Efektivitas Ekstrak Kulit Batang Rhizophora mucronata Sebagai Antibakteri untuk Mencegah Perkembangan Bakteri Edwardsiella tardapada Ikan Mas (Cyprinuscarpio L.)
62
LAMPIRAN
Universitas Sumatera Utara
63
Lampiran 1. Proses Ekstraksi
Pengambilankulit batang
mangrove
Pengeringan
Penggilingan kulit batang
Proses perendaman
Penyaringan
Penguapan
Hasil ekstrak Penimbangan ekstrak Penyimpanan ekstrak
Universitas Sumatera Utara
64
Lampiran 2. Proses Pengujian Antibakteri
Penimbangan ekstrakPengadukan ekstrak
ke dalam ekstrak
Perbandingan suspensiPengolesan suspensi bakteri
dengan Mcfarland 108ke dalam media TSA
Perendaman kertas cakram
Peletakan kertas cakram
ke dalam suspensi bakteri
Pengukuran zona bening
Universitas Sumatera Utara
65
Lampiran3. Proses Pengujian Toksisitas LC50 48 jam
Pengisian air ke dalam
akuarium
Penimbangan ekstrak
konsentrasi
Pengamatan mortalias ikan
Pengukuran kualitas air
Pemberian ekstrak sesuai
Universitas Sumatera Utara
66
Lampiran 4. Penginfeksian, Penghitungan Koloni dan Pengobatan Ikan
Pemanenan bakteri
Pemindahan ke tabung reaksi Penginfeksian bakteri
Uji biokimia
Hasil uji biokimia MR (+)
VP (-)
Hasil ujibiokimia positif
citrat
Hasil uji biokimia O/FPembedahan ikan Pemindahan ke dalam tub
positif fermentatif
Universitas Sumatera Utara
67
Lampiran 4. Lanjutan
Pengukuran sampel
Pengadukan sampel dalam
media BFP cair
Pengenceran sampel
Penuangan ke media RS
Penghitungan koloni bakteri Pemberian ekstrak untuk
pengobatan
Pengamatan kelulushidupan ikan
Universitas Sumatera Utara
68
Lampiran 5. Perhitungan Konsentrasi untuk Uji Antimikroba
Ekstrak dengan konsentrasi 60% dibuat dengan melarutkan ekstrak
sebanyak 0,6 g dalam 1 ml DMSO. Kemudian diencerkan menjadi konsentrasi
40% dan 20% dalam 0,5 DMSO. Contoh perhitungan pengencerannya adalah
sebagai berikut:
Pengenceran 40%
V1 x N1
= V2 x N2
V1 x 60
= 0,5 x 40
V1
= 20/60
V1
= 0,333 ml atau 333,33 µl diambil dari konsentrasi 60% kemudian
diencerkan dengan DMSO sebanyak 166,67 µl sehingga didapatkan konsentrasi
40% sebanyak 0,5 ml
Pengenceran 20%
V1 x N1
= V2 x N2
V1 x 60
= 0,5 x 20
V1
= 10/60
V1
= 0,166 ml atau 166,66 µl diambil dari konsentrasi 60% kemudian
diencerkan dengan DMSO sebanyak 333,34 µl sehingga didapatkan konsentrasi
20% sebanyak 0,5 ml.
Universitas Sumatera Utara
69
Lampiran 6. Data Awal Zona Hambat Ekstrak Kulit Batang Rhizophora
mucronata terhadap Bakteri Edwardsiella tarda
Zona hambat pada bakteri Edwardsiella tarda yang diamati selama 24 jam
Ekstrak
Ulangan
Metanol
U1
U2
U3
U1
U2
U3
U1
U2
U3
U1
U2
U3
U1
U2
U3
N-heksana
Eti asetat
Kloramfenikol
DMSO
Zona hambat 24 jam (mm)
60%
40%
20%
Kontrol
18,25
13,20
8,15
19,50
14,50
9,85
19,35
14,15
10,15
0
0
0
0
0
0
0
0
0
15,15
7,40
4,25
18,50
10,75
5,87
14,35
7,65
4,15
37,50
39,51
38,50
0
0
0
Universitas Sumatera Utara
70
Lampiran 7. Tabel Probit
Persentase
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
99
0
3,72
4,16
4,48
4,75
5
5,25
5,52
5,84
6,28
0
7,33
1
2,67
3,77
4,19
4,5
4,77
5,03
5,28
5,55
5,88
6,34
0,1
7,37
2
2,95
3,82
4,23
4,53
4,8
5,05
5,31
5,58
5,92
6,41
0,2
7,41
3
3,12
3,87
4.26
4,56
4,82
5,08
5,33
5,61
5,95
6,48
0,3
7,46
Probit
4
5
3,25 3,36
3,92 3,96
4,29 4,33
4,59 4,61
4,85 4,87
5,1 5,13
5,36 5,39
5,64 5,67
5,99 6,04
6,55 6,64
0,4
0,5
7,51 7,58
6
3,45
4,01
4,36
4,64
4,9
5,15
5,41
5,71
6,08
6,75
0,6
7,65
7
3,52
4,05
4,39
4,67
4,92
5,18
5,44
5,74
6,13
6,88
0,7
7,75
8
3,59
4,08
4,442
4,69
4,95
5,2
5,47
5,77
6,18
7,05
0,8
7,88
9
3,66
4,12
4,45
4,72
4,97
5,23
5,5
5,81
6,23
7,33
0,9
8,09
Universitas Sumatera Utara
71
Tabel 8. Data Pengamatan Mortalitas Ikan Mas Pada Uji LC50 48 jam
Ulangan
1
2
3
Jam Ke
Konsentrasi
(ppm)
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48
25
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
30
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
2
3
3
5
5
5
5
5
5
5
50
1
5
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
75
2
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
25
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
30
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
50
2
8
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
75
3
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
25
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
30
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
2
4
4
4
4
5
5
5
5
50
1
4
8
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
75
3
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Universitas Sumatera Utara
72
Lampiran 9. Perhitungan LC50 Ekstrak Kulit Batang Rhizophora mucronata
dengan Pelarut Metanol
Persen
LC50
Konsentrasi
Total
Jumlah
Log
Mortalitas
Probit (ppm)
(ppm)
Populasi Kematian
Konsentrasi
(%)
25
30
0
0
1,39
0
30
30
14
46,67
1,47
4,92
39,30
50
30
30
100
1,69
8,09
75
30
30
100
1,87
8,09
Contoh perhitungan persen mortalitas pada ekstrak metanol dengan konsentrasi 30
ppm
Persen mortalitas = Jumlah Ikan yang mati x 100%
Jumlah populasi
= 14/30 x 100 %
= 46,67 %
Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak etil asetat:
Nilai Probit
Ekstrak Metanol
y = 15,36x - 19,49
R² = 0,7583
Log Konsentrasi
Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit
sumbu y didapatkan persamaan y = 15,36x –19,49 dan R² = 0,7583
Penentuan LC50 (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar
50 %)
Universitas Sumatera Utara
73
50%
nilai probit (y) = 5 (dilihat dari table probit), x = log konsentrasi.
Perhitungan LC50 dari persamaan regresi y = 15,36x –19,49 dan R² =
0,7580 adalah sebagai berikut:
5 = 15,36x–19,49
x = (5 – (-19,49) / 15,36
x = 1,594401042
anti log dari x = 1,594401042
LC50 = 39,30 ppm
Universitas Sumatera Utara
74
Lampiran 10. Data Kelulushidupan Benih Ikan Mas Setelah Diinfeksi
Bakteri dan Pasca Perendaman Ekstrak
Ikan yang hidup
Konsentrasi
ekstrak
Setelah Diinfeksi
Setelah Perendaman
U1
U2
U3
U1
U2
U3
Kontrol negatif
10
10
10
10
10
10
Kontrol positif
8
6
7
2
0
0
Ekstrak 2,86 ppm
8
7
7
8
7
7
Ekstrak 3,93 ppm
10
10
10
10
10
10
Keterangan :
Kontrol negatif : tidak diinfeksi bakteri dan tidak direndam ekstrak
Kontrol positif : diinfeksi bakteri tanpa direndam ekstrak
Universitas Sumatera Utara
75
Lampiran 11. Tabel Analisis ANOVA
Anova: Two-Factor With
Replication
SUMMARY
Kontrol
negatif
Kontrol
positif
Ekstrak 2,86
ppm
Ekstrak 3,93
ppm
Total
Setelah
diinfeksi
Count
3
Sum
Average
Variance
3
30
10
0
3
3
12
21
22
22
95
7 7,333333333 7,333333333 7,916666667
1 0,333333333 0,333333333 1,901515152
Setelah
perendaman
Count
Sum
Average
Variance
3
3
3
30
2
20
10 0,666666667 6,666666667
0 1,333333333 0,333333333
3
12
30
82
10 6,833333333
0 16,15151515
Total
Count
Sum
Average
Variance
ANOVA
Source of
Variation
Sample
Columns
Interaction
Within
Total
6
6
60
23
10 3,833333333
0 12,96666667
SS
7,041666667
127,4583333
64,45833333
6,666666667
205,625
df
1
3
3
16
6
6
42
52
7 8,666666667
0,4 2,266666667
MS
F
P-value
F crit
7,041666667
16,9 0,000817548 4,493998478
42,48611111 101,9666667 1,21598E-10 3,238871517
21,48611111 51,56666667 1,90433E-08 3,238871517
0,416666667
23
Universitas Sumatera Utara
76
Lampiran 12. Perhitungan dan Proses Pengenceran Bakteri
Jumlah Koloni
10-4
10-3
10-2
10-1
Rata-rata
Jumlah Bakteri (CFU/ml)
Sebelum
Sesudah
8,5 x 103
2,3 x 102
1,0 x 101
0
2,18 x 103
5,1 x 103
1,8 x 102
0
0
1,32 x 103
10ml
1ml
1 ml
Sampel organ
10-1
10-2
10-3
10-4
masing-masing berisi 9 ml BFP cair
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
Universitas Sumatera Utara
77
Lampiran 13. Pengukuran Kualitas Air Pada Pagi dan Sore Selama
Pengamatan
Hari
ke1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Suhu
(oC)
25
25
26
25
26
27
26
25
25
27
25
25
27
26
25
26
25
25
26
25
Pagi
DO
(ppm)
5,5
5,6
5,5
5,5
5,5
5,6
5,5
5,7
5,5
5,7
5,6
5,5
5,5
5,6
5,7
5,5
5,6
5,6
5,5
5,6
pH
6,5
6,5
6,5
6,5
6,5
6,7
6,7
6,5
6,5
6,5
6,5
6,7
6,7
6,7
6,7
6,7
6,5
6,5
6,5
6,5
Suhu
(oC)
29
28
28
27
27
28
27
29
29
29
29
29
28
27
28
29
29
28
29
28
Sore
DO
(ppm)
5,7
5,7
5,7
5,8
5,8
5,7
5,7
5,8
5,8
5,8
5,7
5,8
5,7
5,8
5,7
5,7
5,7
5,7
5,7
5,8
pH
6,6
6,7
6,7
6,6
6,7
6,8
6,8
6,8
6,8
6,8
6,7
6,8
6,8
6,8
6,7
6,8
6,7
6,7
6,8
6,7
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR PUSTAKA
Ajizah, A. 2004. Sensitivitas Salmonella typhymurium Terhadap Daun Jambu Biji
(Psidium guajava L.). Jurnal Bioscientiae. 1(1): 8 – 31.
