ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME.

(1)

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

SKRIPSI

diajukan untuk memenuhi sebagian dari syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Program Studi Biologi

Oleh

Nilamsari Kurniasih Indrawan 1102839

PROGRAM STUDI BIOLOGI DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

(2)

NILAMSARI KURNIASIH INDRAWAN

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN MELANOCORTIN – 1 RESEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

disetujui dan disahkan oleh pembimbing : Pembimbing I

Diah Kusumawaty, M.Si. NIP. 197008112001122001

Pembimbing II

Any Aryani, M.Si. NIP. 197105302001122001

Mengetahui,

Ketua Departemen Pendidikan Biologi

Dr. Bambang Supriatno, M.Si. NIP 196305211988031002

(3)

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN – 1 RESEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Oleh

Nilamsari Kurniasih Indrawan

Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi sebagian syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biologi Departemen Pendidikan Biologi

Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

November 2015

Hak Cipta dilindungi undang-undang.

Skripsi ini tidak boleh diperbanyak seluruhnya atau sebagian, dengan dicetak ulang, difotocopy, atau cara lainnya tanpa izin penulis.

(4)

i Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

ABSTRAK

Ikan Gurame (Osphronemus goramy) merupakan ikan air tawar yang banyak ditemukan di kawasan Indonesia yang memiliki kelimpahan yang cukup banyak serta memiliki banyak manfaat pada bidang pangan dan ekonomi. Potensi yang dimiliki dari O. goramy cukup tinggi, namun penelitian ikan gurame masih sangat minim. Penelitian mengenai database sequence, gen melanosit Melanocortin – 1 – Receptor (MC1R) pada O. goramy belum pernah diteliti. Gen MC1R adalah gen

pengkode yang menerima respon berupa sinyal untuk memproduksi melanin dan proses pembentukan pigmen. Isolasi gen MC1R pada penelitian ini menggunakan metode PCR dengan dua pasang primer yang didesain berdasarkan sequence gen MC1R dari ikan Infraclassis Teleostei. Primer yang didesain yaitu primer

degenerate non nested dan primer degenerate nested menggunakan aplikasi

Primaclade. Hasil penelitian menunjukan bahwa gen MC1R berhasil disolasi menggunakan kedua pasangan primer yang telah didesain dengan analisis secara bioinformatik menggunakan aplikasi Premier Biosoft. Analisis bioinformatik menunjukan tidak terdapat struktur sekunder dari primer. Hasil BLAST primer menempel pada gen MC1R DNA genome dan CDS. Desain primer. Sequence gen sebagai peran utama untuk pembuatan primer spesifik dan dianalisis dengan validasi cDNA O. goramy yang telah terinfeksi oleh bakteri Aeromonas

hydrophilla. Primer spesifik berhasil mengamplifikasi gen MC1R. Hasil sequence

yang telah didapatkan, dikarakteriksasi serta dianalisis menggunakan pohon filogenetika dan aplikasi SMART untuk mengetahui kebenaran gen MC1R pada

sequence DNA O. goramy. Ternyata O. goramy memiliki kekerabatan paling baik

dengan Onigocia bimaculata dan memiliki kekerabatan dekat dengan ordo Tetraodontiformes,

(5)

ABSTRACT

Gurame fish (Osphronemus goramy) is a freshwater fish that commonly found in the area of Indonesia, it has quite a lot abundance and has a lot of benefits in food and economic sector. Benefits of O. goramy felt by the public but research of the genes in Osphronemus goramy is still very low. Research on database sequences, melanocytes gene Melanocortin - 1 - Receptor (MC1R) on O. goramy has not been studied. MC1R gene is an encoding gene that receives signal’s response and process for producing melanin pigment formation. Isolation of MC1R gene in this study is using PCR with pair of primers designed based on the MC1R gene sequences Infraclassis Teleostei fish. Primers designed in this research is non-nested degenerate primers and non-nested degenerate primers using Primaclade. The results showed that the gene MC1R managed electrically insulated using both primers have the bioinformatics analysis using the Premier Biosoft application. Bioinformatics analysis showed there was no secondary structure of primer. BLAST results primer attached to the DNA genome and CDS MC1R gene. Sequence of genes as the main role for the manufacture of specific primers and analyzed by cDNA validation O. goramy who have been infected by Aeromonas

hydrophilla bacteria. Specific primer managed to amplify the target. Results of

sequence characterization that has been obtained by analysis using phylogenetic trees and applications SMART to determine the truth of the MC1R gene in the DNA sequence O. goramy. O. goramy have found that most good kinship with

Onigocia bimaculata and has a close kinship with the order Tetraodontiformes.

(6)

iii Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

KATA PENGANTAR

Puji serta syukur terpanjatkan ke Hadirat Illahi Rabbi, Allah SWT yang telah memberikan kesempatan dan nikmat-Nya, ridha dan izin-Nya serta kasih sayang Nya yang selalu tercurah limpahkan kepada penulis untuk dapat menyelesaikan skripi yang berjudul “Karakterisasi Gen Parsial Melanocortin-1Receptor (MC1R). Pada Ikan Gurame (Osphronemus goramy)” ini dengan baik dan benar. Salawat serta salam selalu tercurah limpahkan kepada Nabi besar, Rasulullah SAW, beserta keluarganya, sahabatnya dan kita semua sebagai umatnya.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kata kesempurnaan, banyak sekali kekurangan sehingga perlu perbaikan. Semua kekurangan ini diakui sebagai kekhilafan dari penulis sebagai tempat kekurangan dan kesalahan. Oleh karena itu penulis sangat mengharapkan adanya saran dan kritik untuk perbaikan untuk menjadi lebih baik lagi di masa yang akan datang. Penulis berharap skripsi ini akan bermanfaat sedikitnya dan sebagai sumbangan untuk dunia ilmu pengetahuan.

Penulis tidak dapat menyelesaikan skripsi ini banyak bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis berkenan untuk menghaturkan ucapan terima kasih dari yang terdalam kepada:

1. Ibu Diah Kusumawaty, M.Si. selaku dosen pembimbing I atas segala bimbingan, arahan, bantuan dana, dan motivasi selama penyusunan skripsi. 2. Ibu Any Aryani, M.Si. selaku dosen pembimbing II atas segala masukan,

bimbingan dan arahan serta motivasi selama penyusunan skripsi.

3. Bapak Dr.Bambang Supriatno, M.Si. selaku ketua Departemen Pendidikan Biologi FPMIPA UPI atas segala kemudahan yang diberikan selama penyusunan skripsi.

4. Bapak Dr. Didik Priyandoko, M.Si. selaku ketua prodi Biologi Departemen Pendidikan Biologi atas segala bantuan dan kemudahan yang diberikan selama penyusunan skripsi

(7)

5. Bapak Dr. Yayan Sanjaya, M.Si. selaku dosen pembimbing akademik atas segala masukan, bimbingan, arahan serta motivasi yang diberikan dari awal penulis masuk hingga penyusunan skripsi.

6. Seluruh staf dosen departemen Pendidikan Biologi FPMIPA UPI atas segala ilmu dan waktu yang telah diberikan selama ini.

7. Seluruh staf laboran, Pak Deden, Pak Sarna, Bu Iin, Teh Enci, dan Pak Kus atas segala bantuan yang telah diberikan demi kelancaran penelitian skripsi. 8. Orang tua tercinta, Mamah Netty Kurniati dan Abah Ir, Denny Indrawan,

Kakak-kakak tersayang Teh Sari Dewi Kurniasih, M.Si dan Aa Radian Febi Indrawan, S.T., Andung Enok Sumarni, Angku Juliar Thaib, Bibi- bibi: Bi Suzie, Bi Susan, Bi Andam, Om Daus, Ua-ua: Ua Tata, Ua Tini, Ua Nina, dan Ua Tati yang selalu memberikan dukungan, bimbingan, perhatian, motivasi serta doa.

