjutnya daun padi digerus dan ditambahkan 750 µL bufer ekstraksi.
Bufer ekstraksi terdiri atas 100 mL Tris-HCl (pH 8), 100 mL NaCl, 100 mL
EDTA (pH 8,0), SDS 12,5 g dan ditambahkan akuades (dH2O) hingga volume
akhir mencapai 1000 mL. Setelah itu dipanaskan di dalam water bath selama 20
menit dengan suhu 650C.
Campuran kloroform : isoamilalkohol sebanyak 750 µL dengan
perbandingan 24:1 v/v ditambahkan setelah inkubasi 20 menit. Tabung Eppendorf
selanjutnya dikocok hingga homogen dan dilakukan sentrifus dengan kecepatan
12.000 rpm selama 15 menit. Lapisan atas dipipet dengan hati-hati dan
dipindahkan kedalam tabung Eppendorf yang baru dan ditambahkan etanol
absolut sebanyak 750 µL. Selanjutnya diinkubasi dalam freezer selama 1 jam.
Larutan DNA dan etanol absolut yang telah diinkubasi selanjutnya disentrifus
selama 15 menit 12.000 rpm. Hasil sentrifus berupa pelet dicuci dengan etanol
70% sebanyak 750 µL dan disentrifus kembali dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 10 menit. Supernatan dibuang dan tabung yang berisi pelet dikeringkan
selama 1 hari. Pelet yang telah kering dilarutkan dengan 50 µL air ultrapure untuk
selanjutnya dianalisis.
Analisis Kualitatif dan Kuantitatif DNA Padi (Sambrook et al. 2001)
Kualitas DNA padi diuji dengan menggunakan teknik elektroforesis gel
agarosa 1%. Agarosa 1% dibuat dengan menambahkan 1 gram agarosa dengan
100 ml 10 x TBE dan dipanaskan dalam microwave sampai agarosa larut.
Selanjutnya larutan agarosa dituang dalam cetakan sampai mengeras. Sebanyak
3µL DNA padi hasil isolasi ditambahkan dengan loading dye sebanyak 5µL.
Kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Elektroforesis dilakukan
selama 1 jam dengan menggunakan bufer 0.5 x TBE. Deteksi pita DNA dengan
merendam agarosa selama 10 menit dalam EtBr dan direndam air selama 10 menit.
Selanjutnya hasil isolasi DNA dilihat dengan menggunakan mesin ChemiDoc.
Analisis kuantitatif DNA dilakukan dengan mengencerkan DNA sebanyak
100 kali. Pengenceran dilakukan dengan menambahkan sebanyak 2 µ L DNA
dengan 200 µL akuades. Selanjutnya dimasukkan ke dalam kuvet dan dihitung
absorbansinya pada 260 dan 280.
4
Amplifikasi gen Pup1 dengan PCR
Amplifikasi gen Pup1 dengan menggunakan primer SSR yaitu primer K291. Sampel DNA yang diamplifikasi sebanyak 98 buah yaitu DNA hasil
persilangan Batur x Kasalath (BK), Batur x NIL-C443 (BN). Situ Bagendit x
Kasalath (SK), dan Situ bagendit x NIL-C443 (SN), Campuran reaksi PCR (untuk
1 x reaksi) terdiri atas 10 x bufer PCR dengan MgCl sebanyak 2 µL, dNTPs
sebanyak 2 µL, GC Rich sebanyak 1 µl, ddH2O sebanyak 9 µL, dan Taq
polimerase sebanyak 1 µL. Ke dalam plate PCR dimasukkan 3 µL DNA template
dan 2 µL primer. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR. Tahapan pada
program tersebut diawali dengan denaturasi dengan suhu 94oC selama 5 menit..
Tahap pertama pada suhu 94oC selama 1 menit. Tahap kedua berlangsung selama
1 menit dengan suhu 55oC. Tahap terakhir dengan suhu 72oC selama 2 menit.
Tahap selanjutnya adalah ekstensi akhir. Tahap ini berlangsung selama 7 menit
dengan suhu 72oC. Hasil PCR ini disimpan dalam suhu 40C sampai siap
digunakan untuk elektroforesis.
