Amplifikasi Gen Bar dan Gen Hpt Terkait Stabilitas Padi Mutan Serta Evaluasi Karakter Agronominya
i
AMPLIFIKASI GEN BAR DAN GEN HPT TERKAIT
STABILITAS PADI MUTAN SERTA EVALUASI
KARAKTER AGRONOMINYA
NETRIA WAHYUNI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
iii
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Amplifikasi Gen bar
dan Gen hpt Terkait Stabilitas Padi Mutan Serta Evaluasi Karakter Agronominya
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2014
Netria Wahyuni
NIM G84100090
ABSTRAK
NETRIA WAHYUNI. Amplifikasi Gen bar dan Gen hpt Terkait Stabilitas
Padi Mutan Serta Evaluasi Karakter Agronominya. Dibimbing oleh
SURYANI dan TRI JOKO SANTOSO.
Sistem transposon Ac/Ds mengandung konstrak sebagai penanda
aktivasi dan berfungsi dalam mengembangkan tanaman mutan yang
menghasilkan perubahan-perubahan fenotipe. Penelitian ini bertujuan
mengamplifikasi gen bar dan gen hpt berkaitan dengan stabilitas padi mutan
transposon Ac/Ds dan perubahan fenotipe berdasarkan karakter agronominya.
Materi tanaman padi yang digunakan untuk penelitian adalah 6 galur padi
IR.64 T2 mutan (total 214 tanaman) dan padi IR.64 sebagai kontrol.
Tanaman-tanaman mutan diisolasi DNA-nya dan diamplifikasi PCR dengan
menggunakan pasangan primer spesifik untuk gen bar dan hpt. Hasil
penelitian menunjukkan ukuran gen bar dan gen hpt masing-masing
berukuran ± 700 bp dan ± 600 bp. Perubahan karakter-karakter agronomi pada
tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 disebabkan adanya insersi elemen
transposon yang mengandung 4x enhancer.
Kata kunci: IR64, karakter agronomi, Transposon Ac/Ds.
ABSTRACT
NETRIA WAHYUNI. Amplification of bar Gene and hpt Gene Related to
Rice Mutant Stability and The Evaluation of it’s Agronomy Character.
Supervised by SURYANI and TRI JOKO SANTOSO.
Transposon Ac / Ds system containing an activation tagging
constructs serves to develop a mutant plant that will produce changes in
phenotype. This study aims to amplify the bar and hpt genes related to the
stability of the mutant rice transposon Ac/Ds and observe the changes in
phenotype based on the agronomy characters. Rice plant materials used for
the study were six mutant T2 rice lines IR.64 (total 214 plants) and IR64
wild type rice as a control. The DNA of mutant plants was isolated and then
amplified by PCR technique using primers specific for the bar and hpt
genes. The results showed that the bar and hpt genes in the rice plant IR.64
mutant T2 with size were ± 700 bp and ± 600 bp. Evaluation of agronomic
characters showed there were changes in these characters of mutant rice
lines IR64 generation T2 that probably caused by the transposon insertion
element containing 4x enhancer.
Keywords: Ac / Ds transposon, agronomic traits, IR64.
iii
AMPLIFIKASI GEN BAR DAN GEN HPT TERKAIT
STABILITAS PADI MUTAN SERTA EVALUASI
KARAKTER AGRONOMINYA
NETRIA WAHYUNI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
iv
i
Judul Skripsi : Amplifikasi Gen Bar dan Gen Hpt Terkait Stabilitas Padi Mutan
serta Evaluasi Karakter Agronominya
Nama
: Netria Wahyuni
NIM
: G84100090
Disetujui oleh
Dr Suryani, SP MSc
Pembimbing I
Dr Tri Joko Santoso, SP MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
ii
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari hingga bulan Mei 2014 ini
adalah Amplifikasi Gen Bar dan Gen Hpt Terkait Stabilitas Padi Mutan Serta
Evaluasi Karakter Agronominya.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Suryani, SP MSc dan Bapak
Dr Tri Joko Santoso, SP MSi selaku dosen pembimbing yang telah banyak
memberikan pengarahan dan saran. Terima kasih kepada bapak Dr Tri Joko
Santoso untuk proyek penelitian dan kesempatan melakukan penelitian sampai
selesai di BB Biogen Cimanggu Bogor. Di samping itu, penghargaan penulis
sampaikan kepada Ibu Nur, Ka Mira, Mba Mariana, Ka Ammar, Wulan beserta
seluruh staf Konservasi Biologi Molekuler BB-Biogen yang telah membantu
selama pengumpulan data penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan
kepada ayah, ibu, kakak serta seluruh keluarga dan teman-teman Biokimia 47
untuk segala doa, kasih sayang dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2014
Netria Wahyuni
iii
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
iii
DAFTAR GAMBAR
iv
DAFTAR LAMPIRAN
iv
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan alat
2
Prosedur Penelitian
2
HASIL
4
Tanaman Padi IR.64 Mutan Generasi T2
4
Kuantitas dan Kualitas DNA Genom Padi
5
Amplifikon PCR Gen bar dan Gen hpt
5
PEMBAHASAN
8
Hasil Isolasi DNA Padi
8
Amplikon Gen bar dan Gen hpt
9
Evaluasi Karakter Agronomi
SIMPULAN DAN SARAN
10
11
Simpulan
11
Saran
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
32
iv
DAFTAR TABEL
1. Galur-galur padi IR.64 mutan generasi T2 dan padi IR.64 tipe liar
(kontrol)
2. Jumlah tanaman padi IR.64 T2 mutan dan padi IR.64 tipe liar (kontrol)
setelah ditanam di bak semai
3. Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi dari beberapa tanaman
perwakilan galur padi IR64 mutan generasi T2
4. Hasil analisis kestabilan beberapa tanaman padi mutan
5. Hasil rekapitulasi analisis PCR gen bar dan hpt pada 6 galur padi IR64
mutan generasi T2
6. Tinggi tanaman, jumlah malai, panjang malai dan panjang daun
bendera padi IR64 T2 mutan
7. Bobot 100 butir, jumlah gabah isi dan jumlah gabah hampa padi IR64
T2 mutan
2
4
5
7
7
7
8
DAFTAR GAMBAR
1. Elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer bar pada
tanaman padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12.2.
2. Elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer hpt pada
tanaman padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12.1.
3. Peta T-DNA genom yang digunakan pada transformasi transposon
Ac/Ds
6
6
9
DAFTAR LAMPIRAN
1. Diagram alur penelitian
2. Konsentrasi dan kemurnian DNA
3. Elektroforegram Sampel Tanaman Padi IR.64 T2 Mutan Hasil
Amplifikasi Menggunakan Primer Bar
4. Elektroforegram Sampel Tanaman Padi IR.64 T2 Mutan Hasil
Amplifikasi Menggunakan Primer Hpt
5. Hasil analisis kestabilan transposon Ds
6. Motif sekuen primer yang digunakan
14
14
21
24
26
31
1
PENDAHULUAN
Kekayaan genom padi dapat dieksplorasi melalui identifikasi gen-gen
penting yang terdapat di dalam genom padi yang berperan dalam menentukan
fenotipe, dan mendapatkan informasi mengenai fungsi gen-gen padi sehingga
kualitasnya dapat ditingkatkan (Jeoung et al. 2002). Menurut Bouchez dan Hofte
(1998) pendekatan yang dilakukan dalam menganalisis fungsi gen ada dua yaitu
forward genetics dan reverse genetics. Pendekatan forward genetics dilakukan
dengan menganalisis fungsi gen dari tanaman mutan kemudian dilanjutkan ke
sekuen gennya, sedangkan pendekatan reverse genetics dilakukan dengan
berpedoman pada informasi sekuen gen yang diketahui.
Transposon merupakan segmen DNA spesifik yang dapat bertransposisi dari
satu lokasi ke lokasi lain di dalam genom sel dengan cara memotong segmen suatu
DNA dan meligasinya (Griffth et al. 1999). Transposon Ac (activator) telah
mengalami delesi pada bagian inverted repeat sehingga bersifat tidak mampu
berpindah, tetapi menghasilkan enzim transposase (otonom) (Greco et al. 2003).
Transposon Ds (dissociation) mengalami delesi pada bagian gen transposase
sehingga tidak menghasilkan enzim transposase (non-otonom) dan mampu
berpindah (mobile) (Brooker 2005). Transposon Ds akan berpindah posisi dalam
genom menuju tempat yang berbeda dan tersisip pada gen-gen fungsional.
Sedangkan elemen Ac akan menyandikan enzim untuk mengaktifkan elemen Ds
selama bertransposisi. Transposon Ds yang terdapat dalam genom tanaman akan
stabil jika tidak disertai dengan transposon Ac (Kolesnik et al. 2004).
Kestabilan mutan diketahui dengan mengidentifikasi gen-gen ketahanan
terhadap antibiotik higromisin (gen hpt) dan ketahanan terhadap herbisida (gen bar)
yang masing-masing berada pada elemen Ac dan elemen Ds. Enzim higromisin
fosfotransferase yang dihasilkan gen hpt memiliki peran dalam mendetoksifikasi
aminosiklitol antibiotik higromisin B. Gen bar (basta resistant) adalah gen yang
membawa ketahanan terhadap fosfinotrisin (PPT), yang merupakan bahan aktif
herbisida bialaphos dan basta (Rodriguez & Nottenburg 2002).
Posisi mutasi yang berbeda-beda di dalam tanaman padi dapat diperoleh
melalui aktivitas perpindahan transposon Ds (Greco et al. 2001). Kestabilan
tanaman mutan berdasarkan ada tidaknya elemen Ac dapat diidentifikasi
menggunakan teknik PCR dengan mengamplifikasi gen bar yang dibawa oleh
elemen Ds dan gen hpt yang dibawa oleh elemen Ac. Tanaman padi IR64 mutan
akan stabil dalam kromosom tanaman apabila gen bar menyisip dan teramplifikasi
setelah pengecekan melaui PCR sedangkan gen hpt tidak teramplifikasi pada
tanaman tersebut. Pengujian tanaman yang menunjukan tidak stabilnya mutan pada
tanaman padi mutan (transposon Ds) akan terus mengalami perubahan fenotipe
pada tanaman padi sampai generasi selanjutnya dan transposon Ds terus menyisip
dan berpindah kekromosom lainnya. Tanaman padi mutan yang stabil akan
mengalami perubahan fenotipe yang sama dari generasi ke generasi selanjutnya.
Penelitian ini bertujuan mengamplifikasi gen bar dan gen hpt berkaitan
dengan stabilitas padi mutan transposon Ac/Ds dan perubahan fenotipe berdasarkan
karakter agronominya. Manfaat penelitian ini adalah diperolehnya galur-galur padi
IR.64 mutan generasi T2 yang stabil yang dapat digunakan sebagai sumber tanaman
2
untuk mengidentifikasi gen-gen penting di bidang pertanian dapat dimanfaatkan
sebagai varietas unggul baru setelah dilakukan pengujian-pengujian lebih lanjut.
METODE
Bahan dan alat
Bahan tanaman yang digunakan untuk penelitian terdiri 6 galur tanaman
padi IR.64 mutan generasi T2 dan 1 galur tanaman padi IR 64 tipe liar dengan total
tanaman sebanyak 239. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah NF water, primer
hpt (higromisin fosfotransferase) dan primer bar (basta resistant), 10x Bufer PCR,
MgCl2, dNTP mix 10 mM, Taq DNA polymerase, gel agarosa, 1x buffer TAE
(Tris HCl-asam asetat-EDTA), loading dye, T4 DNA polymerase (gel red), DNA
hasil PCR, dan marker 1 kb ladder.
Peralatan yang digunakan adalah tabung mikro 2 mL, tabung mikro 1.5 mL,
pipet mikro 1000p, 200p, 20p, 2p dan multichanel mikropipet, tip, oven, microfuge,
neraca analitik, spektrofotometer nanodrop, stirer, vorteks, UV Illuminator
ChemiDoc EQ Biorad, perangkat elektroforesis vertikal, ice maker, labu
Erlenmeyer, microwave, gelas ukur, gelas piala, baki gel agarosa, plate PCR, kulkas
penyimpanan sampel, dan mesin PCR tetrad PTC-225.
Prosedur Penelitian
Penanaman Padi IR.64 Mutan Generasi T2
Tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 yang digunakan sebagai bahan
sampel penelitian memiliki kode tanaman untuk masing-masing galur dengan arti
sebagai berikut, T2 menyatakan tanaman padi mutan generasi T2, 64 sebagai
tanaman padi kultivar IR.64, B2 menyatakan transposon (konstrak B2) dan 4.12.1
menyatakan nama galur tanaman padi mutan. Galur-galur tanaman sebanyak 6
galur digunakan sebagai sampel untuk pengujian kestabilan elemen transposon Dc
di dalam genom tanaman tersebut, dan digunakan untuk mengetahui pengamatan
perubahan karakter agronominya. Total benih tanaman yang digunakan sebanyak
360 bulir padi IR.64 T2 mutan (6 galur padi IR.64 mutan generasi T2) dan 25 bulir
(1 galur) padi IR.64 tipe liar yang digunakan sebagai kontrol (Tabel 1).
Tabel 1 Galur-galur padi IR.64 mutan generasi T2 dan padi IR.64 tipe liar (kontrol)
Kode Tanaman
T2.64.B2.4.12.1
T2.64.B2.4.12.2
T2.64.B2.4.5.1
T2.64.B2.4.5.2
T2.64.B2.5.3.8
T2.64.B2.5.3.2
Kontrol
Jumlah benih
60 benih
60 benih
60 benih
60 benih
60 benih
60 benih
25 benih
3
Isolasi DNA Daun Padi (Doyle & Doyle 1987)
Sampel daun dipotong dari tanaman padi sepanjang 10 cm dan dimasukkan
ke dalam tabung mikro 2 mL. Sampel daun bersama dengan tabung direndam ke
dalam nitrogen cair dan digerus dengan penggerus (sumpit bambu) sampai halus
berbentuk serbuk. Hasil gerusan kemudian ditambahkan bufer CTAB sebanyak
1000 µL, dicampur dan kemudian diinkubasi pada suhu 65oC selama 15 menit pada
penangas air (setiap 5 menit tabung dibolak-balik). Setelah itu sampel didinginkan
pada suhu ruang, dan kemudian ditambahkan dengan natrium asetat 3M sebanyak
100 µL dan chisam (perbandingan klorofom:isoamil sebanyak 24:1) sebanyak 1
mL. Campuran kemudian dibolak-balik secara perlahan-lahan kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit.
Supernatan di ambil dan dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 mL yang
baru dan kemudian ditambahkan natrium asetat sebanyak 1/10 µL volume
supernatan dan isopropanol sebanyak 2/3 µL volume supernatan. Campuran
kemudian di bolak-balik secara perlahan-lahan untuk mempresipitasi DNA. Sampel
disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan
dibuang perlahan-lahan agar pelet DNA tidak ikut terbuang. Pelet DNA yang
terbentuk ditambahkan etanol 70% sebanyak 200 µL dan disentrifugasi pada
kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya supernatan dibuang dan pelet
DNA dikeringkan di oven pada suhu 60oC sampai kering. Sampel DNA yang
diperoleh kemudian dimurnikan dari RNA-nya dengan ditambahkan TE-RNase
sebanyak 50 µL dan kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit, setelah
itu DNA disimpan pada suhu -20oC.
