Molecular Markers Development that is Associated with Apomixis Characters and the Strength of Cell Wall Composed Yellow Latex Secretory Duct on Mangosteen (Garcinia mangostana L.).
Pengembangan Marka Molekular yang Berasosiasi dengan
Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding Sel Penyusun
Saluran Getah Kuning pada Manggis (Garcinia mangostana L.)
RISA ARYANTRI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Pengembangan Marka
Molekuler yang Berasosiasi dengan Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding
Sel Penyusun Saluran Getah Kuning pada Manggis (Garcinia mangostana L.)
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013
Risa Aryantri
NRP G353110121
* Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.
RINGKASAN
RISA ARYANTRI. Pengembangan Marka Molekuler yang Berasosiasi dengan
Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding Sel Penyusun Saluran Getah Kuning
pada Manggis (Garcinia mangostana L.). Dibimbing oleh MIFTAHUDIN dan
SOBIR.
Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan salah satu komoditi buah
tropis yang menjadi unggulan ekspor Indonesia dan dijuluki sebagai “Queen of
Tropical Fruits”. Saat ini terdapat dua isu utama dalam pengembangan tanaman
manggis dan kerabat dekatnya, yaitu sifat apomiksis dan adanya getah kuning
pada buah manggis yang disebabkan rusaknya dinding sel penyusun saluran getah
kuning, sehingga perlu dilakukan penelitian yang mempelajari aspek apomiksis
pada Garcinia dan kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning pada
manggis. Penelitian ini terbagi menjadi dua topik utama, yaitu pengembangan
marka molekuler terpaut karakter apomiksis pada Garcinia dan pengembangan
marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel penyusun saluran getah
kuning pada manggis.
Manggis memiliki mekanisme reproduksi apomiksis. Apomiksis merupakan
sistem reproduksi yang terjadi secara alami, dimana embrio yang dihasilkan tidak
melalui pembelahan miosis ataupun pembuahan ovum. Keturunan dari tanaman
apomiksis memiliki konstitusi genetik yang sama dengan induk betinanya. Pada
Garcinia, bentuk apomiksisnya dikenal sebagai embrio edventif yang terbagi
menjadi apomiksis obligat dan apomiksis fakultatif. Akan tetapi, identifikasi dan
karakterisasi sifat apomiksis pada Garcinia sangat diperlukan dalam proses
konservasi dan pemanfaatannya, sehingga perlu dilakukan pengembangan marka
molekuler spesifik yang berasosiasi dengan sifat apomiksis sebagai alat yang
digunakan dalam identifikasi, karakterisasi dan seleksi plasma nutfah Garcinia.
Bagian pertama dari penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan marka
molekuler terpaut karakter apomiksis yang dapat digunakan untuk mengetahui
hubungan kekerabatan manggis dan kerabat dekatnya. Proses amplifikasi DNA
dilakukan dengan menggunakan primer yang telah dikembangkan oleh Ozias
akins et al. (1998) berdasarkan sekuen DNA Pennisetum. Primer tersebut
digunakan untuk amplifikasi DNA dari 4 spesies Garcinia, yaitu Garcinia
mangostana L., G. hambroniana Pierre., G. celebica L. dan G. malacensis T.
Anderson. Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa dari ke 4 spesies tersebut hanya
Garcinia hambroniana Pierre yang tidak teramplifikasi, sedangkan ketiga spesies
lainnya menghasilkan fragmen pita dengan ukuran sama, yaitu ± 480 pb. Hasil
analisis BLAST pada NCBI terhadap sekuen DNA dari hasil PCR tersebut
menunjukkan tidak ada homologi dengan sekuen DNA dari tanaman lain,
sehingga langkah selanjutnya didesain primer berdasarkan Single Nucleotide
Polymorphism (SNP dari 3 sekuen pita DNA dari ke 3 spesies (G. mangostana L.,
G. celebica L. dan G. malacensis T. Anderson).
Pada penelitian ini telah didesain dan digunakan 3 set primer, yaitu (1)
Apo_Fak1 (forward 5‟ACAATAATCACCACCATACC‟3 dan reverse 5‟GTCT
TTTCCACTTGGGCTGG‟3); (2); Apo_Fak2 (forward 5‟ACAATAATCACC
ACCATACC‟3 dan reverse 5‟AGGCTTCAACTTAGTTG TCA‟3); (3) Apo_Obli
(forward 5‟ACAATAATCACCACCATACC‟3 dan reverse 5‟TCATTTCCCA
CTTGGGCTGT‟3). Ke tiga set primer tersebut diverifikasi menggunakan 3
spesies acuan (G. mangostana L., G. celebica L. dan G. malacensis T. Anderson)
dan hasilnya menunjukkan pita berukuran ± 300 pb pada G. mangostana L. dan
G. celebica L. dan ± 317 pb G. malacensis T. Anderson yang berkaitan dengan
sifat apomiksis dari tiap spesies. Dengan menggunakan marka molekuler tersebut
41 spesies Garcinia yang dianalisis dapat dikelompokkan ke dalam 3 kelompok,
yaitu 14 spesies apomiksis obligat, 14 spesies apomiksis fakultatif dengan bunga
dioecius dan 13 spesies apomiksis fakultatif dengan bunga hermaprodit.
Faktor lainnya yang perlu diperhatikan dalam pengembangan tanaman
manggis adalah bagaimana menghilangkan getah kuning pada buah manggis.
Getah kuning merupakan masalah utama yang dapat menurunkan kualitas buah
manggis yang menyebabkan rasa buah menjadi tidak enak. Struktur saluran getah
kuning pada manggis merupakan saluran besar yang dikelilingi oleh sel epitel
yang berbentuk seperti kanal dan bercabang. Terdapatnya getah kuning pada buah
diperkirakan karena terjadinya kerusakan dinding sel epitel penyusun saluran
getah kuning. Pada manggis, getah kuning sering kali terdapat pada aril buah.
Metode pemuliaan untuk mendapatkan manggis tidak bergetah sulit dilakukan,
karena kerusakan dinding sel sangat dipengaruhi oleh lingkungan. Bagian kedua
dari penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan marka molekuler terpaut
karakter kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning pada buah manggis.
Kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning sangat berkaitan erat dengan
sekresi getah kuning pada buah manggis. Marka molekuler yang terpaut karakter
kekuatan dinding sel dapat digunakan untuk mengidentifikasi plasma nutfah
manggis yang berpotensi menjafdi tetua yang menghasilkan buah tidak bergetah
kuning. Marka ini dapat digunakan dalam proses seleksi keturunan pada program
pemuliaan manggis.
Desain primer dilakukan secara tersarang (nested) berdasarkan sekuen gen
Frangile Fiber 1 (FRA 1). Dari 4 kombinasi primer yang digunakan hanya 1
kombinasi primer yang berhasil menghasilkan pita amplifikasi dan dapat
membedakan antara sifat manggis bergetah dan tidak bergetah kuning. Pita
tersebut disekuen ulang dan digunakan sebagai dasar untuk desain primer yang
digunakan untuk mengembangkan marka molekuler terpaut kekuatan dinding sel.
Marka molekuler yang berhasil dikembangkan merupakan pita DNA berukuran ±
260 pb, hasil amplifikasi menggunakan kombinasi primer forward 5‟CAA
AGGAATGGGAGCATAAG‟3 and reverse 5‟AGCGGACCACATTTAGAGT
G„3. Marka tersebut dinamakan marka kekuatan dinding sel manggis (KDSM).
Hasil verifikasi marka molekuler pada 39 aksesi manggis menunjukkan
kesesuaian antara keberadaan pita dengan sifat kekuatan dinding sel. Aksesi yang
tidak bergetah kuning menghasilkan pita DNA, sedangkan aksesi yang bergetah
kuning tidak menghasilkan pita DNA.
Di antara 39 aksesi manggis yang telah dianalisis tersebut, 20 aksesi dengan
buah bergetah kuning tidak menghasilkan pita DNA, sedangkan 19 aksesi dengan
buah tidak bergetah kuning terbagi menjadi dua, yaitu 16 aksesi menghasilkan
pita DNA, sedangkan 3 aksesi manggis lainnya tidak menghasilkan pita DNA.
Kata kunci: apomiksis, Garcinia mangostana L., Garcinia spp., getah kuning,
marka molekuler
SUMMARY
RISA ARYANTRI. Molecular Markers Development that is Associated
with Apomixis Characters and the Strength of Cell Wall Composed Yellow Latex
Secretory Duct on Mangosteen (Garcinia mangostana L.). Supervised by
MIFTAHUDIN and SOBIR.
Mangosteen is one of the excellent export fruit commodity from Indonesia
and well-known as Queen of Tropical Fruits. There are two current main
development issues of mangosteen, which are apomixis and yellow latex secretion
from the fruit caused by destruction of epithelial cell that form yellow latex
secretory duct. Therefore, a research to study the aspects of apomixis and cell wall
strength that form yellow latex secretory duct in mangosteen should be done. This
research consisted of two main topics, the development of molecular marker that
is associated with the apomixis characters in Garcinia and molecular marker that
is associated with the cell wall strength characters that form yellow latex secretory
duct in mangosteen.
Mangosteen reproduces through apomixis mechanism. Apomixis is a
naturally occurring mode of reproduction that results in embryo formation without
the involvement of meiosis or fertilization of the egg. Seed-derived progeny of an
apomictic plant is genetically identical to the maternal parent. In Garcinia,
apomixis form is called as adventitious embryony, which is divided into obligate
and facultative apomixis. Identification and characterization of those apomixis in
Garcinia is important for conservation and utilization of Garcinia members. The
development of specific molecular markers that associated with apomixis is
necessary. The developed markers can then be used as a tool for identification,
characterization and selection of Garcinia germplasms.
The first part of this research aimed to develop molecular markers related to
apomixis character. The DNA ampilication was carried out using primer
developed by Ozias-akins et al. (1998) based on the sequence of Pennisetum
DNA. The primer was used to amplify DNA from four Garcinia species, i.e. :
Garcinia mangostana L., G. hambroniana Pierre., G. celebica L. and G.
malacensis T. Anderson. The result showed that only G. hambroniana Pierre.
DNA could be not amplified, while the others showed the ampilication band with
the size of ± 480 bp. The BLAST sequence analysis of the PCR frgment showed
that there was no homology with other DNA sequences in database. Three set of
primers were then designed based on Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
among three DNA sequences from those three species (G. mangostana L., G.
celebica L. and G. malacensis T. Anderson).
This research succesfully developed three set of primers, which were (1)
Apo_Fak1 (forward 5‟ACAATAATCACCACCATACC‟3 and reverse 5‟GTCTT
TTCCACTTGGGCTGG‟3); (2); Apo_Fak2 (forward 5‟ACAATAATCACCA
CCATACC‟3 and reverse 5‟AGGCTTCAACTTAGTTGTCA‟3); (3) Apo_Obli
(forward 5‟ACAATAATCACCACCATACC‟3 and reverse 5‟TCATTTCCCA
CTTGGGCTGT‟3). Those three set of primers were then verified using three
reference species (G. mangostana L., G. celebica L. and G. malacensis T.
Anderson) and the result showed two specific bands that related with apomixis
character, i.e. : a 300 bp DNA band produced from G. mangostana L. and G.
celebica L., while a 317 bp produced from G. malacensis T. Anderson. Forty one
species of Garcinia can be separated into three groups based on the developed
molecular markers. Fourteen species were identified as obligate apomixis,
fourteen species were facultative apomixis with dioecius flowers, and the other
thirteen species were facultative apomixis with hermaprodit flowers.
Another aspect of mangosteen development that should be considered is
how to eliminate yellow latex secretion from mangosteen fruit. Yellow latex is a
major problem on mangosteen that could decrease fruit quality. The structure of
yellow latex secretory ducts, which consist of big lumen, was surrounded by
epithelial cells. The duct is canal-like form and branched. It is suggested that the
destruction of epithelial cell that form yellow latex secretory duct caused yellow
latex secretion. In mangosteen, yellow latex is often found in fruit aril. Since the
yellow latex secretion character in mangosteen is largely influenced by
environment, the breeding technique to develop free yellow latex fruit is quite
difficult. The objective of the second part in this research was to develop a
molecular marker that is associated with the fruit epithelial cell wall strength. The
developed molecular marker which linked to cell wall strength character might be
useful to identify mangosteen germplasm that potential as parent producing free
yellow latex fruit. The marker could also be used in progeny selection in the
mangosteen breeding program.
Nested primers were designed based on the Fragile Fiber 1 (FRA 1) gene
sequences. Among four developed primer combinations only one primer
combination could produce specific band that could discriminate the yellow latex
producing plant and free yellow latex plant. The DNA band was resequenced and
used to design a new set of primer (forward 5‟CAAAGGAATGG
GAGCATAAG‟3 and reverse 5‟AGCG GACCACATTTAGAGTG„3) that was
used to develop a molecular marker related to cell wall strength. The molecular
marker were named as KDSM. The verification of molecular marker using thirty
nine accessions of mangosteen showed close relation between marker KDSM and
yellow latex secretion character. In general plants that secreted yellow latex did
not have DNA band, while the other one hand a 260 bp DNA band.
Among thirty nine mangosteen accessions, twenty accessions that secreted
yellow latex did not produce DNA band, while nineteen accessions that do not
secreted yellow latex were divided into two groups. Sixteen accessions produce a
260 bp DNA band and three accessions did not produce DNA band.
Keywords: apomixis, Garcinia mangostana L., Garcinia spp., yellow latex,
molecular markers
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
Pengembangan Marka Molekular yang Berasosiasi denngan
Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding Sel Penyusun
Saluran Getah Kuning pada Manggis (Garcinia mangostana L.)
RISA ARYANTRI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biologi Tumbuhan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Darda Efendi, MSi
Judu\ Tesis : Pengembangan Marka Molekuler yang Berasosiasi dengan
Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding Sel Penyusun Saluran
Getah Kuning pada Manggis (Garcinia mangostana L.)