Elektroforesis Hasil Ampilifikasi Gen Pup1 (Sambrook et al. 2001)
Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan Poliakrilamid Gel
Elektroforesis (PAGE). Gel dibuat dari 60 mL larutan PAGE 8%, 600 µL APS
dan 60 µL TEMED. Larutan dikocok dan dimasukkan kedalam pelat kaca yang
telah disusun terlebih dahulu. Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam
tangki elektroforesis yang berisi 0.5 X TBE. Hasil PCR diinjeksikan ke dalam
sumur sebanyak 4.5 µL dan dilakukan elektroforesis selama 110 menit dengan
tegangan sebesar 80 V. Ke dalam sumur dimasukkan juga DNA marker yang
berguna untuk penentuan ukuran DNA. Untuk mendeteksi gen Pup1 dilakukan
pewarnaan dengan pewarna perak.
Pewarnaan dilakukan dengan merendam gel yang telah dilepas dari kaca
dengan larutan perak yang terdiri atas 0.4 g Perak Nitrat dalam 300 mL ddH2O
selama 8 menit. Selanjutnya gel direndam dalam larutan NaOH dan formaldehid
(4 gr NaOH dalam 300 mL ddH2O ditambahkan 2 mL formaldehid). Perendaman
dilakukan sampai pita pada gel dapat diamati.
Uji Morfologi Perakaran Dengan Cekaman Alumunium (Yoshida et al. 1976)
Tanaman padi hasil persilangan yaitu BC2F6, yang diuji dikecambahkan
terlebih dahulu dalam cawan Petri, sampai tumbuh akar. Selanjutnya ditempatkan
dalam infraboard dan ditutup dengan kertas saring. Kemudian infraboard yang
telah berisi padi ditempatkan dalam bak yang telah berisi larutan Yoshida. Laruan
ini berisi larutan P, Mg, Ca, N dan K. Larutan Yoshida ini terdiri atas konsentrasi
yang berbeda-beda. Seperti yang terlihat pada Tabel 1. Perlakuan ini diulang
sebanyak tiga kali. Sehingga banyaknya bak yang berisi padi berjumlah 12 buah
bak. Tanaman akan dibiarkan tumbuh selama tiga minggu. Setelah itu dilakukan
pengamatan terhadap panjang akar, jumlah akar, dan bobot kering akar serta
jumlah akar. Pengukuran panjang akar dan panjang tajuk dilakukan dengan
menggunkan mistar. Sedangkan sebelum dilakukan pengukuran bobot kering akar
dan tajuk, padi hasil perlakuan dimasukkan kedalam oven sampai kering.
Selanjutnya dilakukan penimbangan bobot kering akar dan tajuk. Data hasil
pengamatan dianalisis menggunakan rancangan acak lengkap.
5
Tabel 1. Komposisi larutan Yoshida
Kondisi
Normal
Cekaman
Al
Mg
(mL)
Perlakuan
0.5 P
10 P
0.5 P + 45 ppm
Al
10 P + 45 ppm
Al
Komposisi larutan Yoshida (dalam 2 liter dH2O)
N
P
Ca
K
Unsur mikro
(mL)
(mL)
(mL)
(mL)
(mL)
2.5
2.5
2.5
2.5
0.125
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
0.125
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
Analisis Data Hasil Pengamatan
Analisis hasil pengamatan dilakukan dengan menggunakan rancangan acak
lengkap. Data yang diperoleh berasal dari 3 kali ulangan dan 4 perlakuan, yaitu
kondisi normal 0.5 P dan 10 P serta kondisi cekaman Al 0.5 + 45 ppm Al dan 10 P
+ 45 ppm Al, maka unit percobaan akan ada sebanyak 12 unit percobaan. Bentuk
model linear dapat dituliskan sebagai berikut :
Yij = µ + τi + εij
dimana : i = 1, 2, 3, dan 4 (jumlah perlakuan)
j = 1, 2, dan 3 (jumlah ulangan)
µ = rataan umum
τi = pengaruh perlakuan ke-i
εij = pengaru perlakuan ke-i ulangan ke-j
Dilanjutkan dengan menggunakan uji ANOVA dan uji Dunnet. Uji Anova
digunakan untuk melihat dalam perlakuan yang diberikan terdapat perbedaan atau
tidak. Sedangkan untuk uji lanjutan dilakukan uji Dunnet. Uji Dunnet biasa
dilakukan untuk membandingkan antara sampel dengan kontrol.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Hasil Isolasi DNA Padi
Hasil isolasi DNA padi persilangan diuji keberadaannya dengan
menggunakan agarosa 1% dan divisualisasikan dengan menggunakan EtBr. Hasil
analisis kualitatif DNA padi hasil persilangan terlihat pada Gambar 1. DNA padi
pada gambar merupakan padi persilangan antara Batur dan NIL-C443 (BN).