Analisis Kuantitatif DNA Genom dengan Nanodrop (Thermo Fisher Scientific
2009)
Sebanyak 2 μL larutan buffer TE dimasukkan ke dalam lubang ukur sebagai
blanko. Setelah itu, lubang ukur dibersihkan dengan mengelap menggunakan kertas
tisu. Kemudian, sampel DNA sebanyak 2 μL dimasukkan ke dalam lubang ukur dan
diukur konsentrasinya mengikuti prosedur pengukuran dari alat nanodrop tersebut.
Hasil pengukuran akan muncul dalam satuan konsentrasi ng/μL. Nilai kemurnian
DNA dapat dilihat berdasarkan nilai rasio pembacaan Å260/Å280.
Amplifikasi Gen bar dan Gen hpt dengan PCR (Trijatmiko et al. 2011)
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan dua pasang primer yang
spesifik terhadap sampel yang digunakan yaitu primer untuk gen ketahanan basta
(bar) dan gen ketahanan antibiotik higromisin (hpt). Sekuen primer hpt dan bar
yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 6. Total volume reaksi PCR di dalam
satu tabung adalah 10 μL dengan komposisi 3 μL NF Water, 5 μL KAPA2G, 0.5 μL
primer forward (5 uM), 0.5 μL primer reverse (5 uM), 0.5 μL DMSO, dan 1 μL
DNA cetakan. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR. Profil PCR yang
digunakan adalah pre-denaturasi 940C selama 5 menit, denaturasi 940C selama 30
detik, penempelan primer 670C untuk primer bar dan 600C untuk primer hpt selama
30 detik, dan pemanjangan primer 720C selama 30 detik dengan pengulangan
sebanyak 30 siklus.
4
Analisis Produk PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa (Sambrook &
Russell 2001)
Sebanyak 1.2 gram agarosa dicampur dengan 120 mL 1x bufer TAE
(konsentrasi gel 1%). Larutan tersebut dipanaskan dalam microwave selama 2
menit. Agarose yang sudah terlarut dimasukkan ke dalam cetakan agar yang sudah
diberi cetakan sumur. Setelah gel agarosa padat, gel dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis yang berisi 1x bufer TAE. Sebanyak 5 μL produk PCR dicampur
dengan 2 μL loading dye kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Penanda
migrasi (marker) 1 kb ladder juga dimasukan ke dalam sumur gel yang lain. Tahap
selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan voltase 75 volt selama 40 menit. Hasil
elektroforesis gel agarose divisualisasi menggunakan chemidoc gel system.
Analisis Kestabilan Transposon Ds
Data kemunculan pita-pita DNA hasil PCR menggunakan primer hpt dan
bar digunakan untuk menentukan kestabilan transposon Ds di dalam tanaman padi
IR64 mutan. Tanaman padi IR64 mutan generasi T2 dikatakan stabil apabila data
hasil elektroforegram menunjukan hasil positif untuk primer bar dan negatif untuk
primer hpt.
Evaluasi Karakter Agronomi Padi Mutan
Pengamatan karakter-karakter agronomi padi dilakukan terhadap 6 galur
padi IR.64 T2 mutan dan 1 galur IR.64 tipe liar (kontrol). Parameter yang diamati
adalah tinggi tanaman, umur berbunga, jumlah malai per tanaman, jumlah biji isi
dan hampa per malai, panjang malai, jumlah anakan, panjang daun bendera, bobot
100 butir. Data hasil pengamatan diuji menggunakan analisis ragam dengan
software statistik SAS 7 dan uji lanjut duncan.
HASIL
Tanaman Padi IR.64 Mutan Generasi T2
Galur-galur padi IR64 mutan generasi T2 yang ditanam di rumah kaca
menunjukkan bahwa dari sebanyak 60 benih per galur tidak semuanya dapat
tumbuh menjadi tanaman. Total tanaman yang tumbuh dari masing-masing galur
ditampilkan pada Tabel 2.
Tabel 2 Jumlah tanaman padi IR.64 T2 mutan dan padi IR.64 tipe liar (kontrol)
setelah ditanam di bak semai
Kode Tanaman
T2.64.B2.4.12.1
T2.64.B2.4.12.2
T2.64.B2.4.5.1
T2.64.B2.4.5.2
T2.64.B2.5.3.8
T2.64.B2.5.3.2
Kontrol
Tanaman Normal
20 Tanaman
25 Tanaman
46 Tanaman
26 Tanaman
51 Tanaman
46 Tanaman
25 Tanaman
Tanaman Albino
11 Tanaman
9 Tanaman
3 Tanaman
16 Tanaman
4 Tanaman
6 Tanaman
-
Tanaman Mati
29 Tanaman
26 Tanaman
11 Tanaman
18 Tanaman
5 Tanaman
8 Tanaman
-
5
Kuantitas dan Kualitas DNA Genom Padi
Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA pada tanaman padi
IR.64 T2 mutan dan tanaman padi IR.64 tipe liar (kontrol) ditunjukkan pada Tabel
3. Data yang ditampilkan merupakan wakil dari setiap galur (satu galur terdiri dari
dua tanaman), adapun data secara lengkap disajikan pada bagian lampiran. Galur
padi mutan T2.64.B2.5.3.2.9 memiliki konsentrasi DNA yang paling rendah (82.4
ng/ul) dan memiliki kemurnian DNA yang rendah (1.8) jika dibandingkan dengan
galur tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 yang lainnya dan kontrol. Beberapa
galur tanaman padi menunjukan nilai kemurnian yang baik pada kisaran 1.8-2.0
yang berarti bebas dari kontaminan protein maupun RNA. DNA hasil isolasi dari
enam galur padi IR.64 T2 mutan dan satu galur padi IR.64 tipe liar (kontrol)
selanjutnya digunakan sebagai cetakan pada proses amplifikasi PCR untuk
mendeteksi keberadaan gen bar dan hpt menggunakan primer spesifik gen.
Tabel 3 Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi dari beberapa tanaman
perwakilan galur padi IR64 mutan generasi T2
Sampel
T2.64.B2.4.12.1.15
T2.64.B2.4.12.1.16
T2.64.B2.4.12.2.14
T2.64.B2.4.12.2.15
T2.64.B2.4.5.1.4
T2.64.B2.4.5.1.5
T2.64.B2.4.5.2.1
T2.64.B2.4.5.2.2
T2.64.B2.5.3.8.4
T2.64.B2.5.3.8.5
T2.64.B2.5.3.2.9
T2.64.B2.5.3.2.10
IR.64 Kontrol 1
IR.64 Kontrol 2
Konsentrasi
2190
1792.3
650.8
457.8
1278.7
858.7
1180.1
534
486
376.9
82.4
627.6
441.2
689.5
A 260/280
2.0
2.0
1.9
1.8
2.0
2.0
2.0
1.9
1.9
1.9
1.8
1.9
1.9
1.9
Amplifikon PCR Gen bar dan Gen hpt
Gen bar dan hpt sebagai marka seleksi yang digunakan untuk melihat
kestabilan tanaman-tanaman padi IR.64 mutan generasi T2. Kedua gen pada
tanaman diamplifikasi dengan menggunakan primer spesifik terhadap keberadaan
gen bar dan primer spesifik terhadap gen hpt. Berdasarkan data hasil amplifikasi
PCR diketahui bahwa sebagian besar tanaman-tanaman padi IR.64 mutan generasi
T2 menunjukkan hasil positif setelah diamplifikasi dengan primer bar yaitu
diindikasikan dengan terbentuknya fragmen DNA berukuran ±700 bp. Hasil
amplifikasi PCR terhadap gen bar diambil perwakilan pada tanaman-tanaman
mutan galur T2.64.B2.4.12.2 dan ditampilkan pada Gambar 1. Hasil amplifikasi
menunjukkan bahwa dari 10 tanaman mutan, 9 diantaranya positif mengandung gen
bar sedangkan tanaman negatif terhadap pengujian gen bar yaitu tanaman nomor
13 (T2.64.B2.4.12.2.20). Sementara itu, hasil amplifikasi PCR dengan primer
spesifik bar pada galur-galur yang lain ditampilkan pada lampiran.
Hasil amplifikasi DNA padi dengan primer hpt pada padi galur
T2.64.B2.4.12.1 nomor (4-15 dan 18-20) menyatakan hasil adanya gen hpt yang
diindikasikan dengan terbentuknya pita DNA hasil amplifikasi berukuran 600 bp
6
(Gambar 2). Adapun pada tanaman nomor 16 dan 17 tidak mengandung gen hpt
karena tidak terbentuk pita DNA dengan ukuran yang diharapkan. Sementara itu,
hasil amplifikasi PCR dengan primer gen hpt pada galur-galur yang lain
ditampilkan pada lampiran.
Gambar 1 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer bar pada
tanaman padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12.2. Marker, plasmid,
kontrol (IR64 tipe liar), tanaman padi mutan nomor 4-12 positif gen bar,
sampel nomor 13 negatif gen bar
Gambar 2 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer hpt pada
tanaman padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12.1. Marker, plasmid,
kontrol (IR.64 tipe liar), tanaman padi nomor 4-15 dan 18-20 positif
mengandung hpt, tanaman padi nomor 16 dan 17 negatif hpt
Stabilitas Transposon Ds pada Tanaman Padi IR.64 Mutan Generasi T2
Hasil analisis kestabilan tanaman-tanaman mutan padi IR.64 mutan generasi
T2 disajikan pada Tabel 4. Data yang ditampilkan merupakan perwakilan tanaman
dari tiap-tiap galur dan setiap galur diambil perwakilan 2 sampel tanaman.
Tanaman-tanaman mutan padi yang telah stabil diindikasikan dengan positif gen
bar dan negatif gen hpt. Hal ini menunjukan bahwa pada tanaman-tanaman mutan
yang stabil sudah tidak mempunyai elemen transposon Ac (negatif hpt) namun
7
masih mengandung elemen transposon Ds (positif bar). Hasil analisis PCR untuk
semua tanaman pada 6 galur padi IR.64 mutan generasi T2 dengan jumlah total 214
tanaman menunjukkan bahwa 94 tanaman telah stabil tranposon Ds di dalam genom
tanaman (Tabel 5).
Tabel 4 Hasil analisis kestabilan beberapa tanaman padi mutan
Padi Mutan
T2.64.B2.4.12.1.15
T2.64.B2.4.12.1.16
T2.64.B2.4.12.2.14
T2.64.B2.4.12.2.15
T2.64.B2.4.5.1.4
T2.64.B2.4.5.1.5
T2.64.B2.4.5.2.1
T2.64.B2.4.5.2.2
T2.64.B2.5.3.8.4
T2.64.B2.5.3.8.5
T2.64.B2.5.3.2.9
T2.64.B2.5.3.2.10
Gen bar
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Gen hpt
+
+
+
+
-
Kestabilan
Tidak ada mutan
Stabil
Stabil
Tidak stabil
Stabil
Tidak stabil
Stabil
Tidak stabil
Tidak stabil
Stabil
Tidak stabil
Stabil
Tabel 5 Hasil rekapitulasi analisis PCR gen bar dan hpt pada 6 galur padi IR64
mutan generasi T2
Nama galur
T2.64.B2.4.12.1
T2.64.B2.4.12.2
T2.64.B2.4.5.1
T2.64.B2.4.5.2
T2.64.B2.5.3.8
T2.64.B2.5.3.2
Jumlah
Positif bar
(stabil)
4
2
6
6
33
43
94
Jumlah tanaman
Positif bar
Positif hpt
dan hpt
1
8
1
22
3
34
0
20
0
18
0
0
5
102
Negatif bar
dan hpt
7
0
3
0
0
3
13
Total
tanaman
20
25
46
26
51
46
214
Evaluasi Karakter Agronomi Padi Mutan
Hasil analisis menunjukkan bahwa karakter agronomi seperti tinggi
tanaman, jumlah malai, panjang malai dan panjang daun bendera, jumlah gabah
hampa dan gabah isi, serta bobot 100 butir menunjukkan karakter agronomi pada
tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 lebih baik dibandingkan dengan tanaman
padi kontrol pada taraf uji beda nyata 5% pengujian lanjutan duncan (Tabel 6 dan
Tabel 7). Dari hasil pengamatan diketahui bahwa terdapat dua galur padi mutan
yang mempunyai karakter agronomi tinggi tanaman, jumlah malai, panjang malai,
panjang daun bendera berbeda nyata dengan kontrol yaitu galur F dan G (Tabel 6).
Hasil analisis karakter komponen hasil tanaman padi IR.64 T2 mutan
dibandingkan dengan kontrol disajikan pada Tabel 7. Bobot 100 butir dari semua
galur padi mutan berbeda nyata dengan kontrol. Semua galur padi mutan
mempunyai bobot 100 butir yang lebih rendah dibandingkan dengan kontrol.
Sementara itu, jumlah gabah isi dan hampa untuk beberapa galur padi mutan
berbeda nyata dengan kontrol. Satu galur mutan yaitu mutan G mempunyai jumlah
8
gabah yang secara nyata lebih tinggi dari kontrol dan semua galur padi mutan
mempunyai jumlah gabah hampa yang lebih tinggi dari kontrol.
Tabel 6 Tinggi tanaman, jumlah malai, panjang malai dan panjang daun bendera
padi IR64 T2 mutan
Varietas
Kontrol IR.64 (A)
T2.64.B2.4.12.1
(B)
T2.64.B2.4.12.2
(C)
T2.64.B2.4.5.1 (D)
T2.64.B2.4.5.2 (E)
T2.64.B2.5.3.8 (F)
T2.64.B2.5.3.2 (G)
Keterangan:
88.53b
89.73b
Panjang
Jumlah
Malai (cm)
Daun
Malai (n=1) (n=5)
bendera
(cm)
(n=5)
21.47a
25.72b
34c
a
b
21.47
25.67
39.39b
94.77a
22.55a
26.97a
40.34ab
95.02a
96.11a
95.77a
96.99a
21.41a
21.83a
18.20b
16.84b
26.53ab
27.16a
27.02a
27.48a
39.64ab
41.50ab
40.61ab
41.80a
Tinggi tanaman
(cm) (n=1)
a dan b
Angka-angka pada kolom yang diikuti huruf yang sama dan menunjukkan hasil
yang tidak berbeda nyata pada taraf beda nyata 5% uji Duncan. n menunjukan
banyak ulangan perlakuan.
Tabel 7 Bobot 100 butir, jumlah gabah isi dan jumlah gabah hampa padi IR64 T2
mutan
Varietas
Kontrol IR.64 (A)
T2.64.B2.4.12.1 (B)
T2.64.B2.4.12.2 (C)
T2.64.B2.4.5.1 (D)
T2.64.B2.4.5.2 (E)
T2.64.B2.5.3.8 (F)
T2.64.B2.5.3.2 (G)
Bobot 100 butir (g)
(n=1)
2.44a
2.11c
2.28b
2.29b
2.23b
2.24b
2.18bc
Jumlah Gabah
Isi (n=5)
Hampa (n=5)
112.17bc
97.25c
112.52bc
103.40bc
101.49c
118.26b
137.30a
24.40c
82.24ab
79.48ab
74.40b
91.31a
77.93ab
70.66b
Keterangan: a,b,cAngka-angka pada kolom yang diikuti huruf yang sama dan menunjukkan hasil tidak
berbeda nyata pada taraf beda nyata 5% uji Duncan. n menyatakan banyaknya
ulangan perlakuan.