: Risa Aryantri
Nama
: G353110121
NRP
Disetujui oleh
Komisi Pembirnbing
Dr Ir Miftahudin, MSi
Ketua
Prof Dr Ir Sobir, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Biologi Turnbuhan
Dr Ir Miftahudin M Si
Tanggal Ujian: 29 Juli 2013
Tanggal Lulus:
0 7 0CT 2013
Judul Tesis : Pengembangan Marka Molekuler yang Berasosiasi dengan
Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding Sel Penyusun Saluran
Getah Kuning pada Manggis (Garcinia mangostana L.)
Nama
: Risa Aryantri
NRP
: G353110121
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir Miftahudin, MSi
Ketua
Prof Dr Ir Sobir, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Biologi Tumbuhan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Miftahudin, MSi
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2012 ini ialah karkater
apomiksis dan ketahanan getah kuning, dengan judul Pengembangan Marka
Molekuler yang Berasosiasi dengan Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding
Sel Penyusun Saluran Getah Kuning pada Manggis (Garcinia manggostana L.).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Miftahudin, M.Si dan
Bapak Prof. Dr. Ir. Sobir, M.Si selaku pembimbing. Di samping itu, penghargaan
penulis sampaikan kepada Ibu Sulassih dari Pusat Kajian Hortikultura Tropik IPB
Bogor, Ibu Dr. Ellina Mansyah berserta Bapak Wandi, Balai Penelitian Tanaman
Buah Tropika Solok, serta Ibu Lina, pembudidaya manggis Desa Leuwiliang,
yang telah membantu selama pengumpulan data. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih
sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2013
Risa Aryantri
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
ix
DAFTAR GAMBAR
ix
DAFTAR LAMPIRAN
x
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
1
1
2
2
TINJAUAN PUSTAKA
Manggis (Garcinia mangostana L.) dan Kerabat Dekatnya (Garcinia
spp.)
Apomiksis Garcinia mangostana L. dan Garcinia spp.
Getah Kuning (Gamboge Disorder)
Marka Molekuler
Sequence Tagged Sites (STS) dan Single Nucleotide Polymorphism
(SNP)
4
PENGEMBANGAN MARKA MOLEKULER TERPAUT KARAKTER
APOMIKSIS PADA MANGGIS DAN KERABAT DEKATNYA
Abstrak
Pendahuluan
Bahan dan Metode
Waktu dan Tempat
Bahan Tanaman
Metode
Hasil dan Pembahasan
Marka Molekuler Terpaut Karakter Apomiksis
Isolasi DNA Manggis (Garcinia mangostana L.) dan Kerabat
Dekatnya (Garcinia spp.)
Amplifikasi DNA Manggis dan Kerabat Dekatnya dengan Marka
Molekuler
Terpaut Karakter Apomiksis
Analisis Sekuan DNA dan Pengembangan Marka Molekuler untuk
Indentifikasi Karakter Apomiksis pada Manggis dan Kerabat
Dekatnya
Verifikasi Marka Molekuler Terpaut Karakter Apomiksis dan
Analisis Data
Simpulan
PENGEMBANGAN MARKA MOLEKULER TERPAUT KEKUATAN
DINDING SEL PENYUSUN SALURAN GETAH KUNING PADA
MANGGIS (Garcinia mangostana L.)
Abstrak
4
5
5
7
7
8
8
9
9
9
9
10
12
12
12
13
13
14
16
21
22
22
DAFTAR ISI (lanjutan)
Pendahuluan
Bahan dan Metode
Bahan Tanaman
Metode
Hasil dan Pembahasan
Desain Primer untuk Marka Molekuler Terpaut Karakter Kekuatan
Dinding Sel
Isolasi DNA Manggis (Garcinia mangostana L.)
Amplifikasi DNA Manggis dengan Marka Molekuler Terpaut
Karakter Kekuatan Dinding Sel
Analisis Sekuan DNA dan Pengembangan Marka Molekuler untuk
Indentifikasi Karakter Kekuatan Dinding Sel pada Manggis
Verifikasi Marka Molekuler Terpaut Kekuatan Dinding Sel dan
Analisis Data
Simpulan
22
23
23
24
26
26
28
28
29
30
31
PEMBAHASAN UMUM
32
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
33
33
34
UCAPAN TERIMAKASIH
34
DAFTAR PUSTAKA
34
LAMPIRAN
38
RIWAYAT HIDUP
46
DAFTAR TABEL
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Sampel 41 spesies manggis dan kerabat dekatnya (Garcinia spp.)
Marka molekuler spesifik terpaut karakter apomiksis pada Garcinia
Hasil amplifikasi verifikasi marka molekuler terpaut karakter apomiksis
Karakter morfologi Garcinia spp.
Sampel 39 aksesi manggis buah bergetah dan tidak bergetah kuning
Aksesi tanaman yang digunakan sebagai acuan untuk mengembangkan
Primer untuk marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel
Kombinasi primer kekuatan dinding sel dengan nested PCRa
Primer untuk marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel dari
10
16
18
20
24
26
27
28
30
DAFTAR GAMBAR
1. Diagram
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
alir penelitian pengembangan marka molekuler terpaut
apomiksis dan kekuatan dinding sel pada manggis dan kerabat dekat
Habitus manggis (Garcinia mangostana L.) di kebun manggis
Leuwiliang Bogor
Getah kuning pada buah manggis. A = Getah kuning pada pericarp
dan B = Getah kuning pada endocarp
Hasil elektroforesis ektraksi DNA manggis dan kerabat dekatnya. M =
Hasil elektroforesis amplifikasi DNA manggis dan kerabat dekatnya
Hasil aligment sekuen DNA terpaut karakter apomiksis. bold =
variasi nukleotida,
= primer apomiksis forward dan reverse,
Apo_F = Primer apomiksis forward, Apo_1R = Primer apomiksis
reverse 1, Apo_2R = Primer apomiksis reverse 2 dan Apo_3R = Primer
apomiksis reverse 3
Hasil elektroforesis amplifikasi DNA manggis dan kerabat dekatnya. M
= 1 kb, 1 = Garcinia celebica L. (2), 2 = Garcinia malaccensis T.
Anderson, 3 = Garcinia mangostana L., Apo_Fak1 = marka molekuler
apomiksis fakultatif 1, Apo_Fak2 = marka molekuler apomiksis
fakultatif 2 dan Apo_Obli = marka molekuler apomiksis obligat
Hasil aligment sekuen DNA terpaut karakter apomiksis.
=
variasi nukleotida pada wilayah primer Apo_2R
Morfologi bunga dan buah Garcinia. A = bunga dioecius dengan cupat
buah memanjang, B = bunga hermaprodit dengan cupat buah tidak
memanjang, 1 = Garcinia celebica L. (2), 2 = Garcinia hambroniana
Pierre., 3 = Garcinia megaphylla Verd., 4 = Garcinia porrecta dan 5 =
Garcinia malaccensis T. Anderson
Urutan basa nukleotida terpaut kekuatan dinding sel (5‟–3‟) hasil
seleksi Database Genbank. Hijau = marka molekuler K_1F, ungu =
primer K_1R, biru = primer K_2F dan kuning = primer K_2R
Hasil elektroforesis ektraksi DNA manggis. M = Lamda, 1–3 = DNA
manggis buah tidak bergetah kuning dan 4–5 = DNA manggis buah
bergetah kuning
Hasil eletroforesis amplifikasi DNA manggis menggunakan kombinasi
pasangan primer pertama K_2F dan K_1R dan primer ke dua K_2F dan
3
4
6
13
14
15
17
19
21
27
28
K_2R. M = 1 kb, 1 = DNA satu individu manggis dengan buah bergetah
kuning dan 2 = DNA satu individu manggis dengan buah tidak bergetah
kuning
13. Contoh hasil elektroforesis amplifikasi DNA manggis menggunakan
marka molekuler KDSM. M = 1 kb, 1–17 = aksesi manggis buah tidak
bergetah dan 20–34 = aksesi manggis buah bergetah kuning
29
31
DAFTAR LAMPIRAN
1. Hasil kromatogram analisis runutan basa DNA Garcinia mangostana L.
forward terpaut karakter apomiksis
38
2. Hasil kromatogram analisis runutan basa DNA Garcinia malacenssis T.
Anderson forward terpaut karakter apomiksis
39
3. Hasil kromatogram analisis runutan basa DNA Garcinia celebica L.
forward terpaut karakter apomiksis
40
4. Hasil kromatogram Garcinia sp forward terpaut karakter kekuatan
dinding sel pada manggis.
41
5. Hasil kromatogram Garcinia megaphylla verd. forward terpaut karakter
kekuatan dinding sel pada manggis.
42
6. Hasil kromatogram Garcinia celebica L. forward terpaut karakter
kekuatan dinding sel pada manggis.
43
7. Desain marka molekuler dari sekuen acuan terpaut kekuatan dinding sel
tanamana
8. Hasil kromatogram analisis runutan basa DNA Garcinia mangostana L.
reverse terpaut karakter kekuatan dinding sel
44
45
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan salah satu komoditas buah
tropik primadona ekspor Indonesia yang sangat disenangi dan diminati pasar
internasional sehingga dijuluki “queen of tropical fruits” (Cox 1976). Manggis
bersifat apomiksis obligat (biji berkembang tanpa terjadi fertilisasi) dan berasal
dari embrio adventif (Sprecher 1919). Peristiwa apomiksis merupakan pola unik
dari pembentukan tanaman, dimana biji yang dihasilkan fertil dan memiliki
konstitusi genetik yang sama dengan induk betinanya (Sinaga 2008). Apomiksis
pada tanaman Garcinia terbagi menjadi dua, yaitu apomiksis obligat dan
apomiksis fakultatif (reproduksi seksual masih dapat terjadi). Pada apomiksis
obligat peristiwa seksual dihambat dan embrio terbentuk dari perkembangan sel
nuselar dengan inti diploid, sedangkan pada apomiksis fakultatif sel nuselar
tertentu mangalami reproduksi seksual dan sel nuselar lainnya mengalami
reproduksi aseksual (Koltunow 1993).
Perbedaan dan pengetahuan dasar genetik mengenai sifat apomiksis
obligat dan fakultatif pada manggis dan kerabat dekatnya diperlukan dalam
analisis kekerabatan serta pengembangan tanaman manggis dan kerabat dekatnya,
akan tetapi informasi ini belum banyak dipelajari. Oleh karena itu perlu dilakukan
penelitian mengenai dasar genetik sifat apomiksis pada manggis dan kerabat
dekatnya, untuk mendukung program pemuliaan (PKBT 2010) dan menambah
pemahaman akan hubungan kekerabatan antar aksesi manggis dan kerabat
dekatnya yang sangat berpengaruh terhadap peningkatan mutu serta memudahkan
menejemen konservasinya (Roldan et al. 2001).
Saat ini permintaan ekspor manggis masih sangat tinggi, tetapi kuota
permintaan tidak dapat terpenuhi dengan baik (Mansyah 2011). Hal ini
dikarenakan berbagai kendala, seperti rendahnya produksi dan mutu buah
manggis yang tidak memenuhi kriteria ekspor (Gunadnya et al. 2001),
dikarenakan oleh cemaran getah kuning (Indriyani et al. 2002). Menurut Dorly et
al. (2008) getah kuning dihasilkan di dalam saluran getah yang berbentuk kanal
bercabang dikelilingi oleh sel epitel pada endokarp dan rusaknya dinding sel epitel
ini akan menyebabkan keluarnya getah kuning yang akan mengotori aril (daging
buah). Selain itu, getah kuning juga dapat merusak daging buah yang
menyebabkan rasa buah menjadi pahit (Sdoodee & Limpun 2002). Buah manggis
yang bergetah kuning pada bagian daging buah sulit dibedakan dengan buah yang
tidak bergetah kuning, kecuali buah dibuka terlebih dahulu. Hal ini menyulitkan
proses seleksi untuk memperoleh buah manggis yang tidak bergetah kuning
(PKBT 2007). Oleh karena itu diperlukan tanaman yang memiliki dinding sel
epitel yang kuat dan tahan terhadap pecahnya dinding sel. Untuk membentu
seleksi agar lebih cepat dan efektif, diperlukan marka molekuler yang tekait
dengan sifat kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning. Marka
molekuler tersebut dapat digunakan untuk memilih tanamn manggis yang akan
dikembangkan sebagai tetua buah manggis yang tidak bergetah kuning (Sobir 28
Maret 2012, komunikasi pribadi).
2
Marka molekuler yang berasosiasi dengan sifat apomiksis dan kekuatan
dinding sel telah dikembangkan pada penelitian sebelumnya (PKBT 2010 dan
Mansyah 2011). Berdasarkan marka molekuler tersebut, penelitian ini bertujuan
untuk mendapatkan marka molekuler spesifik terpaut karakter apomiksis yang
dapat digunakan dalam analisis kekerabatan manggis dan kerabat dekatnya serta
marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel penyusun saluran getah
kuning pada manggis yang dapat digunakan untuk identifikasi buah manggis yang
berpotensi tidak mengeluarkan getah kuning akibat kerusakan dinding sel. Marka
molekuler tersebut dikembangkan berdasarkan sekuen DNA dari tanaman
manggis dan kerabat dekatnya.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk: (1) mendapatkan marka molekuler spesifik
yang berasosiasi dengan karakter apomiksis untuk analisis kekerabatan Garcinia
dan (2) mendapatkan marka molekuler spesifik yang berasosiasi dengan karakter
kekuatan dinding sel pada manggis yang berguna untuk identifikasi buah manggis
yang berpotensi tidak mengeluarkan getah kuning.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan memberi informasi mengenai: (1) marka
molekuler spesifik yang berasosiasi dengan karakter apomiksis untuk analisis
kekerabatan Garcinia dan (2) marka molekuler spesifik yang berasosiasi dengan
karakter kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning pada manggis yang
dapat digunakan untuk identifikasi buah manggis yang berpotensi tidak
mengeluarkan getah kuning.