9. Sahabat terbaik dan tersayang serta seperjuangan, satu kosan, satu lab, satu kelompok kegiatan, satu kelas Pina Rosica, dan Rizka Khairunisa. Radita Maulasari, Septi Sri Rahmawati, Deasi Resnasari, Tia Nur Jannah, Arini Fadillah yang selalu mendukung, mendoakan serta ikatan ukhuwahnya.

10.Teman-teman satu tim lab Angga Kly Sandy selaku rekan kerja terbaik, dan ‘Genk Lab Mikro’ Sandy Ahmad Herdiansyah, Dina Karina Islami, Putri Yunitha Wardini, Puji Nurhayat, Amelia Qadaryanti, dan Hestiarahma Purnamasari yang selalu memberikan semangat dan keceriaan saat penelitian. 11.Sahabat serta saudara seperjuangan ‘GREATEST TEAM 2011’ Nur Rokhmani Tri Siswi, Erna Nur Hasanah, Dani Nur Arifin, M. Hilman Anwaruddin, Dimas Mutiar, Ahmad Fauzi Mulyana, dan Helmi Nasrulhaq yang memberukan semangat, doa dalam ikatan ukhuwahnya.

12.Adik-adik kelas tersayang angkatan 2012 Fippy, Filda, Siti Sarah, Dzihni, Novi Dewi, Dede, Listia, Sky, dan Akbar, angkatan 2013 Fanny, Audya, Lulut, Zahra, Siti Nuroniah, Siti Komariah, dan Tuqo, angkatan 2014 Nadong, Uswah, Fatimah, Dei, Puti, Nida dan Anggi semoga menjadi lebih baik kelak.

(8)

v Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

13.Keluarga Biologi C 2011 ‘Tocsic’ yang menjadi teman-teman seperjuangan selama empat di kampus UPI tercinta.

14.Keluarga Besar DPM REMA UPI 2015 yang telah memberikan warna dalam amanah dan perjuangan di dalam organisasi kampus Raditya Muttaqin S., Ina, Jihad, Dea, Azizah, Eha, Ririn Amna, Yayu, Epul, Ayu Aditya, Arni, Devi, Yeni, Alfi, Ihsan dan Farhan

15.Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu serta mendoakan hingga selesai katya tulis ini.

Penulis menyadari banyak sekali kekurangan dalam penulisan skripsi ini tanpa dukungan dan bimbingan pihak yang terkait penulis tidak mungkin dapat menyelesaikan skripsi ini. Dengan segala kerendahan hati, penulis menerima kritik dan saran untuk dapat memperbaiki segala kekurangan. Semoga Allah membalas semua kebaikan dan pengorbanan yang telah diberikan.

Bandung, November 2015

(9)

vi DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK ... i

ABSTRACT ... ii

KATA PENGANTAR ... iii

DAFTAR ISI ... vi

DAFTAR GAMBAR ... ix

DAFTAR TABEL ... xi

DAFTAR LAMPIRAN ... xii

BAB I PENDAHULUAN ... 1

A. Latar Belakang ... 1

B. Rumusan Masalah ... 4

C. Pertanyaan Penelitian ... 4

D. Batasan Masalah ... 5

E. Tujuan Penelitian ... 5

F. Manfaat Penelitian ... 5

BAB II AMPLIFIKASI DNA GEN MC1R IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)... 6

A. Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) ... 6

B. Sel Melanosit dan Melanogenesis ... 7

C. Gen Melanocortin – 1 Receptor MC1R ... 8

D. Isolasi DNA Genome ... 10

E. Polymerase Chain Reaction (PCR) ... 12

F. Primer Degenerate Nested dan Non Nested ... 15

G. Karakterisasi Gen ... 17

1. Analisis Sequence DNA ... 17

2. Analisis Protein ... 18

3. Pohon Filogenetik ... 19

BAB III METODE PENELITIAN ... 20

A. Jenis Penelitian ... 20

(10)

vii

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

C. Waktu dan Lokasi Penelitian... 20

D. Alat dan Bahan ... 20

E. Alur Penelitian dan Langkah Kerja ... 20

1. Tahap Persiapan ... 20

2. Tahap Penelitian ... 21

a. Mengumpulkan sequence gen MC1R dari berbagai jenis ikan Infraclassis Teleostei ... 21

b. Desain Pasangan Primer Degenerate Gen MC1R ... 22

c. Isolasi DNA Genome Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) ... 22

1. Isolasi DNA Kromosom ... 22

2. Pengukuran Konsentrasi DNA ... 23

d. Amplifikasi dengan Metode PCR dan Elektroforesis ... 23

e. Sequenccing DNA dan Analisis Urutan Gen MC1R ... 25

f. Perancangan Primer Spesifik dari Sequence Gen MC1R ... 26

g. Uji Validasi Primer Spesifik Stok DNA Genome Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) dan Stok Sampel cDNA Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) ... 26

h. Analisis Data Bioinformatika dan Karakterisasi Pohon Filogenetik ... 26

F. Alur Penelitian ... 27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 28

A. Primer Degenerate Non Nested dan Nested Gen MC1R ... 28

B. Isolasi DNA Genome Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) ... 32

C. Isolasi DNA MC1R Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) dengan Primer Degenerate Nested dan Non Nested ... 34

1. Amplifikasi DNA MC1R Primer Degenerate Non Nested ... 34

2. Amplifikasi DNA MC1R Primer Degenerate Nested ... 38

D. Karakterisasi Gen MC1R Osphronemus gourami ... 39

1. Pensejajaran Sequence Nukleotida Gen MC1R Osphronemus gouramy ... 39

2. Pensejajaran Sequence Asam Amino Gen MC1R Osphronemus gouramy ... 50

3. Analisis Pohon Filogenetik MC1R Osphronemus gouramy ... 56

E. Desain Primer Spesifik, Amplifikasi DNA Genome dan Validasi cDNA Osphronemus gouramy ... 59

(11)

viii

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 62

A. Kesimpulan ... 62

B. Saran ... 62

DAFTAR PUSTAKA ... 63

(12)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

DAFTAR GAMBAR

Gambar

2.1 Osphronemus gouramy ... 6

2.2 Jalur Melanogenesis ... 8

2.3 Lokasi Gen MC1R ... 9

2.4 Struktur Domain Analisis SMART ... 18

3.1 Program PCR Primer Degenerate Non Nested ... 24

3.2 Program PCR Primer Degenerate Nested ... 24

3.3 Diagram Alur Penelitian... 26

4.1 Hasil Kandidat Primer Degenerate ... 27

4.2 Elektroforesis DNA Genome gurame sampel isolasi DNA terbentuk pita berukuran lebih dari 10.000 bp dengan smear potongan fragmen DNA genome ... 32

4.3 Elektrogram primer MC1R_F1 dan MC1R_R1, produk PCR sampel menunjukan smear tidak terbentuk pita DNA target ... 34

4.4 Elektrogram primer non nested dengan hasil pita DNA tunggal ukuran 600 bp dan primer nested dengan hasil pita DNA tunggal ukuran 400 bp ... 35

4.5 Posisi urutan primer pada sequence MC1R Takifugu rubripes... 37

4.6 Contig sequence gen MC1R menggunakan aplikasi DNA Baser ... 39

4.7 Hasil analisis BLASTn sequence MC1R pita berwarna merah menandakan tingkat kesamaan sequence sampel dengan sequence data di GenBank. ... 41