PEMBAHASAN
Hasil Isolasi DNA Padi
Isolasi DNA daun padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12(1),
T2.64.B2.4.12(2), T2.64.B2.4.5(1), T2.64.B2.4.5(2), T2.64.B2.5.3(8) dan
T2.64.B2.5.3(2) bertujuan untuk mendapatkan DNA murni. Hasil isolasi DNA
tanaman padi selanjutnya diuji menggunakan nanodrop untuk mengetahui kualitas
atau kemurnian DNA dan konsentrasi DNA. Uji kuantitas dan kualitas DNA dari 6
galur tanaman padi IR.64 T2 mutan dan tanaman padi IR64 tipe liar (kontrol)
menunjukkan bahwa sebagian besar sampel DNA memiliki kemurnian yang baik
9
pada kisaran nilai 1.8-2.0. Konsentrasi hasil pengukuran cukup untuk digunakan
sebagai cetakan pada tahap amplifikasi dengan teknik PCR. Kontaminasi RNA dan
protein yang terdapat di dalam beberapa sampel tidak membutuhkan proses
pemurnian atau isolasi ulang. Hal ini dikarenakan RNA dan protein yang terdapat di
dalam sampel DNA akan terdegradasi pada saat proses PCR terutama pada tahapan
denaturasi. Kontaminan baik RNA maupun protein yang terdapat di dalam sampel
DNA konsentrasinya sangat kecil sehingga dapat diabaikan dan tidak berpengaruh
terhadap proses amplifikasi PCR (Sambrook et al. 2001).
Amplikon Gen bar dan Gen hpt
Konfirmasi keberadaan elemen transposon Ac/Ds di dalam tanaman padi
dilakukan dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) melalui amplifikasi gen
bar dan gen hpt. Dari informasi keberadaan elemen Ac dan Ds dapat digunakan
untuk mengetahui stabilitas tanaman padi IR64 mutan generasi T2. Elektroforesis
hasil amplifikasi PCR pada sampel DNA padi mutan generasi T2 dilakukan
menggunakan gel agarosa 1%. Hasil elektroforesi gel agarose terlihat pada Gambar
1 dan Gambar 2. Agarosa memiliki resolusi pemisahan lebih rendah dibandingkan
dengan pemisahan menggunakan poliakrilamid, kisaran pemisahan lebih besar dan
pengujian kualitatif DNA lebih baik (Sambrook et al. 2001).
Primer bar digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan elemen transposon
Ds sedangkan primer hpt untuk mengidentifikasi keberadaan transposon Ac di
dalam tanaman. Hal ini dikarenakan gen bar berada satu fragmen dengan elemen
Ds sedangkan gen hpt (hyg) berada satu fragmen dengan elemen Ac (Gambar 3).
Hasil analisis PCR menggunakan primer bar pada tanaman IR.64 T2 mutan
menunjukkan hasil positif apabila terbentuk amplikon gen bar yang berukuran ±
700 bp sedangkan primer hpt menunjukkan hasil positif apabila terbentuk amplikon
dengan ukuran 600 bp.
Hasil analisis PCR menunjukkan bahwa elemen transposon Ac dan Ds masih
tersisip di dalam genom atau kromosom galur-galur tanaman padi IR.64 T2 mutan.
Berdasarkan hasil PCR gen bar dan gen hpt, dapat diketahui sampel tanamantanaman mutan padi yang stabil. Tanaman IR.64 mutan generasi T2 telah stabil
trasnposon Ds apabila hasil amplifikasi PCR positif dengan primer bar dan negatif
dengan primer hpt. Secara umum, hasil analisis PCR pada 6 galur padi IR64 mutan
generasi T2 diperoleh sebanyak 94 dari total 214 tanaman (43,9%) yang telah stabil
yang diindikasikan dengan hasil PCR positif pada gen bar saja (Tabel 5).
Gambar 3. Peta T-DNA genom yang digunakan pada transformasi transposon
Ac/Ds (Trijatmiko et al. 2005)
10
Menurut Greco et al (2001) untuk memperoleh tanaman mutan yang
diinginkan diperlukan transposon yang stabil, sehingga tidak terjadi perpindahan ke
kromosom lain. Kualitas pita-pita hasil elektroforegram yang dihasilkan cukup
baik, karena hanya sedikit intensitas fragmen smear (Gambar 1 dan Gambar 2).
Fragmen ini muncul karena terpotongnya untaian DNA utuh penyusun kromosom
selama ekstraksi DNA. Fragmen DNA terpotong disebabkan kerusakan mekanis
karena penggerusan, ataupun aktifitas enzim selama isolasi, konsentrasi DNA yang
tinggi, dan penggunaan voltase yang terlalu besar (Jamsari 2007).
Evaluasi Karakter Agronomi
Pengamatan tinggi tanaman dilakukan pada waktu tanaman memiliki malai
dan bulir malai padi berisi padat. Tinggi tanaman diukur dari permukaan tanah
sampai ujung daun tertinggi. Evaluasi karakter tinggi tanaman menunjukkan bahwa
semua galur padi mutan mengalami perubahan tinggi tanaman yaitu lebih tinggi
apabila dibandingkan dengan kontrol kecuali untuk galur B (Tabel 6). Evaluasi
karakter jumlah malai menunjukkan bahwa empat galur padi mutan mempunyai
jumlah malai tidak berbeda nyata dengan kontrol (galur B, C, D dan E), sementara
2 galur lainnya (galur F dan G) mempunyai jumlah malai yang lebih sedikit
dibanding kontrol (Tabel 6). Panjang malai, empat galur padi mutan mempunyai
malai yang lebih panjang dibandingkan dengan kontrol. Panjang daun bendera 6
galur tanaman padi IR.64 T2 mutan menunjukan hasil yang berbeda nyata pada
taraf beda nyata 5% yaitu lebih panjang dibandingkan tanaman padi IR.64 kontrol.
Peralihan dari fase vegetatif ke fase generatif tanaman padi ditunjukan dengan
tanaman padi yang mulai berbunga. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa umur
berbunga padi IR.64 T2 mutan (84 hari) lebih cepat dibandingkan tanaman IR.64
kontrol positif (90 hari). Perbedaan pembungaan tanaman merupakan sifat
agronomi yang dipengaruhi faktor genetik dan fisiologi. Sehingga diduga terjadi
akumulasi alel-alel dari tetua pada individu (Trijatmiko 2001). Bobot 100 butir padi
IR.64 kontrol (2.44 g) lebih besar dibandingkan 6 galur tanaman padi IR.64 T2
mutan. Hasil analisis menunjukkan bobot 100 bulir gabah untuk masing-masing
galur (6 galur) padi IR.64 mutan berbeda nyata dengan bobot IR.64 kontrol karena
bobot kontrol lebih berat, sedangkan perbandingan terhadap sesama galur mutan
menunjukan hasil tidak berbeda nyata pada taraf uji lanjut 5%. Bobot IR.64 T2
mutan dan bobot bulir IR64 kontrol masih lebih kecil dibandingkan bobot bulir padi
ideal (2.8-3.0 g) (Ma et al. 2006).
Tanaman padi ideal memiliki jumlah gabah berkisar antara 180-240, dengan
gabah isi lebih dari 85 persen (Ma et al. 2006). Hasil analis lanjut pada taraf 5% uji
duncen gabah isi menunjukkan jumlah gabah isi terbesar pada galur padi mutan
T2.64.B2.5.3.2 (G) dan berbeda nyata terhadap IR.64 kontrol dan galur mutan
lainnya (Tabel7). Hasil pengamatan gabah hampa menunjukkan bahwa padi IR.64
T2 mutan pada galur T2.64.B2.4.5.2 (E) memiliki jumlah gabah hampa terbanyak
serta berbeda nyata terhadap gabah galur T2.64.B2.5.3.2, T2.64.B2.4.5.1 dan IR64
kontrol (Tabel7). Hasil analisis pada panjang daun bendera (Tabel 6) dengan hasil
pengukuran terpanjang pada galur mutan G yang berbeda nyata terhadap IR.64
kontrol dan galur mutan B pada taraf uji lanjut 5%.
Hasil penelitian Peng et al (2008) menunjukkan bahwa untuk meningkatkan
hasil padi tipe baru dibutuhkan tetua yang memiliki karakter agronomi seperti
tanaman yang tinggi, jumlah gabah per malai dan ukuran malai yang besar. Hasil
11
analisis karakter agronomi tanaman padi IR.64 T2 mutan dan IR.64 kontrol telah
menunjukan hasil yang sesuai dengan hasil penelitian Peng et al (2008) karena hasil
pengujian tinggi tanaman, jumlah gabah per malai dan ukuran malai tanaman padi
IR.64 T2 mutan yang lebih besar dibandingkan IR.64 kontrol. Perubahanperubahan karakter agronomi diduga disebabkan oleh adanya insersi elemen
transposon yang mengandung 4x enhancer pada segmen-segmen kromosom yang
berada dekat dengan gen-gen yang mungkin terkait dengan karakter-karakter
agronomi.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen bar dan gen hpt di dalam tanaman padi IR.64 T2 mutan dapat
diamplifikasi menggunakan primer spesifik gen bar dan gen hpt dan menghasilkan
amplikon masing-masing berukuran ± 700 bp dan ± 600 bp. Hasil analisis PCR
pada 6 galur padi IR64 mutan generasi T2 diperoleh sebanyak 94 dari total 214
tanaman (43,9%) yang telah stabil yang diindikasikan dengan hasil PCR positif
pada gen bar saja. Evaluasi karakter-karakter agronomi menunjukkan telah terjadi
perubahan karakter-karakter tersebut pada tanaman padi IR64 mutan generasi T2.
Perubahan-perubahan tersebut kemungkinan diduga disebabkan oleh adanya insersi
elemen transposon yang mengandung 4x enhancer pada segmen-segmen kromosom
yang berada dekat dengan gen-gen yang mungkin terkait dengan karakter-karakter
agronomi.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi gen-gen yang
berhubungan dengan perubahan-perubahan karakter agronomi pada generasi
tanaman padi IR64 mutan berikutnya.
DAFTAR PUSTAKA
Abdullah B, Tjokrowidjojo S, Kustianto B, Daradjat AA. 2005. Pembentukan padi
varietas unggul tipe baru. Penelitian Pertanian 24(1):1-7.
Bouchez D, H Hofte. 1998. Functional genomic in plants. Plant Physiol. 118:725732.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2011. Berita Resmi Statistik. Jakarta: BPS
Brooker R J. 2005. Analysis and Principle. 2nd ed. New York (US): McGraw-Hill
companies, Inc.
Griffith AJF. 1999. An Introduction to Genetic Analysis. Ed ke-7. New York (US):
W.H. Freeman.
Greco R, PBF Ouwerkerk, AJC Taal, C Favalli, T Begiristain, P Puigmonech,
L
Colombo, JHC Hoge, A Pereira. 2001. Early and multiple Ac
transpositions in rice suitable for efficient insertional mutagenesis. Plant
Molecular Biology 46: 215-227.
12
Greco R, PBF Ouwerkerk, RJ De Kam, C Sallaud, C Favalli, L Colombo, E
Guiderdoni, AH Meijer, JHC
Herawati R, Purwoko BS, Dewi IS. 2009. Keragaman genetik dan karakter
agronomi galur haploid padi gogo dengan sifat-sifat tipe baru hasi kultur
antera. J Agron Indonesia.37(2):87-94.
Hoge, A Pereira. 2003. Transpositional behavior of an Ac/Ds system for reverse
genetics in rice. Theory Applied Genetics 108: 10-24.
Jeoung DH, S An, HG Kang, S Moon, J Han, S Park, HS Lee, K An, and G
An. 2002. T-DNA insertional mutagenesis for activation tagging in rice.
Plant Physiology 130: 1636-1644.
Kolesnik T, I Szeverenyi, D Bachman, CS Kumar, S Jiang, R Ramamoorthy,
M Cal, ZG Ma, V Sundaresan, S Ramachandran. 2004. Establishing
an efficient Ac/Ds tagging system in rice. The Plant Journal 37: 301314.
[LITBANG] Balai Penelitian Bahan Pangan. 2006. Mengenal padi VUTB
Fatmawati. http://jakarta.litbang.deptan.go.id/klinikagribisnis. J Litbang
12:1-6.
Ma J, W Ma, D Ming, S Yang, Q Zhu. 2006. Characteristics of rice plant with
heavy panicle. Agricultural Sciences 5(12):101-105.
Peng S, GS Khush, P Virk, Q Tang, and Y Zou. 2008. Progress in ideotype
breeding in increase rice yield potential. Field Crop Res 108:32-38.
Rahmawati S. 2006. Status perkembangan dan perbaikan genetik padi
menggunakan teknik transformasi Agrobacterium. AgroBiogen 2: 364-375.
Rodriguez RC, Nottenburg C. 2003. Antibiotic resistance genes and their use in
genetic transformation especially in plants. [internet]. [diunduh pada 2014
Juni 15]. Tersedia pada http:www.cambiaip.org/whitepapers/TransgenidAb.
Sambrook J, DW Russel. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New
York (US): Cold-Spring Harbor Laboratory Press.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrpphotometer V1.0
User Manual. Wilmington (US): Thermo Fischer Scientific.
Trijatmiko KR, GV Arkel, A Karaba, EV Enckevort, A Pereira. 2005. Activation
tagging using En-I and Ac-Ds maize transposon systems in rice. Dalam
Comparative Analysis of Drought Resistance Genes in Arabidopsis and
Rice. Ph.D. Thesis Wageningen University, Wageningen, The Netherland
with Summaries in English, Dutch and Indonesian. p. 111-128.
Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH, Kohli A. 2011. Molecular Analysis
of Transgenic Plants. NewYork (US): Springer.
Webb KJ, Morris P. 1992. Methodologies of plant transformation, In:
Gatehouse AMR, Hilder VA, Boulter D, editor. Plant Genetic
Manipulation for Crop Protection. United Kingdom (GB): CAB
International.