3
Berdasarkan tujuan dan ruang lingkup penelitian yang dilakukan disusun
alur pikir penelitian. Penelitian ini dilaksanakan melalui beberapa tahapan dengan
bagan alur penelitian yang dapat dilihat pada Gambar 1.
Isu utama pengembangan Garcinia
Apomiksis
Getah kuning
41 spesies Garcinia
(apomiksis obligat dan
apomiksis fakultatif)
39 aksesi manggis (20
bergetah kuning dan 19
tidak bergetah kuning)
Isolasi DNA
Isolasi DNA
Amplifikasi DNA
Elektroforesis gel
agarose
Menggunakan primer yang
dikembangkan berdasarkan
penelitian sebelumnya untuk
sifat apomiksis (PKBT 2010)
dan sekuen homologi gen
penyandi kekuatan dinding sel
(Mansyah 2011)
Amplifikasi DNA I
Elektroforesis gel
agarose
Purifikasi fragmen
DNA polimorfik
Analisis runutan basa
DNA dan desain primer
dengan teknik SNP
Amplifikasi II produk
elusi
Verifikasi marka
molekuler
Marka Molekuler
spesifik
Analisis data
Analisis
data
Verifikasi marka
molekuler
Amplifikasi III produk
amplifikasi II
Analisis runutan basa
DNA dan desain primer
dengan teknik STS
Gambar 1 Diagram alir penelitian pengembangan marka molekuler terpaut
apomiksis dan kekuatan dinding sel pada manggis dan kerabat dekat
4
TINJAUAN PUSTAKA
Manggis (Garcinia mangostana L.) dan Kerabat Dekatnya (Garcinia spp.)
Garcinia termasuk ke dalam famili Cluciaseae yang terdiri atas 4 suku,
yaitu Clusieae, Garciniaeae, Calophyylleae dan Symphonieae. Garciniaeae terdiri
atas genus Ochrocarpos, Marialva, Micranthera dan Garcinia. Pada penelitian ini
kami mengembangkan marka molekuler pada Garcinia. Karakter khas dari
Garcinia memiliki getah berwarna putih atau kuning pada seluruh bagian
tanaman. Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan tanaman buah tropik dan
berdasarkan beberapa penelitian diketahui bahwa manggis berasal dari Indonesia
serta kawasan Asia Tenggara. Rhichards (1990), menyatakan bahwa manggis
(jumlah kromosom 2n=96) memiliki morfologi intermediet antara dua kerabat
dekatnya G. hambroniana Pierre. dan G. malaccensis T. Anderson yang
merupakan agamospermy fakultatif dan merupakan hasil persilangan antara G.
hombroniana Pierre dengan G. malaccensis T. Anderson. Manggis merupakan
pohon hutan tahunan (perennial), dioecious, tinggi 6−20 meter, berbatang lurus
dengan cabang yang simetris (Gambar 2).
Mahkota daun (kanopi) tampak indah menyerupai setengah kerucut.
Daunnya lebar dan tebal, tunggal (folium simplex), berhadapan, bentuk oval
memanjang (oblongus), mengkilap, kaku dan ujung daun meruncing pendek,
tangkainya memeluk pucuk, sehingga pasangan teratas menutupi kuncup
terminalnya, dengan ibu tulang daun (midrib) yang berwarna hijau muda
(Sunarjono 2000).
Gambar 2 Habitus manggis (Garcinia mangostana L.) di kebun manggis
Leuwiliang Bogor
Bunganya besar, kelopaknya tebal berwarna hijau terdiri dari 4 helai.
Putiknya bercabang 4−8 yang tetap melekat pada ujung buah dan memiliki
benang sari steril. Buah berbentuk bulat panjang 3−6 cm, dengan diameter 4−7.5
cm, berkulit licin, di ujung buah masih kelihatan cuping bekas kepala putik yang
5
jumlahnya sama dengan banyaknya segmen daging buah yang berada di
dalamnya. Kulit buah berwarna merah keunguan (purple), tebal sekitar 5 mm.
Berat buah bervariasi 75−150 gram tergantung pada umur pohon dan daerah
geografisnya. Buah manggis memiliki tipe berupa buah buni, daging buah
tebalnya kira-kira 0.9 cm. Setiap biji yang besar mempunyai ruas-ruas yang
masing-masing mempunyai potensi untuk tumbuh. Manggis dan kerabat dekatnya
memiliki ciri khusus yaitu seluruh bagian tumbuhan bergetah dan biji bersifat
apomiksis (Satuhu 1994).
Apomiksis Garcinia mangostana L. dan Garcinia spp.
Apomiksis (apogami) merupakan bentuk reproduksi aseksual pada
tumbuhan melalui biji. Pada apomiksis, kecambah muncul dari biji tetapi bukan
berasal dari embrio, namun berasal dari jaringan maternal. Sehingga genetik
tumbuhan baru yang muncul akan identik dengan tetua betinanya. Menurut Asker
dan Jerling (1992) apomiksis merupakan proses reproduksi aseksual yang terjadi
pada ovul tanaman berbunga sebagai struktur yang berkembang melaksanakan
fungsi reproduksi seksual. Mekanisme apomiksis pada angiospermae berbeda
dengan mekanisme amfiksis, dimana mekanisme amfiksis terjadi secara sporofitik
membentuk mikrospora dan megaspore melalui meiosis, kemudian mengalami
mitosis membentuk mikrogametofit dan megagametofit. Sedangkan fertilisasi
ganda menghasilkan endosperm dan embrio zigotik.
Apomiksis pada Garcinia terbagi menjadi dua, yaitu apomiksis obligat dan
apomiksis fakultatif. Pada apomiksis fakultatif proses reproduksi masih dapat
terjadi, dimana sel nuselar yang satu mengalami reproduksi seksual dan sel
nuselar lainnya mengalami reproduksi aseksual. Apomiksis terjadi secara
nonrecurrent (stabil), embrio haploid terjadi tanpa fertilisasi, maupun secara
apomiksis recurrent, embrio terjadi tanpa reduksi mitotik dan fertilisasi, sehingga
seluruh genotip maternal diwariskan kepada keturunannya (Sinaga 2008). Saat ini
telah telah diperoleh pita-pita marka molekuler polimorfik antara karakter
apomiksis dan non apomiksis (PKBT 2010) yang diperoleh dari hasil
pengembangan marka SCAR (sequence characterized amplified region) terpaut
sifat apomiksis pada Pennisetum squamulatum (Ozias askins et al. 1998) dan
selanjutnya akan didesain marka molekuler spesifik karakter apomiksis pada buah
manggis.
Getah Kuning (Gamboge Disorder)
Getah kuning merupakan masalah utama yang menjadi faktor pembatas
volume ekspor buah manggis karena menurunkan kualitas manggis layak ekspor,
sehingga dari total produksi manggis Indonesia hanya 9.6% yang termasuk
kualitas layak ekspor (Ditjen 2009). Getah kuning adalah senyawa metabolit
sekunder yang merupakan gummi resin pada tanaman Guttiferae (Tjitrosoepromo
1994). Berdasarkan hasil penelitian Pusat Penelitian dan Pengembangan
Hortikultura diketahui bahwa getah kuning pada buah manggis dapat dibedakan
menjadi getah kuning pada kulit luar buah (pericarp) (Gambar 3a) dan getah
kuning pada kulit bagian dalam buah (endocarp) yang mencemari daging buah
6
(aril) sehingga rasa buah menjadi pahit dan tidak layak konsumsi (Gambar 3b).
Getah kuning dapat dijumpai pada buah manggis yang masih muda maupun yang
telah matang.
A
B
Gambar 3 Getah kuning pada buah manggis. A = Getah kuning pada
pericarp dan B = Getah kuning pada endocarp
Getah kuning diproduksi sebagai sistem pertahanan dan bagian dari
metabolisme tanaman (Dorly 2009). Getah kuning dapat disebabkan karena
tusukan Helopeltis antonii (Sunarjono 2000), peningkatan kadar air tanah secara
tiba-tiba setelah mengalami kekeringan, terjadinya benturan, serangan cendawan
Fusarium oxysforum, gangguan serangga dan pada saat buah matang kondisi
lingkungan sangat basah (Mansyah 2011). Pengendalian getah kuning dapat
dilakukan dengan berbagai cara, yaitu membiarkan rerumputan disekitar tanaman
manggis pada saat buah masih muda, pengaturan perairan dan perbaikan drainase
kebun serta pemberian kalsium dan boron (Yenisbar 2011).
Getah kuning pada buah manggis juga dapat disebabkan karena rusaknya
sel epitel pada saluran getah yang menyebabkan keluarnya getah kuning. Ini dapat
terjadi karena perbedaan pertumbuhan antara biji dan aril dengan bagian perikarp
buah dan terjadi perubahan tekanan tugor sel akibat fluktuasi kandungan air tanah
selama fase perkembangan buah, sehingga dinding sel saluran getah kuning yang
tidak kuat akan pecah dan mengeluarkan getah kuning. Lemahnya dinding sel
pada buah manggis diperkirakan karena rendahnya mikrofibril selulosa penyusun
dinding sel yang disintesis oleh tumbuhan.
Kekuatan dinding sel (Cell Wall Strength/CWS) saluran getah kuning pada
manggis berkaitan dengan penyusunan mikrofibril selulosa pada dinding sel
tersebut. Sekuen gen Fragile Fiber 1 (FRA 1) merupakan gen penyandi
mikrofibril selulosa penyusun dinding sel. Sehingga pada penelitian ini digunakan
sekuen gen FRA 1 untuk menganalisis kekuatan dinding sel pada tanaman
manggis yang di ambil dari beberapa tanaman, yaitu Arabidopsis thaliana kinesinlike protein (AY158083.1 dan AY158084.1), A. thaliana microtubule motor
(NM_180820.1 dan NM_124156.4) dan Ricinus communis kinesin heavy chain
(XM_002510131.1) yang selanjutnya akan didesain marka molekuler spesifik
karakter kekuatan dinding sel pada buah manggis (Mansyah 2011).
7
Marka Molekuler
Marka molekuler merupakan alat bantu dalam mengidentifikasi genotipe
yang dimiliki oleh suatu individu. Pengembangan marka molekuler untuk
menyeleksi sifat yang diinginkan dari suatu organisme dapat dilakukan dengan
mengidentifikasi marka molekuler yang terpaut dengan karakter tanaman yang
dipelajari. Salah satu kelebihan dari metode ini adalah waktu pengujian yang
cepat dan tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Marka molekuler hanya
berguna apabila menghasilkan fragmen pita polimorfik dan terpaut dengan sifat
yang akan diamati atau dengan marka molekuler lain, dimana marker molekular
yang ideal juga bersifat kodominan, banyak terdapat dalam genom, aksesnya
mudah dan memiliki konsistensi tinggi. Syarat polimorfik diperlukan karena
penanda genetik harus bisa membedakan individu-individu dalam populasi yang
diteliti. Suatu marka harus bisa mengelompokkan individu paling tidak dalam dua
kelompok. Syarat terpaut dengan marka, gen atau sifat lain diperlukan karena
fungsi marka molekuler adalah sebagai tanda pengenal yang harus melekat pada
sifat yang diteliti.
Pengembangan marka molekuler untuk identifikasi buah manggis yang
bergetah kuning dan tidak bergetah kuning telah dilakukan pada penelitian
sebelumnya (Mansyah 2011), pada 27 aksesi manggis. Hasil penelitian tersebut
menunjukkan adanya keterkaitan antara marka molekuler mangosteen cell wall
strength (MCWS) dengan penyakit getah kuning pada buah manggis yang dapat
digunakan sebagai marka untuk mengidentifikasi getah kuning buah manggis.
Akan tetapi marka tersebut belum spesifik untuk sekuen DNA manggis, karena
marka yang dikembangkan berdasarkan sekuen-sekuen DNA dari berbagai
tanaman. Sehingga perlu dilakukan penelitian ini untuk mendapatkan marka
spesifik terkait kekuatan dinding sel yang dikembangkan dari tanaman manggis.
Saat ini marka molekuler terpaut karakter apomiksis pada Garcinia belum
diidentifakasi, sehingga pada penelitian ini juga dilakukan pengembangan marka
molekuler terpaut sifat apomiksis yang dikembangkan dari Garcinia untuk dapat
digunakan dalam pengembangan tanaman Garcinia.
Sequence Tagged Sites (STS) dan Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
Marka STS merupakan marka berbasis PCR (Polymerase Chain Reaction)
yang memiliki panjang primer 18-25 nukleotida dan diperoleh melalui hasil
sekuensing fragmen gen yang sudah diketahui ukurannya atau berbasis pada
informasi sekuen DNA. Primer yang didesain dapat dikembangkan dari fragmen
spesifik yang merupakan penciri khusus pada genom organisme. Ini berdasarkan
beberapa fragmen spesifik yang diperoleh dari fingerprinting berbasis PCR
sebagai penciri karakter yang diinginkan dan dapat dianalisis lebih lanjut, seperti
kloning fragmen ke dalam vektor, yang dilanjutkan dengan sekuensing dan desain
primer spesifik.
Reprodusibilitas dan kegunaan marka STS lebih tinggi dibandingkan
dengan marka molekuler lainnya. Meskipun marka STS secara genetik bersifat
dominan, namun dapat dikonversi menjadi marka kodominan melalui pemotongan
dengan menggunakan enzim restriksi. Marka STS dapat digunakan dalam
pemetaan genetik, membutuhkan enzim endonuklease restriksi untuk hasil PCR,
8
bersifat kodominan, mudah diadopsi dan diterima dalam hal otomatisasi, serta
menghasilkan amplifikasi yang stabil dan berulang-ulang dengan tipe polimorfik
yang dideteksi berdasarkan pertukaran basa (Litbang-Deptan 2011).