Smear terlihat pada sumur 1-16, sedangkan pada sumur 2 tidak terdapat smear.
Smear dapat diakibatkan karena masih adanya zat pengotor seperti protein
atau RNA dan terdegradasinya sebagian DNA hasil ekstraksi. Selain dilakukan uji
kualitatif, dilakukan pula uji kuantitatif. Hal ini untuk memastikan ada tidaknya
pengotor pada sampel DNA dan melihat konsentrasi pada masing-masing sampel.
Berdasarkan hasil pengukuran pada 260 : 280, kemurnian sampel DNA hasil
ekstraksi, terdapat beberapa sampel masih memiliki kemurnian yang rendah, yaitu
masih di bawah 1.8 (Tabel 2). Sedangkan kemurnian yang baik terlihat pada
sampel BN 3 dengan besar absorbansi
260 :
280 yaitu 1.981 (Tabel 2).
Kemurnian sampel dikatakan baik bila nilai absorban 260 : 280 berada pada
kisaran 1.8-2.0.
6
Gambar 1 Elektroforegram beberapa DNA daun padi persilangan Batur
dan NIL C-443 hasil isolasi (lajur 1-16 ).
Tabel 2 Konsentrasi DNA hasil isolasi
Sampel
260
280
BN1
BN3
BN4
BN5
BN6
BN7
BN8
BN14
BN15
BN16
0.164
0.088
0.065
0.075
0.041
0.151
0.026
0.116
0.059
0.026
0.155
0.044
0.051
0.053
0.036
0.083
0.023
0.081
0.039
0.024
260μ 280
1.032
1.981
1.266
1.419
1.140
1.821
1.151
1.421
1.534
1.054
Konsentrasi ( g/mL)
801.327
438.114
324.133
373.002
203.159
753.192
129.542
578.354
298.548
128.603
Amplifikasi Gen Pup1
Amplifikasi gen Pup1 dilakukan untuk mengkonfirmasi keberadaan gen
Pup1 pada DNA padi hasil persilangan. Hasil amplifikasi kemudian diseparasi
dengan teknik elektroforesis vertikal dengan menggunakan gel poliakrilamid 8%.
Hasil elektroforesis diwarnai dengan menggunakan pewarna nitrat perak (Gambar
2 dan 3).
Gen
Pup1
Gambar 2 Elektroforegam persilangan NIL-C443 dan Batur. Marker:
DNA 100 bp, lajur 1 (BT) padi Batur; lajur 2 (kas): padi
Kasalath; lajur 3 (NIL) padi NIL C-443, lajur 4 (NIP) padi
Nipponbare; lajur 5-28 (1-23) padi persilangan NIL-C443
dan Batur.
7
Gen
Pup1
Gambar 3 Elektroforegam persilangan NIL-C443 dan Batur. Marker: DNA 100 bp,
lajur 1 (BT) padi Batur; lajur 2 (kas): padi Kasalath; lajur 3 (NIL) padi
NIL C-443, lajur 4 (NIP) padi Nipponbare; lajur 5-27 (1-22) padi
persilangan Kasalath dan Batur.
Hasil amplifikasi gen Pup1 pada persilangan Batur dengan NIL-C443
(BN) disajikan pada Gambar 2. Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa
keseluruhan sampel mengikuti tetua Kasalath. Pita pada sampel (BN) sebanyak 23
pita menunjukkan kesamaan dengan pita pada padi Kasalath. Hal yang sama
ditunjukkan oleh hasil persilangan Batur dengan Kasalath (BK). Keseluruhan
sampel menunjukkan kemiripan dengan padi Kasalath.
Morfologi perakaran tanaman padi hasil persilangan dengan cekaman
Alumunium
Pengamatan terhadap morfologi perakaran tanaman padi hasil persilangan
dilakukan untuk melihat keefektifan persilangan. Masing-masing padi hasil
persilangan diberi perlakuan dengan kondisi yang sama. Tanaman padi
ditumbuhkan dalam bak berisi larutan Yoshida dengan konsentrasi yang berbedabeda, yaitu 0.5 P, 10 P, 0.5 P+45 ppm Al. dan 10 P+45 ppm Al. Tetua yang
digunakan sebagai pembanding adalah tetua yang tidak toleran terhadap defisiensi
P, yaitu Batur dan Situ Bagendit. Perbedaan nyata terlihat pada tabel jika nilai uji
F < 0.005, sedangkan bila nilai uji F >0.005 sampel dikatakan tidak berbeda nyata.