Ali, H., F. S. Chowdhury., Ashrafuzzaman., A. N. Chowdhury., R. U. Haque., K.
M.A. Zinnah.,dan M. Rahman. 2014. Identification Pathogenecity,
Antibiotic and Herbal Sensitivity of Edwardsiella tarda Causing Fish
Disease in Bangladesh. Jurnal Current Research in Microbology and
Biotechnology. 2(1): 292 – 297.
Amri, K dan Khairuman. 2008. Buku Pintar Budidaya 15 Ikan Konsumsi.
Agromedia Pustaka. Jakarta.
Arumugam, S., D. Palanisamy., dan R.T. Sambandam. 2014. Identification of
Bioactive Compounds of Rhizophora mucronata Poir. Leaves Using
Supercritical Fluid Extraction and Gc-Ms. Journal Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences. 3(10): 1621 – 1631.
Batool, N., N. Ilyas., dan A. Shahzad. 2014. Asiatic Mangrove (Rhizophora
mucronata) – an Overview. European Academic Reasearch. 2(3): 3348 –
3363.
Darsana, I. G. O., I. N. K. Besung., dan H. Mahatmi. 2012. Potensi Daun
Binahong (Anredera Cordifolia (Tenore) Steenis) dalam Menghambat
Pertumbuhan Bakteri Escherichia coli secara In Vitro. Indonesia Medicus
Veterinus. 1(3): 337 – 351.
Davis dan Stout. 1971. Aktivitas Antimikroba Ekstrak Biji Mimba Terhadap
Bakteri Salmonella thypi dan Staphylococcus aureus. Jurnal Biogenesis.
2(2): 64 – 66.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar Umum
Tumbuhan Obat. Jakarta.
Desmiaty, Y., H. Ratih., M.A. Dewi., dan R. Agustin. 2008. Penentuan Jumlah
Tanin Total pada Daun Jati Belanda (Guazuma ulmifolia Lamk) dan Daun
Sambang Darah (Excoecaria bicolor Hassk.) Secara Kolorimetri dengan
Pereaksi Biru Prusia. Ortocarpus. 8: 106 – 109.
Dewi, F. K. 2010. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Buah Mengkudu
(Morinda citrifolia, Linnaeus) terhadap Bakteri Pembusuk Daging Segar.
[Skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas
Sebelas Maret. Surakarta.
Diastuti, H dan Suwandri. 2009. Fraksinasi dan Identifikasi Senyawa Antikanker
Ekstrak Kulit Batang Rhizopora mucronata Serta Uji Toksisitasnya
Terhadap Larva Udang (Artemia salina Leach). Jurnal Molekul. 4(2): 54 –
61.
Universitas Sumatera Utara
Elya B., A. Soemiati., dan Farida. 2009. Antibakteri Ekstrak Kulit Batang
Manggis Hutan (Garcinia rigida Miq.). Majalah Ilmu Kefarmasian. 6(1): 9
– 17.
Firma., R.R. Amalia., U. Sari., C. Chusbul., dan A. Amri. 2012. Deteksi
Edwardsiella tarda pada Ikan Lele (Clarias sp.) dengan Metode
Fluorescent Antibody Technique (FAT). Jurnal Akuakultur Indonesia.
11(1): 96 – 102.
Fitrial, Y. 2009. Analisis Potensi Biji dan Umbi Teratai (Nymphaea pubescens
Willd) untuk Pangan Fungsional Prebiotik dan Antibakteri Escherichia
coli Enteropatogenik K 1.1. [Tesis]. Pasca Sarjana Institut Pertanian
Bogor. Bogor.
Ghofur, M., M. Sugihartono., dan R. Thomas. 2014. Efektifitas Pemberian
Ekstrak Daun Sirih (Piper betle L.) Terhadap Penetasan Telur Ikan
Gurami (Osphronemus gouramy Lac.). Jurnal Ilmiah Universitas
Batanghari. Jambi. 14(1): 37 – 44.
Gunawan, D dan S. Marina. 2004. Ilmu Obat Alam (Farmakognosi) Jilid 1.
Penebar Swadaya. Jakarta.
Hagerman, A.E. 2002. Condensed Tannin Structural Chemistry. Department of
Chemistry and Biochemistry. Miami University. USA.
Hamidah, S. 2006. Rendemen dan Kadar Tanin Kulit Kayu Bakau (Rhizophora
mucronata Lamck) dari Daerah Takisung. Jurnal Hutan Tropis Borneo.
(18): 15 – 23.
Harborne. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalis
Tumbuhan. ITB Press. Bandung.
Hasrati, E dan R. Rusnawati. 2011. Kajian Penggunaan Daging Ikan Mas
(Cyprinus carpio Linn) Terhadap Tekstur dan Cita Rasa Bakso Daging
Sapi. Jurnal Agromedia. 29(1): 17 – 31.
Heinrich, M., J. Barnes., S. Gibbons., dan E.M. Williamson. 2010. Farmakologi
dan Fitoterapi. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.
Ibrahem, M.D., I.B. Shaheed., H.A. Elyazeed., dan H. Korani. 2011. Assessment
of The Susceptibility of Polyculture Reared African Catfish and Nile
Tilapia to Edwardsiella tarda. Jurnal American Science. 7(3): 779 – 786.
Kordi, G.H. 2004. Penanggulangan Hama dan Penyakit Ikan. Rineka Cipta.
Jakarta.
Laili, U. 2007. Pengaruh Pemberian Ekstrak Temulawak (Curcuma xanthorrhiza
Roxb) terhadap Prevelensi dan Kelulushidupan Ikan Mas (Cyprinus
carpio) yang Diinfeksi Bakteri Aeromonas hydrophyla. [Skripsi]. Fakultas
Sains dan Teknologi. Universitas Islam Negeri Malang. Malang.
Universitas Sumatera Utara
Lisdawati V., S. Wiryowidagdo., dan L.B.S. Kardono. 2006. Brine Shrimp
Lethality Test dari Berbagai Fraksi Ekstrak Daging Buah dan Kulit Biji
Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa). Buletin Penelitian Kesehatan.
34(3): 111 – 118.
Lukistyowati, I. 2012. Studi Efektifitas Sambiloto (Andrographis paniculata
Nees) untuk Mencegah Penyakit Edwardsiellosis PadaIkan Patin
(Pangasius hypopthalmus). Jurnal Berkala Perikanan Terubuk. 40(2): 56 –
74.
Mawaddah, R. 2008. Kajian Hasil Riset Potensi Antimikroba Alami dan Aplikasi
dalam Bahan Pangan di Pusat Informasi Teknologi Pertanian Fateta IPB.
[Skripsi]. Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Monalisa D., T. Handayani., dan D. Sukmawati. 2011. Uji Daya Antibakteri
Ekstrak daun Tapak Liman (Elephantopus scaber L.) Terhadap
Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi. Jurnal BIOMA. 9(2): 13 –
20.
Mubarokah, Y. 2014. Eksplorasi Potensi Daun, Kulit Batang, dan Kulit Ranting
Rhizophora mucronata (Lamarck) sebagai Bahan Antidiare. [Skripsi].
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Mukhriani. 2014. Ekstraksi, Pemisahan Senyawa dan Identifikasi Senyawa Aktif.
Jurnal Kesehatan. 7(2): 361 – 367.
Mulyani, Y., E. Bachtiar., dan M.U. Kurnia. 2013. Peranan Senyawa Metabolit
Sekunder Tumbuhan Mangrove terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas
hydrophila Pada Ikan Mas (Cyprinus carpio L.). Jurnal Akuatika. 4(1): 1 –
9.
Narwiyani, S. dan Kurniasih. 2011. Perbandingan Patogenesitas, Edwardsiella
tarda Pada Ikan Mas Koki (Charassius auratus) dan Ikan Celebes
Rainbow (Telmatherina celebensis). Jurnal J. Ris. Akuakultur. 6(2): 291–
301.
Nurdiansyah dan A. Redha. 2011. Efek Lama Maserasi Bubuk Kopra Terhadap
Rendemen, Densitas, dan Bilangan Asam Biodiesel yang Dihasilkan
dengan Metode Transesterifikasi In Situ. Jurnal Belian. 10(2): 218 – 224.
Pradana, D. 2013. Uji Daya Hambat Ekstrak Kulit Batang Rhizophora mucronata
Terhadap Pertumbuhan Bakteri Aeromonas hydrophila, Streptococcus
agalactiae dan Jamur Saprolegnia sp. secara In Vitro. [Skripsi]. Fakultas
Pertanian. Universitas Sumatera Utara. Medan.
Pratiwi, S.I. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta.
Purwaningsih, I. 2013. Identifikasi Ektoparasit Protozoa pada Benih Ikan Mas
(Cyprinus carpio Linnaeus, 1758) di Unit Kerja Budidaya Air Tawar
Universitas Sumatera Utara
(UKBAT) Cangkringan Sleman DIY. [Skripsi]. Fakultas Sains dan
Teknologi. UIN Sunan Kalijaga. Yogyakarta.
Rahman, M.A., S.N. Hasan., K.S. Sampad., dan A.K. Das. 2011. Antiociceptive,
Antidiarrhoeal and Cytotoxic Activities of Rhizophora mucronata Lamk.
Jurnal Pharmacologyonline. 1: 921 – 929.
Rais, I.R. 2014. Ekstraksi Andrografolid dari Andrographis paniculata (Burm.f.)
Nees Menggunakan Ekstraktor Soxhlet. Jurnal Pharmaciana. 4(1): 85 – 92.
Rajapakshe, A.D.W.R., K.P. Prasad., dan S.C. Mukhaejee. 2003. Gross Clinical
Signs and Haematological Changes Associated with Artificial Infection of
Edwardsiella tarda in Koi Carp. Jurnal Nation Aquatic Resources
Research and Development Agency. 1 – 10.
Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. ITB Press. Bandung.
Setyawan, A.D dan Y.I. Ulumuddin. 2012. Species Diversity of Rhizophora in
Tambelan Islands, Natuna Sea, Indonesia. Jurnal Biodiversitas. 13(4): 172
– 177.
Simbala, H.E.I. 2009. Analisis Senyawa Alkaloid Beberapa Jenis Tumbuhan Obat
sebagai Bahan Aktif Fitofarmaka. Jurnal Pasifik. 1(4): 489 – 494.
Sari, D.K. 2008. Penapisan Antibakteri dan Inhibitor Topoisomerase I dari
Xylocarpus granatum. [Tesis]. Sekolah Pasca Sarjana. Institut Pertanian
Bogor. Bogor.
Sirait, M. 2007. Penuntun Fitokimia dalam Farmasi. ITB Press. Bandung.
Sufriadi, A. 2006. Manfaat Daun Kayu Manis (Cinnamomum burmanni) terhadap
Khasiat Antioksidasi Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.)