Marka SNP merupakan marka molekuler yang berdasarkan variasi satu
nukleotida dalam sekuen DNA individu, dimana variasi ini ditunjukkan dari
terjadinya perubahan satu nukleotida oleh nukleotida lainnya yang dapat
menyebabkan perubahan asam amino sehingga mempengaruhi penyusunan
protein yang terbentuk pada individu tersebut. Identifikasi SNP secara langsung
dapat dilakukan dengan melakukan sekuensing segmen DNA hasil PCR
menggunakan marka molekuler spesifik untuk suatu sifat yang diinginkan dan
membandingkan hasil sekuen segmen DNA tersebut sampai teridentifikasinya
perbedaan nukleotida antar sekuen individu.
PENGEMBANGAN MARKA MOLEKULER YANG
BERASOSIASI DENGAN KARAKTER APOMIKSIS PADA
MANGGIS DAN KERABAT DEKATNYA
Abstrak
Manggis dan kerabat dekatnya memiliki mekanisme reproduksi apomiksis.
Apomiksis merupakan sistem reproduksi yang terjadi secara alami, dimana
embrio yang dihasilkan tidak melalui pembelahan miosis ataupun pembuahan
ovum. Keturunan dari tanaman apomiksis memiliki konstitusi genetik yang sama
dengan induk betinanya. Betuk apomiksis pada manggis dan kerabat dekatnya
merupakan apomiksis embrio adventif. Sifat apomiksis pada manggis dan kerabat
dekatnya, terdiri atas dua tipe, yaitu apomiksis obligat dan apomiksis fakultatif.
Identifikasi dan karakterisasi plasma nutfah manggis dan kerabat dekatnya sangat
diperlukan dalam proses konservasi dan peningkatan sumber genetiknya.
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangan marka molekuler spesifik terpaut
karakter apomiksis yang dapat digunakan untuk mempelajari dan memahami
mekanisme apomiksis pada manggis dan kerabat dekatnya. Pengembangan marka
molekuler dilakukan berdasarkan sekuen DNA 3 spesies Garcinia (Garcinia
mangostana L., Garcinia celebica L. dan Garcinia malacensis Hk. F
) yang diperoleh dari hasil amplifikasi menggunakan primer Ozias akins
berdasarkan sekuen DNA Pennisetum. Berdasarkan sekuen tersebut dilakukan
pengembangan tiga set primer, yaitu Apo_Fak1, Apo_Fak2 dan Apo_Obli. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa primer yang telah dikembangkan berhasil
menghasilkan pita spesifik dengan ukuran ± 300 pb dan ± 317 pb pada masingmasing spesies terpaut karakter apomiksis dan mengelompokkan 41 spesies
Garcinia kedalam 3 kelompok, yaitu 14 spesies apomiksis obligat, 14 spesies
apomiksis fakultatif dengan bunga dioecius dan 13 spesies apomiksis fakultatif
dengan bunga hermaprodit. Informasi ini dapat digunakan sebagai informasi dasar
dalam program pemuliana Garcinia.
Kata Kunci: Apomiksis, manggis dan kerabat dekatnya, marka molekuler spesifik
9
Pendahuluan
Manggis (Garcinia mangostana L.) dan kerabat dekatnya (Garcinia spp.)
merupakan anggota famili Gutiferae atau Cluciaseae. Mekanisme reproduksi pada
manggis dan kerabat dekatnya bersifat apomiksis. Peristiwa apomiksis merupakan
pola unik dari pembentukan tanaman, dimana biji yang dihasilkan bersifat fertil
dan memiliki konstitusi genetik yang sama dengan induk betinanya (Sinaga
2008). Apomiksis pada tanaman Garcinia terbagi menjadi dua, yaitu apomiksis
obligat dan apomiksis fakultatif (Sprecher 1919). Manggis bersifat apomiksis
obligat (biji berkembang tanpa terjadi fertilisasi) dan berasal dari embrio adventif
(Sprecher 1919). Menurut Den Nijs dan Van Dijk (1993) pada reproduksi
apomiksis obligat, biji terbentuk tanpa terjadi reduksi jumlah kromosom dan
terjadi reproduksi aseksual. Hal ini didukung Mansyah (2002), yang menyatakan
bahwa pada berbagai tingkat perkembangan bunga secara visual dengan
menggunakan lup pada bunga manggis menunjukkan tidak terlihat adanya serbuk
sari. Sedangkan pada apomiksis fakultatif sel nuselar tertentu mangalami
reproduksi seksual dan sel nuselar lainnya mengalami reproduksi aseksual
(Koltunow 1993). Menurut Nogler (1984) ditemukannya variasi genetik pada
tanaman apomiksis fakultatif, disebabkan karena terjadinya reproduksi seksual,
sehingga menghasilkan individu yang bervariasi secara genetik dengan jumlah
kromosom yang tetap.
Perbedaan dan pengetahuan dasar genetik mengenai sifat apomiksis
obligat dan fakultatif pada manggis dan kerabat dekatnya diperlukan dalam
analisis kekerabatan serta pengembangan tanaman Garcinia, akan tetapi informasi
ini belum banyak dipelajari. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian mengenai
dasar genetik sifat apomiksis pada manggis dan kerabat dekatnya, untuk
mendukung program pemuliaan (PKBT 2010) dan menambah pemahaman akan
hubungan kekerabatan antar aksesi manggis dan kerabat dekatnya yang sangat
berpengaruh terhadap peningkatan mutu serta memudahkan menejemen
konservasinya (Roldan et al. 2001). Berdasarkan informasi tersebut, penelitian ini
bertujuan untuk mendapatkan marka molekuler spesifik terpaut karakter
apomiksis yang dapat digunakan dalam analisis kekerabatan manggis dan kerabat
dekatnya. Marka molekuler tersebut dikembangkan berdasarkan sekuen DNA dari
tanaman manggis dan kerabat dekatnya.
Bahan dan Metode
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat Kajian Hortikultura
Tropik (PKHT) Institut Pertanian Bogor Jawa Barat, pada bulan Mei 2012 sampai
dengan April 2013.
Bahan Tanaman
Sebanyak 41 spesies manggis (Garcinia mangostana L.) dan kerabat
dekatnya (Garcinia spp.), koleksi Kebun Raya Bogor dan Taman Buah Mekar
Sari di koleksi untuk dilakukan analisis DNA (Tabel 1).
10
Tabel 1 Sampel 41 spesies manggis dan kerabat dekatnya (Garcinia spp.)
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
a
Spesies
Garcinia dulcis Kurz
Garcinia sp.
Garcinia forbesii King
Garcinia sp.
Garcinia sizygiifolia Pierre
Garcinia lateriflora Blume var.
javanica Boerl.
Garcinia sp.
Garcinia parvifolia Miq.
Garcinia sp.
Garcinia benthami Pierre
Garcinia tetrandra Pierre
Garcinia tetrandra Pierre
Garcinia porrecta Wall. var.
schizogyna Boerl.
Garcinia spicata Hook.f.
Garcinia picrorhiza Miq.
Garcinia balica Miq.
Garcinia sp.
Garcinia latissima Miq.
Garcinia binucaa (Blanco) Choisy
Garcinia kydia Roxb.
Garcinia xanthochymus Hook.
Garcinia echinocarpa Thwaites
Garcinia nigrolineata Planch
Garcinia livingstonei Anderson
Garcinia picrorhiza Miq. Var.
limonorhiza Boerl.
Garcinia celebica L. (1)
Garcinia sp.
Garcinia megaphylla Verdc.
Garcinia hambroniana Pierre
Garcinia palawensis Elmer (cf.)
Garcinia loureiri Pierre
Garcinia sp.
Garcinia porrecta Wall.
Garcinia tetrandra Pierre
Garcinia forbesii king
Garcinia nigrolineata Planch
Garcinia latisima Miq.
Garcinia hambroniana Pierre
Garcinia malaccensis T. Anderson
Garcinia celebica L. (2)
Garcinia mangostana L.
Nomor aksesia
VI.C/378
VI.C/377
VI.C/381
VI.C/379
VI.C/325
Lokasi Pengambilan
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
VI.C/150
Kebun Raya Bogor
VI.C/385
VI.C/382
VI.C/383
VI.C/106
VI.C/108
VI.C/386
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
VI.C/145
Kebun Raya Bogor
VI.C/111
VI.C/141
VI.C/365
VI.C/472
VI.C/366a
VI.C/161
VII.D/84
VI.A/52
VI.A/36
VI.A/28
VI.A/30
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
VI.A/27
Kebun Raya Bogor
VI.A/16a
VI.A/77
VI.A/45
IX.D/286b
VI.A/63
VI.C/60
VI.C/412
VI.A/79
IX.D/280b
VI.C/474
VI.A/34
VI.A/54
*
*
*
*
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Taman Buah Mekar Sari
Taman Buah Mekar Sari
Taman Buah Mekar Sari
Taman Buah Mekar Sari
Tidak memiliki nomor aksesi.
Metode
Primer untuk Marka Molekuler Terpaut Karakter Apomiksis. Primer
terpaut karakter apomiksis pada penelitian ini menggunakan primer yang telah
dikembangkan pada penelitian sebelumnya (PKBT 2010), berdasarkan hasil
rancangan Ozias akins et al. (1998). Dimana primer terpaut apomiksis tersebut
dikembangkan dari Pennisetum apomiksis dan seksual, berdasarkan hasil
pengembangan sequence characterized amplified region (SCAR) dari sekuen
11
DNA hasil random amplified polymorphic DNA (RAPD). Marka molekuler
terpaut karakter apomiksis yang digunakan pada penelitian ini yaitu, marka
molekuler C4 (forward 5‟CCGCATCTACAATAATCA‟3 dan reverse
5‟GAAATAAAGGCACTGGGA‟3).
Isolasi DNA Manggis (Garcinia mangostana L.) dan Kerabat
Dekatnya (Garcinia spp.). Isolasi DNA 41 tanaman manggis dan kerabat
dekatnya, dilakukan mengikuti metode Doyle dan Doyle (1990) dengan beberapa
modifikasi, menggunakan buffer ekstraksi (10% CTAB, 0.5 M EDTA (pH 8.0), 1
M Tris-HCl (pH 8.0), 5 M NaCl dan 1% β-mercaptoethanol) dengan penambahan
polivinilpyrolidon. Potongan daun muda sebanyak 0.15 mg digerus menggunakan
mortar dengan menambahkan sekitar 0.6-0.8 ml buffer ekstraksi. Setelah digerus
sampai halus, ekstrak daun tersebut dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan
diinkubasi pada suhu 65°C selama 1 jam. Proses inkubasi ini dimaksudkan agar
proses lisis dinding sel dapat berjalan dengan baik. Setelah diinkubasi, eppendorf
selanjutnya disentrifuse pada 11.000 rpm selama 10 menit setelah ditambahkan
CIA (Chloroform:Isoamil Alcohol 24:1 v/v), supernatan diambil dan dipindahkan
ke dalam tabung mikro steril 1000 µl baru dengan menambahkan 500 sampai 600
µl 2-propanol dingin dan diinkubasi dalam freezer overnight. Selanjutnya,
disentrifuse dan supernatan dibuang. Pelet yang diperoleh dicuci dengan alkohol
70% dan dikering anginkan overnight. Pelet dilarutkan dalam 10 sampai 50 µl TE
(1 M Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M EDTA (pH 8.0) dan Aquades).
Skrining Primer. Primer yang telah didesain sebelumnya, selanjutnya
dilakukan skrining primer pada sampel tanaman manggis dan kerabat dekatnya
yang telah dikoleksi. Skrining primer dilakukan dengan menggunakan mesin PCR
(Termocycler Aplied Biosistems 2720 USA) dengan volume reaksi 25 µl (2 µl
DNA template (10 ng/μl), masing-masing 1 µl primer (10 ng/μl), 12.5 µl Go Taq
Green Master Mix (Promega M7122) dan 9.5 µl air murni). Proses amplifikasi
PCR dilakukan sebanyak 35 siklus setelah denaturasi awal pada suhu 94°C selama
4. Setiap siklus terdiri dari denaturasi pada suhu 94°C selama 45 detik, annealing
pada suhu 45-65°C selama 30 detik dan pemanjangan fragmen DNA pada suhu
72°C selama 20 detik. Amplifikasi PCR diakhiri dengan dilakukan ektensi pada
suhu 72°C selama 10 menit.
Elektroforesis Fragmen DNA Manggis dan Kerabat Dekatnya Hasil
PCR. Fragmen DNA hasil amplifikasi di elektroforesis bersama dengan DNA
standar 1 kb DNA ladder pada gel agarose 1.2% dalam buffer TBE 1X selama 45
menit pada tegangan 50 volt dan diwarnai dengan 1% ethidium bromide selama
10 menit untuk melihat fragmen DNA manggis yang dihasilkan. Selanjutnya hasil
elektroforesis didokumentasikan dan disimpan.
Analisis Sekuen Fragmen DNA dan Pengembangan Marka Molekuler
untuk Indentifikasi Karakter Apomiksis pada Manggis dan Kerabat
Dekatnya. Analisis runutan basa DNA fragmen pita marka molekuler terpaut
karakter apomiksis dilakukan menggunakan jasa sekuensing. Pengembangan
marka molekuler terpaut karakter tersebut dilakukan berdasarkan sekuen manggis
dan kerabat dekatnya mengikuti metode Innis dan Gelfand (1990) berdasarkan
12
karakter apomiksis dari hasil analisis runutan basa DNA. Pengembangan marka
molekuler terpaut karakter apomiksis akan dilakukan berdasarkan sekuen manggis
dan kerabat dekatnya dengan teknik SNP.