4.8 Hasil analisis BLASTn sequence MC1R berdasarkan kesamaan sequence terhadap sequence DNA Osphronemus gouramy (sampel) dengan data di GenBank NCBI terdapat 100 spesies ikan kesaamaan gen MC1R ... 42 4.9 Hasil alignment sequence basa nukleotida gen MC1R, Basa dengan

highlight berwarna kuning menyatakan kesamaan basa dari setiap

spesies sedangkan basa dengan highlight abu-abu menyatakan Halaman

(13)

kesamaan yang dimiliki oleh Osphronemus gouramy dengan beberapa spesies. ... 49 4.10 Hasil analisis BLASTp sequence asam amino gen MC1R

Osphronemus gouramy terdapat 100 spesies dengan total jumlah 200

asam amino didapatkan 100 spesies yang memiliki kesaamaan dengan

sequence DNA Osphronemus gouramy terdapat 12 spesies yang

memiliki kesamaan pada posisi awal asam amino berkisar 1-40 ... 50 4.11 Hasil alignment sequence asam amino Gen MC1R, sequence dengan

highlight berwarna kuning menyatakan kesamaan basa dari setiap

spesies sedangkan basa dengan highlight hijau menyatakan pernbedaan yang hanya dimiliki oleh Osphronemus gouramy dan kode dengan diberi highlight merah menandakan start codon ... 52 4.12 Struktur domain protein Osphronemus gouramy (a), hasil analisis SMART didapatkan daerah domain transmembran MC1R, terdapat pada sequence asam amino 1-100 terdapat 2 daerah transmembran dan 3 domain transmembran, struktur domain protein dari Takifugu sp (b) memiliki 7 domain Transmembran ... 54 4.13 Pohon filogenetik Infraclassis Teleostei berdasarkan sequence nukleotida gen MC1R metode Neighbour-Joining, Osphronemus

gouramy berada pada kelompok besar Infraclassis Teleostei dan

berada pada kelompok 1 Ordo Perciformes ... 55 4.14 Pohon filogenetik Infraclassis Teleostei berdasarkan sequence asam amino gen MC1R metode Neighbour-Joining, Osphronemus gouramy berada pada kelompok besar Infraclassis Teleostei ... 55 4.15 Elektrogram hasil PCR primer spesifik validasi cDNA (a) dan Hasil PCR Mix DNA (b), keduanya mengamplifikasi DNA dengan ukuran 110 bp ... 58 4.16 Hasil alignment sequence validasi cDNA menggunakan primer spesifik, terdapat 1 delesi pada sequence validasi cDNA (urutan dan 149) 1 basa yang berbeda (urutan ke 71) ... 59

(14)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

DAFTAR TABEL

Tabel

3.1 Daftar species ikan Ordo Perciformes untuk desain Primer

Degenerate ... 20

3.2 Komposisi reaksi PCR DreamTaq Green PCR Master Mix 2x ... 23

4.1 Kandidat sequence primer non nested dan nested Primaclade ... 28

4.2 Skala analisis primer Premier Biosoft ... 29

4.3 Nilai kemurnian dan konsentrasi isolasi DNA genome ... 33

4.4 Uji kuantitatif hasil PCR primer nested dan non nested ... 36

4.5 Hasil BLASTn sequence nukleotida gen MC1R... 40

4.6 Hasil BLASTp sequence asam amino Osphronrmus gouramy ... 51

4.7 Primer spesifik gen MC1R Opshronemus gouramy ... 58 Halaman

(15)

xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran

1 Daftar alat dan bahan penelitian ... 68 2 Protokol pembuatan larutan stok ... 70

(16)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang

Indonesia merupakan salah satu negara mega biodiversity di dunia yang memiliki kekayaan ekosistem beragam, salah satunya adalah ekosistem perairan air tawar yang memiliki 1300 jenis ikan dengan kepadatan 720/km2 (Wargasasmita, 2002). Kekayaan tersebut cukup baik dan berpotensi sebagai penghasil ikan (Kusumo et al., 2002). Ikan gurame merupakan salah satu ikan air tawar yang dibudidayakan di Indonesia namun sering ditemukan pula pada perairan kawasan Asia Tenggara. Pada aspek pangan ikan gurame dikonsumsi masyarakat dan dikenal dengan kelezatannya, selain itu pada aspek bisnis ikan ini memiliki nilai ekonomi yang cukup tinggi karena daya jual yang dimiliki ikan gurame cukup besar, hal ini disebabkan oleh masyarakat yang mengkonsumsi ikan gurame berjumlah tinggi (Setjaningsih et al., 2007).

Strain ikan gurame yang dibudidayakan di Indonesia diantaranya gurame

angsa, jepang, bastarn, porselen, bluesafir, dan paris. Keanekaragaman ini akibat proses terjadinya variasi genetik salah satumya dengan proses genetic ingression (Nugroho, 2011). Variasi genetik merupakan perbedaan sifat alel yang dapat terlihat jelas hal ini diakibatkan oleh mutasi kode genetik pada sequence DNA. Mutasi pada kode genetik dapat terjadi akibat stress atau kondisi alam yang ekstrem (Campbell et al., 2011).

Masalah pembudidayaan ikan secara umum terjadi akibat kondisi lingkungan yang tidak baik sehingga mengakibatkan stress pada ikan dan menimbulkan penyakit. Penyakit yang biasa menginfeksi dari ikan air tawar terdiri dari dua macam diantaranya adalah penyakit yang disebabkan oleh parasit atau dari lingkungan yang ekstrim. Gejala penyakit yang muncul dari ikan, baik akibat infeksi bakteri patogen atau kondisi lingkungan yang ekstrim akan menyebabkan kematian sehingga budidaya ikan akan menurun produktivitasnya. Penyakit yang biasa terjadi pada ikan air tawar salah satunya disebabkan oleh bakteri patogen

(17)

Beberapa gejala akibat kondisi stress pada ikan atau saat terserang penyakit, baik terinfeksi bakteri patogen ataupun sebaliknya dapat terlihat pada kulit. Peradangan yang terjadi pada kulit diantaranya perubahan warna kulit ikan atau kehitaman pada bagian-bagian terinfeksi. Menurut Baugman dan Saghari (2009) menyatakan bahwa warna kulit serta perubahannya ditentukan oleh pigmen utama yaitu melanin yang disintesiskan pada melanosom melalui organel sel khusus pada melanosit yang terletak pada lapisan basal epidermis. Ekspresi pigmen terjadi pada setiap hewan, warna kulit menjadi hitam merupakan salah satu tanda ekspresi gen pigmen melanin, ekspresi ini dapat dipengaruhi oleh adanya stress salah satunya adalah stress dari infeksi penyakit atau infeksi dari bakteri (Jitmau

et al., 2010).

Perubahan warna pada kulit, sisik dan bulu disebabkan oleh adanya aktivitas dari sel melanosit yang menghasilkan melanin (Yatim, 1996). Pembentukan melanin terjadi pada sel melanosit bila adanya stress seperti sinar UV, infeksi penyakit, temperatur dan stress lainnya untuk menginduksi pembentukan melanin oleh sel melanosit (Jitmau, Rondonuwu, & Semangun, 2010). Proses melanogenesis dapat dipengaruhi oleh menurun atau meningkatnya sistem imunitas. Sistem imunitas dipengaruhi pula oleh stress dan infeksi dari zat atau mikroba asing sebagai perlawanan dan pertahanan tubuh, hal ini terjadi pula pada setiap vertebrata dan salah satunya adalah ikan, penelitian ini sudah diteliti pada ikan salmon (Arciuli et al., 2012).