Boerl.)) Selama Penyimpanan. [Skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Supriadi, I. 2012. Viabilitas dan Patogenitas Edwardsiella tarda Pada Ikan Lele
Dumbo (Clarias gariepinus) yang Dibekukan Pada Suhu -20oC. [Tesis]
Manajemen Perikanan. Universitas Terbuka. Jakarta.
Susanti, A. 2009. Pengaruh Pemberian Bakteri Probiotik Vibrio SKT-b Melalui
Artemia dengan Dosis yang Berbeda Terhadap Pertumbuhan dan
Kelangsungan Hidup Pasca Larva Udang Windu Penaeus Monodon.
[Skripsi]. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor.
Bogor.
Wahjuningrum, D., M.N. Ikhsan., Sukenda., dan Y. Evan. 2014. Penggunaan
Ekstrak Kunyit Sebagai Pengendali Infeksi Bakteri Edwardsiella tarda
pada Ikan Lele. Jurnal Akuakultur Indonesia. 13(1): 1 – 10.
Widanarni., M.A. Lidaenni., dan D. Wahjuningrum. 2010. Pengaruh Pemberian
Bakteri Probiotik Vibrio SKT-b dengan Dosis yang Berbeda Terhadap
Universitas Sumatera Utara
Kelangsungan Hidup dan Pertumbuhan Larva Udang Windu (Panaeus
monodon) Fab. Jurnal Akuakultur Indonesia. 9(1): 21 – 29.
Widya, D.R. 2013. Aktivitas Antimikroba Ekstrak Biji Teratai (Nymphaea
Pubescens L.) Terhadap Bakteri Aeromonas hydrophila, Streptococcus
agalactiae dan Jamur Saprolegnia sp. [Skripsi]. Fakultas Pertanian.
Universitas Sumatera Utara. Medan.
Universitas Sumatera Utara
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan dari bulan Agustus – Desember 2015. Pembuatan
ekstrak dan pengujian fitokimia kulit batang R. mucronata di Laboratorium Kimia
Bahan Alam, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Sumatera Utara. Pengujian efektivitas antibakteri dan uji biokimia di Stasiun
Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan
II. Pengujian LC50 dan uji tantang dilakukan di Laboratorium Budidaya Perairan
Manajemen Sumberdaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah kamera digital, alat tulis, pisau, cawan petri,
jarum suntik, laminar air flow, pipet tetes, mikropipet, botol vial, gelas ukur,
toples kaca, corong, tabung reaksi, beaker glass, rak tabung, mikroskop, preparat,
spatula, inkubator, penangas air (water bath), jarum ose, gunting bedah,
erlenmeyer, blender, aluminium foil, plat TLC, kapas, jangka sorong, kertas
cakram, api bunsen, blade, kertas saring, vortex, spreader, refrigerator, oven,
cotton bud, siphon, timbangan analitik, autoklaf, hot plate, pinset, magnetic
stirrer, akuarium ukuran 60 x 30 x 30 cm3 sebanyak 12 buah, aerator sebanyak 6
buah, DO meter, termometer, dan pH meter.
Bahan yang digunakan adalah pelarut n-heksana (non polar), etil asetat
(semi polar), metanol (polar), kulit batang R. mucronata, akuades steril, alkohol
70%, spirtus, isolat bakteri E. tarda diperoleh dari Karantina Ikan Pengendalian
Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan II, media (OF, Urea, TSIA,
Universitas Sumatera Utara
SIM, SCA, Glukosa, Inositol, Arabinosa, Sorbitol, Manitol, Maltosa, Gelatin,
MIO, MR/VP, LIA, RS, BFP) kertas oksidase, H2S, Dimethyl sulfoxide (DMSO),
NaCl 0,9 %, Mc Farland 0,5, Tryptic Soy Agar (TSA), H2O2 3%, KOH 3%,
kloramfenikol, dan benih ikan mas berukuran 5 – 7 cm sebanyak 200 ekor yang
diperoleh dari Balai Perikanan Budidaya Tuntungan.
Persiapan dan Ekstraksi Kulit Batang R. mucronata
Kulit batang tumbuhan R. mucronata dikumpulkan sebanyak 10 kg dalam
berat basah dari kawasan hutan mangrove desa Denai Kuala, Kec. Pantai Labu,
Kab. Deli Serdang. Pemanenan kulit batang R. mucronata hanya dilakukan pada
pohon dengan diameter lebih dari 30 cm. Kulit batang R. mucronata dicuci
dengan air mengalir dan dipotong kecil-kecil kemudian dikeringkan selama 7 hari
dengan cara diangin-anginkan untuk mengurangi penguapan yang mengikutkan
senyawa yang terkandung di dalamnya. Proses pengeringan ini bertujuan
menurunkan kadar air sehingga tidak mudah ditumbuhi kapang dan bakteri serta
menghilangkan aktivitas enzim yang dapat menguraikan lebih lanjut kandungan
zat aktif yang terdapat di kulit batang tumbuhan tersebut (Gunawan dan Sri,
2004). Kulit batang yang sudah kering selanjutnya dipotong menjadi potongan
yang lebih kecil agar mudah dihaluskan dengan blender hingga berbentuk serbuk.
Serbuk selanjutnya diayak menggunakan ayakan hingga diperoleh serbuk yang
halus dan seragam. Serbuk hasil ayakan sebanyak 4 kg kemudian disimpan ke
dalam plastik bening karena tidak langsung digunakan untuk proses selanjutnya.
Langkah selanjutnya adalah ekstraksi bahan aktif. Ekstraksi merupakan
suatu proses penarikan komponen atau zat aktif menggunakan pelarut tertentu
(Harborne, 1987). Ekstraksi dalam penelitian ini dilakukan dengan metode
Universitas Sumatera Utara
maserasi yaitu proses pengambilan senyawa zat aktif yang dilakukan dengan cara
merendam serbuk dalam pelarut yang sesuai dengan kepolarannya. Dalam
penelitian ini digunakan tiga pelarut dengan kepolaran berbeda yaitu n-heksana
(non polar), etil asetat (semi polar) dan metanol (polar). Serbuk sampel masingmasing sebanyak 1,1 kg direndam dengan 6 l pelarut etil asetat, 1,1 kg direndam
dengan 5 l pelarut metanol dan sebanyak 2,1 kg direndam dengan 5 l n-heksana di
dalam botol kaca. Botol kaca yang berisi rendaman tersebut kemudian ditutup
dengan penutup botol selama 24 jam sambil sesekali diaduk untuk mempercepat
kontak antara sampel dengan pelarut. Setelah itu sampel disaring dengan kapas
sehingga diperoleh filtrat dan ampas. Filtrat yang diperoleh kemudian pelarutnya
dipekatkan dengan penangas air (water bath) sambil sesekali diaduk untuk
mempercepat proses penguapan dan diperoleh ekstrak pekat/kering. Ekstrak
tersebut kemudian disimpan di dalam beaker glass yang ditutup menggunakan
aluminium foil, kemudian disimpan di dalam refrigerator sebelum digunakan.
Proses ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran 1.
Uji Daya Hambat Ekstrak Kulit Batang R. mucronata Terhadap E. tarda
Peremajaan bakteri E. tarda dilakukan dengan mengambil isolat
menggunakan jarum ose dan menanamnya secara aseptis pada media TSA.
Setelah itu diinkubasi pada suhu 35oC selama 24 – 48 jam.
Konsentrasi larutan uji yang digunakan adalah 20%, 40% dan 60% (b/v).
Konsentrasi 60% dibuat dengan cara menimbang ekstrak kulit batang R.
mucronata sebanyak 0,6 g yang dilarutkan dengan 1 ml DMSO. Larutan dengan
konsentrasi 40% dan 20% dibuat dengan cara pengenceran dari konsentrasi 60%
Universitas Sumatera Utara
menggunakan 0,5 ml DMSO. Kontrol negatif digunakan DMSO dan kontrol
positif digunakan kloramfenikol (30 µg/ml).
Tahap pertama yang dilakukan adalah pembuatan suspensi bakteri dengan
cara mengambil biakan menggunakan sengkelit (ose) dan disuspensikan dengan
cara dimasukan ke dalam tabung berisi 3 ml larutan NaCl 0,9%. Suspensi yang
terbentuk disetarakan dengan larutan baku Mc. Farland 0.5 yang ekuivalen dengan
suspensi sel bakteri dengan konsentrasi 1,5 × 108 cfu/ml (Andrews, 2008).
Pengujian antibakteri dilakukan dengan metode disc diffusion (tes Kirby &
Bauer). Prinsipnya adalah piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada
media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media
agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan
mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar (Pratiwi,
2008).
Pada penelitian ini pengujian antibakteri menggunakan blank disc (kertas
cakram kosong) berdiameter 6 mm. Cutton buds steril dimasukkan ke dalam
tabung reaksi yang berisi suspensi bakteri dan diguncang sedikit agar bakteri
teraduk rata kemudian Cutton buds yang mengandung bakteri dioleskan pada
media TSA. Setelah olesan bakteri mengering, kertas cakram yang telah direndam
ekstrak selama 1 jam pada berbagai konsentrasi ditiriskan dan diletakkan di atas
media yang berisi olesan bakteri dengan sedikit ditekan agar cakram menempel
pada permukaan media. Semua pengerjaan dilakukan dengan aseptis. Selanjutnya
diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam di inkubator. Proses pengujian
antibakteri dapat dilihat pada Lampiran 2.
Universitas Sumatera Utara
Penentuan Zona Hambatan
Menurut Pratiwi (2008), ativitas antibakteri dinyatakan positif apabila
terbentuk zona hambat berupa zona bening disekeliling paper disc dan aktivitas
antibakteri dinyatakan negatif apabila tidak terbentuk zona bening. Diameter zona
hambat dapat dideskripsikan dengan Gambar 5.
a
c
b
Gambar 5. Perhitungan diameter zona hambat antibakteri
Keterangan:
a = Diameter kertas cakram (mm)
b = Diameter zona hambat yang terbentuk (mm)
c = Daerah yang ditumbuhi bakteri
b – a = Diameter zona hambat
Uji LC50 Ekstrak Kulit Batang R. mucronata Terhadap Ikan Mas
Uji LC50 48 jam menguji cobakan secara langsung konsentrasi ekstrak
kulit batang R. mucronata terhadap benih ikan mas yang berukuran 5 – 7 cm
sebanyak 10 ekor per akuarium yang berisi 20 liter air dengan 5 perlakuan yakni
A. Tanpa perlakuan 0% (Kontrol), B. Perlakuan ekstrak kulit batang R. mucronata
25 ppm, C. Perlakuan ekstrak kulit batang R. mucronata 30 ppm,D. Perlakuan
ekstrak kulit batang R. mucronata 50 ppm, dan E. Perlakuan ekstrak kulit batang
R. mucronata 75 ppm, dengan masing-masing sebanyak 3 kali ulangan. Parameter
yang diamati adalah jumlah mortalitas benih ikan mas terhadap konsentrasi
Universitas Sumatera Utara
ekstrak kulit batang R. mucronata yang berbeda dengan tetap menjaga kualitas air
tempat hidup ikan uji. Proses uji toksisitas dapat dilihat pada Lampiran 3.