Verifikasi Marka Molekuler. Verifikasi marka molekuler terpaut
apomiksis dilakukan pada
Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding Sel Penyusun
Saluran Getah Kuning pada Manggis (Garcinia mangostana L.)
RISA ARYANTRI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Pengembangan Marka
Molekuler yang Berasosiasi dengan Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding
Sel Penyusun Saluran Getah Kuning pada Manggis (Garcinia mangostana L.)
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013
Risa Aryantri
NRP G353110121
* Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.
RINGKASAN
RISA ARYANTRI. Pengembangan Marka Molekuler yang Berasosiasi dengan
Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding Sel Penyusun Saluran Getah Kuning
pada Manggis (Garcinia mangostana L.). Dibimbing oleh MIFTAHUDIN dan
SOBIR.
Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan salah satu komoditi buah
tropis yang menjadi unggulan ekspor Indonesia dan dijuluki sebagai “Queen of
Tropical Fruits”. Saat ini terdapat dua isu utama dalam pengembangan tanaman
manggis dan kerabat dekatnya, yaitu sifat apomiksis dan adanya getah kuning
pada buah manggis yang disebabkan rusaknya dinding sel penyusun saluran getah
kuning, sehingga perlu dilakukan penelitian yang mempelajari aspek apomiksis
pada Garcinia dan kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning pada
manggis. Penelitian ini terbagi menjadi dua topik utama, yaitu pengembangan
marka molekuler terpaut karakter apomiksis pada Garcinia dan pengembangan
marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel penyusun saluran getah
kuning pada manggis.
Manggis memiliki mekanisme reproduksi apomiksis. Apomiksis merupakan
sistem reproduksi yang terjadi secara alami, dimana embrio yang dihasilkan tidak
melalui pembelahan miosis ataupun pembuahan ovum. Keturunan dari tanaman
apomiksis memiliki konstitusi genetik yang sama dengan induk betinanya. Pada
Garcinia, bentuk apomiksisnya dikenal sebagai embrio edventif yang terbagi
menjadi apomiksis obligat dan apomiksis fakultatif. Akan tetapi, identifikasi dan
karakterisasi sifat apomiksis pada Garcinia sangat diperlukan dalam proses
konservasi dan pemanfaatannya, sehingga perlu dilakukan pengembangan marka
molekuler spesifik yang berasosiasi dengan sifat apomiksis sebagai alat yang
digunakan dalam identifikasi, karakterisasi dan seleksi plasma nutfah Garcinia.
Bagian pertama dari penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan marka
molekuler terpaut karakter apomiksis yang dapat digunakan untuk mengetahui
hubungan kekerabatan manggis dan kerabat dekatnya. Proses amplifikasi DNA
dilakukan dengan menggunakan primer yang telah dikembangkan oleh Ozias
akins et al. (1998) berdasarkan sekuen DNA Pennisetum. Primer tersebut
digunakan untuk amplifikasi DNA dari 4 spesies Garcinia, yaitu Garcinia
mangostana L., G. hambroniana Pierre., G. celebica L. dan G. malacensis T.
Anderson. Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa dari ke 4 spesies tersebut hanya
Garcinia hambroniana Pierre yang tidak teramplifikasi, sedangkan ketiga spesies
lainnya menghasilkan fragmen pita dengan ukuran sama, yaitu ± 480 pb. Hasil
analisis BLAST pada NCBI terhadap sekuen DNA dari hasil PCR tersebut
menunjukkan tidak ada homologi dengan sekuen DNA dari tanaman lain,
sehingga langkah selanjutnya didesain primer berdasarkan Single Nucleotide
Polymorphism (SNP dari 3 sekuen pita DNA dari ke 3 spesies (G. mangostana L.,
G. celebica L. dan G. malacensis T. Anderson).
Pada penelitian ini telah didesain dan digunakan 3 set primer, yaitu (1)
Apo_Fak1 (forward 5‟ACAATAATCACCACCATACC‟3 dan reverse 5‟GTCT
TTTCCACTTGGGCTGG‟3); (2); Apo_Fak2 (forward 5‟ACAATAATCACC
ACCATACC‟3 dan reverse 5‟AGGCTTCAACTTAGTTG TCA‟3); (3) Apo_Obli
(forward 5‟ACAATAATCACCACCATACC‟3 dan reverse 5‟TCATTTCCCA
CTTGGGCTGT‟3). Ke tiga set primer tersebut diverifikasi menggunakan 3
spesies acuan (G. mangostana L., G. celebica L. dan G. malacensis T. Anderson)
dan hasilnya menunjukkan pita berukuran ± 300 pb pada G. mangostana L. dan
G. celebica L. dan ± 317 pb G. malacensis T. Anderson yang berkaitan dengan
sifat apomiksis dari tiap spesies. Dengan menggunakan marka molekuler tersebut
41 spesies Garcinia yang dianalisis dapat dikelompokkan ke dalam 3 kelompok,
yaitu 14 spesies apomiksis obligat, 14 spesies apomiksis fakultatif dengan bunga
dioecius dan 13 spesies apomiksis fakultatif dengan bunga hermaprodit.
Faktor lainnya yang perlu diperhatikan dalam pengembangan tanaman
manggis adalah bagaimana menghilangkan getah kuning pada buah manggis.
Getah kuning merupakan masalah utama yang dapat menurunkan kualitas buah
manggis yang menyebabkan rasa buah menjadi tidak enak. Struktur saluran getah
kuning pada manggis merupakan saluran besar yang dikelilingi oleh sel epitel
yang berbentuk seperti kanal dan bercabang. Terdapatnya getah kuning pada buah
diperkirakan karena terjadinya kerusakan dinding sel epitel penyusun saluran
getah kuning. Pada manggis, getah kuning sering kali terdapat pada aril buah.
Metode pemuliaan untuk mendapatkan manggis tidak bergetah sulit dilakukan,
karena kerusakan dinding sel sangat dipengaruhi oleh lingkungan. Bagian kedua
dari penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan marka molekuler terpaut
karakter kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning pada buah manggis.
Kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning sangat berkaitan erat dengan
sekresi getah kuning pada buah manggis. Marka molekuler yang terpaut karakter
kekuatan dinding sel dapat digunakan untuk mengidentifikasi plasma nutfah
manggis yang berpotensi menjafdi tetua yang menghasilkan buah tidak bergetah
kuning. Marka ini dapat digunakan dalam proses seleksi keturunan pada program
pemuliaan manggis.
Desain primer dilakukan secara tersarang (nested) berdasarkan sekuen gen
Frangile Fiber 1 (FRA 1). Dari 4 kombinasi primer yang digunakan hanya 1
kombinasi primer yang berhasil menghasilkan pita amplifikasi dan dapat
membedakan antara sifat manggis bergetah dan tidak bergetah kuning. Pita
tersebut disekuen ulang dan digunakan sebagai dasar untuk desain primer yang
digunakan untuk mengembangkan marka molekuler terpaut kekuatan dinding sel.
Marka molekuler yang berhasil dikembangkan merupakan pita DNA berukuran ±
260 pb, hasil amplifikasi menggunakan kombinasi primer forward 5‟CAA
AGGAATGGGAGCATAAG‟3 and reverse 5‟AGCGGACCACATTTAGAGT
G„3. Marka tersebut dinamakan marka kekuatan dinding sel manggis (KDSM).
Hasil verifikasi marka molekuler pada 39 aksesi manggis menunjukkan
kesesuaian antara keberadaan pita dengan sifat kekuatan dinding sel. Aksesi yang
tidak bergetah kuning menghasilkan pita DNA, sedangkan aksesi yang bergetah
kuning tidak menghasilkan pita DNA.
Di antara 39 aksesi manggis yang telah dianalisis tersebut, 20 aksesi dengan
buah bergetah kuning tidak menghasilkan pita DNA, sedangkan 19 aksesi dengan
buah tidak bergetah kuning terbagi menjadi dua, yaitu 16 aksesi menghasilkan
pita DNA, sedangkan 3 aksesi manggis lainnya tidak menghasilkan pita DNA.
Kata kunci: apomiksis, Garcinia mangostana L., Garcinia spp., getah kuning,
marka molekuler
SUMMARY
RISA ARYANTRI. Molecular Markers Development that is Associated
with Apomixis Characters and the Strength of Cell Wall Composed Yellow Latex
Secretory Duct on Mangosteen (Garcinia mangostana L.). Supervised by
MIFTAHUDIN and SOBIR.
Mangosteen is one of the excellent export fruit commodity from Indonesia
and well-known as Queen of Tropical Fruits. There are two current main
development issues of mangosteen, which are apomixis and yellow latex secretion
from the fruit caused by destruction of epithelial cell that form yellow latex
secretory duct. Therefore, a research to study the aspects of apomixis and cell wall
strength that form yellow latex secretory duct in mangosteen should be done. This
research consisted of two main topics, the development of molecular marker that
is associated with the apomixis characters in Garcinia and molecular marker that
is associated with the cell wall strength characters that form yellow latex secretory
duct in mangosteen.
Mangosteen reproduces through apomixis mechanism. Apomixis is a
naturally occurring mode of reproduction that results in embryo formation without
the involvement of meiosis or fertilization of the egg. Seed-derived progeny of an
apomictic plant is genetically identical to the maternal parent. In Garcinia,
apomixis form is called as adventitious embryony, which is divided into obligate
and facultative apomixis. Identification and characterization of those apomixis in
Garcinia is important for conservation and utilization of Garcinia members. The
development of specific molecular markers that associated with apomixis is
necessary. The developed markers can then be used as a tool for identification,
characterization and selection of Garcinia germplasms.
The first part of this research aimed to develop molecular markers related to
apomixis character. The DNA ampilication was carried out using primer
developed by Ozias-akins et al. (1998) based on the sequence of Pennisetum
DNA. The primer was used to amplify DNA from four Garcinia species, i.e. :
Garcinia mangostana L., G. hambroniana Pierre., G. celebica L. and G.
malacensis T. Anderson. The result showed that only G. hambroniana Pierre.
DNA could be not amplified, while the others showed the ampilication band with
the size of ± 480 bp. The BLAST sequence analysis of the PCR frgment showed
that there was no homology with other DNA sequences in database. Three set of
primers were then designed based on Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
among three DNA sequences from those three species (G. mangostana L., G.
celebica L. and G. malacensis T. Anderson).
This research succesfully developed three set of primers, which were (1)
Apo_Fak1 (forward 5‟ACAATAATCACCACCATACC‟3 and reverse 5‟GTCTT
TTCCACTTGGGCTGG‟3); (2); Apo_Fak2 (forward 5‟ACAATAATCACCA
CCATACC‟3 and reverse 5‟AGGCTTCAACTTAGTTGTCA‟3); (3) Apo_Obli
(forward 5‟ACAATAATCACCACCATACC‟3 and reverse 5‟TCATTTCCCA
CTTGGGCTGT‟3). Those three set of primers were then verified using three
reference species (G. mangostana L., G. celebica L. and G. malacensis T.
Anderson) and the result showed two specific bands that related with apomixis
character, i.e. : a 300 bp DNA band produced from G. mangostana L. and G.
celebica L., while a 317 bp produced from G. malacensis T. Anderson. Forty one
species of Garcinia can be separated into three groups based on the developed
molecular markers. Fourteen species were identified as obligate apomixis,
fourteen species were facultative apomixis with dioecius flowers, and the other
thirteen species were facultative apomixis with hermaprodit flowers.
Another aspect of mangosteen development that should be considered is
how to eliminate yellow latex secretion from mangosteen fruit. Yellow latex is a
major problem on mangosteen that could decrease fruit quality. The structure of
yellow latex secretory ducts, which consist of big lumen, was surrounded by
epithelial cells. The duct is canal-like form and branched. It is suggested that the
destruction of epithelial cell that form yellow latex secretory duct caused yellow
latex secretion. In mangosteen, yellow latex is often found in fruit aril. Since the
yellow latex secretion character in mangosteen is largely influenced by
environment, the breeding technique to develop free yellow latex fruit is quite
difficult. The objective of the second part in this research was to develop a
molecular marker that is associated with the fruit epithelial cell wall strength. The
developed molecular marker which linked to cell wall strength character might be
useful to identify mangosteen germplasm that potential as parent producing free
yellow latex fruit. The marker could also be used in progeny selection in the
mangosteen breeding program.
Nested primers were designed based on the Fragile Fiber 1 (FRA 1) gene
sequences. Among four developed primer combinations only one primer
combination could produce specific band that could discriminate the yellow latex
producing plant and free yellow latex plant. The DNA band was resequenced and
used to design a new set of primer (forward 5‟CAAAGGAATGG
GAGCATAAG‟3 and reverse 5‟AGCG GACCACATTTAGAGTG„3) that was
used to develop a molecular marker related to cell wall strength. The molecular
marker were named as KDSM. The verification of molecular marker using thirty
nine accessions of mangosteen showed close relation between marker KDSM and
yellow latex secretion character. In general plants that secreted yellow latex did
not have DNA band, while the other one hand a 260 bp DNA band.
Among thirty nine mangosteen accessions, twenty accessions that secreted
yellow latex did not produce DNA band, while nineteen accessions that do not
secreted yellow latex were divided into two groups. Sixteen accessions produce a
260 bp DNA band and three accessions did not produce DNA band.
Keywords: apomixis, Garcinia mangostana L., Garcinia spp., yellow latex,
molecular markers
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
Pengembangan Marka Molekular yang Berasosiasi denngan
Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding Sel Penyusun
Saluran Getah Kuning pada Manggis (Garcinia mangostana L.)
RISA ARYANTRI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biologi Tumbuhan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Darda Efendi, MSi
Judu\ Tesis : Pengembangan Marka Molekuler yang Berasosiasi dengan
Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding Sel Penyusun Saluran
Getah Kuning pada Manggis (Garcinia mangostana L.)