Gen yang mengatur pembentukan melanin oleh sel melanosit diantaranya adalah gen Melanocortin -1 Receptor (MC1R) dan gen Tyrosinase-related Protein 1 (Tyrp1). Gen MC1R merupakan gen yang mengode produksi melanin pada kulit dan rambut, sedangkan gen Tyrp1 merupakan enzim yang mengkode untuk enzim tyronase yang penting dalam proses pembentukan pigmen atau melanin. Berdasarkan penelitian (Tezuka et al., 2011) bahwa gen penghasil melanin dalam penelitian ini adalah gen MC1R pada ikan dapat terekspresikan akibat kondisi lingkungan, kondisi yang terlihat atau fenotip dari warna kulit ikan yang berwarna hitam sesuai dengan genotip yang ada pada ikan tersebut, dalam arti lain, kondisi tubuh ikan berwarna hitam ditemukan adanya keberadaan gen MC1R dalam ikan

(18)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

tersebut. Penelitian ini merupakan penelitian pertama yang meneliti tentang gen MC1R hingga didapatkan kode sequence yang utuh.

Database sequence DNA dari ikan Gurame saat ini masih sangat minim,

berdasarkan data yang didapatkan dari GenBank NCBI gen pada ikan gurame (Osphronemus gouramy) hanya terdapat 13 gen. Hal ini dapat membuat peneliti lain tidak dapat mengetahui potensi besar yang dimiliki oleh ikan gurame (NCBI, 2015). Database sequence adalah data komputerisasi sequence basa nukleotida dan protein dari suatu gen DNA yang disimpan dan diolah sebagai informasi dan dapat diambil secara mudah (Xiong, 2006). Database sequence salah satu dasar penting dalam pembelajaran serta penelitian dalam bidang biologi molekuler.

Sequence merupakan kunci untuk menjawab pertanyaan penelitian yang ada pada

bidang biologi untuk menganalisis dan mendeterminasi, jika para peneliti memahami sequence, maka para peneliti dapat menghubungkan ilmu lain untuk perkembangan ilmu terapan lainnya yang saling berkaitan (Claverie & Notredame, 2007).

Museum sequence (GenBank) merupakan tempat penting untuk mengabadikan, menjaga serta mengembangkan sequence DNA dari suatu gen yang telah diteliti oleh para peneliti dalam proses memecahkan masalah, mengembangkan potensi serta memberikan solusi dari segala hal yang dapat dikembangkan melalui bidang biologi molekuler. GenBank merupakan tempat penyimpanan database sequence basa nukleotida gen dari berbagai organisme dan mikrooganisme. Salah satu

GenBank yang diketahui diantaranya: National Center for Biotechnology Information (NCBI) dari United State, Molecular Biology Laboratory (EMBL)

dari Eropa, dan DNA Data Bank of Japan (DDBJ) dari Jepang. (Xiong, 2006; Claverie & Notredame, 2007). Kekayaan database sequence merupakan salah satu gudang ilmu yang akan didapatkan dari berbagai kalangan pada masyarakat dan akan mendapatkan manfaat bagi peneliti.

Salah satu anggota Dewan Riset Nasional bagian perikanan Indonesia menyatakan bahwa penelitian Indonesia dalam bidang perikanan masih sangatlah kurang, sehingga dibutuhkan penelitian lebih dalam untuk bidang perikanan guna memanfaatkan kekayaan Indonesia dan mengembangkannya (Sb, 2013). Saat ini penelitian mengenai genetika sel melanosit ikan di Indonesia masih sangat minim,

(19)

adanya informasi genetik mengenai urutan basa nitrogen gen ikan gurame pada literatur dan informasi genetik GenBank masih sangat sedikit, sehingga untuk memecahkan salah satu permasalahan serta mengembangkan ilmu dibutuhkan kajian penelitian gen MC1R untuk memperkaya informasi genetika. Informasi kajian gen MC1R dapat dijadikan sebagai awal tinjauan dan penelitian lebih dalam untuk menghadapi permasalahan yang ada pada ikan gurame.

Penelitian untuk mendapatkan sequences diperlukan metode isolasi gen yang tepat salah satunya dengan proses amplifikasi DNA menggunakan primer yang tepat sesuai dengan kriteria dan standar pembuatan primer yang baik. Berdasarkan paparan yang sudah dijelaskan bahwa diperlukan penelitian untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi gen MC1R sel melanosit pada ikan gurame yang belum diketahui sequences DNA nya, dengan menggunakan primer yang dirancang dari

sequences ikan Teleostei, sebagai gerbang awal solusi pemecahan salah satu

masalah kesehatan ikan gurame yaitu ikan gurame yang telah terinfeksi oleh

Aeromonas hydrophila yang merupakan bakteri patogen bagi ikan gurame dan

ikan tawar lainnya. Harapan dari penelitian karakterisasi gen MC1R ini ditemukannya primer spesifik yang dapat membantu menganalisis tingkat stress dan kesehatan ikan gurame berdasarkan kualitas warna tubuhnya.

B. Rumusan Masalah

Apakah primer yang dirancang dari sequences ikan infraclassis Teleostei dapat mengamplifikasi gen Melanocortin-1-Receptor (MC1R) pada DNA genom ikan gurame (Osphronemus gouramy)?

C. Pertanyaan Penelitian

1) Bagaimana cara mendesain primer degenerate untuk mengamplifikasi gen MC1R?

2) Bagaimana keberhasilan amplifikasi gen MC1R menggunakan primer

degenerate?

(20)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

D. Batasan Masalah

1) Sampel merupakan ikan gurame (Osphronemus gouramy) varian Angsa (Soang) yang didapat dari pengelolaan ikan Tasikmalaya dan Sukabumi, Jawa Barat, Indonesia

2) Primer spesifik yang digunakan merupakan hasil sequencing isolasi DNA genom dari gen MC1R.

3) Primer degenerate yang digunakan merupakan hasil alignment dari kumpulan DNA gen MC1R infraclassis Teleostei.

4) Karakterisasi gen yang dilakukan merupakan analisis multiple alignment, BLAST sequence, pohon filogenetik dan struktur protein domain.

E. Tujuan Penelitian

Mengkarakterisasi gen MC1R ikan gurame (Osphronemus gouramy)

F. Manfaat Penelitian

1) Memberikan informasi mengenai isolasi DNA genom MC1R pada ikan gurame (Osphronemus gouramy).

2) Memberikan informasi mengenai uji validasi primer spesifik DNA genom MC1R dan stok sampel cDNA pada ikan gurame Osphronemus gouramy yang telah diinfeksi oleh Aeromonas hydrophila Strain A2.

3) Sebagai ilmu, khususnya dibidang biologi molekuler, mikrobiologi, dan hewan

4) Sebagai kajian pustaka awal bagi peneliti lain untuk mengembangkan penelitian.

(21)

BAB III

METODE PENELITIAN A.Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian deskriptif. Penelitian deskriptif adalah penelitian yang mendeskripsikan suatu gambaran yang sistematis dengan fakta-fakta yang didapatkan (Nazir, 1988).

B. Populasi dan Sampel

1. Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah 30 individu ikan Gurame (Osphronemus gouramy) yang diambil dari kota Tasikmalaya dan Sukabumi 2. Sampel yang digunakan adalah DNA genome ikan gurame (Osphronemus

gouramy)

3. Sequence gen MC1R dari Ordo Perciformes yang diperoleh dari GenBank

NCBI. Daftar species ikan dari Ordo Perciformes yang digunakan sebagaimana dipaparkan pada Tabel 3.1

C. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian ini dimulai pada bulan Januari 2015 sampai dengan September 2015 yang dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Gedung JICA FPMIPA A dan Laboratorium Bioteknologi Departemen Pendidikan Biologi Gedung FPMIPA B Universitas Pendidikan Indonesia, Jalan Dr. Setiabudhi No.299 Bandung.

D.Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdapat pada Laboratorium Mikrobiologi Departemen Pendidikan Biologi FPMIPA UPI. Daftar alat dan bahan terlampir dalam Lampiran 1.