13
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Diagram Alur Penelitian
Penanaman benih (IR64 mutan generasi T2 dan
IR64 kontrol)
Isolasi DNA padi
Analisis kuantitatif dan kualitatif DNA
Amplifikasi DNA dengan PCR
Elektroforesis
Identifikasi karakter unggul agronomi
Analisis data
15
Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian DNA
Sampel
T2.64.B2.4.12.1.1
Konsentrasi
A 260/280
846.1
1.93
T2.64.B2.4.12.1.2
623.5
1.92
T2.64.B2.4.12.1.3
1081.5
1.92
T2.64.B2.4.12.1.4
425.4
1.89
T2.64.B2.4.12.1.5
611.3
1.88
T2.64.B2.4.12.1.6
657.4
2.02
T2.64.B2.4.12.1.7
792.1
1.92
T2.64.B2.4.12.1.8
991.3
1.93
T2.64.B2.4.12.1.9
500.4
1.89
T2.64.B2.4.12.1.10
902.4
1.91
T2.64.B2.4.12.1.11
892.7
1.92
T2.64.B2.4.12.1.12
1417.6
1.89
T2.64.B2.4.12.1.13
578.8
1.9
T2.64.B2.4.12.1.14
651.8
1.9
T2.64.B2.4.12.1.15
2190
1.96
T2.64.B2.4.12.1.16
1792.3
2
T2.64.B2.4.12.1.17
943.3
1.94
T2.64.B2.4.12.1.18
932.9
1.94
T2.64.B2.4.12.1.19
652.5
1.93
T2.64.B2.4.12.1.20
560
1.88
T2.64.B2.4.12.2.1
1510.1
1.93
T2.64.B2.4.12.2.2
881
1.98
T2.64.B2.4.12.2.3
1020.9
1.96
T2.64.B2.4.12.2.4
711.2
1.87
T2.64.B2.4.12.2.5
1312.1
1.94
T2.64.B2.4.12.2.6
610.6
1.93
T2.64.B2.4.12.2.7
893.6
1.91
T2.64.B2.4.12.2.8
T2.64.B2.4.12.2.9
257.5
424.4
1.87
1.9
T2.64.B2.4.12.2.10
486.2
1.9
T2.64.B2.4.12.2.11
729.5
1.93
T2.64.B2.4.12.2.12
1074.9
1.94
T2.64.B2.4.12.2.13
963
1.96
T2.64.B2.4.12.2.14
650.8
1.92
T2.64.B2.4.12.2.15
457.8
1.77
T2.64.B2.4.12.2.16
1197.7
1.95
T2.64.B2.4.12.2.17
1412
1.48
T2.64.B2.4.12.2.18
585.2
1.28
T2.64.B2.4.12.2.19
638.2
T2.64.B2.4.12.2.20
779.2
1.89
2
T2.64.B2.4.12.2.21
T2.64.B2.4.12.2.22
2602.1
883.3
1.69
1.74
16
Lanjutan Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian...
Sampel
Konsentrasi
A 260/280
T2.64.B2.4.12.2.23
1103.6
1.95
T2.64.B2.4.12.2.24
1392.6
2
T2.64.B2.4.12.2.25
558.4
1.91
T2.64.B2.4.5.1.1
1720.5
1.94
T2.64.B2.4.5.1.2
726.8
1.93
T2.64.B2.4.5.1.3
52.3
1.6
T2.64.B2.4.5.1.4
1278.7
1.98
T2.64.B2.4.5.1.5
858.7
1.99
T2.64.B2.4.5.1.6
1250.9
1.97
T2.64.B2.4.5.1.7
732.2
1.9
T2.64.B2.4.5.1.8
594.2
1.89
T2.64.B2.4.5.1.9
789.8
1.92
T2.64.B2.4.5.1.10
1254.7
1.93
T2.64.B2.4.5.1.11
598.4
2.03
T2.64.B2.4.5.1.12
1091.2
1.96
T2.64.B2.4.5.1.13
752.4
1.89
T2.64.B2.4.5.1.14
1169
1.99
T2.64.B2.4.5.1.15
1153.5
1.93
T2.64.B2.4.5.1.16
825.7
1.96
T2.64.B2.4.5.1.17
1160.4
1.96
T2.64.B2.4.5.1.18
713.3
1.9
T2.64.B2.4.5.1.19
1160.1
1.94
T2.64.B2.4.5.1.20
1054.9
1.99
T2.64.B2.4.5.1.21
3222.8
1.97
T2.64.B2.4.5.1.22
1948.3
1.96
T2.64.B2.4.5.1.23
567.8
1.92
T2.64.B2.4.5.1.24
2077.5
2.05
T2.64.B2.4.5.1.25
566.6
1.85
T2.64.B2.4.5.1.26
820.8
1.92
T2.64.B2.4.5.1.27
1676.4
2
T2.64.B2.4.5.1.28
869.5
1.91
T2.64.B2.4.5.1.29
615.5
1.91
T2.64.B2.4.5.1.30
2321.8
1.99
T2.64.B2.4.5.1.31
1556.7
1.94
T2.64.B2.4.5.1.32
1770.3
1.98
T2.64.B2.4.5.1.33
1909.6
1.98
T2.64.B2.4.5.1.34
1565.4
2.01
T2.64.B2.4.5.1.35
495.9
1.91
T2.64.B2.4.5.1.36
1000.3
1.93
T2.64.B2.4.5.1.37
1217.5
1.99
T2.64.B2.4.5.1.38
T2.64.B2.4.5.1.39
1436.1
1.96
1.92
758.8
17
Lanjutan Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian...
Sampel
Konsentrasi
A 260/280
1.88
T2.64.B2.4.5.1.40
455.9
T2.64.B2.4.5.1.42
869.9
1.98
T2.64.B2.4.5.1.43
1060.7
1.94
T2.64.B2.4.5.1.44
1873.8
1.99
T2.64.B2.4.5.1.45
4257.9
1.86
T2.64.B2.4.5.1.46
1984.1
1.91
T2.64.B2.4.5.2.1
1180.1
1.98
T2.64.B2.4.5.2.2
534
1.89
T2.64.B2.4.5.2.3
1631.6
1.94
T2.64.B2.4.5.2.4
353.8
1.88
T2.64.B2.4.5.2.5
1417.4
1.96
T2.64.B2.4.5.2.6
814.5
1.86
T2.64.B2.4.5.2.7
300.5
1.89
T2.64.B2.4.5.2.8
346.4
1.86
T2.64.B2.4.5.2.9
509.5
1.96
T2.64.B2.4.5.2.10
606.9
1.95
T2.64.B2.4.5.2.11
1115.1
1.91
T2.64.B2.4.5.2.12
869.9
2.02
T2.64.B2.4.5.2.13
2400
1.75
T2.64.B2.4.5.2.14
1863.9
1.97
T2.64.B2.4.5.2.15
406.9
1.91
T2.64.B2.4.5.2.16
537.8
1.93
T2.64.B2.4.5.2.17
296.2
1.86
T2.64.B2.4.5.2.18
804.8
20.07
T2.64.B2.4.5.2.19
792.1
2.02
T2.64.B2.4.5.2.20
821.5
1.93
T2.64.B2.4.5.2.21
821.2
1.92
T2.64.B2.4.5.2.22
951.1
1.99
T2.64.B2.4.5.2.23
647.8
1.89
T2.64.B2.4.5.2.24
1237.8
1.96
T2.64.B2.4.5.2.25
967.5
1.92
T2.64.B2.4.5.2.26
842.7
1.93
T2.64.B2.5.3.8.1
604.8
1.89
T2.64.B2.5.3.8.2
368.4
1.88
T2.64.B2.5.3.8.3
593.9
1.88
T2.64.B2.5.3.8.4
486
1.93
T2.64.B2.5.3.8.5
376.9
1.92
T2.64.B2.5.3.8.6
671.1
1.97
T2.64.B2.5.3.8.7
433.9
1.91
T2.64.B2.5.3.8.8
T2.64.B2.5.3.8.9
284.5
1.43
468.5
1.92
18
Lanjutan Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian...
Sampel
Konsentrasi
A 260/280
1.92
T2.64.B2.5.3.8.11
450.6
T2.64.B2.5.3.8.12
759.3
1.93
T2.64.B2.5.3.8.13
109.2
1.72
T2.64.B2.5.3.8.14
642.8
1.93
T2.64.B2.5.3.8.15
247.9
1.83
T2.64.B2.5.3.8.16
185.7
1.82
T2.64.B2.5.3.8.17
636
1.88
T2.64.B2.5.3.8.18
387.6
1.89
T2.64.B2.5.3.8.19
579.8
1.89
T2.64.B2.5.3.8.20
314.9
1.89
T2.64.B2.5.3.8.21
281.9
1.88
T2.64.B2.5.3.8.22
512.9
1.91
T2.64.B2.5.3.8.23
520.2
1.93
T2.64.B2.5.3.8.24
162.2
1.78
T2.64.B2.5.3.8.25
578.3
1.9
T2.64.B2.5.3.8.26
599
1.92
T2.64.B2.5.3.8.27
444.1
1.92
T2.64.B2.5.3.8.28
297.4
1.85
T2.64.B2.5.3.8.29
1416.1
1.97
T2.64.B2.5.3.8.30
608.3
1.89
T2.64.B2.5.3.8.31
291.7
1.85
T2.64.B2.5.3.8.32
149.2
1.78
T2.64.B2.5.3.8.33
683.5
1.91
T2.64.B2.5.3.8.34
953.5
1.99
T2.64.B2.5.3.8.35
599.7
1.96
T2.64.B2.5.3.8.36
689.4
1.9
T2.64.B2.5.3.8.37
152.9
1.77
T2.64.B2.5.3.8.38
682.5
1.89
T2.64.B2.5.3.8.39
524.3
1.92
T2.64.B2.5.3.8.40
679
1.88
T2.64.B2.5.3.8.41
197.2
1.85
T2.64.B2.5.3.8.42
65.8
1.55
T2.64.B2.5.3.8.43
485.2
1.89
T2.64.B2.5.3.8.44
990
1.9
T2.64.B2.5.3.8.45
996.7
1.94
T2.64.B2.5.3.8.46
250.4
1.84
T2.64.B2.5.3.8.47
1118.2
1.97
T2.64.B2.5.3.8.48
380.4
1.87
T2.64.B2.5.3.8.49
347.1
1.91
T2.64.B2.5.3.8.50
196
1.93
T2.64.B2.5.3.8.51
T2.64.B2.5.3.2.1
966.8
1.99
1.97
1072.8
19
Lanjutan Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian...
Sampel
Konsentrasi
A 260/280
T2.64.B2.5.3.2.5
1233.5
1.89
T2.64.B2.5.3.2.6
453.9
1.87
T2.64.B2.5.3.2.7
755.6
1.96
T2.64.B2.5.3.2.8
1028.7
1.95
T2.64.B2.5.3.2.9
82.4
1.76
T2.64.B2.5.3.2.10
627.6
1.94
T2.64.B2.5.3.2.11
400.8
1.89
T2.64.B2.5.3.2.12
392.5
1.92
T2.64.B2.5.3.2.13
675
1.85
T2.64.B2.5.3.2.14
1971.2
1.98
T2.64.B2.5.3.2.15
1856.7
1.97
T2.64.B2.5.3.2.16
528.8
1.87
T2.64.B2.5.3.2.17
402.4
1.88
T2.64.B2.5.3.2.18
676.7
1.89
T2.64.B2.5.3.2.19
471.3
1.92
T2.64.B2.5.3.2.20
789.5
1.94
T2.64.B2.5.3.2.21
912.6
1.94
T2.64.B2.5.3.2.22
602.9
1.89
T2.64.B2.5.3.2.23
545.8
1.88
T2.64.B2.5.3.2.24
670.5
1.99
T2.64.B2.5.3.2.25
281.7
1.88
T2.64.B2.5.3.2.26
303.3
1.85
T2.64.B2.5.3.2.27
865.5
1.95
T2.64.B2.5.3.2.28
1342
1.93
T2.64.B2.5.3.2.29
692.8
1.96
T2.64.B2.5.3.2.30
553.7
1.9
T2.64.B2.5.3.2.31
560
1.9
T2.64.B2.5.3.2.32
798.3
1.93
T2.64.B2.5.3.2.33
1187.3
2
T2.64.B2.5.3.2.34
586.9
1.94
T2.64.B2.5.3.2.35
870
1.94
T2.64.B2.5.3.2.36
1888.1
2.01
T2.64.B2.5.3.2.37
779.6
1.98
T2.64.B2.5.3.2.38
601.6
1.89
T2.64.B2.5.3.2.39
1434.3
1.95
T2.64.B2.5.3.2.40
561.7
1.89
T2.64.B2.5.3.2.41
1142.9
2
T2.64.B2.5.3.2.42
620
1.92
T2.64.B2.5.3.2.43
521.9
1.89
T2.64.B2.5.3.2.44
617.1
1.89
T2.64.B2.5.3.2.45
463.5
1.87
T2.64.B2.5.3.2.46
487
1.88
20
Lanjutan Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian...
Sampel
Konsentrasi
A 260/280
Kontrol 1
441.2
1.9
Kontrol 2
689.5
1.9
Kontrol 3
1151.8
1.97
Kontrol 4
568.2
1.9
Kontrol 5
650.4
1.95
Kontrol 6
666.6
1.91
Kontrol 7
859.6
1.87
Kontrol 8
947.8
1.96
Kontrol 9
993.4
1.95
Kontrol 10
635.2
1.88
Kontrol 11
686.4
1.89
Kontrol 12
687.2
1.9
Kontrol 13
362.2
1.86
Kontrol 14
449.8
1.9
Kontrol 15
541.5
1.87
Kontrol 16
735.9
2.01
Kontrol 17
351.7
1.88
Kontrol 18
737.6
1.95
Kontrol 19
1496.3
1.98
Kontrol 20
340
1.85
Kontrol 21
415.2
1.9
Kontrol 22
286.4
1.88
Kontrol 23
460.2
1.88
Kontrol 24
2012.4
1.94
Kontrol 25
979.8
1.92
21
Lampiran 3 Elektroforegram Sampel Tanaman Padi IR.64 T2 Mutan Hasil
Amplifikasi Menggunakan Primer Bar
22
Lanjutan Lampiran 3 Elektroforegram Sampel Tanaman...
23
Lanjutan Lampiran 3 Elektroforegram Sampel Tanaman...
24
Lampiran 4 Elektroforegram Sampel Tanaman Padi IR.64 T2 Mutan Hasil
Amplifikasi Menggunakan Primer Hpt
25
Lanjutan Lampiran 4 Elektroforegram Sampel Tanaman...
26
Lampiran 5 Hasil Analisis Kestabilan Transposon Ds
Padi Mutan
Gen bar
Gen hpt
Kestabilan
T2.64.B2.4.12.1.1
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.2
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.3
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.4
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.5
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.6
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.7
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.8
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.9
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.10
-
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.11
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.12
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.13
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.14
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.15
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.16
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.12.1.17
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.12.1.18
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.19
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.12.1.20
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.12.2.1
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.2
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.3
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.4
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.5
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.6
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.7
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.8
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.9
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.10
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.11
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.12
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.13
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.12.2.14
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.12.2.15
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.16
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.17
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.18
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.19
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.20
-
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.21
+
+
T2.64.B2.4.12.2.22
+
+
Tidak stabil
Tidak stabil
27
Lanjutan Lampiran 5 Hasil Analisis Kestabilan...
Padi Mutan
Gen bar
Gen hpt
Kestabilan
T2.64.B2.4.12.2.23
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.24
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.25
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.1
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.2
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.3
-
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.4
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.1.5
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.6
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.1.7
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.8
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.9
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.10
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.11
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.12
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.13
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.14
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.1.15
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.1.16
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.17
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.18
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.19
-
-
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.20
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.21
-
-
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.22
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.23
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.24
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.25
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.26
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.27
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.1.28
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.29
-
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.30
-
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.31
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.32
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.33
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.5.1.34
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.35
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.36
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.37
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.1.38
T2.64.B2.4.5.1.39
+
+
Tidak stabil
+
+
Tidak stabil
28
Lanjutan Lampiran 5 Hasil Analisis Kestabilan...