Penginfeksian dan Pengujian Bakteri
Isolat bakteri E. tarda dimurnikan kembali sebanyak 2 cawan petri penuh
yang telah berisi media TSA untuk penyuntikan ikan. Bakteri yang sudah
dimurnikan kemudian dipanen dan diencerkan dengan larutan fisiologis (NaCl
0,9%) sebanyak 10 ml. Setelah itu dihomogenkan dengan menggukan vortex dan
disetarakan dengan larutan McFarland 107CFU/ml, kemudian diinfeksikan ke ikan
mas.
Penginfeksian
bakteri
pada
ikan
dilakukan
dengan
penyuntikan
menggunakan jarum suntik sebanyak 0,1 ml/ekor suspensi bakteri dengan
kepadatan 107CFU/ml dan disuntikkan secara intraperitoneal (Setyowati. dkk.,
2014). Setelah ikan diinfeksi kemudian diamati pergerakan dan gejala ikan yang
terinfeksi bakteri E. tarda. Pemberian pakan dilakukan 2 kali sehari, yaitu pada
pagi dan sore hari serta diamati kualitas airnya. Hal ini dilakukan agar ikan yang
telah disuntikan mati bukan akibat suntikan, melainkan bakteri.
Ikan yang telah disuntikan, diisolasi dan dilakukan uji biokimia untuk
mengetahui apakah bakteri yang menyerang ikan mas adalah bakteri E.tarda.
Proses penginfeksian dan pengujian bakteri dapat dilihat pada Lampiran 4.
Perhitungan Koloni Bakteri E. tarda pada Ikan Mas
Prose penghitungan jumlah koloni bakteri Edwardsiella tarda dengan
metode cawan sebar dengan pengenceran dan untuk menghitung koloni
menggunakan metode TPC (Total Plate Count). Ikan yang telah terinfeksi selama
24 jam kemudian dibedah dengan mengambil organ tubuhnya. Menurut KEPBKIM (2015) ikan ukuran 4 – 6 cm, target uji adalah bagian isi perut sampai
Universitas Sumatera Utara
dengan ginjal dan sebagian enchepalon yang diambil dari memotong tepi
operculum dan menekan secara lateral, sedangkan ikan ukuran lebih dari 6 cm,
target uji terdiri dari ginjal, limpa dan otak. Tahap pengenceran yaitu 10-1, 10-2,
10-3, dan 10-4.
Sampel organ diambil sebanyak 1 gram dan diencerkan menggunakan
media BFP cair sebanyak 10 ml. Empat buah tabung reaksi diisi media BFP cair
sebanyak 9 ml. Biakan bakteri diambil sebanyak 1 ml dari campuran bakteri
dengan pengenceran 10-1 agar mendapatkan bakteri dengan pengenceran10-2,
begitu seterusnya sampai pengenceran 10-4. Sampel yang sudah diencerkan di
vortex kemudian dituang sebanyak 1 ml ke media RS dan diberi label sesuai
pengenceran.Setelah itu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35oC kemudian
dihitung koloni bakteri dengan metode TPC dan dilakukan perhitungan jumlah
bakteri menurut menurut (Hadioetomo, 1993 dalam Susanti, 2009).
Ni = No x
1
��
Keterangan:
x 10
Ni = Jumlah sel bakteri (CFU/ml)
No = Jumlah koloni bakteri yang tumbuh
fp = Faktor pengenceran
Uji Tantang
Uji tantang dilakukan pada hari ke-5 pasca penginfeksian, kemudian
dilakukan pengobatan dengan 4 perlakuan dan 3 ulangan, yaitu perlakuan kontrol
negatif (tidak diinfeksi bakteri dan tidak direndam ekstrak), kontrol positif
(diinfeksi bakteri dan tidak direndam ekstrak), ekstrak dengan larutan metanol
2,86 ppm dan ekstrak dengan larutan metanol 3,93 ppm (10% dari hasil uji LC50).
Universitas Sumatera Utara
Benih ikan uji sebanyak 10 ekor dalam 20 liter air per akuarium. Perendaman
dilakukan selama 14 hari dan diamati kelulushidupan ikan (SR). Pada saat uji
tantang pada hari ke-14 frekuensi pemberian pakan ditingkatkan yaitu tiga kali
dalam sehari, dengan jadwal pemberian pagi (07.00-08.00), siang (12.00- 13.00),
dan malam (19.00-20.00) WIB.
Pengamatan Kualitas Air
Untuk menjaga kualitas air selama percobaan dilakukan penyiponan jika
diperlukan. Parameter kualitas air yang diukur meliputi suhu, DO, dan pH.
Pengukuran dilakukan setiap pengamatan, pagi dan sore.
Analisis Data
Untuk zona hambat pengukuran zona bening dirata-ratakan dan dianalisis
dengan metode deskipstif dalam bentuk tabel dan gambar. Uji tantang, analisis
data menggunakan ANOVA. Selanjutnya untuk analisis data uji LC50 48 jam
dengan perhitungan Analisis Probit yaitu dilakukan dengan persamaan regresi
linear y = a + bx yang didapatkan dari grafik hubungan antar log konsentrasi
dengan mortalitas probit menggunakan program Microsoft Excel.
Universitas Sumatera Utara
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Ekstraksi
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi/perendaman serbuk kulit
batang R. mucronata dengan menggunakan pelarut metanol, n-heksana, dan etil
asetat. Hasil ekstraksi kulit batang tumbuhan R. mucronata dapat dilihat pada
Tabel 1.
Tabel 1. Hasil ekstraksi kulit batang tumbuhan Rhizophora mucronata.
No.
1.
2.
3.
4.
Hasil
Berat sampel (g)
Berat ekstrak (g)
Bentuk
Warna
Metanol
1100
250
Pasta
Merah
kehitaman
Etil asetat
1100
5
Pasta kering
Cokelat
kemerahan
n-Heksana
2200
3
Pasta agak cair
Hijau
kekuningan
Uji Daya Hambat Ekstrak Kulit Batang R. mucronata
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram
yang menggunakan blank disc ukuran 6 mm. Hasil pengujian ekstrak kulit batang
R. mucronata terhadap pertumbuhan bakteri E. tarda menunjukkan bahwa ekstrak
tersebut mampu menghambat pertumbuhan bakteri E. tarda. Besarnya daya
hambat ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap pertumbuhan bakteri E. tarda
dapat diketahui dengan mengukur zona bening yang menghambat pertumbuhan
bakteri E. tarda menggunakan jangka sorong. Pengamatan terhadap pertumbuhan
bakteri E. tarda dilakukan selama 24 jam. Zona hambat ekstrak kulit batang R.
mucronata terhadap bakteri E. tarda dapat dilihat pada Tabel 2 dan Gambar 6.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 2. Zona hambat rata-rata ekstrak kulit batang R. mucronata
bakteri E. tarda
Bakteri
E. tarda
Ekstrak dengan
pelarut
Etil Asetat
Metanol
N-heksana
Kloramfenikol
DMSO
terhadap
Diameter rata-rata zona hambat (mm)
60%
40%
20%
Kontrol
16,11
8,60
4,75
19,03
13,95
9,38
0
0
0
38,50
0
Daya hambat ektrak kulit batang R. mucronata yang paling besar terlihat
pada ekstrak metanol dengan konsentrasi 60% sebesar 19,50 mm, konsentrasi
40% sebesar 14,94 mm dan konsentrasi 20% sebesar 9,95 mm. Perhitungan
konsentrasi uji antimikroba dan data awal hasil pengukuran zona hambat ekstrak
kulit batang R. mucronata dapat dilihat pada Lampiran 5 dan Lampiran 6.
(a)
(b)
(d)
(e)
(c)
Gambar 6. Hasil pengujian antibakteri terhadap bakteri E. tarda; (a) ekstrak
dengan pelarut etil asetat (b) ekstrak dengan pelarut metanol (c)
ekstrak dengan pelarut n-heksana (d) kontrol positif/kloramfenikol (e)
kontrol negatif (DMSO)
Universitas Sumatera Utara
Uji LC50 Ekstrak Kulit Batang R. mucronata Terhadap Ikan Mas
Toksisitas ekstrak kulit batang R. mucronata dilakukan untuk mengetahui
kandungan bioaktif ekstrak tersebut dengan menggunakan Uji LC50. Ekstrak yang
paling menghambat pada uji daya hambat diaplikasikan dalam uji LC50, yaitu
ekstrak metanol. Data hasil uji LC50 ekstrak metanol dari kulit batang R.
mucronata dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Data hasil uji LC50 ekstrak metanol dari kulit batang R. mucronata
Konsentrasi
(ppm)
0
25
30
50
75
Total
Populasi
30
30
30
30
30
Jumlah
Kematian
0
0
14
30
30
Persen
Mortalitas (%)
0
0
46,67
100
100
LC50
(ppm)
39,30
Mortalitas benih ikan mas terhadap ekstrak metanol menunjukkan bahwa
pada konsentrasi 25 ppm tidak ada yang mati, sedangkan pada konsentrasi 50 ppm
benih ikan mas sudah mati sebesar 100%. Pada pemberian konsentrasi 30 ppm
benih ikan mas mati sebanyak 46,67%. Perhitungan LC50 dilihat dari nilai probit
yang disesuaikan dengan tabel probit (Lampiran 7) dan nilai log konsentrasi. Dari
hasil perhitungan uji LC50 didapatkan nilai konsentrasi yang dapat mematikan
ikan sebanyak 50% adalah 39,30 ppm. Data pengamatan mortalitas benih ikan
mas dan perhitungan LC50 ekstrak kulit batang R. Mucronata dapat dilihat pada
Lampiran 8 dan Lampiran 9.
Uji Tantang
Benih Ikan Mas yang telah terinfeksi dilihat pada perubahan morfologi
dan tingkah lakunya. Salah satu perubahan ikan yang terinfeksi bakteri E. tarda
yaitu tubuhnya pucat, hilangnya sisik akibat luka dan dapat menyebakan
Universitas Sumatera Utara
pendarahan bahkan kematian. Ikan yang terinfeksi dilakukan uji biokimia untuk
memastikan ikan tersebut terinfeksi bakteri E. tarda. Setelah itu dilakukan
pengobatan
dengan
cara
perendaman
ekstrak.
Perhitungan
rata-rata
kelulushidupan ikan mas setelah diinfeksi bakteri dan direndam ekstrak dapat
dilihat pada Tabel 4 dan perubahan ikan yang diinfeksi bakteri dan setelah
direndam ekstrak dapat dilihat pada Gambar 7.