E.Alur Penelitian dan Langkah Kerja

Penelitian ini dilakukan menjadi tiga tahap penelitian, yaitu tahap persiapan dan tahap penelitian diantaranya sebagai berikut

(22)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu 1. Tahap Persiapan

Tahap persiapan meliputi persiapan alat dan bahan yang akan dilakukan dalam proses penelitian. Alat-alat yang bersih dan bahan yang digunakan, dibungkus menggunakan plastik tahan panas dan disterilisasi menggunakan autoclave selama 15-20 menit pada suhu 121ºC dengan tekanan. Alat dan bahan yang digunakan terlampir pada Lampiran 1. Kegiatan penelitian di lakukan Laboratorium Mikrobiologi Departemen Pendidikan Biologi FPMIPA UPI.

2. Tahap Penelitian

a. Mengumpulkan sequence gen MC1R dari berbagai jenis ikan Infraclassis Teleostei

Primer dibuat dengan menganalisa sequence gen MC1R dari GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Sequence gen yang dibuat primernya berasal dari gen MC1R Infraclassis Teleostei, Ordo Perciformes yang tertera pada Tabel 3.1 syarat pembuatan primer dari sequence sekerabat sebanyak minimal lima spesies. Pada penelitian ini total jumlah species yang digunakan sebanyak 11 species.

Sequence DNA dikumpulkan dengan format FASTA umtuk multiple alignment

(pensejajaran banyak sequence) dengan menggunakan aplikasi software Clustal X. Tabel 3.1 Daftar species ikan Ordo Perciformes untuk desain Primer Degenerate

No. Nama Ikan Nomor GenBank Nomor

1 Takifugu rubripes_t24 AB437783.1 189068473

2 Takifugu chinensis_k22 AB437805.1 189068993

3 Takifugu sp_01 AB437812.1 189069007

4 Takifugu chinensis_k24 AB437807.1 189068997

5 Takifugu sp_s1 AB437808.1 189068999

6 Takifugu rubripes AY227791.1 29165373

7 Tetraodon nigroviridis AY332238.1 33867666

8 Poecilia reticulata AB563501.1 322803513

9 Xhiphophorus maculatus DQ866828.1 113206523

(23)

11 Dicentrarchus FN377856.1 270377196

b. Desain Pasanngan Primer Degenerate Gen MC1R

Hasil pensejajaran kemudian dibuat pasangan primer degeneratenya dengan mengakses laman Primaclade (http://primaclade.org/cgi-bin/primaclade.cgi). Hasil amplikon diperkirakan 400-800 bp. Didapatkan beberapa kandidat primer yang terdapat pada Bab 4 Hasil dan Pembahasan (Tabel 4.2).

c. Isolasi DNA Genome Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) 1. Isolasi DNA Kromosom

Isolasi DNA genome ikan gurame dari 30 jenis ikan gurame di daerah Sukabumi dan Tasikmalaya menggunakan metode lisis CTAB 2x. Daging atau jaringan ikan gurame dengan ukuran luas 1 cm2 yang sudah dihancurkan dimasukan ke dalam larutan 500 µl buffer lysis CTAB (Buffer (-) CTAB + SDS10% + CTAB perbandingan (0,7:0,3:0,1, pH 8,0) pada tabung eppendorf, ditambahkan 7 µl SDS 20% dan β-mercaptoetanol, dihomogenasi sehingga larut dan merata, lalu tabung diinkubasi pada suhu 60°C selama satu jam, setelah inkubasi ditambahkan 10 µl Proteinase K (10mg/ml) kemudian diinkubasi selama 12-15 jam pada suhu 65°C. Proses sebelumnya dilanjutkan dengan inkubasi lalu Potassium Asetat 5 M sebanyak 1/10 volume awal ditambahkan ke dalam tabung, dihomogenkan dan diinkubasi di dalam freezer pada suhu 20°C selama 20 menit. Tabung yang sudah diinkubasi, disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit, setelah disentrifugasi terbentuk 2 lapisan, lapisan supernatan dan protein.

Supernatan diambil secara hati-hati dan dipindahkan ke pada tabung

eppendorf yang baru, lalu ditambahkan RNAse 10mg/ml sebanyak 1/100x

volume cairan. Setelah itu, tabung diinkubasi pada suhu 37°C selama satu jam. Tabung diekstraksi dengan CIAA (Kloroform:Isoamil Alkohol ; 24:1) sebanyak ½ x volume total, lalu larutan dihomogenasi dengan cara dibolak-balikan minimal sebanyak 50 kali, hingga larut, dan berwarna putih susu. Proses ini dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit, hingga terdapat tiga lapisan. Larutan pertama cairan berisi DNA, kedua protein dan ketiga

(24)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

kloroform. Lapisan pertama dipindahkan pada tabung eppendorf baru, lalu ditambahkan sodium asetat 3M sebanyak 1/10 x volume total pada tabung baru tersebut, lalu dihomogenkan.

Ethanol absolute yang dingin sebanyak 2x volume total ditambahkan,

kemudian dihomogenkan hingga terlihat putih awan, setelah itu diinkubasi pada suhu -20°C selama satu malam. Pada keesokan setelah proses inkubasi, akan dilanjutkan dengan sentrifugasi larutan pada 15000 rpm selama 10 menit, sehingga terdapat pelet berwarna putih yang mengandung DNA, ethanol dibuang secara hati-hati, setelah itu dibilas menggunakan alkohol 70% sebanyak 1 x volume total, lalu alkohol dibuang kembali. Pelet dikeringkan di dalam oven selama kurang lebih 15 menit, setelah kering dilarutkan ke dalam Buffer TE (10 mM Tris/1mM EDTA) larutan tersebut adalah larutan stok DNA simpan pada suhu -20°C. DNA genome yang sudah diisolasi dicampurkan dalam 1 tabung, masing-masing diambil 1µl menjadi 1 tabung mikrotube. DNA bulk atau Mix DNA dan akan menghasilkan konsentrasi yang sesuai diinginkan (Karsinah et al., 2002). Proses ini merupakan tahapan yang dilakukan pada koleksi penelitian sebelumnya (Kusumawaty, Tahun, belum dipublikasikan).

2. Pengukuran Konsentrasi DNA

Pengukuran konsentrasi DNA dengan metode spektrofotometri. DNA murni dapat menyerap cahaya UV karena adanya basa purin dan pirimidin. Pita ganda DNA dapat menyerap UV pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein atau fenol akan menyerap cahaya pada 280 nm, sehingga kemurnian dapat diukur dengan dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm (Å260/Å280). Rumus sebagai berikut (Fatchiyah, 2002) :

[DNA] = Å260 x 50 x faktor pengenceran

d. Amplifikasi dengan Metode PCR dan Elektroforesis

DNA genome ikan gurame yang diisolasi diamplifikasi dengan metode PCR. Komposisi PCR yang digunakan terdiri dari Dreamtaq Green PCR MasterMix 2x didalamnya terdapat dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, 0,4 mM masing-masing, MgCl2 4mM, Dreamtaq Green DNA Polymerase dan Dreamtaq Green Buffer,

(25)

Primer degenerate yang terdapat pada Tabel 4.1, Taq DNA Polymerase, 1 µl DNA template ikan gurame (DNA stok diencerkan 20x dan 200x kemudian (diambil 1µl), dan air deion ditambahkan hingga volume 12,5µl. Bahan tersebut dimasukan ke dalam tabung khusus untuk alat Thermal cycler dengan program

Gene Amplyfied PCR System 9700 (Scientific, 2011).