: Risa Aryantri
Nama
: G353110121
NRP
Disetujui oleh
Komisi Pembirnbing
Dr Ir Miftahudin, MSi
Ketua
Prof Dr Ir Sobir, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Biologi Turnbuhan
Dr Ir Miftahudin M Si
Tanggal Ujian: 29 Juli 2013
Tanggal Lulus:
0 7 0CT 2013
Judul Tesis : Pengembangan Marka Molekuler yang Berasosiasi dengan
Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding Sel Penyusun Saluran
Getah Kuning pada Manggis (Garcinia mangostana L.)
Nama
: Risa Aryantri
NRP
: G353110121
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir Miftahudin, MSi
Ketua
Prof Dr Ir Sobir, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Biologi Tumbuhan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Miftahudin, MSi
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2012 ini ialah karkater
apomiksis dan ketahanan getah kuning, dengan judul Pengembangan Marka
Molekuler yang Berasosiasi dengan Karakter Apomiksis dan Kekuatan Dinding
Sel Penyusun Saluran Getah Kuning pada Manggis (Garcinia manggostana L.).
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Miftahudin, M.Si dan
Bapak Prof. Dr. Ir. Sobir, M.Si selaku pembimbing. Di samping itu, penghargaan
penulis sampaikan kepada Ibu Sulassih dari Pusat Kajian Hortikultura Tropik IPB
Bogor, Ibu Dr. Ellina Mansyah berserta Bapak Wandi, Balai Penelitian Tanaman
Buah Tropika Solok, serta Ibu Lina, pembudidaya manggis Desa Leuwiliang,
yang telah membantu selama pengumpulan data. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih
sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2013
Risa Aryantri
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
ix
DAFTAR GAMBAR
ix
DAFTAR LAMPIRAN
x
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
1
1
2
2
TINJAUAN PUSTAKA
Manggis (Garcinia mangostana L.) dan Kerabat Dekatnya (Garcinia
spp.)
Apomiksis Garcinia mangostana L. dan Garcinia spp.
Getah Kuning (Gamboge Disorder)
Marka Molekuler
Sequence Tagged Sites (STS) dan Single Nucleotide Polymorphism
(SNP)
4
PENGEMBANGAN MARKA MOLEKULER TERPAUT KARAKTER
APOMIKSIS PADA MANGGIS DAN KERABAT DEKATNYA
Abstrak
Pendahuluan
Bahan dan Metode
Waktu dan Tempat
Bahan Tanaman
Metode
Hasil dan Pembahasan
Marka Molekuler Terpaut Karakter Apomiksis
Isolasi DNA Manggis (Garcinia mangostana L.) dan Kerabat
Dekatnya (Garcinia spp.)
Amplifikasi DNA Manggis dan Kerabat Dekatnya dengan Marka
Molekuler
Terpaut Karakter Apomiksis
Analisis Sekuan DNA dan Pengembangan Marka Molekuler untuk
Indentifikasi Karakter Apomiksis pada Manggis dan Kerabat
Dekatnya
Verifikasi Marka Molekuler Terpaut Karakter Apomiksis dan
Analisis Data
Simpulan
PENGEMBANGAN MARKA MOLEKULER TERPAUT KEKUATAN
DINDING SEL PENYUSUN SALURAN GETAH KUNING PADA
MANGGIS (Garcinia mangostana L.)
Abstrak
4
5
5
7
7
8
8
9
9
9
9
10
12
12
12
13
13
14
16
21
22
22
DAFTAR ISI (lanjutan)
Pendahuluan
Bahan dan Metode
Bahan Tanaman
Metode
Hasil dan Pembahasan
Desain Primer untuk Marka Molekuler Terpaut Karakter Kekuatan
Dinding Sel
Isolasi DNA Manggis (Garcinia mangostana L.)
Amplifikasi DNA Manggis dengan Marka Molekuler Terpaut
Karakter Kekuatan Dinding Sel
Analisis Sekuan DNA dan Pengembangan Marka Molekuler untuk
Indentifikasi Karakter Kekuatan Dinding Sel pada Manggis
Verifikasi Marka Molekuler Terpaut Kekuatan Dinding Sel dan
Analisis Data
Simpulan
22
23
23
24
26
26
28
28
29
30
31
PEMBAHASAN UMUM
32
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
33
33
34
UCAPAN TERIMAKASIH
34
DAFTAR PUSTAKA
34
LAMPIRAN
38
RIWAYAT HIDUP
46
DAFTAR TABEL
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Sampel 41 spesies manggis dan kerabat dekatnya (Garcinia spp.)
Marka molekuler spesifik terpaut karakter apomiksis pada Garcinia
Hasil amplifikasi verifikasi marka molekuler terpaut karakter apomiksis
Karakter morfologi Garcinia spp.
Sampel 39 aksesi manggis buah bergetah dan tidak bergetah kuning
Aksesi tanaman yang digunakan sebagai acuan untuk mengembangkan
Primer untuk marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel
Kombinasi primer kekuatan dinding sel dengan nested PCRa
Primer untuk marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel dari
10
16
18
20
24
26
27
28
30
DAFTAR GAMBAR
1. Diagram
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
alir penelitian pengembangan marka molekuler terpaut
apomiksis dan kekuatan dinding sel pada manggis dan kerabat dekat
Habitus manggis (Garcinia mangostana L.) di kebun manggis
Leuwiliang Bogor
Getah kuning pada buah manggis. A = Getah kuning pada pericarp
dan B = Getah kuning pada endocarp
Hasil elektroforesis ektraksi DNA manggis dan kerabat dekatnya. M =
Hasil elektroforesis amplifikasi DNA manggis dan kerabat dekatnya
Hasil aligment sekuen DNA terpaut karakter apomiksis. bold =
variasi nukleotida,
= primer apomiksis forward dan reverse,
Apo_F = Primer apomiksis forward, Apo_1R = Primer apomiksis
reverse 1, Apo_2R = Primer apomiksis reverse 2 dan Apo_3R = Primer
apomiksis reverse 3
Hasil elektroforesis amplifikasi DNA manggis dan kerabat dekatnya. M
= 1 kb, 1 = Garcinia celebica L. (2), 2 = Garcinia malaccensis T.
Anderson, 3 = Garcinia mangostana L., Apo_Fak1 = marka molekuler
apomiksis fakultatif 1, Apo_Fak2 = marka molekuler apomiksis
fakultatif 2 dan Apo_Obli = marka molekuler apomiksis obligat
Hasil aligment sekuen DNA terpaut karakter apomiksis.
=
variasi nukleotida pada wilayah primer Apo_2R
Morfologi bunga dan buah Garcinia. A = bunga dioecius dengan cupat
buah memanjang, B = bunga hermaprodit dengan cupat buah tidak
memanjang, 1 = Garcinia celebica L. (2), 2 = Garcinia hambroniana
Pierre., 3 = Garcinia megaphylla Verd., 4 = Garcinia porrecta dan 5 =
Garcinia malaccensis T. Anderson
Urutan basa nukleotida terpaut kekuatan dinding sel (5‟–3‟) hasil
seleksi Database Genbank. Hijau = marka molekuler K_1F, ungu =
primer K_1R, biru = primer K_2F dan kuning = primer K_2R
Hasil elektroforesis ektraksi DNA manggis. M = Lamda, 1–3 = DNA
manggis buah tidak bergetah kuning dan 4–5 = DNA manggis buah
bergetah kuning
Hasil eletroforesis amplifikasi DNA manggis menggunakan kombinasi
pasangan primer pertama K_2F dan K_1R dan primer ke dua K_2F dan
3
4
6
13
14
15
17
19
21
27
28
K_2R. M = 1 kb, 1 = DNA satu individu manggis dengan buah bergetah
kuning dan 2 = DNA satu individu manggis dengan buah tidak bergetah
kuning
13. Contoh hasil elektroforesis amplifikasi DNA manggis menggunakan
marka molekuler KDSM. M = 1 kb, 1–17 = aksesi manggis buah tidak
bergetah dan 20–34 = aksesi manggis buah bergetah kuning
29
31
DAFTAR LAMPIRAN
1. Hasil kromatogram analisis runutan basa DNA Garcinia mangostana L.
forward terpaut karakter apomiksis
38
2. Hasil kromatogram analisis runutan basa DNA Garcinia malacenssis T.
Anderson forward terpaut karakter apomiksis
39
3. Hasil kromatogram analisis runutan basa DNA Garcinia celebica L.
forward terpaut karakter apomiksis
40
4. Hasil kromatogram Garcinia sp forward terpaut karakter kekuatan
dinding sel pada manggis.
41
5. Hasil kromatogram Garcinia megaphylla verd. forward terpaut karakter
kekuatan dinding sel pada manggis.
42
6. Hasil kromatogram Garcinia celebica L. forward terpaut karakter
kekuatan dinding sel pada manggis.
43
7. Desain marka molekuler dari sekuen acuan terpaut kekuatan dinding sel
tanamana
8. Hasil kromatogram analisis runutan basa DNA Garcinia mangostana L.
reverse terpaut karakter kekuatan dinding sel
44
45
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan salah satu komoditas buah
tropik primadona ekspor Indonesia yang sangat disenangi dan diminati pasar
internasional sehingga dijuluki “queen of tropical fruits” (Cox 1976). Manggis
bersifat apomiksis obligat (biji berkembang tanpa terjadi fertilisasi) dan berasal
dari embrio adventif (Sprecher 1919). Peristiwa apomiksis merupakan pola unik
dari pembentukan tanaman, dimana biji yang dihasilkan fertil dan memiliki
konstitusi genetik yang sama dengan induk betinanya (Sinaga 2008). Apomiksis
pada tanaman Garcinia terbagi menjadi dua, yaitu apomiksis obligat dan
apomiksis fakultatif (reproduksi seksual masih dapat terjadi). Pada apomiksis
obligat peristiwa seksual dihambat dan embrio terbentuk dari perkembangan sel
nuselar dengan inti diploid, sedangkan pada apomiksis fakultatif sel nuselar
tertentu mangalami reproduksi seksual dan sel nuselar lainnya mengalami
reproduksi aseksual (Koltunow 1993).
Perbedaan dan pengetahuan dasar genetik mengenai sifat apomiksis
obligat dan fakultatif pada manggis dan kerabat dekatnya diperlukan dalam
analisis kekerabatan serta pengembangan tanaman manggis dan kerabat dekatnya,
akan tetapi informasi ini belum banyak dipelajari. Oleh karena itu perlu dilakukan
penelitian mengenai dasar genetik sifat apomiksis pada manggis dan kerabat
dekatnya, untuk mendukung program pemuliaan (PKBT 2010) dan menambah
pemahaman akan hubungan kekerabatan antar aksesi manggis dan kerabat
dekatnya yang sangat berpengaruh terhadap peningkatan mutu serta memudahkan
menejemen konservasinya (Roldan et al. 2001).
Saat ini permintaan ekspor manggis masih sangat tinggi, tetapi kuota
permintaan tidak dapat terpenuhi dengan baik (Mansyah 2011). Hal ini
dikarenakan berbagai kendala, seperti rendahnya produksi dan mutu buah
manggis yang tidak memenuhi kriteria ekspor (Gunadnya et al. 2001),
dikarenakan oleh cemaran getah kuning (Indriyani et al. 2002). Menurut Dorly et
al. (2008) getah kuning dihasilkan di dalam saluran getah yang berbentuk kanal
bercabang dikelilingi oleh sel epitel pada endokarp dan rusaknya dinding sel epitel
ini akan menyebabkan keluarnya getah kuning yang akan mengotori aril (daging
buah). Selain itu, getah kuning juga dapat merusak daging buah yang
menyebabkan rasa buah menjadi pahit (Sdoodee & Limpun 2002). Buah manggis
yang bergetah kuning pada bagian daging buah sulit dibedakan dengan buah yang
tidak bergetah kuning, kecuali buah dibuka terlebih dahulu. Hal ini menyulitkan
proses seleksi untuk memperoleh buah manggis yang tidak bergetah kuning
(PKBT 2007). Oleh karena itu diperlukan tanaman yang memiliki dinding sel
epitel yang kuat dan tahan terhadap pecahnya dinding sel. Untuk membentu
seleksi agar lebih cepat dan efektif, diperlukan marka molekuler yang tekait
dengan sifat kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning. Marka
molekuler tersebut dapat digunakan untuk memilih tanamn manggis yang akan
dikembangkan sebagai tetua buah manggis yang tidak bergetah kuning (Sobir 28
Maret 2012, komunikasi pribadi).
2
Marka molekuler yang berasosiasi dengan sifat apomiksis dan kekuatan
dinding sel telah dikembangkan pada penelitian sebelumnya (PKBT 2010 dan
Mansyah 2011). Berdasarkan marka molekuler tersebut, penelitian ini bertujuan
untuk mendapatkan marka molekuler spesifik terpaut karakter apomiksis yang
dapat digunakan dalam analisis kekerabatan manggis dan kerabat dekatnya serta
marka molekuler terpaut karakter kekuatan dinding sel penyusun saluran getah
kuning pada manggis yang dapat digunakan untuk identifikasi buah manggis yang
berpotensi tidak mengeluarkan getah kuning akibat kerusakan dinding sel. Marka
molekuler tersebut dikembangkan berdasarkan sekuen DNA dari tanaman
manggis dan kerabat dekatnya.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk: (1) mendapatkan marka molekuler spesifik
yang berasosiasi dengan karakter apomiksis untuk analisis kekerabatan Garcinia
dan (2) mendapatkan marka molekuler spesifik yang berasosiasi dengan karakter
kekuatan dinding sel pada manggis yang berguna untuk identifikasi buah manggis
yang berpotensi tidak mengeluarkan getah kuning.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan memberi informasi mengenai: (1) marka
molekuler spesifik yang berasosiasi dengan karakter apomiksis untuk analisis
kekerabatan Garcinia dan (2) marka molekuler spesifik yang berasosiasi dengan
karakter kekuatan dinding sel penyusun saluran getah kuning pada manggis yang
dapat digunakan untuk identifikasi buah manggis yang berpotensi tidak
mengeluarkan getah kuning.