Padi Mutan
Gen bar
Gen hpt
T2.64.B2.4.5.1.40
+
+
Kestabilan
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.41
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.42
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.43
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.44
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.45
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.46
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.1
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.2.2
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.3
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.4
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.5
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.6
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.7
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.8
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.9
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.10
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.11
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.12
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.13
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.14
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.2.15
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.16
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.17
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.2.18
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.19
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.2.20
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.21
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.22
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.23
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.24
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.25
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.2.26
+
-
AMPLIFIKASI GEN BAR DAN GEN HPT TERKAIT
STABILITAS PADI MUTAN SERTA EVALUASI
KARAKTER AGRONOMINYA
NETRIA WAHYUNI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
iii
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Amplifikasi Gen bar
dan Gen hpt Terkait Stabilitas Padi Mutan Serta Evaluasi Karakter Agronominya
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2014
Netria Wahyuni
NIM G84100090
ABSTRAK
NETRIA WAHYUNI. Amplifikasi Gen bar dan Gen hpt Terkait Stabilitas
Padi Mutan Serta Evaluasi Karakter Agronominya. Dibimbing oleh
SURYANI dan TRI JOKO SANTOSO.
Sistem transposon Ac/Ds mengandung konstrak sebagai penanda
aktivasi dan berfungsi dalam mengembangkan tanaman mutan yang
menghasilkan perubahan-perubahan fenotipe. Penelitian ini bertujuan
mengamplifikasi gen bar dan gen hpt berkaitan dengan stabilitas padi mutan
transposon Ac/Ds dan perubahan fenotipe berdasarkan karakter agronominya.
Materi tanaman padi yang digunakan untuk penelitian adalah 6 galur padi
IR.64 T2 mutan (total 214 tanaman) dan padi IR.64 sebagai kontrol.
Tanaman-tanaman mutan diisolasi DNA-nya dan diamplifikasi PCR dengan
menggunakan pasangan primer spesifik untuk gen bar dan hpt. Hasil
penelitian menunjukkan ukuran gen bar dan gen hpt masing-masing
berukuran ± 700 bp dan ± 600 bp. Perubahan karakter-karakter agronomi pada
tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 disebabkan adanya insersi elemen
transposon yang mengandung 4x enhancer.
Kata kunci: IR64, karakter agronomi, Transposon Ac/Ds.
ABSTRACT
NETRIA WAHYUNI. Amplification of bar Gene and hpt Gene Related to
Rice Mutant Stability and The Evaluation of it’s Agronomy Character.
Supervised by SURYANI and TRI JOKO SANTOSO.
Transposon Ac / Ds system containing an activation tagging
constructs serves to develop a mutant plant that will produce changes in
phenotype. This study aims to amplify the bar and hpt genes related to the
stability of the mutant rice transposon Ac/Ds and observe the changes in
phenotype based on the agronomy characters. Rice plant materials used for
the study were six mutant T2 rice lines IR.64 (total 214 plants) and IR64
wild type rice as a control. The DNA of mutant plants was isolated and then
amplified by PCR technique using primers specific for the bar and hpt
genes. The results showed that the bar and hpt genes in the rice plant IR.64
mutant T2 with size were ± 700 bp and ± 600 bp. Evaluation of agronomic
characters showed there were changes in these characters of mutant rice
lines IR64 generation T2 that probably caused by the transposon insertion
element containing 4x enhancer.
Keywords: Ac / Ds transposon, agronomic traits, IR64.
iii
AMPLIFIKASI GEN BAR DAN GEN HPT TERKAIT
STABILITAS PADI MUTAN SERTA EVALUASI
KARAKTER AGRONOMINYA
NETRIA WAHYUNI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
iv
i
Judul Skripsi : Amplifikasi Gen Bar dan Gen Hpt Terkait Stabilitas Padi Mutan
serta Evaluasi Karakter Agronominya
Nama
: Netria Wahyuni
NIM
: G84100090
Disetujui oleh
Dr Suryani, SP MSc
Pembimbing I
Dr Tri Joko Santoso, SP MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
ii
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari hingga bulan Mei 2014 ini
adalah Amplifikasi Gen Bar dan Gen Hpt Terkait Stabilitas Padi Mutan Serta
Evaluasi Karakter Agronominya.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Suryani, SP MSc dan Bapak
Dr Tri Joko Santoso, SP MSi selaku dosen pembimbing yang telah banyak
memberikan pengarahan dan saran. Terima kasih kepada bapak Dr Tri Joko
Santoso untuk proyek penelitian dan kesempatan melakukan penelitian sampai
selesai di BB Biogen Cimanggu Bogor. Di samping itu, penghargaan penulis
sampaikan kepada Ibu Nur, Ka Mira, Mba Mariana, Ka Ammar, Wulan beserta
seluruh staf Konservasi Biologi Molekuler BB-Biogen yang telah membantu
selama pengumpulan data penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan
kepada ayah, ibu, kakak serta seluruh keluarga dan teman-teman Biokimia 47
untuk segala doa, kasih sayang dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2014
Netria Wahyuni
iii
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
iii
DAFTAR GAMBAR
iv
DAFTAR LAMPIRAN
iv
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan alat
2
Prosedur Penelitian
2
HASIL
4
Tanaman Padi IR.64 Mutan Generasi T2
4
Kuantitas dan Kualitas DNA Genom Padi
5
Amplifikon PCR Gen bar dan Gen hpt
5
PEMBAHASAN
8
Hasil Isolasi DNA Padi
8
Amplikon Gen bar dan Gen hpt
9
Evaluasi Karakter Agronomi
SIMPULAN DAN SARAN
10
11
Simpulan
11
Saran
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
32
iv
DAFTAR TABEL
1. Galur-galur padi IR.64 mutan generasi T2 dan padi IR.64 tipe liar
(kontrol)
2. Jumlah tanaman padi IR.64 T2 mutan dan padi IR.64 tipe liar (kontrol)
setelah ditanam di bak semai
3. Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi dari beberapa tanaman
perwakilan galur padi IR64 mutan generasi T2
4. Hasil analisis kestabilan beberapa tanaman padi mutan
5. Hasil rekapitulasi analisis PCR gen bar dan hpt pada 6 galur padi IR64
mutan generasi T2
6. Tinggi tanaman, jumlah malai, panjang malai dan panjang daun
bendera padi IR64 T2 mutan
7. Bobot 100 butir, jumlah gabah isi dan jumlah gabah hampa padi IR64
T2 mutan
2
4
5
7
7
7
8
DAFTAR GAMBAR
1. Elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer bar pada
tanaman padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12.2.
2. Elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer hpt pada
tanaman padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12.1.
3. Peta T-DNA genom yang digunakan pada transformasi transposon
Ac/Ds
6
6
9
DAFTAR LAMPIRAN
1. Diagram alur penelitian
2. Konsentrasi dan kemurnian DNA
3. Elektroforegram Sampel Tanaman Padi IR.64 T2 Mutan Hasil
Amplifikasi Menggunakan Primer Bar
4. Elektroforegram Sampel Tanaman Padi IR.64 T2 Mutan Hasil
Amplifikasi Menggunakan Primer Hpt
5. Hasil analisis kestabilan transposon Ds
6. Motif sekuen primer yang digunakan
14
14
21
24
26
31
1
PENDAHULUAN
Kekayaan genom padi dapat dieksplorasi melalui identifikasi gen-gen
penting yang terdapat di dalam genom padi yang berperan dalam menentukan
fenotipe, dan mendapatkan informasi mengenai fungsi gen-gen padi sehingga
kualitasnya dapat ditingkatkan (Jeoung et al. 2002). Menurut Bouchez dan Hofte
(1998) pendekatan yang dilakukan dalam menganalisis fungsi gen ada dua yaitu
forward genetics dan reverse genetics. Pendekatan forward genetics dilakukan
dengan menganalisis fungsi gen dari tanaman mutan kemudian dilanjutkan ke
sekuen gennya, sedangkan pendekatan reverse genetics dilakukan dengan
berpedoman pada informasi sekuen gen yang diketahui.
Transposon merupakan segmen DNA spesifik yang dapat bertransposisi dari
satu lokasi ke lokasi lain di dalam genom sel dengan cara memotong segmen suatu
DNA dan meligasinya (Griffth et al. 1999). Transposon Ac (activator) telah
mengalami delesi pada bagian inverted repeat sehingga bersifat tidak mampu
berpindah, tetapi menghasilkan enzim transposase (otonom) (Greco et al. 2003).
Transposon Ds (dissociation) mengalami delesi pada bagian gen transposase
sehingga tidak menghasilkan enzim transposase (non-otonom) dan mampu
berpindah (mobile) (Brooker 2005). Transposon Ds akan berpindah posisi dalam
genom menuju tempat yang berbeda dan tersisip pada gen-gen fungsional.
Sedangkan elemen Ac akan menyandikan enzim untuk mengaktifkan elemen Ds
selama bertransposisi. Transposon Ds yang terdapat dalam genom tanaman akan
stabil jika tidak disertai dengan transposon Ac (Kolesnik et al. 2004).
Kestabilan mutan diketahui dengan mengidentifikasi gen-gen ketahanan
terhadap antibiotik higromisin (gen hpt) dan ketahanan terhadap herbisida (gen bar)
yang masing-masing berada pada elemen Ac dan elemen Ds. Enzim higromisin
fosfotransferase yang dihasilkan gen hpt memiliki peran dalam mendetoksifikasi
aminosiklitol antibiotik higromisin B. Gen bar (basta resistant) adalah gen yang
membawa ketahanan terhadap fosfinotrisin (PPT), yang merupakan bahan aktif
herbisida bialaphos dan basta (Rodriguez & Nottenburg 2002).
Posisi mutasi yang berbeda-beda di dalam tanaman padi dapat diperoleh
melalui aktivitas perpindahan transposon Ds (Greco et al. 2001). Kestabilan
tanaman mutan berdasarkan ada tidaknya elemen Ac dapat diidentifikasi
menggunakan teknik PCR dengan mengamplifikasi gen bar yang dibawa oleh
elemen Ds dan gen hpt yang dibawa oleh elemen Ac. Tanaman padi IR64 mutan
akan stabil dalam kromosom tanaman apabila gen bar menyisip dan teramplifikasi
setelah pengecekan melaui PCR sedangkan gen hpt tidak teramplifikasi pada
tanaman tersebut. Pengujian tanaman yang menunjukan tidak stabilnya mutan pada
tanaman padi mutan (transposon Ds) akan terus mengalami perubahan fenotipe
pada tanaman padi sampai generasi selanjutnya dan transposon Ds terus menyisip
dan berpindah kekromosom lainnya. Tanaman padi mutan yang stabil akan
mengalami perubahan fenotipe yang sama dari generasi ke generasi selanjutnya.
Penelitian ini bertujuan mengamplifikasi gen bar dan gen hpt berkaitan
dengan stabilitas padi mutan transposon Ac/Ds dan perubahan fenotipe berdasarkan
karakter agronominya. Manfaat penelitian ini adalah diperolehnya galur-galur padi
IR.64 mutan generasi T2 yang stabil yang dapat digunakan sebagai sumber tanaman
2
untuk mengidentifikasi gen-gen penting di bidang pertanian dapat dimanfaatkan
sebagai varietas unggul baru setelah dilakukan pengujian-pengujian lebih lanjut.
METODE
Bahan dan alat
Bahan tanaman yang digunakan untuk penelitian terdiri 6 galur tanaman
padi IR.64 mutan generasi T2 dan 1 galur tanaman padi IR 64 tipe liar dengan total
tanaman sebanyak 239. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah NF water, primer
hpt (higromisin fosfotransferase) dan primer bar (basta resistant), 10x Bufer PCR,
MgCl2, dNTP mix 10 mM, Taq DNA polymerase, gel agarosa, 1x buffer TAE
(Tris HCl-asam asetat-EDTA), loading dye, T4 DNA polymerase (gel red), DNA
hasil PCR, dan marker 1 kb ladder.
Peralatan yang digunakan adalah tabung mikro 2 mL, tabung mikro 1.5 mL,
pipet mikro 1000p, 200p, 20p, 2p dan multichanel mikropipet, tip, oven, microfuge,
neraca analitik, spektrofotometer nanodrop, stirer, vorteks, UV Illuminator
ChemiDoc EQ Biorad, perangkat elektroforesis vertikal, ice maker, labu
Erlenmeyer, microwave, gelas ukur, gelas piala, baki gel agarosa, plate PCR, kulkas
penyimpanan sampel, dan mesin PCR tetrad PTC-225.
Prosedur Penelitian
Penanaman Padi IR.64 Mutan Generasi T2
Tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 yang digunakan sebagai bahan
sampel penelitian memiliki kode tanaman untuk masing-masing galur dengan arti
sebagai berikut, T2 menyatakan tanaman padi mutan generasi T2, 64 sebagai
tanaman padi kultivar IR.64, B2 menyatakan transposon (konstrak B2) dan 4.12.1
menyatakan nama galur tanaman padi mutan. Galur-galur tanaman sebanyak 6
galur digunakan sebagai sampel untuk pengujian kestabilan elemen transposon Dc
di dalam genom tanaman tersebut, dan digunakan untuk mengetahui pengamatan
perubahan karakter agronominya. Total benih tanaman yang digunakan sebanyak
360 bulir padi IR.64 T2 mutan (6 galur padi IR.64 mutan generasi T2) dan 25 bulir
(1 galur) padi IR.64 tipe liar yang digunakan sebagai kontrol (Tabel 1).
Tabel 1 Galur-galur padi IR.64 mutan generasi T2 dan padi IR.64 tipe liar (kontrol)
Kode Tanaman
T2.64.B2.4.12.1
T2.64.B2.4.12.2
T2.64.B2.4.5.1
T2.64.B2.4.5.2
T2.64.B2.5.3.8
T2.64.B2.5.3.2
Kontrol
Jumlah benih
60 benih
60 benih
60 benih
60 benih
60 benih
60 benih
25 benih
3
Isolasi DNA Daun Padi (Doyle & Doyle 1987)
Sampel daun dipotong dari tanaman padi sepanjang 10 cm dan dimasukkan
ke dalam tabung mikro 2 mL. Sampel daun bersama dengan tabung direndam ke
dalam nitrogen cair dan digerus dengan penggerus (sumpit bambu) sampai halus
berbentuk serbuk. Hasil gerusan kemudian ditambahkan bufer CTAB sebanyak
1000 µL, dicampur dan kemudian diinkubasi pada suhu 65oC selama 15 menit pada
penangas air (setiap 5 menit tabung dibolak-balik). Setelah itu sampel didinginkan
pada suhu ruang, dan kemudian ditambahkan dengan natrium asetat 3M sebanyak
100 µL dan chisam (perbandingan klorofom:isoamil sebanyak 24:1) sebanyak 1
mL. Campuran kemudian dibolak-balik secara perlahan-lahan kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit.
Supernatan di ambil dan dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 mL yang
baru dan kemudian ditambahkan natrium asetat sebanyak 1/10 µL volume
supernatan dan isopropanol sebanyak 2/3 µL volume supernatan. Campuran
kemudian di bolak-balik secara perlahan-lahan untuk mempresipitasi DNA. Sampel
disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan
dibuang perlahan-lahan agar pelet DNA tidak ikut terbuang. Pelet DNA yang
terbentuk ditambahkan etanol 70% sebanyak 200 µL dan disentrifugasi pada
kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya supernatan dibuang dan pelet
DNA dikeringkan di oven pada suhu 60oC sampai kering. Sampel DNA yang
diperoleh kemudian dimurnikan dari RNA-nya dengan ditambahkan TE-RNase
sebanyak 50 µL dan kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit, setelah
itu DNA disimpan pada suhu -20oC.