Pembuatan komposisi PCR dilakukan dengan keadaan dingin dengan konposisi terdapat pada Tabel 3.2 Polymerase, dan DNA template, dilakukan dengan cara divorteks (sebelum ditambahkan seluruh bahan), dan menjentik-jentik tabung dengan cepat dan hati-hati, disentrifugasi lalu dimasukan ke dalam mesin PCR, yang sudah diprogram sesuai dengan primer yang sudah dirancang. Setelah itu DNA amplifikasi di elektroforesis pada gel agarosa 1%, dengan tegangan 100 volt selama 40 menit buffer TAE 1 x (larutan buffer TAE 10x diencerkan dalam deion dengan perbandingan 1:19 (v/v) Sampel DNA dicampurkan dengan larutan

Loading dye, 5:2 (v/v), sebelum dimasukan ke dalam sumur gel. Disamping

sampel DNA, dimasukan marker lambda Hind III/ Eco R1 yang merupakan larutan DNA yang sudah diketahui ukurannya .gel agarosa yang sudah dielektroforesis direndam dengan pewarnaan pada larutan ethidium bromida (10 µg.ml) selama dua menit. Kemudian dibilas menggunakan aquades selama 6 menit, gel agarosa diamati pada UV transiluminator.

Tabel 3.2. Komposisi reaksi PCR DreamTaq Green PCR Master Mix 2x Komponen Volume (50 µl

reaksi)

Konsentrasi akhir

Volume akhir (10 µl reaksi)

DreamTaq Green

PCR Master Mix 2x

25 µl 1x 5 µl

Primer Forward 0.1-1.0 µM 0.5 µM 0,5 µl

Primer Reverse 0.1-1.0 µM 0.5 µM 0,5 µl

Sample DNA 10 pg- 1 µg 10 ng 0,5 µl

Nuclease-free water sampai 50 µl Sampai 10 µl

(26)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

Gambar 3.1 Program PCR Primer Degenerate Non Nested

Gambar 3.2 Program PCR Primer Degenerate Nested

e. Sequencessing DNA dan Analisis Urutan Gen MC1R

Sequencessing (urutan) hasil amplifikasi dengan metode PCR 2 sampel, yaitu

sampel ikan gurame dari primer degenerate non nested dan primer degenerate

nested dilakukan dengan reaksi 2 arah pasangan primer menggunakan mesin sequencer BigDye Applied Biosystem yang tersedia pada Macrogen, Korea

(www.macrogen.com). Analisa urutan merupakan ringkasan dari seluruh metode yang sudah dilakukan untuk mengetahui basa nukleotida dan dibandingkan kesamaannya dengan urutan lainnya.

95ºC 95ºC

51,2ºC

”

’ ” 72ºC 72ºC

” ’

10ºC

∞ 35 siklus

95ºC 95ºC

52,8ºC

”

’ ” 72ºC 72ºC

” ’

10ºC

∞ 35 siklus

(27)

f. Perancangan Primer Spesifik dari Sequence Gen MC1R

Perancangan primer spesifik dilakukan dengan penjajaran hasil sequencessing gen MC1R yang didapatkan dari GenBank (www.ncbi.nih.nlm.gov), untuk mendapatkan daerah sequence yang lestari menggunakan program DNAbaser, dan Clustal X untuk mendapatkan primer forward dan reverse, primer dirancang dengan syarat primer standar.

g. Uji Validasi Primer Spesifik Stok DNA Genome Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) dan Stok Sampel cDNA Ikan Gurame (Osphronemus gouramy)

Setelah perancangan primer spesifik, uji validasi primer menggunakan amplifikasi dengan metode PCR dan elektroforesis seperti sebelumnya, kepada stok DNA Genome ikan gurame dan stok cDNA ikan gurame (Osphronemus

gouramy) yang telah terinfeksi Aeromonas hydrophila Strain A2 (Kusumawaty,

2014) sumber belum dipublikasikan

h. Analisis Data Bioinformatika dan Karakterisasi Pohon Filogenetik

Hasil uji penelitian deksriptif data dan dokumentasi dikumpulkan. Hasil

sequencesing berupa basa nukleotida sequence diurutkan dengan cara Alignment

dan Contig menggunakan aplikasi Clustal X dan diurutkan basa nukleotida

sequence gen MC1R menggunakan aplikasi DNABaser. Sequence yang sudah

baik di BLAST untuk mengetahui kebenaran gen yang dimiliki dengan dan mengetahui kesamaan jenis yang dimiliki oleh jenis ikan lainnya, BLAST ini diakses di blast.ncbi.nlm.nih.gov. Sequences jenis ikan yang ada pada hasil BLAST dibuat format FASTA dan di alignment menggunakan aplikasi Clustal X, untuk mencari daerah homologi dan gap yang dimiliki oleh sequence untuk dianalisis. Sequence yang sudah di alignment dianalisis dengan aplikasi SMART untuk mengetahui struktur domain dan membuat pohon filogenetik untuk mengkarakterisasi gen dan mengetahui kekerabatan serta validasi sequence gen MC1R dengan menggunakan metode Neighbour-Joining menggunakan aplikasi MEGA v.5 (Dharmayanti, 2011)

(28)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu F. Alur Penelitian

(29)

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN A.Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dipaparkan dan dibahas dapat ditarik kesimpulan bahwa pasangan primer degenerate non nested dengan primer

forward 5’ - RTCAGCCTGGTGGARAACAT -3’ dan primer reverse 5’- GAGGAAGAAVGGVCCCCA -3’ dan pasangan primer nested dengan primer forward 5’- CTGGTGGARAACATCCTGGT -3’ dan primer reverse 5’- ACACCAGSGTGRTGCAGAA -3’ dapat mengamplifikasi gen MC1R pada ikan gurame (Osphronemus gouramy). Dengan hasil sequence yang dihasilkan dari produk PCR adalah sebesar 600 bp yang membuktikan bahwa gen MC1R pada

Osphronemus gouramy benar teramplifikasi dengan baik menggunakan uji cDNA Osphronemus gouramy dengan pasangan primer spesifik: primer forward 5’- GTCTAGGTGGAGAAGCATTCGT -3’ dan primer reverse 5’- TACTACTTCATCTGCTGCCTGG-3’, serta data pohon filogenetik dengan kekerabatan yang dimiliki oleh Osphronemus gouramy yang dekat kekerabatannya dengan Ordo Tetratodontoformes.

B.Saran

Berdasarkan hasil penelitian dan kesimpulan yang dipaparkan, terdapat saran untuk pengetahuan dan pengembangan serta menambah informasi yang bermanfaat mengenai penelitian ini, yaitu primer spesifik yang dihasilkan dapat digunakan untuk penelitian lanjutan isolasi gen MC1R pada ikan gurame (Osphronemus gouramy) untuk menyempurnakan database sequence DNA MC1R Osphronemus gouramy serta dapat diaplikasikan pada penelitian selanjutnya.

(30)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

DAFTAR PUSTAKA

(IDT), I. D. (2015). Intergrated DNA Technologies (IDT). Retrieved from Intergrated DNA Technologies (IDT):

http://www.idtdna.com/pages/docs/quick-looks/quick-look---degenerate-sequences-and-non-standard-bases.pdf?sfvrsn=1. [6 Oktober 2015] Arciuli, M., Fiocco, D., Cicero, R., Maida, I., Zanna, P. T., Guida, G., . . .

Gallone, A. (2012). Melanogenesis in Visceral Tissues of Salmo salar. A link between immunity and pigment production? Biochem Cell. Bio, 769-778.

Ardiana, D. W. (2009). Teknik Isolasi DNA Genom Pepaya dan JEruk

Menggunakan Modifikasi Buffer CTAB. Nuletin Teknik Pertanian, 12-16. Bar, I., Kaddar, E., Velan, A., & David, L. (2013). Melanocortin Recptor 1 and

Black pigmentation in the Japanese Ornamental Carp (Cyprinus carpio var. Koi). Frontiers in Genetics 4(6), 1-11.

