PENELITIAN I : OPTIMASI DAN MODIFIKASI
Metode Penelitian Pengambilan Sampel Daun
Sampel daun aren yang digunakan adalah daun dari populasi alam di daerah Angkola Barat, Sipirok, Batangtoru, Porsea dan Ranto, Provinsi Sumatera
Utara. Daun dipilih yang masih mudalembut berwarna kuning keputihan kemudian dicuci bersih, dilap pakai tissue dan kemudian dibawa ke Laboratorium
Kultur Jaringan Universitas Sumatera Utara, Medan.
1. Tanpa Menggunakan N2 Cair dan Pasir Kuarsa
Isolasi dan Pemurnian DNA
Daun aren yang berasal dari pohon yang berbeda dari daerah Angkola Barat, Sipirok Tapanuli Selatan ditimbang masing-masing 0,1-0,3 g. Daun
dipotong halus dengan gunting secara melintang. Kemudian daun dimasukkan ke dalam mortar untuk digerus dan ditambahkan buffer ekstraksi CTAB. Daun
digerus sampai halus searah jarum jam. Ke dalam mortar ditambah 0,1 g PVPP sebagai antioksidan + 0,5 ml buffer ekstraksi CTAB, kemudian digerus kembali
hingga benar-benar lumat. Daun dipindahkan kedalam tabung mikro 2 ml, ditambah 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 10µl
β-mercaptoethanol, kemudian divortex hingga rata. Masing-masing tabung diberi tanda sesuai dengan sampel
yang digunakan. Tabung tersebut diinkubasi ke dalam penangas air bersuhu 65
o
C selama 30 menit, setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara regular. Setelah
selesai dipanaskan dimasukkan 1 ml larutan KIAA ke dalam tabung. Kemudian
Universitas Sumatera Utara
tabung dikocok lagi hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
Bila ekstraksi berhasil maka supernatant akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Kemudian fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan
ditambah 1 ml larutan KIAA dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 2 ml dan
ditambahkan 1 ml isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih
sudah tampak jelas disimpan pada suhu 4
o
Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol 100 dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 4
C selama 30 menit. Setelah 30 menit cairan isopropanol dalam tabung dibuang dan benang-benang halus dalam tabung
ditinggalkan lalu dikeringanginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan `100µl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi antara pelet dengan
buffer TE Orozco-Castillo dkk., 1994.
o
C selama 30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000
rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah 100 µl buffer TE dan pelet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stock DNA
yang diperoleh disimpan pada suhu ± 20 C bila tidak digunakan
Orozco-Castillo dkk., 1994.
2. Menggunakan Pasir Kuarsa Isolasi dan Pemurnian DNA