Analisis Kuantitatif DNA Genom dengan Nanodrop (Thermo Fisher Scientific
2009)
Sebanyak 2 μL larutan buffer TE dimasukkan ke dalam lubang ukur sebagai
blanko. Setelah itu, lubang ukur dibersihkan dengan mengelap menggunakan kertas
tisu. Kemudian, sampel DNA sebanyak 2 μL dimasukkan ke dalam lubang ukur dan
diukur konsentrasinya mengikuti prosedur pengukuran dari alat nanodrop tersebut.
Hasil pengukuran akan muncul dalam satuan konsentrasi ng/μL. Nilai kemurnian
DNA dapat dilihat berdasarkan nilai rasio pembacaan Å260/Å280.
Amplifikasi Gen bar dan Gen hpt dengan PCR (Trijatmiko et al. 2011)
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan dua pasang primer yang
spesifik terhadap sampel yang digunakan yaitu primer untuk gen ketahanan basta
(bar) dan gen ketahanan antibiotik higromisin (hpt). Sekuen primer hpt dan bar
yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 6. Total volume reaksi PCR di dalam
satu tabung adalah 10 μL dengan komposisi 3 μL NF Water, 5 μL KAPA2G, 0.5 μL
primer forward (5 uM), 0.5 μL primer reverse (5 uM), 0.5 μL DMSO, dan 1 μL
DNA cetakan. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR. Profil PCR yang
digunakan adalah pre-denaturasi 940C selama 5 menit, denaturasi 940C selama 30
detik, penempelan primer 670C untuk primer bar dan 600C untuk primer hpt selama
30 detik, dan pemanjangan primer 720C selama 30 detik dengan pengulangan
sebanyak 30 siklus.
4
Analisis Produk PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa (Sambrook &
Russell 2001)
Sebanyak 1.2 gram agarosa dicampur dengan 120 mL 1x bufer TAE
(konsentrasi gel 1%). Larutan tersebut dipanaskan dalam microwave selama 2
menit. Agarose yang sudah terlarut dimasukkan ke dalam cetakan agar yang sudah
diberi cetakan sumur. Setelah gel agarosa padat, gel dimasukkan ke dalam tangki
elektroforesis yang berisi 1x bufer TAE. Sebanyak 5 μL produk PCR dicampur
dengan 2 μL loading dye kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Penanda
migrasi (marker) 1 kb ladder juga dimasukan ke dalam sumur gel yang lain. Tahap
selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan voltase 75 volt selama 40 menit. Hasil
elektroforesis gel agarose divisualisasi menggunakan chemidoc gel system.
Analisis Kestabilan Transposon Ds
Data kemunculan pita-pita DNA hasil PCR menggunakan primer hpt dan
bar digunakan untuk menentukan kestabilan transposon Ds di dalam tanaman padi
IR64 mutan. Tanaman padi IR64 mutan generasi T2 dikatakan stabil apabila data
hasil elektroforegram menunjukan hasil positif untuk primer bar dan negatif untuk
primer hpt.
Evaluasi Karakter Agronomi Padi Mutan
Pengamatan karakter-karakter agronomi padi dilakukan terhadap 6 galur
padi IR.64 T2 mutan dan 1 galur IR.64 tipe liar (kontrol). Parameter yang diamati
adalah tinggi tanaman, umur berbunga, jumlah malai per tanaman, jumlah biji isi
dan hampa per malai, panjang malai, jumlah anakan, panjang daun bendera, bobot
100 butir. Data hasil pengamatan diuji menggunakan analisis ragam dengan
software statistik SAS 7 dan uji lanjut duncan.
HASIL
Tanaman Padi IR.64 Mutan Generasi T2
Galur-galur padi IR64 mutan generasi T2 yang ditanam di rumah kaca
menunjukkan bahwa dari sebanyak 60 benih per galur tidak semuanya dapat
tumbuh menjadi tanaman. Total tanaman yang tumbuh dari masing-masing galur
ditampilkan pada Tabel 2.
Tabel 2 Jumlah tanaman padi IR.64 T2 mutan dan padi IR.64 tipe liar (kontrol)
setelah ditanam di bak semai
Kode Tanaman
T2.64.B2.4.12.1
T2.64.B2.4.12.2
T2.64.B2.4.5.1
T2.64.B2.4.5.2
T2.64.B2.5.3.8
T2.64.B2.5.3.2
Kontrol
Tanaman Normal
20 Tanaman
25 Tanaman
46 Tanaman
26 Tanaman
51 Tanaman
46 Tanaman
25 Tanaman
Tanaman Albino
11 Tanaman
9 Tanaman
3 Tanaman
16 Tanaman
4 Tanaman
6 Tanaman
-
Tanaman Mati
29 Tanaman
26 Tanaman
11 Tanaman
18 Tanaman
5 Tanaman
8 Tanaman
-
5
Kuantitas dan Kualitas DNA Genom Padi
Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA pada tanaman padi
IR.64 T2 mutan dan tanaman padi IR.64 tipe liar (kontrol) ditunjukkan pada Tabel
3. Data yang ditampilkan merupakan wakil dari setiap galur (satu galur terdiri dari
dua tanaman), adapun data secara lengkap disajikan pada bagian lampiran. Galur
padi mutan T2.64.B2.5.3.2.9 memiliki konsentrasi DNA yang paling rendah (82.4
ng/ul) dan memiliki kemurnian DNA yang rendah (1.8) jika dibandingkan dengan
galur tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 yang lainnya dan kontrol. Beberapa
galur tanaman padi menunjukan nilai kemurnian yang baik pada kisaran 1.8-2.0
yang berarti bebas dari kontaminan protein maupun RNA. DNA hasil isolasi dari
enam galur padi IR.64 T2 mutan dan satu galur padi IR.64 tipe liar (kontrol)
selanjutnya digunakan sebagai cetakan pada proses amplifikasi PCR untuk
mendeteksi keberadaan gen bar dan hpt menggunakan primer spesifik gen.
Tabel 3 Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi dari beberapa tanaman
perwakilan galur padi IR64 mutan generasi T2
Sampel
T2.64.B2.4.12.1.15
T2.64.B2.4.12.1.16
T2.64.B2.4.12.2.14
T2.64.B2.4.12.2.15
T2.64.B2.4.5.1.4
T2.64.B2.4.5.1.5
T2.64.B2.4.5.2.1
T2.64.B2.4.5.2.2
T2.64.B2.5.3.8.4
T2.64.B2.5.3.8.5
T2.64.B2.5.3.2.9
T2.64.B2.5.3.2.10
IR.64 Kontrol 1
IR.64 Kontrol 2
Konsentrasi
2190
1792.3
650.8
457.8
1278.7
858.7
1180.1
534
486
376.9
82.4
627.6
441.2
689.5
A 260/280
2.0
2.0
1.9
1.8
2.0
2.0
2.0
1.9
1.9
1.9
1.8
1.9
1.9
1.9
Amplifikon PCR Gen bar dan Gen hpt
Gen bar dan hpt sebagai marka seleksi yang digunakan untuk melihat
kestabilan tanaman-tanaman padi IR.64 mutan generasi T2. Kedua gen pada
tanaman diamplifikasi dengan menggunakan primer spesifik terhadap keberadaan
gen bar dan primer spesifik terhadap gen hpt. Berdasarkan data hasil amplifikasi
PCR diketahui bahwa sebagian besar tanaman-tanaman padi IR.64 mutan generasi
T2 menunjukkan hasil positif setelah diamplifikasi dengan primer bar yaitu
diindikasikan dengan terbentuknya fragmen DNA berukuran ±700 bp. Hasil
amplifikasi PCR terhadap gen bar diambil perwakilan pada tanaman-tanaman
mutan galur T2.64.B2.4.12.2 dan ditampilkan pada Gambar 1. Hasil amplifikasi
menunjukkan bahwa dari 10 tanaman mutan, 9 diantaranya positif mengandung gen
bar sedangkan tanaman negatif terhadap pengujian gen bar yaitu tanaman nomor
13 (T2.64.B2.4.12.2.20). Sementara itu, hasil amplifikasi PCR dengan primer
spesifik bar pada galur-galur yang lain ditampilkan pada lampiran.
Hasil amplifikasi DNA padi dengan primer hpt pada padi galur
T2.64.B2.4.12.1 nomor (4-15 dan 18-20) menyatakan hasil adanya gen hpt yang
diindikasikan dengan terbentuknya pita DNA hasil amplifikasi berukuran 600 bp
6
(Gambar 2). Adapun pada tanaman nomor 16 dan 17 tidak mengandung gen hpt
karena tidak terbentuk pita DNA dengan ukuran yang diharapkan. Sementara itu,
hasil amplifikasi PCR dengan primer gen hpt pada galur-galur yang lain
ditampilkan pada lampiran.
Gambar 1 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer bar pada
tanaman padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12.2. Marker, plasmid,
kontrol (IR64 tipe liar), tanaman padi mutan nomor 4-12 positif gen bar,
sampel nomor 13 negatif gen bar
Gambar 2 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR menggunakan primer hpt pada
tanaman padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12.1. Marker, plasmid,
kontrol (IR.64 tipe liar), tanaman padi nomor 4-15 dan 18-20 positif
mengandung hpt, tanaman padi nomor 16 dan 17 negatif hpt
Stabilitas Transposon Ds pada Tanaman Padi IR.64 Mutan Generasi T2
Hasil analisis kestabilan tanaman-tanaman mutan padi IR.64 mutan generasi
T2 disajikan pada Tabel 4. Data yang ditampilkan merupakan perwakilan tanaman
dari tiap-tiap galur dan setiap galur diambil perwakilan 2 sampel tanaman.
Tanaman-tanaman mutan padi yang telah stabil diindikasikan dengan positif gen
bar dan negatif gen hpt. Hal ini menunjukan bahwa pada tanaman-tanaman mutan
yang stabil sudah tidak mempunyai elemen transposon Ac (negatif hpt) namun
7
masih mengandung elemen transposon Ds (positif bar). Hasil analisis PCR untuk
semua tanaman pada 6 galur padi IR.64 mutan generasi T2 dengan jumlah total 214
tanaman menunjukkan bahwa 94 tanaman telah stabil tranposon Ds di dalam genom
tanaman (Tabel 5).
Tabel 4 Hasil analisis kestabilan beberapa tanaman padi mutan
Padi Mutan
T2.64.B2.4.12.1.15
T2.64.B2.4.12.1.16
T2.64.B2.4.12.2.14
T2.64.B2.4.12.2.15
T2.64.B2.4.5.1.4
T2.64.B2.4.5.1.5
T2.64.B2.4.5.2.1
T2.64.B2.4.5.2.2
T2.64.B2.5.3.8.4
T2.64.B2.5.3.8.5
T2.64.B2.5.3.2.9
T2.64.B2.5.3.2.10
Gen bar
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Gen hpt
+
+
+
+
-
Kestabilan
Tidak ada mutan
Stabil
Stabil
Tidak stabil
Stabil
Tidak stabil
Stabil
Tidak stabil
Tidak stabil
Stabil
Tidak stabil
Stabil
Tabel 5 Hasil rekapitulasi analisis PCR gen bar dan hpt pada 6 galur padi IR64
mutan generasi T2
Nama galur
T2.64.B2.4.12.1
T2.64.B2.4.12.2
T2.64.B2.4.5.1
T2.64.B2.4.5.2
T2.64.B2.5.3.8
T2.64.B2.5.3.2
Jumlah
Positif bar
(stabil)
4
2
6
6
33
43
94
Jumlah tanaman
Positif bar
Positif hpt
dan hpt
1
8
1
22
3
34
0
20
0
18
0
0
5
102
Negatif bar
dan hpt
7
0
3
0
0
3
13
Total
tanaman
20
25
46
26
51
46
214
Evaluasi Karakter Agronomi Padi Mutan
Hasil analisis menunjukkan bahwa karakter agronomi seperti tinggi
tanaman, jumlah malai, panjang malai dan panjang daun bendera, jumlah gabah
hampa dan gabah isi, serta bobot 100 butir menunjukkan karakter agronomi pada
tanaman padi IR.64 mutan generasi T2 lebih baik dibandingkan dengan tanaman
padi kontrol pada taraf uji beda nyata 5% pengujian lanjutan duncan (Tabel 6 dan
Tabel 7). Dari hasil pengamatan diketahui bahwa terdapat dua galur padi mutan
yang mempunyai karakter agronomi tinggi tanaman, jumlah malai, panjang malai,
panjang daun bendera berbeda nyata dengan kontrol yaitu galur F dan G (Tabel 6).
Hasil analisis karakter komponen hasil tanaman padi IR.64 T2 mutan
dibandingkan dengan kontrol disajikan pada Tabel 7. Bobot 100 butir dari semua
galur padi mutan berbeda nyata dengan kontrol. Semua galur padi mutan
mempunyai bobot 100 butir yang lebih rendah dibandingkan dengan kontrol.
Sementara itu, jumlah gabah isi dan hampa untuk beberapa galur padi mutan
berbeda nyata dengan kontrol. Satu galur mutan yaitu mutan G mempunyai jumlah
8
gabah yang secara nyata lebih tinggi dari kontrol dan semua galur padi mutan
mempunyai jumlah gabah hampa yang lebih tinggi dari kontrol.
Tabel 6 Tinggi tanaman, jumlah malai, panjang malai dan panjang daun bendera
padi IR64 T2 mutan
Varietas
Kontrol IR.64 (A)
T2.64.B2.4.12.1
(B)
T2.64.B2.4.12.2
(C)
T2.64.B2.4.5.1 (D)
T2.64.B2.4.5.2 (E)
T2.64.B2.5.3.8 (F)
T2.64.B2.5.3.2 (G)
Keterangan:
88.53b
89.73b
Panjang
Jumlah
Malai (cm)
Daun
Malai (n=1) (n=5)
bendera
(cm)
(n=5)
21.47a
25.72b
34c
a
b
21.47
25.67
39.39b
94.77a
22.55a
26.97a
40.34ab
95.02a
96.11a
95.77a
96.99a
21.41a
21.83a
18.20b
16.84b
26.53ab
27.16a
27.02a
27.48a
39.64ab
41.50ab
40.61ab
41.80a
Tinggi tanaman
(cm) (n=1)
a dan b
Angka-angka pada kolom yang diikuti huruf yang sama dan menunjukkan hasil
yang tidak berbeda nyata pada taraf beda nyata 5% uji Duncan. n menunjukan
banyak ulangan perlakuan.
Tabel 7 Bobot 100 butir, jumlah gabah isi dan jumlah gabah hampa padi IR64 T2
mutan
Varietas
Kontrol IR.64 (A)
T2.64.B2.4.12.1 (B)
T2.64.B2.4.12.2 (C)
T2.64.B2.4.5.1 (D)
T2.64.B2.4.5.2 (E)
T2.64.B2.5.3.8 (F)
T2.64.B2.5.3.2 (G)
Bobot 100 butir (g)
(n=1)
2.44a
2.11c
2.28b
2.29b
2.23b
2.24b
2.18bc
Jumlah Gabah
Isi (n=5)
Hampa (n=5)
112.17bc
97.25c
112.52bc
103.40bc
101.49c
118.26b
137.30a
24.40c
82.24ab
79.48ab
74.40b
91.31a
77.93ab
70.66b
Keterangan: a,b,cAngka-angka pada kolom yang diikuti huruf yang sama dan menunjukkan hasil tidak
berbeda nyata pada taraf beda nyata 5% uji Duncan. n menyatakan banyaknya
ulangan perlakuan.