Barcellini, W., Colombo, G., Maestra, L. L., Cierci, G., Garofalo, L., Brini, A. T., . . . Catania, A. (2000). a-Melanocyte-Stimulating Hormone Peptides Inhibit HIV-1 Epression in Chronically Infectes Promonocytic U1 Cells ans in Acutely Infected Monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 68, 693-699.

Basu, C., & Thornton, B. (2011). Real-Time PCR (qPCR) Primer Design Using Free Online Software. Biochemistry and Molecular Biology Education, 145-154.

Baugmann, L., & Saghari, S. (2009). Skin Pigmentation and pigmentation

Disorders. New York: Mc-Graw-Hill.

Brown, T. (1990). Gene Cloning. London-New York-Tokyo-Mellbourne-Madras: Chapman and Hall.

Campbell, N. A., Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. I., Wasserman, S., Minorsky, P. V., & Jackson, R. B. (2011). Biology. San Francisco: Pearson Benjamin Cummings.

Carol, S. B. (2006). The Making of The Fittest – DNA and the Ultimate Forensic Record of Evolution . New York: WW. Norton.

Claverie, J.-M., & Notredame, C. (2007). Bioinformatics for Dummies. Indiana: Wiley Publishing.

(31)

Dharmayanti, N. I. (2011). Filogenetika Molekuler: Metode Taksonomi

Organisme Berdasarkan Sejarah Evolusi. Filogenetika Molekuler: Metode

Taksonomi Organisme Berdasarkan Sejarah Evolusi, 1-10.

Erlich, H. (1989). PCR Technology Principiles And Application For DNA

Amplification. New York: M Stockton Press.

Fatchiyah. (2002). Molekuler Prinsip Dasar Analisis . Jakarta: Erlangga. Gadberry, M. D., Malcomer, S. T., Doust, A. N., & Kellogg, E. A. (2005).

Primaclade—a ﬂexible tool to ﬁnd conserved PCR primers across multiple species. Bioinformatics Application Note, 1263-1264.

Gaffar, S. (2007). Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: Uiversitas Padjadjaran.

Gross, J. B., Borowsky, R., & Tabin, C. J. (2009). A Novel Role for MC1R in the Parallel Evolution of Depigmentation in Independent Populations of the Cavfish Astyanax mexicanus. PlosGenetic 5(1), 1-14.

Haff, L. A. (1994). Improved Quantitative PCR Using Nested Primer. Cold Spring

Harbor LAboratory Press, 332-337.

Higdon, C. W., Mitra, R. D., & Johnson, S. L. (2013). Gene Expression Analysis of Zebrafish Melanocytes, Iridophores, and Retinal Pigmented Ephitellium Reveals Indicators of Biological Function and Developmental Origin .

PLOS One 8(), 1-16.

Jitmau, A. M., Rondonuwu, F. S., & Semangun, H. (2010). Lokopen Pelindung Fungsi Indera Pengelihatan, Peraba dan Perasa. Seminar Nasional

Pendidikan Biologi FKIP UNS, 440-446.

Karsinah, Sudarsono, Setyobudi, L., & Aswidinnor, H. (2002). Keragaman Genetik PlasmaNutfah Jeruk Berdasarkan Analisis Penanda RPAD.

Bioteknologi Pertanian, 8-16.

Kusumo, S., Hasanah, M., Moeljopawiro, S., Thohari, M., Subandriyo,

Hardjamulia, A., . . . Kasim, H. (2002). Pedoman Pembentukan Komisi

Daerah dan Pengelolaan Plasma Nutfah. Departemen Pertanian Badan

Penelitian dan Pengembangan Pertanian Komisi Nasional Plasma Nutfah. Letunic, I., Goodstadt, L., Dickens, N. J., Doerks, T., Schultz, J., Mott, R., . . .

Bork, P. (2002). Recent improvments to the SMART domain-based sequence annonation resource. Nucleic Acids Research , (30): 1 , 242-244. Li, C., Orti, G., & Zhao, J. (2010). The Phylogenetic Placement of Sinipercid

Fieshes ("Perciformes") reaveled by 11 Nuclear Loci. Molecular

(32)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

Malik, A., Hewemawati, A. K., Soemamiati, M. H., & Radji, M. (2010). Isolasi dan Skrining Molekuler Bakteri Asam Laktat Pemvbawa Gen

Glukansukrase dari Makan dan Miniman Mengandung Gula. Mukara

Sains, 63-68.

McGinnis, S., & Madden, T. L. (2004). BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Research, 20-25. Mickelsen, & Corton. (1960). Biomalytical Chemistry. Canada: John Wiley. Mike. (2013). Freshwater Aquarium Book. FishLore. Retrieved from FishLore. Mina, S. (2013, Februari 2015 11). Mengenal Penyakit Ikan Gurami. Retrieved

from Bibit Gurami: http://bibitgurami.com/mengenal-penyakit-ikan-gurami/

Mirabella, F. M. (2011). Pendekatan Pohon dalam Filogenetik. Bandung: Institut Teknologi Bandung.

Muladno. (2011). Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda.

Nazir, M. (1988). Metode Penelitian. Jakarta: Ghallia Indonesia.

NCBI. (2015, Oktober 10). Nucleotida. Retrieved from National Canter for Biotechnology Information:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=osphronemus Nugroho, E. (2011). Evaluasi variasi Genetik Ras-Ras Ikan Gurame

Menggunakan Marker DNA. Jurnal Perikanan (J.Fish. Sci ) 12(2), 86-90. Parenrengi, A., Muddin, A., Sukenda, Sumantadinata, K., & Tenriulo, A. (2009).

Karakteristik Sekuen cDNA Pengkode Gen Anti Virus Udang Windu, Penaeus monodon. J.Ris Akuakultur, 4(1), 1-13.

Park, H., & Yaar, M. (2012). Biology of Melanocyte. New York: Mc-Graw-Hill. Piraee, M., & Vining, L. (2002). Use of degenerate primers and touchdown PCR

to amplify halogenase gene fragment from Streptomyces venezuelae ISP5230. Journal og Industrial Microbiology Biotechnology, 1-5.

Riupassa, P. A. (2010). Perancangan Primer-Oligonukleotida Untuk Reaksi Rantai Polimerisasi Gen Sukrosa Sintase (EC 2.4.1.13). Seminar Nasional Basic

Science II, 21-29.

Rychlik, W., Spencer, W., & Rhoads, R. (1990). Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Research , 6409-6412.

(33)

Sambrook, J., & Russel, D. W. (2011). Molecular Cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sanchez, E., Rubi, V., & Cerda-Reverter, J. (2010). Molecular and

Pramacological Characterization of the Melanocortin Type 1 Receptor in the The Sea Bass. General and Comparative Endocrinology, 165, 163-169.

Sb. (2013). Masukan ARN 2015-2019 : Kebijakan Litbang Perikanan untuk

Mendukung Pembangunan Kelautan Perikanan Indonesia. Retrieved from

Dewan Riset Nasional : http://www.drn.go.id/index.php/en/daftar-drd/8- berita-terkini/129-kebijakan-litbang-perikanan-untuk-mendukung-pembangunan-kelautan-perikanan-indonesia. [11 Februari 2015] Schultz, J., Corpley, R. R., Doerks, T., Ponting, C. p., & Bork, P. (2000).

SMART: a web-based tool for the study of genetically mobile domains.

Nucleic Acids Research 28(1), 231-234.