Tabel 4. Perhitungan rata-rata kelulushidupan benih ikan mas yang diinfeksi
bakteri pasca perendaman
Rata-rata
Kelulushidupan Benih
U1
U2
U3
Ikan Mas (%)
Kontrol negatif
10
10
10
100± 0,00a
Kontrol positif
0
2
0
6,67±9,33b
Ekstrak 2,86 ppm
7
6
7
66,67± 3,33c
Ekstrak 3,93 ppm
10
10
10
100±0,00a
Keterangan : Superskrip yang berbeda menunjukkan berbeda nyata (P
LAMPIRAN
Universitas Sumatera Utara
63
Lampiran 1. Proses Ekstraksi
Pengambilankulit batang
mangrove
Pengeringan
Penggilingan kulit batang
Proses perendaman
Penyaringan
Penguapan
Hasil ekstrak Penimbangan ekstrak Penyimpanan ekstrak
Universitas Sumatera Utara
64
Lampiran 2. Proses Pengujian Antibakteri
Penimbangan ekstrakPengadukan ekstrak
ke dalam ekstrak
Perbandingan suspensiPengolesan suspensi bakteri
dengan Mcfarland 108ke dalam media TSA
Perendaman kertas cakram
Peletakan kertas cakram
ke dalam suspensi bakteri
Pengukuran zona bening
Universitas Sumatera Utara
65
Lampiran3. Proses Pengujian Toksisitas LC50 48 jam
Pengisian air ke dalam
akuarium
Penimbangan ekstrak
konsentrasi
Pengamatan mortalias ikan
Pengukuran kualitas air
Pemberian ekstrak sesuai
Universitas Sumatera Utara
66
Lampiran 4. Penginfeksian, Penghitungan Koloni dan Pengobatan Ikan
Pemanenan bakteri
Pemindahan ke tabung reaksi Penginfeksian bakteri
Uji biokimia
Hasil uji biokimia MR (+)
VP (-)
Hasil ujibiokimia positif
citrat
Hasil uji biokimia O/FPembedahan ikan Pemindahan ke dalam tub
positif fermentatif
Universitas Sumatera Utara
67
Lampiran 4. Lanjutan
Pengukuran sampel
Pengadukan sampel dalam
media BFP cair
Pengenceran sampel
Penuangan ke media RS
Penghitungan koloni bakteri Pemberian ekstrak untuk
pengobatan
Pengamatan kelulushidupan ikan
Universitas Sumatera Utara
68
Lampiran 5. Perhitungan Konsentrasi untuk Uji Antimikroba
Ekstrak dengan konsentrasi 60% dibuat dengan melarutkan ekstrak
sebanyak 0,6 g dalam 1 ml DMSO. Kemudian diencerkan menjadi konsentrasi
40% dan 20% dalam 0,5 DMSO. Contoh perhitungan pengencerannya adalah
sebagai berikut:
Pengenceran 40%
V1 x N1
= V2 x N2
V1 x 60
= 0,5 x 40
V1
= 20/60
V1
= 0,333 ml atau 333,33 µl diambil dari konsentrasi 60% kemudian
diencerkan dengan DMSO sebanyak 166,67 µl sehingga didapatkan konsentrasi
40% sebanyak 0,5 ml
Pengenceran 20%
V1 x N1
= V2 x N2
V1 x 60
= 0,5 x 20
V1
= 10/60
V1
= 0,166 ml atau 166,66 µl diambil dari konsentrasi 60% kemudian
diencerkan dengan DMSO sebanyak 333,34 µl sehingga didapatkan konsentrasi
20% sebanyak 0,5 ml.
Universitas Sumatera Utara
69
Lampiran 6. Data Awal Zona Hambat Ekstrak Kulit Batang Rhizophora
mucronata terhadap Bakteri Edwardsiella tarda
Zona hambat pada bakteri Edwardsiella tarda yang diamati selama 24 jam
Ekstrak
Ulangan
Metanol
U1
U2
U3
U1
U2
U3
U1
U2
U3
U1
U2
U3
U1
U2
U3
N-heksana
Eti asetat
Kloramfenikol
DMSO
Zona hambat 24 jam (mm)
60%
40%
20%
Kontrol
18,25
13,20
8,15
19,50
14,50
9,85
19,35
14,15
10,15
0
0
0
0
0
0
0
0
0
15,15
7,40
4,25
18,50
10,75
5,87
14,35
7,65
4,15
37,50
39,51
38,50
0
0
0
Universitas Sumatera Utara
70
Lampiran 7. Tabel Probit
Persentase
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
99
0
3,72
4,16
4,48
4,75
5
5,25
5,52
5,84
6,28
0
7,33
1
2,67
3,77
4,19
4,5
4,77
5,03
5,28
5,55
5,88
6,34
0,1
7,37
2
2,95
3,82
4,23
4,53
4,8
5,05
5,31
5,58
5,92
6,41
0,2
7,41
3
3,12
3,87
4.26
4,56
4,82
5,08
5,33
5,61
5,95
6,48
0,3
7,46
Probit
4
5
3,25 3,36
3,92 3,96
4,29 4,33
4,59 4,61
4,85 4,87
5,1 5,13
5,36 5,39
5,64 5,67
5,99 6,04
6,55 6,64
0,4
0,5
7,51 7,58
6
3,45
4,01
4,36
4,64
4,9
5,15
5,41
5,71
6,08
6,75
0,6
7,65
7
3,52
4,05
4,39
4,67
4,92
5,18
5,44
5,74
6,13
6,88
0,7
7,75
8
3,59
4,08
4,442
4,69
4,95
5,2
5,47
5,77
6,18
7,05
0,8
7,88
9
3,66
4,12
4,45
4,72
4,97
5,23
5,5
5,81
6,23
7,33
0,9
8,09
Universitas Sumatera Utara
71
Tabel 8. Data Pengamatan Mortalitas Ikan Mas Pada Uji LC50 48 jam
Ulangan
1
2
3
Jam Ke
Konsentrasi
(ppm)
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48
25
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
30
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
2
3
3
5
5
5
5
5
5
5
50
1
5
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
75
2
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
25
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
30
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
50
2
8
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
75
3
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
25
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
30
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
2
4
4
4
4
5
5
5
5
50
1
4
8
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
75
3
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Universitas Sumatera Utara
72
Lampiran 9. Perhitungan LC50 Ekstrak Kulit Batang Rhizophora mucronata
dengan Pelarut Metanol
Persen
LC50
Konsentrasi
Total
Jumlah
Log
Mortalitas
Probit (ppm)
(ppm)
Populasi Kematian
Konsentrasi
(%)
25
30
0
0
1,39
0
30
30
14
46,67
1,47
4,92
39,30
50
30
30
100
1,69
8,09
75
30
30
100
1,87
8,09
Contoh perhitungan persen mortalitas pada ekstrak metanol dengan konsentrasi 30
ppm
Persen mortalitas = Jumlah Ikan yang mati x 100%
Jumlah populasi
= 14/30 x 100 %
= 46,67 %
Kurva hubungan log konsentrasi versus nilai probit ekstrak etil asetat:
Nilai Probit
Ekstrak Metanol
y = 15,36x - 19,49
R² = 0,7583
Log Konsentrasi
Dari grafik hubungan antara log konsentrasi (sumbu x) dengan nilai probit
sumbu y didapatkan persamaan y = 15,36x –19,49 dan R² = 0,7583
Penentuan LC50 (Konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian sebesar
50 %)
Universitas Sumatera Utara
73
50%
nilai probit (y) = 5 (dilihat dari table probit), x = log konsentrasi.
Perhitungan LC50 dari persamaan regresi y = 15,36x –19,49 dan R² =
0,7580 adalah sebagai berikut:
5 = 15,36x–19,49
x = (5 – (-19,49) / 15,36
x = 1,594401042
anti log dari x = 1,594401042
LC50 = 39,30 ppm
Universitas Sumatera Utara
74
Lampiran 10. Data Kelulushidupan Benih Ikan Mas Setelah Diinfeksi
Bakteri dan Pasca Perendaman Ekstrak
Ikan yang hidup
Konsentrasi
ekstrak
Setelah Diinfeksi
Setelah Perendaman
U1
U2
U3
U1
U2
U3
Kontrol negatif
10
10
10
10
10
10
Kontrol positif
8
6
7
2
0
0
Ekstrak 2,86 ppm
8
7
7
8
7
7
Ekstrak 3,93 ppm
10
10
10
10
10
10
Keterangan :
Kontrol negatif : tidak diinfeksi bakteri dan tidak direndam ekstrak
Kontrol positif : diinfeksi bakteri tanpa direndam ekstrak
Universitas Sumatera Utara
75
Lampiran 11. Tabel Analisis ANOVA
Anova: Two-Factor With
Replication
SUMMARY
Kontrol
negatif
Kontrol
positif
Ekstrak 2,86
ppm
Ekstrak 3,93
ppm
Total
Setelah
diinfeksi
Count
3
Sum
Average
Variance
3
30
10
0
3
3
12
21
22
22
95
7 7,333333333 7,333333333 7,916666667
1 0,333333333 0,333333333 1,901515152
Setelah
perendaman
Count
Sum
Average
Variance
3
3
3
30
2
20
10 0,666666667 6,666666667
0 1,333333333 0,333333333
3
12
30
82
10 6,833333333
0 16,15151515
Total
Count
Sum
Average
Variance
ANOVA
Source of
Variation
Sample
Columns
Interaction
Within
Total
6
6
60
23
10 3,833333333
0 12,96666667
SS
7,041666667
127,4583333
64,45833333
6,666666667
205,625
df
1
3
3
16
6
6
42
52
7 8,666666667
0,4 2,266666667
MS
F
P-value
F crit
7,041666667
16,9 0,000817548 4,493998478
42,48611111 101,9666667 1,21598E-10 3,238871517
21,48611111 51,56666667 1,90433E-08 3,238871517
0,416666667
23
Universitas Sumatera Utara
76
Lampiran 12. Perhitungan dan Proses Pengenceran Bakteri
Jumlah Koloni
10-4
10-3
10-2
10-1
Rata-rata
Jumlah Bakteri (CFU/ml)
Sebelum
Sesudah
8,5 x 103
2,3 x 102
1,0 x 101
0
2,18 x 103
5,1 x 103
1,8 x 102
0
0
1,32 x 103
10ml
1ml
1 ml
Sampel organ
10-1
10-2
10-3
10-4
masing-masing berisi 9 ml BFP cair
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
Universitas Sumatera Utara
77
Lampiran 13. Pengukuran Kualitas Air Pada Pagi dan Sore Selama
Pengamatan
Hari
ke1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Suhu
(oC)
25
25
26
25
26
27
26
25
25
27
25
25
27
26
25
26
25
25
26
25
Pagi
DO
(ppm)
5,5
5,6
5,5
5,5
5,5
5,6
5,5
5,7
5,5
5,7
5,6
5,5
5,5
5,6
5,7
5,5
5,6
5,6
5,5
5,6
pH
6,5
6,5
6,5
6,5
6,5
6,7
6,7
6,5
6,5
6,5
6,5
6,7
6,7
6,7
6,7
6,7
6,5
6,5
6,5
6,5
Suhu
(oC)
29
28
28
27
27
28
27
29
29
29
29
29
28
27
28
29
29
28
29
28
Sore
DO
(ppm)
5,7
5,7
5,7
5,8
5,8
5,7
5,7
5,8
5,8
5,8
5,7
5,8
5,7
5,8
5,7
5,7
5,7
5,7
5,7
5,8
pH
6,6
6,7
6,7
6,6
6,7
6,8
6,8
6,8
6,8
6,8
6,7
6,8
6,8
6,8
6,7
6,8
6,7
6,7
6,8
6,7
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR PUSTAKA
Ajizah, A. 2004. Sensitivitas Salmonella typhymurium Terhadap Daun Jambu Biji
(Psidium guajava L.). Jurnal Bioscientiae. 1(1): 8 – 31.