PEMBAHASAN
Hasil Isolasi DNA Padi
Isolasi DNA daun padi IR.64 T2 mutan galur T2.64.B2.4.12(1),
T2.64.B2.4.12(2), T2.64.B2.4.5(1), T2.64.B2.4.5(2), T2.64.B2.5.3(8) dan
T2.64.B2.5.3(2) bertujuan untuk mendapatkan DNA murni. Hasil isolasi DNA
tanaman padi selanjutnya diuji menggunakan nanodrop untuk mengetahui kualitas
atau kemurnian DNA dan konsentrasi DNA. Uji kuantitas dan kualitas DNA dari 6
galur tanaman padi IR.64 T2 mutan dan tanaman padi IR64 tipe liar (kontrol)
menunjukkan bahwa sebagian besar sampel DNA memiliki kemurnian yang baik
9
pada kisaran nilai 1.8-2.0. Konsentrasi hasil pengukuran cukup untuk digunakan
sebagai cetakan pada tahap amplifikasi dengan teknik PCR. Kontaminasi RNA dan
protein yang terdapat di dalam beberapa sampel tidak membutuhkan proses
pemurnian atau isolasi ulang. Hal ini dikarenakan RNA dan protein yang terdapat di
dalam sampel DNA akan terdegradasi pada saat proses PCR terutama pada tahapan
denaturasi. Kontaminan baik RNA maupun protein yang terdapat di dalam sampel
DNA konsentrasinya sangat kecil sehingga dapat diabaikan dan tidak berpengaruh
terhadap proses amplifikasi PCR (Sambrook et al. 2001).
Amplikon Gen bar dan Gen hpt
Konfirmasi keberadaan elemen transposon Ac/Ds di dalam tanaman padi
dilakukan dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) melalui amplifikasi gen
bar dan gen hpt. Dari informasi keberadaan elemen Ac dan Ds dapat digunakan
untuk mengetahui stabilitas tanaman padi IR64 mutan generasi T2. Elektroforesis
hasil amplifikasi PCR pada sampel DNA padi mutan generasi T2 dilakukan
menggunakan gel agarosa 1%. Hasil elektroforesi gel agarose terlihat pada Gambar
1 dan Gambar 2. Agarosa memiliki resolusi pemisahan lebih rendah dibandingkan
dengan pemisahan menggunakan poliakrilamid, kisaran pemisahan lebih besar dan
pengujian kualitatif DNA lebih baik (Sambrook et al. 2001).
Primer bar digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan elemen transposon
Ds sedangkan primer hpt untuk mengidentifikasi keberadaan transposon Ac di
dalam tanaman. Hal ini dikarenakan gen bar berada satu fragmen dengan elemen
Ds sedangkan gen hpt (hyg) berada satu fragmen dengan elemen Ac (Gambar 3).
Hasil analisis PCR menggunakan primer bar pada tanaman IR.64 T2 mutan
menunjukkan hasil positif apabila terbentuk amplikon gen bar yang berukuran ±
700 bp sedangkan primer hpt menunjukkan hasil positif apabila terbentuk amplikon
dengan ukuran 600 bp.
Hasil analisis PCR menunjukkan bahwa elemen transposon Ac dan Ds masih
tersisip di dalam genom atau kromosom galur-galur tanaman padi IR.64 T2 mutan.
Berdasarkan hasil PCR gen bar dan gen hpt, dapat diketahui sampel tanamantanaman mutan padi yang stabil. Tanaman IR.64 mutan generasi T2 telah stabil
trasnposon Ds apabila hasil amplifikasi PCR positif dengan primer bar dan negatif
dengan primer hpt. Secara umum, hasil analisis PCR pada 6 galur padi IR64 mutan
generasi T2 diperoleh sebanyak 94 dari total 214 tanaman (43,9%) yang telah stabil
yang diindikasikan dengan hasil PCR positif pada gen bar saja (Tabel 5).
Gambar 3. Peta T-DNA genom yang digunakan pada transformasi transposon
Ac/Ds (Trijatmiko et al. 2005)
10
Menurut Greco et al (2001) untuk memperoleh tanaman mutan yang
diinginkan diperlukan transposon yang stabil, sehingga tidak terjadi perpindahan ke
kromosom lain. Kualitas pita-pita hasil elektroforegram yang dihasilkan cukup
baik, karena hanya sedikit intensitas fragmen smear (Gambar 1 dan Gambar 2).
Fragmen ini muncul karena terpotongnya untaian DNA utuh penyusun kromosom
selama ekstraksi DNA. Fragmen DNA terpotong disebabkan kerusakan mekanis
karena penggerusan, ataupun aktifitas enzim selama isolasi, konsentrasi DNA yang
tinggi, dan penggunaan voltase yang terlalu besar (Jamsari 2007).
Evaluasi Karakter Agronomi
Pengamatan tinggi tanaman dilakukan pada waktu tanaman memiliki malai
dan bulir malai padi berisi padat. Tinggi tanaman diukur dari permukaan tanah
sampai ujung daun tertinggi. Evaluasi karakter tinggi tanaman menunjukkan bahwa
semua galur padi mutan mengalami perubahan tinggi tanaman yaitu lebih tinggi
apabila dibandingkan dengan kontrol kecuali untuk galur B (Tabel 6). Evaluasi
karakter jumlah malai menunjukkan bahwa empat galur padi mutan mempunyai
jumlah malai tidak berbeda nyata dengan kontrol (galur B, C, D dan E), sementara
2 galur lainnya (galur F dan G) mempunyai jumlah malai yang lebih sedikit
dibanding kontrol (Tabel 6). Panjang malai, empat galur padi mutan mempunyai
malai yang lebih panjang dibandingkan dengan kontrol. Panjang daun bendera 6
galur tanaman padi IR.64 T2 mutan menunjukan hasil yang berbeda nyata pada
taraf beda nyata 5% yaitu lebih panjang dibandingkan tanaman padi IR.64 kontrol.
Peralihan dari fase vegetatif ke fase generatif tanaman padi ditunjukan dengan
tanaman padi yang mulai berbunga. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa umur
berbunga padi IR.64 T2 mutan (84 hari) lebih cepat dibandingkan tanaman IR.64
kontrol positif (90 hari). Perbedaan pembungaan tanaman merupakan sifat
agronomi yang dipengaruhi faktor genetik dan fisiologi. Sehingga diduga terjadi
akumulasi alel-alel dari tetua pada individu (Trijatmiko 2001). Bobot 100 butir padi
IR.64 kontrol (2.44 g) lebih besar dibandingkan 6 galur tanaman padi IR.64 T2
mutan. Hasil analisis menunjukkan bobot 100 bulir gabah untuk masing-masing
galur (6 galur) padi IR.64 mutan berbeda nyata dengan bobot IR.64 kontrol karena
bobot kontrol lebih berat, sedangkan perbandingan terhadap sesama galur mutan
menunjukan hasil tidak berbeda nyata pada taraf uji lanjut 5%. Bobot IR.64 T2
mutan dan bobot bulir IR64 kontrol masih lebih kecil dibandingkan bobot bulir padi
ideal (2.8-3.0 g) (Ma et al. 2006).
Tanaman padi ideal memiliki jumlah gabah berkisar antara 180-240, dengan
gabah isi lebih dari 85 persen (Ma et al. 2006). Hasil analis lanjut pada taraf 5% uji
duncen gabah isi menunjukkan jumlah gabah isi terbesar pada galur padi mutan
T2.64.B2.5.3.2 (G) dan berbeda nyata terhadap IR.64 kontrol dan galur mutan
lainnya (Tabel7). Hasil pengamatan gabah hampa menunjukkan bahwa padi IR.64
T2 mutan pada galur T2.64.B2.4.5.2 (E) memiliki jumlah gabah hampa terbanyak
serta berbeda nyata terhadap gabah galur T2.64.B2.5.3.2, T2.64.B2.4.5.1 dan IR64
kontrol (Tabel7). Hasil analisis pada panjang daun bendera (Tabel 6) dengan hasil
pengukuran terpanjang pada galur mutan G yang berbeda nyata terhadap IR.64
kontrol dan galur mutan B pada taraf uji lanjut 5%.
Hasil penelitian Peng et al (2008) menunjukkan bahwa untuk meningkatkan
hasil padi tipe baru dibutuhkan tetua yang memiliki karakter agronomi seperti
tanaman yang tinggi, jumlah gabah per malai dan ukuran malai yang besar. Hasil
11
analisis karakter agronomi tanaman padi IR.64 T2 mutan dan IR.64 kontrol telah
menunjukan hasil yang sesuai dengan hasil penelitian Peng et al (2008) karena hasil
pengujian tinggi tanaman, jumlah gabah per malai dan ukuran malai tanaman padi
IR.64 T2 mutan yang lebih besar dibandingkan IR.64 kontrol. Perubahanperubahan karakter agronomi diduga disebabkan oleh adanya insersi elemen
transposon yang mengandung 4x enhancer pada segmen-segmen kromosom yang
berada dekat dengan gen-gen yang mungkin terkait dengan karakter-karakter
agronomi.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen bar dan gen hpt di dalam tanaman padi IR.64 T2 mutan dapat
diamplifikasi menggunakan primer spesifik gen bar dan gen hpt dan menghasilkan
amplikon masing-masing berukuran ± 700 bp dan ± 600 bp. Hasil analisis PCR
pada 6 galur padi IR64 mutan generasi T2 diperoleh sebanyak 94 dari total 214
tanaman (43,9%) yang telah stabil yang diindikasikan dengan hasil PCR positif
pada gen bar saja. Evaluasi karakter-karakter agronomi menunjukkan telah terjadi
perubahan karakter-karakter tersebut pada tanaman padi IR64 mutan generasi T2.
Perubahan-perubahan tersebut kemungkinan diduga disebabkan oleh adanya insersi
elemen transposon yang mengandung 4x enhancer pada segmen-segmen kromosom
yang berada dekat dengan gen-gen yang mungkin terkait dengan karakter-karakter
agronomi.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi gen-gen yang
berhubungan dengan perubahan-perubahan karakter agronomi pada generasi
tanaman padi IR64 mutan berikutnya.
DAFTAR PUSTAKA
Abdullah B, Tjokrowidjojo S, Kustianto B, Daradjat AA. 2005. Pembentukan padi
varietas unggul tipe baru. Penelitian Pertanian 24(1):1-7.
Bouchez D, H Hofte. 1998. Functional genomic in plants. Plant Physiol. 118:725732.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2011. Berita Resmi Statistik. Jakarta: BPS
Brooker R J. 2005. Analysis and Principle. 2nd ed. New York (US): McGraw-Hill
companies, Inc.
Griffith AJF. 1999. An Introduction to Genetic Analysis. Ed ke-7. New York (US):
W.H. Freeman.
Greco R, PBF Ouwerkerk, AJC Taal, C Favalli, T Begiristain, P Puigmonech,
L
Colombo, JHC Hoge, A Pereira. 2001. Early and multiple Ac
transpositions in rice suitable for efficient insertional mutagenesis. Plant
Molecular Biology 46: 215-227.
12
Greco R, PBF Ouwerkerk, RJ De Kam, C Sallaud, C Favalli, L Colombo, E
Guiderdoni, AH Meijer, JHC
Herawati R, Purwoko BS, Dewi IS. 2009. Keragaman genetik dan karakter
agronomi galur haploid padi gogo dengan sifat-sifat tipe baru hasi kultur
antera. J Agron Indonesia.37(2):87-94.
Hoge, A Pereira. 2003. Transpositional behavior of an Ac/Ds system for reverse
genetics in rice. Theory Applied Genetics 108: 10-24.
Jeoung DH, S An, HG Kang, S Moon, J Han, S Park, HS Lee, K An, and G
An. 2002. T-DNA insertional mutagenesis for activation tagging in rice.
Plant Physiology 130: 1636-1644.
Kolesnik T, I Szeverenyi, D Bachman, CS Kumar, S Jiang, R Ramamoorthy,
M Cal, ZG Ma, V Sundaresan, S Ramachandran. 2004. Establishing
an efficient Ac/Ds tagging system in rice. The Plant Journal 37: 301314.
[LITBANG] Balai Penelitian Bahan Pangan. 2006. Mengenal padi VUTB
Fatmawati. http://jakarta.litbang.deptan.go.id/klinikagribisnis. J Litbang
12:1-6.
Ma J, W Ma, D Ming, S Yang, Q Zhu. 2006. Characteristics of rice plant with
heavy panicle. Agricultural Sciences 5(12):101-105.
Peng S, GS Khush, P Virk, Q Tang, and Y Zou. 2008. Progress in ideotype
breeding in increase rice yield potential. Field Crop Res 108:32-38.
Rahmawati S. 2006. Status perkembangan dan perbaikan genetik padi
menggunakan teknik transformasi Agrobacterium. AgroBiogen 2: 364-375.
Rodriguez RC, Nottenburg C. 2003. Antibiotic resistance genes and their use in
genetic transformation especially in plants. [internet]. [diunduh pada 2014
Juni 15]. Tersedia pada http:www.cambiaip.org/whitepapers/TransgenidAb.
Sambrook J, DW Russel. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New
York (US): Cold-Spring Harbor Laboratory Press.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrpphotometer V1.0
User Manual. Wilmington (US): Thermo Fischer Scientific.
Trijatmiko KR, GV Arkel, A Karaba, EV Enckevort, A Pereira. 2005. Activation
tagging using En-I and Ac-Ds maize transposon systems in rice. Dalam
Comparative Analysis of Drought Resistance Genes in Arabidopsis and
Rice. Ph.D. Thesis Wageningen University, Wageningen, The Netherland
with Summaries in English, Dutch and Indonesian. p. 111-128.
Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH, Kohli A. 2011. Molecular Analysis
of Transgenic Plants. NewYork (US): Springer.
Webb KJ, Morris P. 1992. Methodologies of plant transformation, In:
Gatehouse AMR, Hilder VA, Boulter D, editor. Plant Genetic
Manipulation for Crop Protection. United Kingdom (GB): CAB
International.
13
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Diagram Alur Penelitian
Penanaman benih (IR64 mutan generasi T2 dan
IR64 kontrol)
Isolasi DNA padi
Analisis kuantitatif dan kualitatif DNA
Amplifikasi DNA dengan PCR
Elektroforesis
Identifikasi karakter unggul agronomi
Analisis data
15
Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian DNA
Sampel
T2.64.B2.4.12.1.1
Konsentrasi
A 260/280
846.1
1.93
T2.64.B2.4.12.1.2
623.5
1.92
T2.64.B2.4.12.1.3
1081.5
1.92
T2.64.B2.4.12.1.4
425.4
1.89
T2.64.B2.4.12.1.5
611.3
1.88
T2.64.B2.4.12.1.6
657.4
2.02
T2.64.B2.4.12.1.7
792.1
1.92
T2.64.B2.4.12.1.8
991.3
1.93
T2.64.B2.4.12.1.9
500.4
1.89
T2.64.B2.4.12.1.10
902.4
1.91
T2.64.B2.4.12.1.11
892.7
1.92
T2.64.B2.4.12.1.12
1417.6
1.89
T2.64.B2.4.12.1.13
578.8
1.9
T2.64.B2.4.12.1.14
651.8
1.9
T2.64.B2.4.12.1.15
2190
1.96
T2.64.B2.4.12.1.16
1792.3
2
T2.64.B2.4.12.1.17
943.3
1.94
T2.64.B2.4.12.1.18
932.9
1.94
T2.64.B2.4.12.1.19
652.5
1.93
T2.64.B2.4.12.1.20
560
1.88
T2.64.B2.4.12.2.1
1510.1
1.93
T2.64.B2.4.12.2.2
881
1.98
T2.64.B2.4.12.2.3
1020.9
1.96
T2.64.B2.4.12.2.4
711.2
1.87
T2.64.B2.4.12.2.5
1312.1
1.94
T2.64.B2.4.12.2.6
610.6
1.93
T2.64.B2.4.12.2.7
893.6
1.91
T2.64.B2.4.12.2.8
T2.64.B2.4.12.2.9
257.5
424.4
1.87
1.9
T2.64.B2.4.12.2.10
486.2
1.9
T2.64.B2.4.12.2.11
729.5
1.93
T2.64.B2.4.12.2.12
1074.9
1.94
T2.64.B2.4.12.2.13
963
1.96
T2.64.B2.4.12.2.14
650.8
1.92
T2.64.B2.4.12.2.15
457.8
1.77
T2.64.B2.4.12.2.16
1197.7
1.95
T2.64.B2.4.12.2.17
1412
1.48
T2.64.B2.4.12.2.18
585.2
1.28
T2.64.B2.4.12.2.19
638.2
T2.64.B2.4.12.2.20
779.2
1.89
2
T2.64.B2.4.12.2.21
T2.64.B2.4.12.2.22
2602.1
883.3
1.69
1.74
16
Lanjutan Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian...