Scientific, T. (2011). Produk Information Thermo Scientific . ThermoScientific. Setjaningsih, L., Arifin, O. Z., & Gustiano, R. (2007). Karakterisasi Tiga Strain Ikan Gurame (Osphronemus gouramy Lac.) Berdasarkan Metode Truss Morfometriks. Jurnal Iktiologi Indonesia 7(1), 23-30.

Shope, R. E. (1975). Invertebrate Immunity. New York, San Francisco, London: Academic Press Inc.

Sudargo, F., & Susilawaty, S. A. (2013). Zoologi Vertebrata Perkuliahan

Berbasis Praktikum Superkelas Pisces. Bandung: FPMIPA UPI.

Suzuki, D., Brandley, M. C., & Tokita, M. (2010). The mitochondrial phylogeny of an ancient lineage of ray-finned fishes (Polypteridae) with

implifications for the evolution of body elongatio, pelvic fin loss, and craniofacial morphology in Osteichthyes. BMC Evolution Biology

10(209), 1-4.

Tarwiyah. (2001). Budidaya Ikan Gurame. Jakarta: Menegristek Bidang Pendayagunaan dan Pemasyarakatan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi. Tezuka, A., Yamamoto, H., Yokoyama, J., Oosterhout, C. v., & Kawata, M.

(2011). The MC1R gene in the guppy (Poecilia reticulata) : Genotypic and phenotyoic polymorphisms. BMC Research Notes, 1-8.

Tezuka, Ayumi; Yamamoto, Hiroaki; Yokoyama, Jun; Oosterhout, Cock van; Kawata, Masakado. (2011). The MC1R gene in the guppy (Poecilia reticulata) : Genotypic and phenotyoic polymorphisms. BMC Research

(34)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

Videira, I. F., Moura, D. F., & Magina, S. (2013). Mechanisms Regulating Melanogenesis. An Bras Dermatol 88(1), 76-83.

Wang, X., & Seed, B. (2003). A PCR Primer Bank for Quantitative Gene Expression Analysis. Nucleic Acids Research, 1-8.

Watson, J. D., Baker, T. A., Bell, S. P., Gann, A., Levine, M., & Harrison, R. L. (2014). Molecular Biology of the Gene. New York: CSH Press.

Xiong, J. (2006). Essential Bioinformatics. New York, Melbourne, Madrid, Cape Town, Singapore, São Paulo: Cambridge University.

Yatim, W. (1996). Histologi. Bandung: Tarsito.

Yuwono, T. (2006). Teori dan Aplikasi Polymerase Chain, Panduan Eksperimen

(1)

62 Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN A.Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dipaparkan dan dibahas dapat ditarik kesimpulan bahwa pasangan primer degenerate non nested dengan primer

forward 5’ - RTCAGCCTGGTGGARAACAT -3’ dan primer reverse 5’-

GAGGAAGAAVGGVCCCCA -3’ dan pasangan primer nested dengan primer

forward 5’- CTGGTGGARAACATCCTGGT -3’ dan primer reverse 5’-

ACACCAGSGTGRTGCAGAA -3’ dapat mengamplifikasi gen MC1R pada ikan

gurame (Osphronemus gouramy). Dengan hasil sequence yang dihasilkan dari produk PCR adalah sebesar 600 bp yang membuktikan bahwa gen MC1R pada Osphronemus gouramy benar teramplifikasi dengan baik menggunakan uji cDNA Osphronemus gouramy dengan pasangan primer spesifik: primer forward 5’-

GTCTAGGTGGAGAAGCATTCGT -3’ dan primer reverse 5’-

TACTACTTCATCTGCTGCCTGG-3’, serta data pohon filogenetik dengan

kekerabatan yang dimiliki oleh Osphronemus gouramy yang dekat

kekerabatannya dengan Ordo Tetratodontoformes.

B.Saran

(2)

DAFTAR PUSTAKA

(IDT), I. D. (2015). Intergrated DNA Technologies (IDT). Retrieved from Intergrated DNA Technologies (IDT):

Gallone, A. (2012). Melanogenesis in Visceral Tissues of Salmo salar. A link between immunity and pigment production? Biochem Cell. Bio, 769-778.

Ardiana, D. W. (2009). Teknik Isolasi DNA Genom Pepaya dan JEruk

Menggunakan Modifikasi Buffer CTAB. Nuletin Teknik Pertanian, 12-16. Bar, I., Kaddar, E., Velan, A., & David, L. (2013). Melanocortin Recptor 1 and

Black pigmentation in the Japanese Ornamental Carp (Cyprinus carpio var. Koi). Frontiers in Genetics 4(6), 1-11.

Basu, C., & Thornton, B. (2011). Real-Time PCR (qPCR) Primer Design Using Free Online Software. Biochemistry and Molecular Biology Education, 145-154.

Baugmann, L., & Saghari, S. (2009). Skin Pigmentation and pigmentation Disorders. New York: Mc-Graw-Hill.

Brown, T. (1990). Gene Cloning. London-New York-Tokyo-Mellbourne-Madras: Chapman and Hall.

Campbell, N. A., Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. I., Wasserman, S., Minorsky, P. V., & Jackson, R. B. (2011). Biology. San Francisco: Pearson Benjamin Cummings.

Carol, S. B. (2006). The Making of The Fittest – DNA and the Ultimate Forensic Record of Evolution . New York: WW. Norton.

Claverie, J.-M., & Notredame, C. (2007). Bioinformatics for Dummies. Indiana: Wiley Publishing.

(3)

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015

ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR (MC1R) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

Dharmayanti, N. I. (2011). Filogenetika Molekuler: Metode Taksonomi

Organisme Berdasarkan Sejarah Evolusi. Filogenetika Molekuler: Metode Taksonomi Organisme Berdasarkan Sejarah Evolusi, 1-10.

Erlich, H. (1989). PCR Technology Principiles And Application For DNA Amplification. New York: M Stockton Press.

Fatchiyah. (2002). Molekuler Prinsip Dasar Analisis . Jakarta: Erlangga. Gadberry, M. D., Malcomer, S. T., Doust, A. N., & Kellogg, E. A. (2005).

Primaclade—a ﬂexible tool to ﬁnd conserved PCR primers across multiple species. Bioinformatics Application Note, 1263-1264.

Gaffar, S. (2007). Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: Uiversitas Padjadjaran.

Haff, L. A. (1994). Improved Quantitative PCR Using Nested Primer. Cold Spring Harbor LAboratory Press, 332-337.

Jitmau, A. M., Rondonuwu, F. S., & Semangun, H. (2010). Lokopen Pelindung Fungsi Indera Pengelihatan, Peraba dan Perasa. Seminar Nasional Pendidikan Biologi FKIP UNS, 440-446.

Karsinah, Sudarsono, Setyobudi, L., & Aswidinnor, H. (2002). Keragaman Genetik PlasmaNutfah Jeruk Berdasarkan Analisis Penanda RPAD. Bioteknologi Pertanian, 8-16.

Kusumo, S., Hasanah, M., Moeljopawiro, S., Thohari, M., Subandriyo,

Hardjamulia, A., . . . Kasim, H. (2002). Pedoman Pembentukan Komisi Daerah dan Pengelolaan Plasma Nutfah. Departemen Pertanian Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian Komisi Nasional Plasma Nutfah. Letunic, I., Goodstadt, L., Dickens, N. J., Doerks, T., Schultz, J., Mott, R., . . .

Fieshes ("Perciformes") reaveled by 11 Nuclear Loci. Molecular Phylogenetic Evolution 56, 1096-1104.

(4)

Malik, A., Hewemawati, A. K., Soemamiati, M. H., & Radji, M. (2010). Isolasi dan Skrining Molekuler Bakteri Asam Laktat Pemvbawa Gen

Glukansukrase dari Makan dan Miniman Mengandung Gula. Mukara Sains, 63-68.