3
Berdasarkan tujuan dan ruang lingkup penelitian yang dilakukan disusun
alur pikir penelitian. Penelitian ini dilaksanakan melalui beberapa tahapan dengan
bagan alur penelitian yang dapat dilihat pada Gambar 1.
Isu utama pengembangan Garcinia
Apomiksis
Getah kuning
41 spesies Garcinia
(apomiksis obligat dan
apomiksis fakultatif)
39 aksesi manggis (20
bergetah kuning dan 19
tidak bergetah kuning)
Isolasi DNA
Isolasi DNA
Amplifikasi DNA
Elektroforesis gel
agarose
Menggunakan primer yang
dikembangkan berdasarkan
penelitian sebelumnya untuk
sifat apomiksis (PKBT 2010)
dan sekuen homologi gen
penyandi kekuatan dinding sel
(Mansyah 2011)
Amplifikasi DNA I
Elektroforesis gel
agarose
Purifikasi fragmen
DNA polimorfik
Analisis runutan basa
DNA dan desain primer
dengan teknik SNP
Amplifikasi II produk
elusi
Verifikasi marka
molekuler
Marka Molekuler
spesifik
Analisis data
Analisis
data
Verifikasi marka
molekuler
Amplifikasi III produk
amplifikasi II
Analisis runutan basa
DNA dan desain primer
dengan teknik STS
Gambar 1 Diagram alir penelitian pengembangan marka molekuler terpaut
apomiksis dan kekuatan dinding sel pada manggis dan kerabat dekat
4
TINJAUAN PUSTAKA
Manggis (Garcinia mangostana L.) dan Kerabat Dekatnya (Garcinia spp.)
Garcinia termasuk ke dalam famili Cluciaseae yang terdiri atas 4 suku,
yaitu Clusieae, Garciniaeae, Calophyylleae dan Symphonieae. Garciniaeae terdiri
atas genus Ochrocarpos, Marialva, Micranthera dan Garcinia. Pada penelitian ini
kami mengembangkan marka molekuler pada Garcinia. Karakter khas dari
Garcinia memiliki getah berwarna putih atau kuning pada seluruh bagian
tanaman. Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan tanaman buah tropik dan
berdasarkan beberapa penelitian diketahui bahwa manggis berasal dari Indonesia
serta kawasan Asia Tenggara. Rhichards (1990), menyatakan bahwa manggis
(jumlah kromosom 2n=96) memiliki morfologi intermediet antara dua kerabat
dekatnya G. hambroniana Pierre. dan G. malaccensis T. Anderson yang
merupakan agamospermy fakultatif dan merupakan hasil persilangan antara G.
hombroniana Pierre dengan G. malaccensis T. Anderson. Manggis merupakan
pohon hutan tahunan (perennial), dioecious, tinggi 6−20 meter, berbatang lurus
dengan cabang yang simetris (Gambar 2).
Mahkota daun (kanopi) tampak indah menyerupai setengah kerucut.
Daunnya lebar dan tebal, tunggal (folium simplex), berhadapan, bentuk oval
memanjang (oblongus), mengkilap, kaku dan ujung daun meruncing pendek,
tangkainya memeluk pucuk, sehingga pasangan teratas menutupi kuncup
terminalnya, dengan ibu tulang daun (midrib) yang berwarna hijau muda
(Sunarjono 2000).
Gambar 2 Habitus manggis (Garcinia mangostana L.) di kebun manggis
Leuwiliang Bogor
Bunganya besar, kelopaknya tebal berwarna hijau terdiri dari 4 helai.
Putiknya bercabang 4−8 yang tetap melekat pada ujung buah dan memiliki
benang sari steril. Buah berbentuk bulat panjang 3−6 cm, dengan diameter 4−7.5
cm, berkulit licin, di ujung buah masih kelihatan cuping bekas kepala putik yang
5
jumlahnya sama dengan banyaknya segmen daging buah yang berada di
dalamnya. Kulit buah berwarna merah keunguan (purple), tebal sekitar 5 mm.
Berat buah bervariasi 75−150 gram tergantung pada umur pohon dan daerah
geografisnya. Buah manggis memiliki tipe berupa buah buni, daging buah
tebalnya kira-kira 0.9 cm. Setiap biji yang besar mempunyai ruas-ruas yang
masing-masing mempunyai potensi untuk tumbuh. Manggis dan kerabat dekatnya
memiliki ciri khusus yaitu seluruh bagian tumbuhan bergetah dan biji bersifat
apomiksis (Satuhu 1994).
Apomiksis Garcinia mangostana L. dan Garcinia spp.
Apomiksis (apogami) merupakan bentuk reproduksi aseksual pada
tumbuhan melalui biji. Pada apomiksis, kecambah muncul dari biji tetapi bukan
berasal dari embrio, namun berasal dari jaringan maternal. Sehingga genetik
tumbuhan baru yang muncul akan identik dengan tetua betinanya. Menurut Asker
dan Jerling (1992) apomiksis merupakan proses reproduksi aseksual yang terjadi
pada ovul tanaman berbunga sebagai struktur yang berkembang melaksanakan
fungsi reproduksi seksual. Mekanisme apomiksis pada angiospermae berbeda
dengan mekanisme amfiksis, dimana mekanisme amfiksis terjadi secara sporofitik
membentuk mikrospora dan megaspore melalui meiosis, kemudian mengalami
mitosis membentuk mikrogametofit dan megagametofit. Sedangkan fertilisasi
ganda menghasilkan endosperm dan embrio zigotik.
Apomiksis pada Garcinia terbagi menjadi dua, yaitu apomiksis obligat dan
apomiksis fakultatif. Pada apomiksis fakultatif proses reproduksi masih dapat
terjadi, dimana sel nuselar yang satu mengalami reproduksi seksual dan sel
nuselar lainnya mengalami reproduksi aseksual. Apomiksis terjadi secara
nonrecurrent (stabil), embrio haploid terjadi tanpa fertilisasi, maupun secara
apomiksis recurrent, embrio terjadi tanpa reduksi mitotik dan fertilisasi, sehingga
seluruh genotip maternal diwariskan kepada keturunannya (Sinaga 2008). Saat ini
telah telah diperoleh pita-pita marka molekuler polimorfik antara karakter
apomiksis dan non apomiksis (PKBT 2010) yang diperoleh dari hasil
pengembangan marka SCAR (sequence characterized amplified region) terpaut
sifat apomiksis pada Pennisetum squamulatum (Ozias askins et al. 1998) dan
selanjutnya akan didesain marka molekuler spesifik karakter apomiksis pada buah
manggis.
Getah Kuning (Gamboge Disorder)
Getah kuning merupakan masalah utama yang menjadi faktor pembatas
volume ekspor buah manggis karena menurunkan kualitas manggis layak ekspor,
sehingga dari total produksi manggis Indonesia hanya 9.6% yang termasuk
kualitas layak ekspor (Ditjen 2009). Getah kuning adalah senyawa metabolit
sekunder yang merupakan gummi resin pada tanaman Guttiferae (Tjitrosoepromo
1994). Berdasarkan hasil penelitian Pusat Penelitian dan Pengembangan
Hortikultura diketahui bahwa getah kuning pada buah manggis dapat dibedakan
menjadi getah kuning pada kulit luar buah (pericarp) (Gambar 3a) dan getah
kuning pada kulit bagian dalam buah (endocarp) yang mencemari daging buah
6
(aril) sehingga rasa buah menjadi pahit dan tidak layak konsumsi (Gambar 3b).
Getah kuning dapat dijumpai pada buah manggis yang masih muda maupun yang
telah matang.
A
B
Gambar 3 Getah kuning pada buah manggis. A = Getah kuning pada
pericarp dan B = Getah kuning pada endocarp
Getah kuning diproduksi sebagai sistem pertahanan dan bagian dari
metabolisme tanaman (Dorly 2009). Getah kuning dapat disebabkan karena
tusukan Helopeltis antonii (Sunarjono 2000), peningkatan kadar air tanah secara
tiba-tiba setelah mengalami kekeringan, terjadinya benturan, serangan cendawan
Fusarium oxysforum, gangguan serangga dan pada saat buah matang kondisi
lingkungan sangat basah (Mansyah 2011). Pengendalian getah kuning dapat
dilakukan dengan berbagai cara, yaitu membiarkan rerumputan disekitar tanaman
manggis pada saat buah masih muda, pengaturan perairan dan perbaikan drainase
kebun serta pemberian kalsium dan boron (Yenisbar 2011).
Getah kuning pada buah manggis juga dapat disebabkan karena rusaknya
sel epitel pada saluran getah yang menyebabkan keluarnya getah kuning. Ini dapat
terjadi karena perbedaan pertumbuhan antara biji dan aril dengan bagian perikarp
buah dan terjadi perubahan tekanan tugor sel akibat fluktuasi kandungan air tanah
selama fase perkembangan buah, sehingga dinding sel saluran getah kuning yang
tidak kuat akan pecah dan mengeluarkan getah kuning. Lemahnya dinding sel
pada buah manggis diperkirakan karena rendahnya mikrofibril selulosa penyusun
dinding sel yang disintesis oleh tumbuhan.
Kekuatan dinding sel (Cell Wall Strength/CWS) saluran getah kuning pada
manggis berkaitan dengan penyusunan mikrofibril selulosa pada dinding sel
tersebut. Sekuen gen Fragile Fiber 1 (FRA 1) merupakan gen penyandi
mikrofibril selulosa penyusun dinding sel. Sehingga pada penelitian ini digunakan
sekuen gen FRA 1 untuk menganalisis kekuatan dinding sel pada tanaman
manggis yang di ambil dari beberapa tanaman, yaitu Arabidopsis thaliana kinesinlike protein (AY158083.1 dan AY158084.1), A. thaliana microtubule motor
(NM_180820.1 dan NM_124156.4) dan Ricinus communis kinesin heavy chain
(XM_002510131.1) yang selanjutnya akan didesain marka molekuler spesifik
karakter kekuatan dinding sel pada buah manggis (Mansyah 2011).
7
Marka Molekuler
Marka molekuler merupakan alat bantu dalam mengidentifikasi genotipe
yang dimiliki oleh suatu individu. Pengembangan marka molekuler untuk
menyeleksi sifat yang diinginkan dari suatu organisme dapat dilakukan dengan
mengidentifikasi marka molekuler yang terpaut dengan karakter tanaman yang
dipelajari. Salah satu kelebihan dari metode ini adalah waktu pengujian yang
cepat dan tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Marka molekuler hanya
berguna apabila menghasilkan fragmen pita polimorfik dan terpaut dengan sifat
yang akan diamati atau dengan marka molekuler lain, dimana marker molekular
yang ideal juga bersifat kodominan, banyak terdapat dalam genom, aksesnya
mudah dan memiliki konsistensi tinggi. Syarat polimorfik diperlukan karena
penanda genetik harus bisa membedakan individu-individu dalam populasi yang
diteliti. Suatu marka harus bisa mengelompokkan individu paling tidak dalam dua
kelompok. Syarat terpaut dengan marka, gen atau sifat lain diperlukan karena
fungsi marka molekuler adalah sebagai tanda pengenal yang harus melekat pada
sifat yang diteliti.
Pengembangan marka molekuler untuk identifikasi buah manggis yang
bergetah kuning dan tidak bergetah kuning telah dilakukan pada penelitian
sebelumnya (Mansyah 2011), pada 27 aksesi manggis. Hasil penelitian tersebut
menunjukkan adanya keterkaitan antara marka molekuler mangosteen cell wall
strength (MCWS) dengan penyakit getah kuning pada buah manggis yang dapat
digunakan sebagai marka untuk mengidentifikasi getah kuning buah manggis.
Akan tetapi marka tersebut belum spesifik untuk sekuen DNA manggis, karena
marka yang dikembangkan berdasarkan sekuen-sekuen DNA dari berbagai
tanaman. Sehingga perlu dilakukan penelitian ini untuk mendapatkan marka
spesifik terkait kekuatan dinding sel yang dikembangkan dari tanaman manggis.
Saat ini marka molekuler terpaut karakter apomiksis pada Garcinia belum
diidentifakasi, sehingga pada penelitian ini juga dilakukan pengembangan marka
molekuler terpaut sifat apomiksis yang dikembangkan dari Garcinia untuk dapat
digunakan dalam pengembangan tanaman Garcinia.
Sequence Tagged Sites (STS) dan Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
Marka STS merupakan marka berbasis PCR (Polymerase Chain Reaction)
yang memiliki panjang primer 18-25 nukleotida dan diperoleh melalui hasil
sekuensing fragmen gen yang sudah diketahui ukurannya atau berbasis pada
informasi sekuen DNA. Primer yang didesain dapat dikembangkan dari fragmen
spesifik yang merupakan penciri khusus pada genom organisme. Ini berdasarkan
beberapa fragmen spesifik yang diperoleh dari fingerprinting berbasis PCR
sebagai penciri karakter yang diinginkan dan dapat dianalisis lebih lanjut, seperti
kloning fragmen ke dalam vektor, yang dilanjutkan dengan sekuensing dan desain
primer spesifik.
Reprodusibilitas dan kegunaan marka STS lebih tinggi dibandingkan
dengan marka molekuler lainnya. Meskipun marka STS secara genetik bersifat
dominan, namun dapat dikonversi menjadi marka kodominan melalui pemotongan
dengan menggunakan enzim restriksi. Marka STS dapat digunakan dalam
pemetaan genetik, membutuhkan enzim endonuklease restriksi untuk hasil PCR,
8
bersifat kodominan, mudah diadopsi dan diterima dalam hal otomatisasi, serta
menghasilkan amplifikasi yang stabil dan berulang-ulang dengan tipe polimorfik
yang dideteksi berdasarkan pertukaran basa (Litbang-Deptan 2011).