Ali, H., F. S. Chowdhury., Ashrafuzzaman., A. N. Chowdhury., R. U. Haque., K.
M.A. Zinnah.,dan M. Rahman. 2014. Identification Pathogenecity,
Antibiotic and Herbal Sensitivity of Edwardsiella tarda Causing Fish
Disease in Bangladesh. Jurnal Current Research in Microbology and
Biotechnology. 2(1): 292 – 297.
Amri, K dan Khairuman. 2008. Buku Pintar Budidaya 15 Ikan Konsumsi.
Agromedia Pustaka. Jakarta.
Arumugam, S., D. Palanisamy., dan R.T. Sambandam. 2014. Identification of
Bioactive Compounds of Rhizophora mucronata Poir. Leaves Using
Supercritical Fluid Extraction and Gc-Ms. Journal Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences. 3(10): 1621 – 1631.
Batool, N., N. Ilyas., dan A. Shahzad. 2014. Asiatic Mangrove (Rhizophora
mucronata) – an Overview. European Academic Reasearch. 2(3): 3348 –
3363.
Darsana, I. G. O., I. N. K. Besung., dan H. Mahatmi. 2012. Potensi Daun
Binahong (Anredera Cordifolia (Tenore) Steenis) dalam Menghambat
Pertumbuhan Bakteri Escherichia coli secara In Vitro. Indonesia Medicus
Veterinus. 1(3): 337 – 351.
Davis dan Stout. 1971. Aktivitas Antimikroba Ekstrak Biji Mimba Terhadap
Bakteri Salmonella thypi dan Staphylococcus aureus. Jurnal Biogenesis.
2(2): 64 – 66.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar Umum
Tumbuhan Obat. Jakarta.
Desmiaty, Y., H. Ratih., M.A. Dewi., dan R. Agustin. 2008. Penentuan Jumlah
Tanin Total pada Daun Jati Belanda (Guazuma ulmifolia Lamk) dan Daun
Sambang Darah (Excoecaria bicolor Hassk.) Secara Kolorimetri dengan
Pereaksi Biru Prusia. Ortocarpus. 8: 106 – 109.
Dewi, F. K. 2010. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Buah Mengkudu
(Morinda citrifolia, Linnaeus) terhadap Bakteri Pembusuk Daging Segar.
[Skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas
Sebelas Maret. Surakarta.
Diastuti, H dan Suwandri. 2009. Fraksinasi dan Identifikasi Senyawa Antikanker
Ekstrak Kulit Batang Rhizopora mucronata Serta Uji Toksisitasnya
Terhadap Larva Udang (Artemia salina Leach). Jurnal Molekul. 4(2): 54 –
61.
Universitas Sumatera Utara
Elya B., A. Soemiati., dan Farida. 2009. Antibakteri Ekstrak Kulit Batang
Manggis Hutan (Garcinia rigida Miq.). Majalah Ilmu Kefarmasian. 6(1): 9
– 17.
Firma., R.R. Amalia., U. Sari., C. Chusbul., dan A. Amri. 2012. Deteksi
Edwardsiella tarda pada Ikan Lele (Clarias sp.) dengan Metode
Fluorescent Antibody Technique (FAT). Jurnal Akuakultur Indonesia.
11(1): 96 – 102.
Fitrial, Y. 2009. Analisis Potensi Biji dan Umbi Teratai (Nymphaea pubescens
Willd) untuk Pangan Fungsional Prebiotik dan Antibakteri Escherichia
coli Enteropatogenik K 1.1. [Tesis]. Pasca Sarjana Institut Pertanian
Bogor. Bogor.
Ghofur, M., M. Sugihartono., dan R. Thomas. 2014. Efektifitas Pemberian
Ekstrak Daun Sirih (Piper betle L.) Terhadap Penetasan Telur Ikan
Gurami (Osphronemus gouramy Lac.). Jurnal Ilmiah Universitas
Batanghari. Jambi. 14(1): 37 – 44.
Gunawan, D dan S. Marina. 2004. Ilmu Obat Alam (Farmakognosi) Jilid 1.
Penebar Swadaya. Jakarta.
Hagerman, A.E. 2002. Condensed Tannin Structural Chemistry. Department of
Chemistry and Biochemistry. Miami University. USA.
Hamidah, S. 2006. Rendemen dan Kadar Tanin Kulit Kayu Bakau (Rhizophora
mucronata Lamck) dari Daerah Takisung. Jurnal Hutan Tropis Borneo.
(18): 15 – 23.
Harborne. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalis
Tumbuhan. ITB Press. Bandung.
Hasrati, E dan R. Rusnawati. 2011. Kajian Penggunaan Daging Ikan Mas
(Cyprinus carpio Linn) Terhadap Tekstur dan Cita Rasa Bakso Daging
Sapi. Jurnal Agromedia. 29(1): 17 – 31.
Heinrich, M., J. Barnes., S. Gibbons., dan E.M. Williamson. 2010. Farmakologi
dan Fitoterapi. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.
Ibrahem, M.D., I.B. Shaheed., H.A. Elyazeed., dan H. Korani. 2011. Assessment
of The Susceptibility of Polyculture Reared African Catfish and Nile
Tilapia to Edwardsiella tarda. Jurnal American Science. 7(3): 779 – 786.
Kordi, G.H. 2004. Penanggulangan Hama dan Penyakit Ikan. Rineka Cipta.
Jakarta.
Laili, U. 2007. Pengaruh Pemberian Ekstrak Temulawak (Curcuma xanthorrhiza
Roxb) terhadap Prevelensi dan Kelulushidupan Ikan Mas (Cyprinus
carpio) yang Diinfeksi Bakteri Aeromonas hydrophyla. [Skripsi]. Fakultas
Sains dan Teknologi. Universitas Islam Negeri Malang. Malang.
Universitas Sumatera Utara
Lisdawati V., S. Wiryowidagdo., dan L.B.S. Kardono. 2006. Brine Shrimp
Lethality Test dari Berbagai Fraksi Ekstrak Daging Buah dan Kulit Biji
Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa). Buletin Penelitian Kesehatan.
34(3): 111 – 118.
Lukistyowati, I. 2012. Studi Efektifitas Sambiloto (Andrographis paniculata
Nees) untuk Mencegah Penyakit Edwardsiellosis PadaIkan Patin
(Pangasius hypopthalmus). Jurnal Berkala Perikanan Terubuk. 40(2): 56 –
74.
Mawaddah, R. 2008. Kajian Hasil Riset Potensi Antimikroba Alami dan Aplikasi
dalam Bahan Pangan di Pusat Informasi Teknologi Pertanian Fateta IPB.
[Skripsi]. Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Monalisa D., T. Handayani., dan D. Sukmawati. 2011. Uji Daya Antibakteri
Ekstrak daun Tapak Liman (Elephantopus scaber L.) Terhadap
Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi. Jurnal BIOMA. 9(2): 13 –
20.
Mubarokah, Y. 2014. Eksplorasi Potensi Daun, Kulit Batang, dan Kulit Ranting
Rhizophora mucronata (Lamarck) sebagai Bahan Antidiare. [Skripsi].
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Mukhriani. 2014. Ekstraksi, Pemisahan Senyawa dan Identifikasi Senyawa Aktif.
Jurnal Kesehatan. 7(2): 361 – 367.
Mulyani, Y., E. Bachtiar., dan M.U. Kurnia. 2013. Peranan Senyawa Metabolit
Sekunder Tumbuhan Mangrove terhadap Infeksi Bakteri Aeromonas
hydrophila Pada Ikan Mas (Cyprinus carpio L.). Jurnal Akuatika. 4(1): 1 –
9.
Narwiyani, S. dan Kurniasih. 2011. Perbandingan Patogenesitas, Edwardsiella
tarda Pada Ikan Mas Koki (Charassius auratus) dan Ikan Celebes
Rainbow (Telmatherina celebensis). Jurnal J. Ris. Akuakultur. 6(2): 291–
301.
Nurdiansyah dan A. Redha. 2011. Efek Lama Maserasi Bubuk Kopra Terhadap
Rendemen, Densitas, dan Bilangan Asam Biodiesel yang Dihasilkan
dengan Metode Transesterifikasi In Situ. Jurnal Belian. 10(2): 218 – 224.
Pradana, D. 2013. Uji Daya Hambat Ekstrak Kulit Batang Rhizophora mucronata
Terhadap Pertumbuhan Bakteri Aeromonas hydrophila, Streptococcus
agalactiae dan Jamur Saprolegnia sp. secara In Vitro. [Skripsi]. Fakultas
Pertanian. Universitas Sumatera Utara. Medan.
Pratiwi, S.I. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta.
Purwaningsih, I. 2013. Identifikasi Ektoparasit Protozoa pada Benih Ikan Mas
(Cyprinus carpio Linnaeus, 1758) di Unit Kerja Budidaya Air Tawar
Universitas Sumatera Utara
(UKBAT) Cangkringan Sleman DIY. [Skripsi]. Fakultas Sains dan
Teknologi. UIN Sunan Kalijaga. Yogyakarta.
Rahman, M.A., S.N. Hasan., K.S. Sampad., dan A.K. Das. 2011. Antiociceptive,
Antidiarrhoeal and Cytotoxic Activities of Rhizophora mucronata Lamk.
Jurnal Pharmacologyonline. 1: 921 – 929.
Rais, I.R. 2014. Ekstraksi Andrografolid dari Andrographis paniculata (Burm.f.)
Nees Menggunakan Ekstraktor Soxhlet. Jurnal Pharmaciana. 4(1): 85 – 92.
Rajapakshe, A.D.W.R., K.P. Prasad., dan S.C. Mukhaejee. 2003. Gross Clinical
Signs and Haematological Changes Associated with Artificial Infection of
Edwardsiella tarda in Koi Carp. Jurnal Nation Aquatic Resources
Research and Development Agency. 1 – 10.
Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. ITB Press. Bandung.
Setyawan, A.D dan Y.I. Ulumuddin. 2012. Species Diversity of Rhizophora in
Tambelan Islands, Natuna Sea, Indonesia. Jurnal Biodiversitas. 13(4): 172
– 177.
Simbala, H.E.I. 2009. Analisis Senyawa Alkaloid Beberapa Jenis Tumbuhan Obat
sebagai Bahan Aktif Fitofarmaka. Jurnal Pasifik. 1(4): 489 – 494.
Sari, D.K. 2008. Penapisan Antibakteri dan Inhibitor Topoisomerase I dari
Xylocarpus granatum. [Tesis]. Sekolah Pasca Sarjana. Institut Pertanian
Bogor. Bogor.
Sirait, M. 2007. Penuntun Fitokimia dalam Farmasi. ITB Press. Bandung.
Sufriadi, A. 2006. Manfaat Daun Kayu Manis (Cinnamomum burmanni) terhadap
Khasiat Antioksidasi Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.)