Perbedaan dilihat dengan membandingkan antara masing-masing galur hasil
persilangan dalam satu perlakuan dan masing-masing galur hasil persilangan
dengan perlakuan yang berbeda.
Hasil Uji F terhadap hasil persilangan Batur dengan Kasalath berdasarkan
panjang akar tidak berbeda nyata (Tabel 2). Begitu pula berdasarkan panjang tajuk
dan jumlah akar. Hal berbeda ditunjukkan pada bobot kering akar dan bobot
kering tajuk. Hasil uji F menunjukkan bahwa pada bobot kering akar, terdapat
perbedaan nyata antara masing-masing galur (0.023). Selain itu dilakukan uji
lanjutan yaitu uji Dunnet. Hasil uji Dunnet untuk persilangan Batur dengan
Kasalath dilampirkan pada Lampiran 3. Uji Dunnet dilakukan dengan
membandingkan antara galur hasil persilangan dengan tetua Batur. Hasil uji
Dunnet menunjukkan perbedaan nyata terlihat pada galur BK nomor 10 dengan
nilai uji Dunnet 23.361 berdasarkan bobot kering akar.
8
Sedangkan pada persilangan Batur dengan NIL-C443 (BN). Berbeda
dengan persilangan Batur dengan Kasalath, perbedaan nyata terlihat pada panjang
akar. Perbedaan nyata terlihat pada sumber keragaman dengan perlakuan dengan
fosfor (P) dengan nilai F sebesar 0.009 pada panjang akar. Hasil uji Dunnet pada
persilangan Batur dengan NIL-C443 (Lampiran 4) menunjukkan adanya
perbedaan nyata pada panjang akar antara tetua Batur dengan BN nomor 7
(10.884) dan BN nomor 18 (11.654). Sedangkan pada persilangan Batur dengan
NIL-C443 (BN). Berbeda dengan persilangan Batur dengan Kasalath, perbedaan
nyata terlihat pada panjang akar. Perbedaan nyata terlihat pada sumber keragaman
dengan perlakuan dengan fosfor (P) dengan nilai F sebesar 0.009 pada panjang
akar. Hasil uji Dunnet pada persilangan Batur dengan NIL-C443 (Lampiran 4)
menunjukkan adanya perbedaan nyata pada panjang akar antara tetua Batur
dengan BN nomor 7 (10.884) dan BN nomor 18 (11.654).
Sedangkan pada persilangan Batur dengan NIL-C443 (BN). Berbeda
dengan persilangan Batur dengan Kasalath, perbedaan nyata terlihat pada panjang
akar. Perbedaan nyata terlihat pada sumber keragaman dengan perlakuan dengan
fosfor (P) dengan nilai F sebesar 0.009 pada panjang akar. Hasil uji Dunnet pada
persilangan Batur dengan NIL-C443 (Lampiran 4) menunjukkan adanya
perbedaan nyata pada panjang akar antara tetua Batur dengan BN nomor 7
(10.884) dan BN nomor 18 (11.654).
Uji Anova di Tabel 2 juga menunjukkan hasil pengamatan pada
persilangan Situ Bagendit dengan Kasalath (SK). Didalam uji ini terlihat
perbedaan nyata terlihat pada panjang akar dengan sumber keragaman perlakuan
P dan dengan sumber keragaman perbandingan anatara perlakuan fosfor dengan
perlakuan cekaman alumunium. Perbedaan nyata lain terlihat pada bobot kering
akar dengan sumber keragaman pada galur hasil persilangan (G) dengan nilai uji F
sebesar 0.0190 . Jumlah akar juga terlihat berbeda nyata pada sumber keragaman
antar perlakuan P (0.020), antara perlakuan fosfor dengan cekaman alumunium
(0.001) dan antar semua perlakuan dengan galur hasil persilangan (0.010). Hasil
uji Dunnet pada Lampiran 5 menunjukkan bahwa pada bobot akar perbedaan
nyata terlihat antara SK nomor 23 (22.560) dengan tetua Situ Bagendit.
Sedangkan pada bobot kering tajuk antara SK 14 (30.472) berbeda nyata dengan
tetua.
Hasil uji Anova terhadap persilangan Situ Bagendit dengan NIL-C443
(SN) terlihat juga pada Tabel 2. Perbedaan nyata terlihat pada panjang akar
dengan sumber keragaman adalah galur hasil persilangan dengan nilai uji F adalah
0.0074. Hal yang sama ditunjukkan pada panjang tajuk dengan sumber keragaman
adalah perlakuan cekaman alumunium (0.030) dan galur hasil persilangan
(