Marka SNP merupakan marka molekuler yang berdasarkan variasi satu
nukleotida dalam sekuen DNA individu, dimana variasi ini ditunjukkan dari
terjadinya perubahan satu nukleotida oleh nukleotida lainnya yang dapat
menyebabkan perubahan asam amino sehingga mempengaruhi penyusunan
protein yang terbentuk pada individu tersebut. Identifikasi SNP secara langsung
dapat dilakukan dengan melakukan sekuensing segmen DNA hasil PCR
menggunakan marka molekuler spesifik untuk suatu sifat yang diinginkan dan
membandingkan hasil sekuen segmen DNA tersebut sampai teridentifikasinya
perbedaan nukleotida antar sekuen individu.
PENGEMBANGAN MARKA MOLEKULER YANG
BERASOSIASI DENGAN KARAKTER APOMIKSIS PADA
MANGGIS DAN KERABAT DEKATNYA
Abstrak
Manggis dan kerabat dekatnya memiliki mekanisme reproduksi apomiksis.
Apomiksis merupakan sistem reproduksi yang terjadi secara alami, dimana
embrio yang dihasilkan tidak melalui pembelahan miosis ataupun pembuahan
ovum. Keturunan dari tanaman apomiksis memiliki konstitusi genetik yang sama
dengan induk betinanya. Betuk apomiksis pada manggis dan kerabat dekatnya
merupakan apomiksis embrio adventif. Sifat apomiksis pada manggis dan kerabat
dekatnya, terdiri atas dua tipe, yaitu apomiksis obligat dan apomiksis fakultatif.
Identifikasi dan karakterisasi plasma nutfah manggis dan kerabat dekatnya sangat
diperlukan dalam proses konservasi dan peningkatan sumber genetiknya.
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangan marka molekuler spesifik terpaut
karakter apomiksis yang dapat digunakan untuk mempelajari dan memahami
mekanisme apomiksis pada manggis dan kerabat dekatnya. Pengembangan marka
molekuler dilakukan berdasarkan sekuen DNA 3 spesies Garcinia (Garcinia
mangostana L., Garcinia celebica L. dan Garcinia malacensis Hk. F
) yang diperoleh dari hasil amplifikasi menggunakan primer Ozias akins
berdasarkan sekuen DNA Pennisetum. Berdasarkan sekuen tersebut dilakukan
pengembangan tiga set primer, yaitu Apo_Fak1, Apo_Fak2 dan Apo_Obli. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa primer yang telah dikembangkan berhasil
menghasilkan pita spesifik dengan ukuran ± 300 pb dan ± 317 pb pada masingmasing spesies terpaut karakter apomiksis dan mengelompokkan 41 spesies
Garcinia kedalam 3 kelompok, yaitu 14 spesies apomiksis obligat, 14 spesies
apomiksis fakultatif dengan bunga dioecius dan 13 spesies apomiksis fakultatif
dengan bunga hermaprodit. Informasi ini dapat digunakan sebagai informasi dasar
dalam program pemuliana Garcinia.
Kata Kunci: Apomiksis, manggis dan kerabat dekatnya, marka molekuler spesifik
9
Pendahuluan
Manggis (Garcinia mangostana L.) dan kerabat dekatnya (Garcinia spp.)
merupakan anggota famili Gutiferae atau Cluciaseae. Mekanisme reproduksi pada
manggis dan kerabat dekatnya bersifat apomiksis. Peristiwa apomiksis merupakan
pola unik dari pembentukan tanaman, dimana biji yang dihasilkan bersifat fertil
dan memiliki konstitusi genetik yang sama dengan induk betinanya (Sinaga
2008). Apomiksis pada tanaman Garcinia terbagi menjadi dua, yaitu apomiksis
obligat dan apomiksis fakultatif (Sprecher 1919). Manggis bersifat apomiksis
obligat (biji berkembang tanpa terjadi fertilisasi) dan berasal dari embrio adventif
(Sprecher 1919). Menurut Den Nijs dan Van Dijk (1993) pada reproduksi
apomiksis obligat, biji terbentuk tanpa terjadi reduksi jumlah kromosom dan
terjadi reproduksi aseksual. Hal ini didukung Mansyah (2002), yang menyatakan
bahwa pada berbagai tingkat perkembangan bunga secara visual dengan
menggunakan lup pada bunga manggis menunjukkan tidak terlihat adanya serbuk
sari. Sedangkan pada apomiksis fakultatif sel nuselar tertentu mangalami
reproduksi seksual dan sel nuselar lainnya mengalami reproduksi aseksual
(Koltunow 1993). Menurut Nogler (1984) ditemukannya variasi genetik pada
tanaman apomiksis fakultatif, disebabkan karena terjadinya reproduksi seksual,
sehingga menghasilkan individu yang bervariasi secara genetik dengan jumlah
kromosom yang tetap.
Perbedaan dan pengetahuan dasar genetik mengenai sifat apomiksis
obligat dan fakultatif pada manggis dan kerabat dekatnya diperlukan dalam
analisis kekerabatan serta pengembangan tanaman Garcinia, akan tetapi informasi
ini belum banyak dipelajari. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian mengenai
dasar genetik sifat apomiksis pada manggis dan kerabat dekatnya, untuk
mendukung program pemuliaan (PKBT 2010) dan menambah pemahaman akan
hubungan kekerabatan antar aksesi manggis dan kerabat dekatnya yang sangat
berpengaruh terhadap peningkatan mutu serta memudahkan menejemen
konservasinya (Roldan et al. 2001). Berdasarkan informasi tersebut, penelitian ini
bertujuan untuk mendapatkan marka molekuler spesifik terpaut karakter
apomiksis yang dapat digunakan dalam analisis kekerabatan manggis dan kerabat
dekatnya. Marka molekuler tersebut dikembangkan berdasarkan sekuen DNA dari
tanaman manggis dan kerabat dekatnya.
Bahan dan Metode
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat Kajian Hortikultura
Tropik (PKHT) Institut Pertanian Bogor Jawa Barat, pada bulan Mei 2012 sampai
dengan April 2013.
Bahan Tanaman
Sebanyak 41 spesies manggis (Garcinia mangostana L.) dan kerabat
dekatnya (Garcinia spp.), koleksi Kebun Raya Bogor dan Taman Buah Mekar
Sari di koleksi untuk dilakukan analisis DNA (Tabel 1).
10
Tabel 1 Sampel 41 spesies manggis dan kerabat dekatnya (Garcinia spp.)
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
a
Spesies
Garcinia dulcis Kurz
Garcinia sp.
Garcinia forbesii King
Garcinia sp.
Garcinia sizygiifolia Pierre
Garcinia lateriflora Blume var.
javanica Boerl.
Garcinia sp.
Garcinia parvifolia Miq.
Garcinia sp.
Garcinia benthami Pierre
Garcinia tetrandra Pierre
Garcinia tetrandra Pierre
Garcinia porrecta Wall. var.
schizogyna Boerl.
Garcinia spicata Hook.f.
Garcinia picrorhiza Miq.
Garcinia balica Miq.
Garcinia sp.
Garcinia latissima Miq.
Garcinia binucaa (Blanco) Choisy
Garcinia kydia Roxb.
Garcinia xanthochymus Hook.
Garcinia echinocarpa Thwaites
Garcinia nigrolineata Planch
Garcinia livingstonei Anderson
Garcinia picrorhiza Miq. Var.
limonorhiza Boerl.
Garcinia celebica L. (1)
Garcinia sp.
Garcinia megaphylla Verdc.
Garcinia hambroniana Pierre
Garcinia palawensis Elmer (cf.)
Garcinia loureiri Pierre
Garcinia sp.
Garcinia porrecta Wall.
Garcinia tetrandra Pierre
Garcinia forbesii king
Garcinia nigrolineata Planch
Garcinia latisima Miq.
Garcinia hambroniana Pierre
Garcinia malaccensis T. Anderson
Garcinia celebica L. (2)
Garcinia mangostana L.
Nomor aksesia
VI.C/378
VI.C/377
VI.C/381
VI.C/379
VI.C/325
Lokasi Pengambilan
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
VI.C/150
Kebun Raya Bogor
VI.C/385
VI.C/382
VI.C/383
VI.C/106
VI.C/108
VI.C/386
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
VI.C/145
Kebun Raya Bogor
VI.C/111
VI.C/141
VI.C/365
VI.C/472
VI.C/366a
VI.C/161
VII.D/84
VI.A/52
VI.A/36
VI.A/28
VI.A/30
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
VI.A/27
Kebun Raya Bogor
VI.A/16a
VI.A/77
VI.A/45
IX.D/286b
VI.A/63
VI.C/60
VI.C/412
VI.A/79
IX.D/280b
VI.C/474
VI.A/34
VI.A/54
*
*
*
*
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Kebun Raya Bogor
Taman Buah Mekar Sari
Taman Buah Mekar Sari
Taman Buah Mekar Sari
Taman Buah Mekar Sari
Tidak memiliki nomor aksesi.
Metode
Primer untuk Marka Molekuler Terpaut Karakter Apomiksis. Primer
terpaut karakter apomiksis pada penelitian ini menggunakan primer yang telah
dikembangkan pada penelitian sebelumnya (PKBT 2010), berdasarkan hasil
rancangan Ozias akins et al. (1998). Dimana primer terpaut apomiksis tersebut
dikembangkan dari Pennisetum apomiksis dan seksual, berdasarkan hasil
pengembangan sequence characterized amplified region (SCAR) dari sekuen
11
DNA hasil random amplified polymorphic DNA (RAPD). Marka molekuler
terpaut karakter apomiksis yang digunakan pada penelitian ini yaitu, marka
molekuler C4 (forward 5‟CCGCATCTACAATAATCA‟3 dan reverse
5‟GAAATAAAGGCACTGGGA‟3).
Isolasi DNA Manggis (Garcinia mangostana L.) dan Kerabat
Dekatnya (Garcinia spp.). Isolasi DNA 41 tanaman manggis dan kerabat
dekatnya, dilakukan mengikuti metode Doyle dan Doyle (1990) dengan beberapa
modifikasi, menggunakan buffer ekstraksi (10% CTAB, 0.5 M EDTA (pH 8.0), 1
M Tris-HCl (pH 8.0), 5 M NaCl dan 1% β-mercaptoethanol) dengan penambahan
polivinilpyrolidon. Potongan daun muda sebanyak 0.15 mg digerus menggunakan
mortar dengan menambahkan sekitar 0.6-0.8 ml buffer ekstraksi. Setelah digerus
sampai halus, ekstrak daun tersebut dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan
diinkubasi pada suhu 65°C selama 1 jam. Proses inkubasi ini dimaksudkan agar
proses lisis dinding sel dapat berjalan dengan baik. Setelah diinkubasi, eppendorf
selanjutnya disentrifuse pada 11.000 rpm selama 10 menit setelah ditambahkan
CIA (Chloroform:Isoamil Alcohol 24:1 v/v), supernatan diambil dan dipindahkan
ke dalam tabung mikro steril 1000 µl baru dengan menambahkan 500 sampai 600
µl 2-propanol dingin dan diinkubasi dalam freezer overnight. Selanjutnya,
disentrifuse dan supernatan dibuang. Pelet yang diperoleh dicuci dengan alkohol
70% dan dikering anginkan overnight. Pelet dilarutkan dalam 10 sampai 50 µl TE
(1 M Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M EDTA (pH 8.0) dan Aquades).
Skrining Primer. Primer yang telah didesain sebelumnya, selanjutnya
dilakukan skrining primer pada sampel tanaman manggis dan kerabat dekatnya
yang telah dikoleksi. Skrining primer dilakukan dengan menggunakan mesin PCR
(Termocycler Aplied Biosistems 2720 USA) dengan volume reaksi 25 µl (2 µl
DNA template (10 ng/μl), masing-masing 1 µl primer (10 ng/μl), 12.5 µl Go Taq
Green Master Mix (Promega M7122) dan 9.5 µl air murni). Proses amplifikasi
PCR dilakukan sebanyak 35 siklus setelah denaturasi awal pada suhu 94°C selama
4. Setiap siklus terdiri dari denaturasi pada suhu 94°C selama 45 detik, annealing
pada suhu 45-65°C selama 30 detik dan pemanjangan fragmen DNA pada suhu
72°C selama 20 detik. Amplifikasi PCR diakhiri dengan dilakukan ektensi pada
suhu 72°C selama 10 menit.
Elektroforesis Fragmen DNA Manggis dan Kerabat Dekatnya Hasil
PCR. Fragmen DNA hasil amplifikasi di elektroforesis bersama dengan DNA
standar 1 kb DNA ladder pada gel agarose 1.2% dalam buffer TBE 1X selama 45
menit pada tegangan 50 volt dan diwarnai dengan 1% ethidium bromide selama
10 menit untuk melihat fragmen DNA manggis yang dihasilkan. Selanjutnya hasil
elektroforesis didokumentasikan dan disimpan.
Analisis Sekuen Fragmen DNA dan Pengembangan Marka Molekuler
untuk Indentifikasi Karakter Apomiksis pada Manggis dan Kerabat
Dekatnya. Analisis runutan basa DNA fragmen pita marka molekuler terpaut
karakter apomiksis dilakukan menggunakan jasa sekuensing. Pengembangan
marka molekuler terpaut karakter tersebut dilakukan berdasarkan sekuen manggis
dan kerabat dekatnya mengikuti metode Innis dan Gelfand (1990) berdasarkan
12
karakter apomiksis dari hasil analisis runutan basa DNA. Pengembangan marka
molekuler terpaut karakter apomiksis akan dilakukan berdasarkan sekuen manggis
dan kerabat dekatnya dengan teknik SNP.
Verifikasi Marka Molekuler. Verifikasi marka molekuler terpaut
apomiksis dilakukan pada