Boerl.)) Selama Penyimpanan. [Skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Supriadi, I. 2012. Viabilitas dan Patogenitas Edwardsiella tarda Pada Ikan Lele
Dumbo (Clarias gariepinus) yang Dibekukan Pada Suhu -20oC. [Tesis]
Manajemen Perikanan. Universitas Terbuka. Jakarta.
Susanti, A. 2009. Pengaruh Pemberian Bakteri Probiotik Vibrio SKT-b Melalui
Artemia dengan Dosis yang Berbeda Terhadap Pertumbuhan dan
Kelangsungan Hidup Pasca Larva Udang Windu Penaeus Monodon.
[Skripsi]. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor.
Bogor.
Wahjuningrum, D., M.N. Ikhsan., Sukenda., dan Y. Evan. 2014. Penggunaan
Ekstrak Kunyit Sebagai Pengendali Infeksi Bakteri Edwardsiella tarda
pada Ikan Lele. Jurnal Akuakultur Indonesia. 13(1): 1 – 10.
Widanarni., M.A. Lidaenni., dan D. Wahjuningrum. 2010. Pengaruh Pemberian
Bakteri Probiotik Vibrio SKT-b dengan Dosis yang Berbeda Terhadap
Universitas Sumatera Utara
Kelangsungan Hidup dan Pertumbuhan Larva Udang Windu (Panaeus
monodon) Fab. Jurnal Akuakultur Indonesia. 9(1): 21 – 29.
Widya, D.R. 2013. Aktivitas Antimikroba Ekstrak Biji Teratai (Nymphaea
Pubescens L.) Terhadap Bakteri Aeromonas hydrophila, Streptococcus
agalactiae dan Jamur Saprolegnia sp. [Skripsi]. Fakultas Pertanian.
Universitas Sumatera Utara. Medan.
Universitas Sumatera Utara
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan dari bulan Agustus – Desember 2015. Pembuatan
ekstrak dan pengujian fitokimia kulit batang R. mucronata di Laboratorium Kimia
Bahan Alam, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Sumatera Utara. Pengujian efektivitas antibakteri dan uji biokimia di Stasiun
Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan
II. Pengujian LC50 dan uji tantang dilakukan di Laboratorium Budidaya Perairan
Manajemen Sumberdaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah kamera digital, alat tulis, pisau, cawan petri,
jarum suntik, laminar air flow, pipet tetes, mikropipet, botol vial, gelas ukur,
toples kaca, corong, tabung reaksi, beaker glass, rak tabung, mikroskop, preparat,
spatula, inkubator, penangas air (water bath), jarum ose, gunting bedah,
erlenmeyer, blender, aluminium foil, plat TLC, kapas, jangka sorong, kertas
cakram, api bunsen, blade, kertas saring, vortex, spreader, refrigerator, oven,
cotton bud, siphon, timbangan analitik, autoklaf, hot plate, pinset, magnetic
stirrer, akuarium ukuran 60 x 30 x 30 cm3 sebanyak 12 buah, aerator sebanyak 6
buah, DO meter, termometer, dan pH meter.
Bahan yang digunakan adalah pelarut n-heksana (non polar), etil asetat
(semi polar), metanol (polar), kulit batang R. mucronata, akuades steril, alkohol
70%, spirtus, isolat bakteri E. tarda diperoleh dari Karantina Ikan Pengendalian
Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan II, media (OF, Urea, TSIA,
Universitas Sumatera Utara
SIM, SCA, Glukosa, Inositol, Arabinosa, Sorbitol, Manitol, Maltosa, Gelatin,
MIO, MR/VP, LIA, RS, BFP) kertas oksidase, H2S, Dimethyl sulfoxide (DMSO),
NaCl 0,9 %, Mc Farland 0,5, Tryptic Soy Agar (TSA), H2O2 3%, KOH 3%,
kloramfenikol, dan benih ikan mas berukuran 5 – 7 cm sebanyak 200 ekor yang
diperoleh dari Balai Perikanan Budidaya Tuntungan.
Persiapan dan Ekstraksi Kulit Batang R. mucronata
Kulit batang tumbuhan R. mucronata dikumpulkan sebanyak 10 kg dalam
berat basah dari kawasan hutan mangrove desa Denai Kuala, Kec. Pantai Labu,
Kab. Deli Serdang. Pemanenan kulit batang R. mucronata hanya dilakukan pada
pohon dengan diameter lebih dari 30 cm. Kulit batang R. mucronata dicuci
dengan air mengalir dan dipotong kecil-kecil kemudian dikeringkan selama 7 hari
dengan cara diangin-anginkan untuk mengurangi penguapan yang mengikutkan
senyawa yang terkandung di dalamnya. Proses pengeringan ini bertujuan
menurunkan kadar air sehingga tidak mudah ditumbuhi kapang dan bakteri serta
menghilangkan aktivitas enzim yang dapat menguraikan lebih lanjut kandungan
zat aktif yang terdapat di kulit batang tumbuhan tersebut (Gunawan dan Sri,
2004). Kulit batang yang sudah kering selanjutnya dipotong menjadi potongan
yang lebih kecil agar mudah dihaluskan dengan blender hingga berbentuk serbuk.
Serbuk selanjutnya diayak menggunakan ayakan hingga diperoleh serbuk yang
halus dan seragam. Serbuk hasil ayakan sebanyak 4 kg kemudian disimpan ke
dalam plastik bening karena tidak langsung digunakan untuk proses selanjutnya.
Langkah selanjutnya adalah ekstraksi bahan aktif. Ekstraksi merupakan
suatu proses penarikan komponen atau zat aktif menggunakan pelarut tertentu
(Harborne, 1987). Ekstraksi dalam penelitian ini dilakukan dengan metode
Universitas Sumatera Utara
maserasi yaitu proses pengambilan senyawa zat aktif yang dilakukan dengan cara
merendam serbuk dalam pelarut yang sesuai dengan kepolarannya. Dalam
penelitian ini digunakan tiga pelarut dengan kepolaran berbeda yaitu n-heksana
(non polar), etil asetat (semi polar) dan metanol (polar). Serbuk sampel masingmasing sebanyak 1,1 kg direndam dengan 6 l pelarut etil asetat, 1,1 kg direndam
dengan 5 l pelarut metanol dan sebanyak 2,1 kg direndam dengan 5 l n-heksana di
dalam botol kaca. Botol kaca yang berisi rendaman tersebut kemudian ditutup
dengan penutup botol selama 24 jam sambil sesekali diaduk untuk mempercepat
kontak antara sampel dengan pelarut. Setelah itu sampel disaring dengan kapas
sehingga diperoleh filtrat dan ampas. Filtrat yang diperoleh kemudian pelarutnya
dipekatkan dengan penangas air (water bath) sambil sesekali diaduk untuk
mempercepat proses penguapan dan diperoleh ekstrak pekat/kering. Ekstrak
tersebut kemudian disimpan di dalam beaker glass yang ditutup menggunakan
aluminium foil, kemudian disimpan di dalam refrigerator sebelum digunakan.
Proses ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran 1.
Uji Daya Hambat Ekstrak Kulit Batang R. mucronata Terhadap E. tarda
Peremajaan bakteri E. tarda dilakukan dengan mengambil isolat
menggunakan jarum ose dan menanamnya secara aseptis pada media TSA.
Setelah itu diinkubasi pada suhu 35oC selama 24 – 48 jam.
Konsentrasi larutan uji yang digunakan adalah 20%, 40% dan 60% (b/v).
Konsentrasi 60% dibuat dengan cara menimbang ekstrak kulit batang R.
mucronata sebanyak 0,6 g yang dilarutkan dengan 1 ml DMSO. Larutan dengan
konsentrasi 40% dan 20% dibuat dengan cara pengenceran dari konsentrasi 60%
Universitas Sumatera Utara
menggunakan 0,5 ml DMSO. Kontrol negatif digunakan DMSO dan kontrol
positif digunakan kloramfenikol (30 µg/ml).
Tahap pertama yang dilakukan adalah pembuatan suspensi bakteri dengan
cara mengambil biakan menggunakan sengkelit (ose) dan disuspensikan dengan
cara dimasukan ke dalam tabung berisi 3 ml larutan NaCl 0,9%. Suspensi yang
terbentuk disetarakan dengan larutan baku Mc. Farland 0.5 yang ekuivalen dengan
suspensi sel bakteri dengan konsentrasi 1,5 × 108 cfu/ml (Andrews, 2008).
Pengujian antibakteri dilakukan dengan metode disc diffusion (tes Kirby &
Bauer). Prinsipnya adalah piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada
media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media
agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan
mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar (Pratiwi,
2008).
Pada penelitian ini pengujian antibakteri menggunakan blank disc (kertas
cakram kosong) berdiameter 6 mm. Cutton buds steril dimasukkan ke dalam
tabung reaksi yang berisi suspensi bakteri dan diguncang sedikit agar bakteri
teraduk rata kemudian Cutton buds yang mengandung bakteri dioleskan pada
media TSA. Setelah olesan bakteri mengering, kertas cakram yang telah direndam
ekstrak selama 1 jam pada berbagai konsentrasi ditiriskan dan diletakkan di atas
media yang berisi olesan bakteri dengan sedikit ditekan agar cakram menempel
pada permukaan media. Semua pengerjaan dilakukan dengan aseptis. Selanjutnya
diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam di inkubator. Proses pengujian
antibakteri dapat dilihat pada Lampiran 2.
Universitas Sumatera Utara
Penentuan Zona Hambatan
Menurut Pratiwi (2008), ativitas antibakteri dinyatakan positif apabila
terbentuk zona hambat berupa zona bening disekeliling paper disc dan aktivitas
antibakteri dinyatakan negatif apabila tidak terbentuk zona bening. Diameter zona
hambat dapat dideskripsikan dengan Gambar 5.
a
c
b
Gambar 5. Perhitungan diameter zona hambat antibakteri
Keterangan:
a = Diameter kertas cakram (mm)
b = Diameter zona hambat yang terbentuk (mm)
c = Daerah yang ditumbuhi bakteri
b – a = Diameter zona hambat
Uji LC50 Ekstrak Kulit Batang R. mucronata Terhadap Ikan Mas
Uji LC50 48 jam menguji cobakan secara langsung konsentrasi ekstrak
kulit batang R. mucronata terhadap benih ikan mas yang berukuran 5 – 7 cm
sebanyak 10 ekor per akuarium yang berisi 20 liter air dengan 5 perlakuan yakni
A. Tanpa perlakuan 0% (Kontrol), B. Perlakuan ekstrak kulit batang R. mucronata
25 ppm, C. Perlakuan ekstrak kulit batang R. mucronata 30 ppm,D. Perlakuan
ekstrak kulit batang R. mucronata 50 ppm, dan E. Perlakuan ekstrak kulit batang
R. mucronata 75 ppm, dengan masing-masing sebanyak 3 kali ulangan. Parameter
yang diamati adalah jumlah mortalitas benih ikan mas terhadap konsentrasi
Universitas Sumatera Utara
ekstrak kulit batang R. mucronata yang berbeda dengan tetap menjaga kualitas air
tempat hidup ikan uji. Proses uji toksisitas dapat dilihat pada Lampiran 3.