Sampel
Konsentrasi
A 260/280
T2.64.B2.4.12.2.23
1103.6
1.95
T2.64.B2.4.12.2.24
1392.6
2
T2.64.B2.4.12.2.25
558.4
1.91
T2.64.B2.4.5.1.1
1720.5
1.94
T2.64.B2.4.5.1.2
726.8
1.93
T2.64.B2.4.5.1.3
52.3
1.6
T2.64.B2.4.5.1.4
1278.7
1.98
T2.64.B2.4.5.1.5
858.7
1.99
T2.64.B2.4.5.1.6
1250.9
1.97
T2.64.B2.4.5.1.7
732.2
1.9
T2.64.B2.4.5.1.8
594.2
1.89
T2.64.B2.4.5.1.9
789.8
1.92
T2.64.B2.4.5.1.10
1254.7
1.93
T2.64.B2.4.5.1.11
598.4
2.03
T2.64.B2.4.5.1.12
1091.2
1.96
T2.64.B2.4.5.1.13
752.4
1.89
T2.64.B2.4.5.1.14
1169
1.99
T2.64.B2.4.5.1.15
1153.5
1.93
T2.64.B2.4.5.1.16
825.7
1.96
T2.64.B2.4.5.1.17
1160.4
1.96
T2.64.B2.4.5.1.18
713.3
1.9
T2.64.B2.4.5.1.19
1160.1
1.94
T2.64.B2.4.5.1.20
1054.9
1.99
T2.64.B2.4.5.1.21
3222.8
1.97
T2.64.B2.4.5.1.22
1948.3
1.96
T2.64.B2.4.5.1.23
567.8
1.92
T2.64.B2.4.5.1.24
2077.5
2.05
T2.64.B2.4.5.1.25
566.6
1.85
T2.64.B2.4.5.1.26
820.8
1.92
T2.64.B2.4.5.1.27
1676.4
2
T2.64.B2.4.5.1.28
869.5
1.91
T2.64.B2.4.5.1.29
615.5
1.91
T2.64.B2.4.5.1.30
2321.8
1.99
T2.64.B2.4.5.1.31
1556.7
1.94
T2.64.B2.4.5.1.32
1770.3
1.98
T2.64.B2.4.5.1.33
1909.6
1.98
T2.64.B2.4.5.1.34
1565.4
2.01
T2.64.B2.4.5.1.35
495.9
1.91
T2.64.B2.4.5.1.36
1000.3
1.93
T2.64.B2.4.5.1.37
1217.5
1.99
T2.64.B2.4.5.1.38
T2.64.B2.4.5.1.39
1436.1
1.96
1.92
758.8
17
Lanjutan Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian...
Sampel
Konsentrasi
A 260/280
1.88
T2.64.B2.4.5.1.40
455.9
T2.64.B2.4.5.1.42
869.9
1.98
T2.64.B2.4.5.1.43
1060.7
1.94
T2.64.B2.4.5.1.44
1873.8
1.99
T2.64.B2.4.5.1.45
4257.9
1.86
T2.64.B2.4.5.1.46
1984.1
1.91
T2.64.B2.4.5.2.1
1180.1
1.98
T2.64.B2.4.5.2.2
534
1.89
T2.64.B2.4.5.2.3
1631.6
1.94
T2.64.B2.4.5.2.4
353.8
1.88
T2.64.B2.4.5.2.5
1417.4
1.96
T2.64.B2.4.5.2.6
814.5
1.86
T2.64.B2.4.5.2.7
300.5
1.89
T2.64.B2.4.5.2.8
346.4
1.86
T2.64.B2.4.5.2.9
509.5
1.96
T2.64.B2.4.5.2.10
606.9
1.95
T2.64.B2.4.5.2.11
1115.1
1.91
T2.64.B2.4.5.2.12
869.9
2.02
T2.64.B2.4.5.2.13
2400
1.75
T2.64.B2.4.5.2.14
1863.9
1.97
T2.64.B2.4.5.2.15
406.9
1.91
T2.64.B2.4.5.2.16
537.8
1.93
T2.64.B2.4.5.2.17
296.2
1.86
T2.64.B2.4.5.2.18
804.8
20.07
T2.64.B2.4.5.2.19
792.1
2.02
T2.64.B2.4.5.2.20
821.5
1.93
T2.64.B2.4.5.2.21
821.2
1.92
T2.64.B2.4.5.2.22
951.1
1.99
T2.64.B2.4.5.2.23
647.8
1.89
T2.64.B2.4.5.2.24
1237.8
1.96
T2.64.B2.4.5.2.25
967.5
1.92
T2.64.B2.4.5.2.26
842.7
1.93
T2.64.B2.5.3.8.1
604.8
1.89
T2.64.B2.5.3.8.2
368.4
1.88
T2.64.B2.5.3.8.3
593.9
1.88
T2.64.B2.5.3.8.4
486
1.93
T2.64.B2.5.3.8.5
376.9
1.92
T2.64.B2.5.3.8.6
671.1
1.97
T2.64.B2.5.3.8.7
433.9
1.91
T2.64.B2.5.3.8.8
T2.64.B2.5.3.8.9
284.5
1.43
468.5
1.92
18
Lanjutan Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian...
Sampel
Konsentrasi
A 260/280
1.92
T2.64.B2.5.3.8.11
450.6
T2.64.B2.5.3.8.12
759.3
1.93
T2.64.B2.5.3.8.13
109.2
1.72
T2.64.B2.5.3.8.14
642.8
1.93
T2.64.B2.5.3.8.15
247.9
1.83
T2.64.B2.5.3.8.16
185.7
1.82
T2.64.B2.5.3.8.17
636
1.88
T2.64.B2.5.3.8.18
387.6
1.89
T2.64.B2.5.3.8.19
579.8
1.89
T2.64.B2.5.3.8.20
314.9
1.89
T2.64.B2.5.3.8.21
281.9
1.88
T2.64.B2.5.3.8.22
512.9
1.91
T2.64.B2.5.3.8.23
520.2
1.93
T2.64.B2.5.3.8.24
162.2
1.78
T2.64.B2.5.3.8.25
578.3
1.9
T2.64.B2.5.3.8.26
599
1.92
T2.64.B2.5.3.8.27
444.1
1.92
T2.64.B2.5.3.8.28
297.4
1.85
T2.64.B2.5.3.8.29
1416.1
1.97
T2.64.B2.5.3.8.30
608.3
1.89
T2.64.B2.5.3.8.31
291.7
1.85
T2.64.B2.5.3.8.32
149.2
1.78
T2.64.B2.5.3.8.33
683.5
1.91
T2.64.B2.5.3.8.34
953.5
1.99
T2.64.B2.5.3.8.35
599.7
1.96
T2.64.B2.5.3.8.36
689.4
1.9
T2.64.B2.5.3.8.37
152.9
1.77
T2.64.B2.5.3.8.38
682.5
1.89
T2.64.B2.5.3.8.39
524.3
1.92
T2.64.B2.5.3.8.40
679
1.88
T2.64.B2.5.3.8.41
197.2
1.85
T2.64.B2.5.3.8.42
65.8
1.55
T2.64.B2.5.3.8.43
485.2
1.89
T2.64.B2.5.3.8.44
990
1.9
T2.64.B2.5.3.8.45
996.7
1.94
T2.64.B2.5.3.8.46
250.4
1.84
T2.64.B2.5.3.8.47
1118.2
1.97
T2.64.B2.5.3.8.48
380.4
1.87
T2.64.B2.5.3.8.49
347.1
1.91
T2.64.B2.5.3.8.50
196
1.93
T2.64.B2.5.3.8.51
T2.64.B2.5.3.2.1
966.8
1.99
1.97
1072.8
19
Lanjutan Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian...
Sampel
Konsentrasi
A 260/280
T2.64.B2.5.3.2.5
1233.5
1.89
T2.64.B2.5.3.2.6
453.9
1.87
T2.64.B2.5.3.2.7
755.6
1.96
T2.64.B2.5.3.2.8
1028.7
1.95
T2.64.B2.5.3.2.9
82.4
1.76
T2.64.B2.5.3.2.10
627.6
1.94
T2.64.B2.5.3.2.11
400.8
1.89
T2.64.B2.5.3.2.12
392.5
1.92
T2.64.B2.5.3.2.13
675
1.85
T2.64.B2.5.3.2.14
1971.2
1.98
T2.64.B2.5.3.2.15
1856.7
1.97
T2.64.B2.5.3.2.16
528.8
1.87
T2.64.B2.5.3.2.17
402.4
1.88
T2.64.B2.5.3.2.18
676.7
1.89
T2.64.B2.5.3.2.19
471.3
1.92
T2.64.B2.5.3.2.20
789.5
1.94
T2.64.B2.5.3.2.21
912.6
1.94
T2.64.B2.5.3.2.22
602.9
1.89
T2.64.B2.5.3.2.23
545.8
1.88
T2.64.B2.5.3.2.24
670.5
1.99
T2.64.B2.5.3.2.25
281.7
1.88
T2.64.B2.5.3.2.26
303.3
1.85
T2.64.B2.5.3.2.27
865.5
1.95
T2.64.B2.5.3.2.28
1342
1.93
T2.64.B2.5.3.2.29
692.8
1.96
T2.64.B2.5.3.2.30
553.7
1.9
T2.64.B2.5.3.2.31
560
1.9
T2.64.B2.5.3.2.32
798.3
1.93
T2.64.B2.5.3.2.33
1187.3
2
T2.64.B2.5.3.2.34
586.9
1.94
T2.64.B2.5.3.2.35
870
1.94
T2.64.B2.5.3.2.36
1888.1
2.01
T2.64.B2.5.3.2.37
779.6
1.98
T2.64.B2.5.3.2.38
601.6
1.89
T2.64.B2.5.3.2.39
1434.3
1.95
T2.64.B2.5.3.2.40
561.7
1.89
T2.64.B2.5.3.2.41
1142.9
2
T2.64.B2.5.3.2.42
620
1.92
T2.64.B2.5.3.2.43
521.9
1.89
T2.64.B2.5.3.2.44
617.1
1.89
T2.64.B2.5.3.2.45
463.5
1.87
T2.64.B2.5.3.2.46
487
1.88
20
Lanjutan Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian...
Sampel
Konsentrasi
A 260/280
Kontrol 1
441.2
1.9
Kontrol 2
689.5
1.9
Kontrol 3
1151.8
1.97
Kontrol 4
568.2
1.9
Kontrol 5
650.4
1.95
Kontrol 6
666.6
1.91
Kontrol 7
859.6
1.87
Kontrol 8
947.8
1.96
Kontrol 9
993.4
1.95
Kontrol 10
635.2
1.88
Kontrol 11
686.4
1.89
Kontrol 12
687.2
1.9
Kontrol 13
362.2
1.86
Kontrol 14
449.8
1.9
Kontrol 15
541.5
1.87
Kontrol 16
735.9
2.01
Kontrol 17
351.7
1.88
Kontrol 18
737.6
1.95
Kontrol 19
1496.3
1.98
Kontrol 20
340
1.85
Kontrol 21
415.2
1.9
Kontrol 22
286.4
1.88
Kontrol 23
460.2
1.88
Kontrol 24
2012.4
1.94
Kontrol 25
979.8
1.92
21
Lampiran 3 Elektroforegram Sampel Tanaman Padi IR.64 T2 Mutan Hasil
Amplifikasi Menggunakan Primer Bar
22
Lanjutan Lampiran 3 Elektroforegram Sampel Tanaman...
23
Lanjutan Lampiran 3 Elektroforegram Sampel Tanaman...
24
Lampiran 4 Elektroforegram Sampel Tanaman Padi IR.64 T2 Mutan Hasil
Amplifikasi Menggunakan Primer Hpt
25
Lanjutan Lampiran 4 Elektroforegram Sampel Tanaman...
26
Lampiran 5 Hasil Analisis Kestabilan Transposon Ds
Padi Mutan
Gen bar
Gen hpt
Kestabilan
T2.64.B2.4.12.1.1
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.2
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.3
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.4
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.5
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.6
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.7
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.8
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.9
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.10
-
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.11
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.12
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.13
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.14
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.1.15
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.16
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.12.1.17
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.12.1.18
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.12.1.19
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.12.1.20
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.12.2.1
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.2
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.3
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.4
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.5
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.6
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.7
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.8
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.9
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.10
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.11
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.12
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.13
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.12.2.14
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.12.2.15
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.16
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.17
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.18
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.19
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.20
-
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.21
+
+
T2.64.B2.4.12.2.22
+
+
Tidak stabil
Tidak stabil
27
Lanjutan Lampiran 5 Hasil Analisis Kestabilan...
Padi Mutan
Gen bar
Gen hpt
Kestabilan
T2.64.B2.4.12.2.23
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.24
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.12.2.25
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.1
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.2
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.3
-
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.4
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.1.5
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.6
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.1.7
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.8
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.9
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.10
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.11
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.12
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.13
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.14
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.1.15
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.1.16
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.17
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.18
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.19
-
-
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.20
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.21
-
-
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.22
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.23
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.24
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.25
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.26
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.27
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.1.28
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.29
-
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.30
-
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.31
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.32
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.33
-
-
Tidak mutan
T2.64.B2.4.5.1.34
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.35
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.36
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.37
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.1.38
T2.64.B2.4.5.1.39
+
+
Tidak stabil
+
+
Tidak stabil
28
Lanjutan Lampiran 5 Hasil Analisis Kestabilan...
Padi Mutan
Gen bar
Gen hpt
T2.64.B2.4.5.1.40
+
+
Kestabilan
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.41
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.42
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.43
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.44
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.45
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.1.46
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.1
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.2.2
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.3
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.4
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.5
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.6
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.7
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.8
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.9
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.10
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.11
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.12
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.13
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.14
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.2.15
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.16
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.17
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.2.18
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.19
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.2.20
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.21
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.22
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.23
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.24
+
+
Tidak stabil
T2.64.B2.4.5.2.25
+
-
Stabil
T2.64.B2.4.5.2.26
+
-