Penginfeksian dan Pengujian Bakteri
Isolat bakteri E. tarda dimurnikan kembali sebanyak 2 cawan petri penuh
yang telah berisi media TSA untuk penyuntikan ikan. Bakteri yang sudah
dimurnikan kemudian dipanen dan diencerkan dengan larutan fisiologis (NaCl
0,9%) sebanyak 10 ml. Setelah itu dihomogenkan dengan menggukan vortex dan
disetarakan dengan larutan McFarland 107CFU/ml, kemudian diinfeksikan ke ikan
mas.
Penginfeksian
bakteri
pada
ikan
dilakukan
dengan
penyuntikan
menggunakan jarum suntik sebanyak 0,1 ml/ekor suspensi bakteri dengan
kepadatan 107CFU/ml dan disuntikkan secara intraperitoneal (Setyowati. dkk.,
2014). Setelah ikan diinfeksi kemudian diamati pergerakan dan gejala ikan yang
terinfeksi bakteri E. tarda. Pemberian pakan dilakukan 2 kali sehari, yaitu pada
pagi dan sore hari serta diamati kualitas airnya. Hal ini dilakukan agar ikan yang
telah disuntikan mati bukan akibat suntikan, melainkan bakteri.
Ikan yang telah disuntikan, diisolasi dan dilakukan uji biokimia untuk
mengetahui apakah bakteri yang menyerang ikan mas adalah bakteri E.tarda.
Proses penginfeksian dan pengujian bakteri dapat dilihat pada Lampiran 4.
Perhitungan Koloni Bakteri E. tarda pada Ikan Mas
Prose penghitungan jumlah koloni bakteri Edwardsiella tarda dengan
metode cawan sebar dengan pengenceran dan untuk menghitung koloni
menggunakan metode TPC (Total Plate Count). Ikan yang telah terinfeksi selama
24 jam kemudian dibedah dengan mengambil organ tubuhnya. Menurut KEPBKIM (2015) ikan ukuran 4 – 6 cm, target uji adalah bagian isi perut sampai
Universitas Sumatera Utara
dengan ginjal dan sebagian enchepalon yang diambil dari memotong tepi
operculum dan menekan secara lateral, sedangkan ikan ukuran lebih dari 6 cm,
target uji terdiri dari ginjal, limpa dan otak. Tahap pengenceran yaitu 10-1, 10-2,
10-3, dan 10-4.
Sampel organ diambil sebanyak 1 gram dan diencerkan menggunakan
media BFP cair sebanyak 10 ml. Empat buah tabung reaksi diisi media BFP cair
sebanyak 9 ml. Biakan bakteri diambil sebanyak 1 ml dari campuran bakteri
dengan pengenceran 10-1 agar mendapatkan bakteri dengan pengenceran10-2,
begitu seterusnya sampai pengenceran 10-4. Sampel yang sudah diencerkan di
vortex kemudian dituang sebanyak 1 ml ke media RS dan diberi label sesuai
pengenceran.Setelah itu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35oC kemudian
dihitung koloni bakteri dengan metode TPC dan dilakukan perhitungan jumlah
bakteri menurut menurut (Hadioetomo, 1993 dalam Susanti, 2009).
Ni = No x
1
��
Keterangan:
x 10
Ni = Jumlah sel bakteri (CFU/ml)
No = Jumlah koloni bakteri yang tumbuh
fp = Faktor pengenceran
Uji Tantang
Uji tantang dilakukan pada hari ke-5 pasca penginfeksian, kemudian
dilakukan pengobatan dengan 4 perlakuan dan 3 ulangan, yaitu perlakuan kontrol
negatif (tidak diinfeksi bakteri dan tidak direndam ekstrak), kontrol positif
(diinfeksi bakteri dan tidak direndam ekstrak), ekstrak dengan larutan metanol
2,86 ppm dan ekstrak dengan larutan metanol 3,93 ppm (10% dari hasil uji LC50).
Universitas Sumatera Utara
Benih ikan uji sebanyak 10 ekor dalam 20 liter air per akuarium. Perendaman
dilakukan selama 14 hari dan diamati kelulushidupan ikan (SR). Pada saat uji
tantang pada hari ke-14 frekuensi pemberian pakan ditingkatkan yaitu tiga kali
dalam sehari, dengan jadwal pemberian pagi (07.00-08.00), siang (12.00- 13.00),
dan malam (19.00-20.00) WIB.
Pengamatan Kualitas Air
Untuk menjaga kualitas air selama percobaan dilakukan penyiponan jika
diperlukan. Parameter kualitas air yang diukur meliputi suhu, DO, dan pH.
Pengukuran dilakukan setiap pengamatan, pagi dan sore.
Analisis Data
Untuk zona hambat pengukuran zona bening dirata-ratakan dan dianalisis
dengan metode deskipstif dalam bentuk tabel dan gambar. Uji tantang, analisis
data menggunakan ANOVA. Selanjutnya untuk analisis data uji LC50 48 jam
dengan perhitungan Analisis Probit yaitu dilakukan dengan persamaan regresi
linear y = a + bx yang didapatkan dari grafik hubungan antar log konsentrasi
dengan mortalitas probit menggunakan program Microsoft Excel.
Universitas Sumatera Utara
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Ekstraksi
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi/perendaman serbuk kulit
batang R. mucronata dengan menggunakan pelarut metanol, n-heksana, dan etil
asetat. Hasil ekstraksi kulit batang tumbuhan R. mucronata dapat dilihat pada
Tabel 1.
Tabel 1. Hasil ekstraksi kulit batang tumbuhan Rhizophora mucronata.
No.
1.
2.
3.
4.
Hasil
Berat sampel (g)
Berat ekstrak (g)
Bentuk
Warna
Metanol
1100
250
Pasta
Merah
kehitaman
Etil asetat
1100
5
Pasta kering
Cokelat
kemerahan
n-Heksana
2200
3
Pasta agak cair
Hijau
kekuningan
Uji Daya Hambat Ekstrak Kulit Batang R. mucronata
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram
yang menggunakan blank disc ukuran 6 mm. Hasil pengujian ekstrak kulit batang
R. mucronata terhadap pertumbuhan bakteri E. tarda menunjukkan bahwa ekstrak
tersebut mampu menghambat pertumbuhan bakteri E. tarda. Besarnya daya
hambat ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap pertumbuhan bakteri E. tarda
dapat diketahui dengan mengukur zona bening yang menghambat pertumbuhan
bakteri E. tarda menggunakan jangka sorong. Pengamatan terhadap pertumbuhan
bakteri E. tarda dilakukan selama 24 jam. Zona hambat ekstrak kulit batang R.
mucronata terhadap bakteri E. tarda dapat dilihat pada Tabel 2 dan Gambar 6.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 2. Zona hambat rata-rata ekstrak kulit batang R. mucronata
bakteri E. tarda
Bakteri
E. tarda
Ekstrak dengan
pelarut
Etil Asetat
Metanol
N-heksana
Kloramfenikol
DMSO
terhadap
Diameter rata-rata zona hambat (mm)
60%
40%
20%
Kontrol
16,11
8,60
4,75
19,03
13,95
9,38
0
0
0
38,50
0
Daya hambat ektrak kulit batang R. mucronata yang paling besar terlihat
pada ekstrak metanol dengan konsentrasi 60% sebesar 19,50 mm, konsentrasi
40% sebesar 14,94 mm dan konsentrasi 20% sebesar 9,95 mm. Perhitungan
konsentrasi uji antimikroba dan data awal hasil pengukuran zona hambat ekstrak
kulit batang R. mucronata dapat dilihat pada Lampiran 5 dan Lampiran 6.
(a)
(b)
(d)
(e)
(c)
Gambar 6. Hasil pengujian antibakteri terhadap bakteri E. tarda; (a) ekstrak
dengan pelarut etil asetat (b) ekstrak dengan pelarut metanol (c)
ekstrak dengan pelarut n-heksana (d) kontrol positif/kloramfenikol (e)
kontrol negatif (DMSO)
Universitas Sumatera Utara
Uji LC50 Ekstrak Kulit Batang R. mucronata Terhadap Ikan Mas
Toksisitas ekstrak kulit batang R. mucronata dilakukan untuk mengetahui
kandungan bioaktif ekstrak tersebut dengan menggunakan Uji LC50. Ekstrak yang
paling menghambat pada uji daya hambat diaplikasikan dalam uji LC50, yaitu
ekstrak metanol. Data hasil uji LC50 ekstrak metanol dari kulit batang R.
mucronata dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Data hasil uji LC50 ekstrak metanol dari kulit batang R. mucronata
Konsentrasi
(ppm)
0
25
30
50
75
Total
Populasi
30
30
30
30
30
Jumlah
Kematian
0
0
14
30
30
Persen
Mortalitas (%)
0
0
46,67
100
100
LC50
(ppm)
39,30
Mortalitas benih ikan mas terhadap ekstrak metanol menunjukkan bahwa
pada konsentrasi 25 ppm tidak ada yang mati, sedangkan pada konsentrasi 50 ppm
benih ikan mas sudah mati sebesar 100%. Pada pemberian konsentrasi 30 ppm
benih ikan mas mati sebanyak 46,67%. Perhitungan LC50 dilihat dari nilai probit
yang disesuaikan dengan tabel probit (Lampiran 7) dan nilai log konsentrasi. Dari
hasil perhitungan uji LC50 didapatkan nilai konsentrasi yang dapat mematikan
ikan sebanyak 50% adalah 39,30 ppm. Data pengamatan mortalitas benih ikan
mas dan perhitungan LC50 ekstrak kulit batang R. Mucronata dapat dilihat pada
Lampiran 8 dan Lampiran 9.
Uji Tantang
Benih Ikan Mas yang telah terinfeksi dilihat pada perubahan morfologi
dan tingkah lakunya. Salah satu perubahan ikan yang terinfeksi bakteri E. tarda
yaitu tubuhnya pucat, hilangnya sisik akibat luka dan dapat menyebakan
Universitas Sumatera Utara
pendarahan bahkan kematian. Ikan yang terinfeksi dilakukan uji biokimia untuk
memastikan ikan tersebut terinfeksi bakteri E. tarda. Setelah itu dilakukan
pengobatan
dengan
cara
perendaman
ekstrak.
Perhitungan
rata-rata
kelulushidupan ikan mas setelah diinfeksi bakteri dan direndam ekstrak dapat
dilihat pada Tabel 4 dan perubahan ikan yang diinfeksi bakteri dan setelah
direndam ekstrak dapat dilihat pada Gambar 7.
Tabel 4. Perhitungan rata-rata kelulushidupan benih ikan mas yang diinfeksi
bakteri pasca perendaman
Rata-rata
Kelulushidupan Benih
U1
U2
U3
Ikan Mas (%)
Kontrol negatif
10
10
10
100± 0,00a
Kontrol positif
0
2
0
6,67±9,33b
Ekstrak 2,86 ppm
7
6
7
66,67± 3,33c
Ekstrak 3,93 ppm
10
10
10
100±0,00a
Keterangan : Superskrip yang berbeda menunjukkan berbeda nyata (P